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Objectif :
LECBU permet :
Disoler, de dnombrer et didentifier les bactries responsables de linfection
urinaire et de
raliser un antibiogramme de la bactrie responsable
De dnombrer les leucocytes
De rechercher la prsence de cylindres et de cristaux urinaires.
Matriels et mthode
1. Les matriels :
Bec benzun.
Tubes essai.
Boites de ptri.
Pipette pasteur ou anse de platine.
Bandelettes urinaires pour mesurer le pH des urines.
Centrifugeuse.
Microscope optique.
Lame et mamelle.
Des milieux de culture :
Glose nutritive : permettre une numration des bactries
les plus frquemment rencontres, (les entrobactries, les
Pseudomonas , les Staphylocoques et les entrocoques ).
glose lactose au bromocrsol pourpre (BCP) : pour
lisolement des bactries peu exigeantes.
milieu de Mac Conkey : qui permet dinhiber les bactries
Gram+ et le dveloppement en nappe du Proteus .
Une glose au sang frais ou cuit : peut permettre disoler
des Streptocoques ou des Haemophilus.
2. Mthode :
LECBU seffectue en plusieurs tapes et en plusieurs jours.
2.1. Prlvement :
Il peut tre ralis au laboratoire ou domicile. Dans ce dernier cas, le
prlvement doit tre apport sans dlai au laboratoire.
Pour viter une contamination trop importante au cours du recueil de
lurine, le prlvement doit tre effectu dans des conditions prcises :
Se laver les mains
Attendre minimum 3 h aprs la miction prcdente (ou prfrer la 1re
urine du matin)
Rejeter le premier jet durine
Recueillir le milieu de jet dans un flacon strile (
demander au laboratoire)
2.2. Examen macroscopique de lurine :
2.2.1. Couleur et trouble :
Homogniser lurine par retournement ou par
agitation mcanique et noter laspect limpide ou
trouble et la prsence dune ventuelle hmaturie.
2.2.2. Mesure du pH
fait appel des bandelettes revtues de deux indicateurs colors et dont
le changement des couleurs allant de lorange au bleu couvre une gamme
de pH de 5,0 8,5. La ralisation de ce test seffectue galement sur
urines fraches.
2.3. Dnombrement des bactries et des leucocytes urinaires :
2.4. Examen du culot urinaire
2.4.1. Prparation du culot urinaire :
Homogniser lurine.
Remplir les 3/4 dun tube centrifuger.
Centrifuger 5 minutes 2 000 tours/minute.
Technique dantibiogramme :
Rsultats et discussion
1. Couleur :
Normalement jaune.
Rose rouge : hmaturie
Orange-acajou : ictre (jaunisse)
2. Troubles : Indique la Prsence de leucocytes, de bactries et
ventuellement de pus
3. pH : Le pH normal de la premire urine du matin est acide.
Un pH alcalin suggre une infection urinaire.
Expression du rsultat
10-20
Suprieur 20
Expression du rsultat
3- Les cylindres :
pH acide
Phosphates amorphes
Urates amorphes
Triple phosphates
Acide urique
Biurate dammonium
Oxalates de calcium
Phosphate de calcium
Cystine
Carbonate de calcium
Interprtations :
selon la bactriurie et la leucocyturie :
Leucocyturie 104/ml et la bactriurie 103 UFC/ml : absence
dinfection urinaire.
Leucocytaire 104/ml et la bactriurie 105 UFC/ml, avec un seul
type de bactrie, il sagit dune infection urinaire certaine.
Leucocyturie 104/ml et la bactriurie 105 UFC/ml avec deux
types de bactries chez la femme est un examen direct qui retrouve
de nombreuses cellules pithliales, il sagit de deux probables
possibilits :
- Infection gnitale.
- Infection urinaire mais contamine
Leucocyturie 104/ml et la bactriurie 105 UFC/ml, avec un seul
type de bactrie, cest une infection urinaire dans les cas suivants :
- Femme enceinte : confirmer par un deuxime ECBU.
- Immunodprim
- diabtique
- Nourrisson
- Personne ge
Une bactriurie sans leucocyturie peut tre galement observe
lorsque le prlvement est gard trop longtemps +4C ou lorsque
les urines sont hypertonique ou trop alcalines. Ces conditions
contribuent dtruire les leucocytes.
6. Rsultats
dantibiogramme :
- la bactrie est sensible ATB quand la CMI
est infrieure la concentration critique
infrieure (dose minimale d'ATB qu'un malade
peut recevoir sans dangers et qui fait effet sur la
souche bactrienne). ceci signifie qu'il suffit
d'une faible concentration d'antibiotique pour
tuer les bactries .
- la bactrie est rsistante l'antibiotique quand
la CMI est suprieure la concentration critique
suprieure (dose maximale d'antibiotique qu'un
malade peut recevoir sans dangers et qui fait effet
sur la souche bactrienne.).la dose ncessaire pour tuer les bactries est bien trop leve
pour tre supporte chez l'homme sans effets secondaires importants. Cet antibiotique ne
peut pas tre utilis pour traiter une infection.
- la bactrie est intermdiaire l'antibiotique quand la CMI est comprise entre les deux
concentrations critiques. Il ne faut pas utiliser cet antibiotique.
Objectif :
Rechercher et isoler les bactries responsables de diarrhes.
Identifier ces bactries en donnant l'antibiogramme.
La dmarche diagnostique:
1- Prlvement des selles :
a- Chez l'adulte et l'enfant : un peu de selles suffit dans un flacon hermtique.
b- Chez le nourrisson : un couvillonnage rcital suffit.
- Un chantillon muco-purulent ou sanglant est choisi lorsqu'il en existe.
- le choix du flacon idem que lECBU.
2- Technique :
Premier jour :
Examen macroscopique :
Il est important de noter l'aspect macroscopique des selles, car il nous aidera
choisir les milieux de culture.
Les selles peuvent tre liquides, molles ou solides.
Elles peuvent tre aussi hmorragiques.
Examen microscopique :
Si les selles sont solides ou molles, nous devons prparer une suspension.
L'tat frais permet d'observer la morphologie des bactries, leur mobilit ainsi de
dceler la prsence des leucocytes et d'hmaties. Il est possible de rvler des
parasites.
L'examen des selles aprs coloration permet d'tudier l'quilibre de la flore
(concernant le Gram, la morphologie).
Si les selles sont liquides, l'examen microscopique est important pour
orienter les cultures :
La prsence des leucocytes montre que la diarrhe est germes invasifs
(provoquent la lsion des tissus), les germes caractristiques sont : Salmonella
sp, Shigella sp, Campylobacter sp.
En cas d'absence des leucocytes, la diarrhe est du aux germes
enterotoxigniques, les germes caractrisant ce cas sont : Vibrio cholerae,
Aeromonas sp.
Mise en culture :
Les germes recherchs systmatiquement :
Salmonelles et Shigelles:
Concernant les Salmonelles, un milieu d'enrichissement est indispensable tel que :
bouillon au slnite - milieu Leifson ou Muller Kauffmann avec 0.5ml de selle, puis
incubation 37C.
Il n'existe pas un milieu d'enrichissement pour les Shigelles.
Il est important de repiquer le milieu d'enrichissement des Salmonelles sur glose
slective aprs 3-6h maximum d'incubation afin d'viter la multiplication des bactries
commensales mal inhibes au-del de ce temps.
Les milieux slectifs les plus utiliss pour l'isolement de Salmonelles et de
Shigelles sont : glose SS, glose Hektoen.
L'incubation se fait pendant 24h 37C.
E .coli:
Recherche systmatiquement chez l'enfant moins de trois ans.
Autres germes :
Levures :
Leur prsence se rvle lors de l'observation microscopique l'tat frais.
Dans ce cas, on utilise le milieu Sabouraud + chloramphnicol.
Staphylococcus aureus :
Recherche en cas de toxi-infection alimentaire, le milieu utilis Chapman.
Vibrio cholerae :
Recherche directement sur milieu slectif(GNAB) et aprs enrichissement par EPA, puis
repiquage aprs 3heures sur GNAB et sur EPA, puis repiquage de ce dernier dans GNAB.
Incubation 37C/24h.
Deuxime jour :
Reprage des colonies :
Caractrisation et identification biochimiques des colonies suspectes.
1- Les colonies suspectes de Salmonelles et de Shigelles sur glose Hektoen sont
transparentes, vertes, elles sont lac, H2S + ou -.
- On ralise un test d'oxydase instantan, afin d'liminer les Pseudomonas qui sont oxy +
- Raliser un test d'urase
- Aprs incubation, ajouter le ractif de KOWACS
- Ensemencer sur milieu Kliger Hajna
incubation 24h/37C.
- Pour les colonies saumons, on limine les Proteus par le test d'urase sur milieu ure
indole, Proteus est urase+ (le milieu devient rouge en 2heures)
a- Urease + :Proteus.
b- Urease : ajouter le ractif de Kowacs
indole +
Possibilit d'avoir E.coli.
2- Les tests effectus pour E.coli sont : lactose, actone, citrate, H2S, gaz.
3- Les Staphylocoques pathognes forment des colonies pigmentes, entoures d'une
aurole jaune due la fermentation du mannitol.
Les tests effectus sont : cat(+), coagulase(+).
4- Pour l'identification des Vibrio cholerae, qui se prsentent en colonies transparentes
bleutes, on effectue un test d'oxydase (oxy+), catalase (cat+), ure indole, TDA
L'antibiogramme :
L'antibiogramme est impratif pour Salmonella, Shigella, E. coli et pour V. cholerae.
Troisime jour :
Lecture des rsultats d'identification biochimique et de l'antibiogramme.
Salmonella, Shigella :
Hajna Kligler
Tests
Lac
H2S
Urase
Indole
glucose
gaz
LD
Salmonella
+/-
Shigella
Sporozoaires (coccidies)
Infusoires (Balantidium coli)
Flagells(Giardia)
Rhizopodes (amibes)
Helminthes=Nmatodes
Ascaris lombricodes
Trichuris trichiura (trichocphale)
(vers ronds)
Distomatoses (douves)
Schistosoma (bilharzies)
Cestodes(Taenia)
Prlvement sanguin
Aprs prparation de la salle et du matriel de
prlvement :
1- choix de la veine :
2- Antisepsie :
3- Introduction de l'aiguille :
Positionner l'aiguille .
Piquer, en tirant vers le bas, la peau sous le point de piqre, puis aspirer.
4- Retrait de l'aiguille :
Il faut agiter les tubes et attendre 30mn pour mesurer la D.O 505 nm.
D.O
2- Cratinine :
D.O ech
Cra = 20
D.O etalon
cra: 7 -14
mg/l.
mg/l
3- Acide urique :
A.U = 60 mg/l.
D.O talon
Hommes : 34 - 70 mg/l
Femmes : 25 - 60 mg/l
4- Cholestrol total :
Puisqu'il fait partie des lipides, il est prescrit dans un bilan lipidique.
Concernant la technique, semblable celle de la glycmie.
La D.O est prise 500nm
D.O ech
CHO = 2 g/l.
D.O talon
5- Triglycrides :
Cet examen est prescrit pour le diagnostic des hyperlipidmies, ainsi dans un bilan
lipidique.
Le principe du dosage est colorimtrique.
Un taux trs lev en T.G est remarqu sur le srum (celui-ci est trouble mme aprs
la centrifugation).
Les D.O de l'talon et d'ech sont notes, aprs le rglage du zro par le blanc.
D.O ech
T.G = 2 g/l.
D.O talon
Les 4 groupes sanguins (A, B, AB, O) sont dtermins par la prsence ou l'absence
de 2 protines agglutinognes se trouvent la surface des hmaties et jouant le
rle des Ag : protine A et protine B.
La mthode consiste poser 3 gouttes de sang sur une lame, on ajoute une goutte
de chaque srum (anti A, anti B, anti Rh), sans toucher le sang.
Avec un btonnet en plastique, on mlange la goutte du sang et celle du srum.
Aprs 30S environ, bouger la lame d'un mouvement circulaire et noter le rsultat.
A+
B+
AB
AB +
O+
antiA
antiB
antiRh
Agglutination
aucun changement
Conclusion
- Durant notre stage, nous avons remarqu que le personnel du laboratoire
nglige les conditions d'asepsie tels que les gants, le masque..., alors qu'ils
nous les conseillent
- Du cot bactriologique (ECBU, Coproculture), ces laborantins se basent
sur l'tude cytologique et dlaissent la culture et l'identification bactrienne
dans son aspect particulier c.--d. le suivi des tapes.
- Concernant le dnombrement des leucocytes, ils utilisent une mthode
semi quantitative c.--d. non prcise (- / + / ++).
- La recherche des parasites est limite l'examen microscopique direct.
-D'une faon gnrale, le stage a t bnfique puisque nous avons pu voir
de prs le droulement des tests et certain temps de manipuler.
-Un stage plus long serait meilleur pour nous afin d'en savoir d'avantages.