REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Fuentes, Jos1; Alemn, Maira1; Tovar, Jos1; Peates, Naguib1.

1Estudiantes

de la materia Gentica General, Programa de Biologa,

Universidad de Sucre.
Resumen
La PCR permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de
ADN. El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reaccin es
disponer de fragmentos cortos de ADN de cadena sencilla
complementarios a los extremos del fragmento a amplificar. Estos
fragmentos servirn como cebadores para que una enzima polimerasa
sea capaz de incorporar nucletidos complementarios a la cadena molde.
Por su parte, La electroforesis es una tcnica habitual en el laboratorio
clnico, permite separar especies qumicas (cidos nucleicos o protenas)
a lo largo de un campo elctrico en funcin de su tamao y de su carga
elctrica. Los cidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza carga
negativa. Se empez a seguir un protocolo estipulado en la gua, el cual
nos indicaba la preparacin del mater mix, el cual se hizo de un mtodo
practico con reactivos reemplazados por agua, para no desperdiciar
reactivos, esto se llev a cabo con cada uno de los grupos
Palabras claves: PCR, cebadores, nucletidos, electroforesis.

INTRODUCCIN
La reaccin en cadena de la
polimerasa, conocida como PCR
por sus siglas en ingls
(Polymerase Chain Reaction), es
una tcnica de biologa molecular
desarrollada en 1986 por Kary
Mullis (Bartlett & Stirling, 2003).
Su objetivo es obtener un gran
nmero de copias de un
fragmento de ADN particular,
partiendo de un mnimo; en teora
basta partir de una nica copia
de ese fragmento original, o
molde. Esta tcnica sirve para
amplificar un fragmento de ADN;
su utilidad es que tras la
amplificacin resulta mucho ms
fcil identificar con una muy alta
probabilidad, virus o bacterias
causantes de una enfermedad,
identificar personas (cadveres)

o hacer investigacin cientfica

sobre el ADN amplificado. Estos
usos
derivados
de
la
amplificacin han hecho que se
convierta en una tcnica muy
extendida, con el consiguiente
abaratamiento
del
equipo
necesario para llevarla a cabo.
Esta tcnica se fundamenta en la
propiedad natural de los ADN
polimerasas para replicar hebras
de ADN, para lo cual se emplean
ciclos
de
altas
y
bajas
temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN
recin formadas entre s tras
cada fase de replicacin y, a
continuacin, dejar que las
hebras de ADN vuelvan a unirse
para
poder
duplicarlas
nuevamente. La reaccin en
cadena de la polimerasa fue

perfeccionada por Kary Mullis

perteneciente
a
la
Cetus
Corporation en California, en la
dcada de 1980.
Inicialmente la tcnica era lenta,
ya que las polimerasas se
desnaturalizaban al realizar los
cambios de temperatura y era
necesario
agregar
nuevas
polimerasas en cada ciclo.
Puesto que las temperaturas del
ciclo (95 C en las fases de
desnaturalizacin
del
ADN)
suponen
la
inmediata
desnaturalizacin
de
toda
protena, se emplean ADN
polimerasas
termoestables,
extradas de microorganismos
adaptados a vivir a esas
temperaturas, restrictivas para la
mayora de los seres vivos.
Dichos
microorganismos,
generalmente
arqueas,
son:
Thermus aquaticus (polimerasa
Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu),
Thermococcus litoralis (Vent) y
Thermus thermophilus (Tth).
Generalmente
se
emplean
mezclas de polimerasas muy
procesivas (Taq) con otras
capaces de hacer correccin de
errores (Pfu, Vent).
Para realizar la tcnica se
necesitan (Sambrock & Russel,
2001):

Los
4
desoxirribonucletidos

trifosfato (dNTP), sustratos

para polimerizar nuevo
ADN.
Dos
cebadores
o
iniciadores (en ingls,
primers), oligonucletidos
que son, cada uno,
complementarios a una de
las dos hebras del ADN.

Son secuencias cortas, de

entre seis y cuarenta
nucletidos, normalmente
de dieciocho a veintids,
que permiten que la
polimerasa
inicie
la
reaccin. Deben estar
enfrentados y a no mucha
distancia. Delimitan la
zona de ADN a amplificar,
es decir, corresponden a
los
nucletidos
que
definen los extremos de la
secuencia que se desea
replicar.
Iones divalentes. Se suele
usar magnesio (Mg2+),
agregado
comnmente
como cloruro de magnesio
(MgCl2), o algn otro
catin divalente. Tambin
se
puede
emplear
2+
manganeso (Mn ), para
mutagnesis
de
ADN
mediante PCR, ya que
altas concentraciones de
Mn2+ incrementan la tasa
de error durante la sntesis
de ADN. Actan como
cofactores
de
la
polimerasa.
Iones monovalentes, como
el potasio.
Una solucin tampn o
buffer que mantiene el pH
adecuado
para
el
funcionamiento de la ADN
polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla
de distintas polimerasas
con temperatura ptima
alrededor de 70 C (la ms
comn es la polimerasa
Taq).
ADN molde, que contiene
la regin de ADN que se
va a amplificar.

Termociclador, el aparato
que
mantiene
la
temperatura necesaria en
cada una de las etapas
que conforman un ciclo.

La electroforesis es una tcnica

para la separacin de molculas
segn la movilidad de estas en
un campo elctrico (Castagnino,
1968). La separacin puede
realizarse sobre la superficie
hidratada de un soporte slido
(por ejemplo, electroforesis en
papel o en Acetato de Celulosa),
a travs de una matriz porosa
(electroforesis en gel), o bien en
disolucin (electroforesis libre).
Dependiendo de la tcnica que
se use, la separacin obedece en
distinta medida a la carga
elctrica de las molculas y a su
masa.
La electroforesis se usa en una
gran mayora en la materia del
ADN recombinante ya que nos
permite saber la carga que
poseen los polipptidos, y
separar
los
diferentes
polipptidos resultantes de las
variaciones del experimento del
ADN recombinante. La variante
de uso ms comn para el
anlisis de mezclas de protenas
o de cidos nucleicos utiliza
como
soporte
un
gel,
habitualmente de agarosa o de
poliacrilamida.
Los
cidos
nucleicos ya disponen de una
carga elctrica negativa, que los
dirigir al polo positivo, mientras
que las protenas se cargan al
unirse con sustancias como el
SDS (detergente) que incorpora
cargas negativas de una manera
dependiente
de
la
masa
molecular de la protena. Al poner
la mezcla de molculas y aplicar
un campo elctrico, stas se

movern y debern ir pasando

por la malla del gel (una red
tridimensional
de
fibras
cruzadas), por lo que las
pequeas se movern mejor,
ms rpidamente. As, las ms
pequeas avanzarn ms y las
ms grandes quedarn cerca del
lugar de partida (Castagnino,
1968).
METODOLOGA
Para el desarrollo de la
investigacin se procedi a
preparar
un
coctel,
cuyo
contenido estaba basado en los
en los clculos realizados con
anterioridad con base en la tabla
de
la
primera
ronda
de
amplificacin,
tengamos
en
cuenta que estos pasos son una
gua prctica para tener claro el
proceso, adicin de la muestra de
ADN: se transfiri los tubos a la
zona estipulada para siembra de
muestras. Se adicion una
cantidad de cada muestra a cada
tubo y se mezcl con pipeta.
Por ltimo paso aqu se adicion
3 uL de control positivo de ADN
al ltimo tubo para preparar el
control positivo de reaccin.
Reaccin de amplificacin se
encendi termociclador y se
acomodaron tubos en el bloque,
revisando que queden tapados.
Correr el programa denominado
gyrB lepto que presenta el perfil
trmico dispuesto en la gua de
laboratorio, el procedimiento
anterior se efectu en la cmara
blanca, la cual se encontraba
libre
de
material
biolgico
relacionado con ADN.

RESULTADOS

C), de ah su nombre comercial

ms conocido: taq polimerasa.
Cuando se hace una reaccin de
PCR, se simula lo que sucede en
una clula cuando se sintetiza el
ADN y en el tubo se mezclan
todos los ingredientes necesarios
para hacerlo: la polimerasa, el
ADN del organismo que se quiere
estudiar (bovino para el caso
experimental,
y
donde
se
encuentra el fragmento que se
quiere
sintetizar),
los
oligonucletidos
(llamados
tambin primers, iniciadores,
cebadores, oligos, entre otros)
necesarios para que se inicie la
transcripcin,
dinucletidos
(dNTPs), y las condiciones para
que
la
enzima
trabaje
adecuadamente
(cierto
pH,
determinadas
cantidades
de
Magnesio en forma de MgCl2,
KCl, y pueden necesitarse otras
sales o reactivos, dependiendo
de cada polimerasa) (Espinosa,
2015). Esta tcnica tan ingeniosa
tiene muchsimas aplicaciones
distintas y se ha convertido en
una herramienta muy importante
en la biologa molecular; sus
aplicaciones van desde la
gentica
de
poblaciones,
evolucin molecular y genmica
hasta la medicina forense
(Espinosa, 2015).

ANLISIS DE RESULTADOS
PCR son las siglas en ingls de
Polymerase Chain Reaction o
reaccin en cadena de la
polimerasa. La idea bsica de la
tcnica es sintetizar muchas
veces un pedazo o fragmento de
ADN utilizando una polimerasa
que
puede
trabajar
a
temperaturas muy elevadas, ya
que proviene de la bacteria
Thermus aquaticus, que vive a
altas temperaturas (de 79 C a 85

Si ya se tienen los tubos listos

con todo lo necesario para que la
sntesis del fragmento de inters
se lleve a cabo (taq polimerasa,
dinucletidos, ADN, agua, buffer
con Magnesio, y otras sales, y
oligonucletidos). El siguiente
paso es colocar los tubos en una
mquina
conocida
como
termociclador, que bsicamente
sirve para calentarlos o enfriarlos
a temperaturas muy precisas.
Para amplificar el (o los)

fragmento (s) que se desean, se

procede as: el termociclador
calienta o enfra los tubos a tres
temperaturas distintas, que se
repiten una y otra vez (lo que se
llama los ciclos de reaccin), la
primera es a 95 C (y a este paso
se le llama desnaturalizacin)
durante la cual las dobles
cadenas del ADN se abren o
desnaturalizan, quedando en
forma de cadenas sencillas;
despus el termociclador ajusta
la temperatura en un intervalo
entre 40 C y 60 C (llamada de
alineamiento), a esta temperatura
se forman y se rompen
constantemente los puentes de
Hidrgeno
entre
los
oligonucletidos
y el ADN, y aquellas uniones ms
estables
(las
que
son
complementarias) durarn mayor
tiempo,
quedando
los
oligonucletidos
alineados,
formando una pequea regin de
doble cadena. La polimerasa se
une a este pequeo pedazo de
ADN de doble cadena y
comienza a copiar en sentido 5 a
3; al agregar unas bases ms,
los puentes de hidrgeno que se
forman
entre
las
bases
estabilizan ms la unin y el
oligonucletido permanece en
este sitio para el siguiente paso.
Despus la temperatura sube a
72 C (paso que se conoce como
extensin), ya que 72 C es la
temperatura en la cual la
polimerasa alcanza su mxima
actividad, y contina la sntesis
de los fragmentos de ADN a
partir de los oligonucletidos que
ya se haban alineado. En el
primer ciclo, con estas tres
temperaturas, se sintetizan los
primeros fragmentos a partir del
ADN genmico (Espinosa, 2015).
Estos primeros fragmentos no

tendrn el tamao esperado,

sern un poco ms grandes, ya
que la taq copiar hasta donde le
sea posible, pero como se puede
identificar posteriormente, se
obtendrn en cantidades tan
pequeas que al final no se
podrn detectar. Despus se
repiten una vez ms las tres
temperaturas, pero en este
segundo
ciclo,
los
oligonucletidos, adems de
unirse al ADN que se puso al
inicio, tambin se unirn a los
fragmentos recin sintetizados
del primer ciclo, por lo tanto, en
este segundo paso la polimerasa
sintetizar dos fragmentos largos
copiados directamente del ADN y
dos fragmentos del tamao
esperado, que es el tamao que
hay
entre
los
dos
oligonucletidos que usados. De
esta forma, con cada ciclo
aumentar
el
nmero
de
fragmentos del tamao que
queremos, tal y como se llev a
cabo experimentalmente, donde
se efectuaron 34 ciclos. Cabe
mencionar que antes y despus
de estos ciclos se programan dos
pasos, uno de 95 C durante
varios minutos para iniciar con
desnaturalizacin, y al final de los
ciclos, un paso ltimo de
extensin a 72 C para permitir
que la taq termine de sintetizar
todos los fragmentos que pueden
haber quedado incompletos. Para
este tipo de PCR es necesario
que uno de los oligonucletidos
tenga la misma secuencia que se
encuentra en una de las cadenas
del ADN, y el otro deber llevar la
secuencia complementaria que
estar al final del fragmento que
se quiere amplificar (por lo cual
se les llama forward y reverse)
para
que
uno
sea
complementario a la cadena que

forma el otro; si no es as no
podra
amplificarse el sitio que se
necesita. Como cada pedazo
sintetizado sirve como base para
sintetizar otros en el siguiente
ciclo, el nmero de copias
aumentar en forma exponencial.
Con una sola molcula de ADN,
en el ciclo 1 se producen 21 = 2
nuevos fragmentos, en el ciclo 2
sern 22, esto es, 4 fragmentos
recin sintetizados, y as, con 35
ciclos de PCR se producirn 21 +
22 + 234 + 235 = 236 nuevos
fragmentos, de los cuales slo 70
sern fragmentos de un tamao
mayor al esperado (2 por cada
ciclo) obtenidos al sintetizarlos
directamente del ADN genmico;
esta pequea cantidad es casi
imposible de detectar al analizar
los productos.
En la prctica, la PCR puede
fallar por varias razones, entre
ellas: la PCR es una tcnica de
gran sensibilidad, es decir,
necesita una mnima cantidad de
ADN para obtener un gran
nmero de copias. Adems,
puede ser muy propensa a
errores si se lleva a cabo en
condiciones inadecuadas de
esterilidad, que conduzcan a la
amplificacin
de
ADN
no
correspondiente a la muestra a
analizar
(y
por
tanto
a
conclusiones inciertas). Se han
de
tomar
una
serie
de
precauciones para evitar la
contaminacin con ADN extrao.
Ejemplos en los que es
especialmente importante evitar
la amplificacin son la deteccin
de enfermedades (para no
diagnosticar errneamente a los
pacientes) o el diagnstico de
identidad y parentesco. Posibles
precauciones son:

Tener especial cuidado

durante los pasos previos
a
la
amplificacin:
recogida, envo, custodia y
procesado de muestras.
Limpieza exhaustiva y
esterilizacin (leja, etanol,
luz UV, psoralenos, entre
otros) de la superficie de
trabajo entre la realizacin
de una PCR y la siguiente.
En
laboratorios
de
diagnstico gentico, se
suelen
tener
reas
separadas de trabajo: un
laboratorio
para
la
preparacin de la mezcla
madre para la PCR, otro
para la adicin del ADN a
amplificar, otro donde se
encuentra la maquinaria
para realizar la PCR y otro
donde se abre y analiza la
muestra ya amplificada.
Cabinas de seguridad
biolgica
para
reducir
vapores
cargados
de
amplicones
de
enfermedades.
Proteccin adecuada de
los
operarios
que
manipulen las muestras y
los
instrumentos
del
laboratorio: guantes, bata,
cubrezapatos, gafas de
seguridad, pelo recogido.
En
el
diagnstico
molecular es conveniente
que se cambien estos
elementos al pasar de una
zona de trabajo a otra.
Controles
positivos
y
negativos.
Tipado de todo el personal
del laboratorio. En el caso
de
encontrar
una

amplificacin no esperada
se podr comprobar si
proviene de uno de los
operarios.
Las tcnicas de diseo de
cebadores son importantes en la
mejora de la obtencin de
productos de PCR y en evitar la
formacin de productos falsos.
Algunas
consideraciones
al
disear estos cebadores son:

Se
recomienda
usar
primers de ms de 15
nucletidos (18-30 nn)
Normalmente, se suelen
disear de 20 nucletidos.
Los cebadores muy cortos
hacen que la PCR no sea
muy especfica, y los que
se excedan en longitud
harn que se pierda
rendimiento en la reaccin.
Los primers no deben
diferir en ms de 3 bases.
La proporcin entre bases
pricas y pirimidnicas de
los dos oligos sea 1:1 (4060% a lo sumo), y que
empiecen y terminen con 1
2 bases pricas.
Se
requiere
una
distribucin homognea de
los cuatro nucletidos en
la secuencia, evitando los
poliT/A/G/C.
La
Tm
(melting
temperature) de los oligos
no puede diferir en ms de
5 C.
Los cebadores no deben
incluir en su secuencia
regiones
que
sean
complementarias entre s,
o se formarn dmeros
entre ellos.

Existe una gran variedad de

polimerasas
disponibles,
pudiendo elegir la que ms se
ajuste a nuestras necesidades.
Por ejemplo, algunas tienen
actividades inexistentes en otras
o las realizan de forma ms
eficiente,
o
funcionan
en
intervalos de temperatura en los
cuales otras se desnaturalizan o
pierden funcionalidad. Las ms
habituales son la taq y la pfu.
Los componentes del tampn de
reaccin debern ajustarse a las
exigencias de nuestras enzimas.
El termociclador, por supuesto,
debe ser capaz de reproducir
correctamente los ciclos de la
PCR: para ello, diversas casas
comerciales
ofrecen
termocicladores elaborados con
materiales que hagan ms
eficaces el desarrollo y el
transcurso de las etapas, adems
de diversas facilidades de
manejo. Dentro del laboratorio,
su manejo, mantenimiento y
ubicacin ser clave.
Existen diversos mtodos para
visualizar el PCR que se realiza,
es poder analizar el o los
fragmentos obtenidos en el PCR,
y la electroforesis, ya sea en
geles de agarosa o de acrilamida,
permite separar estos fragmentos
de acuerdo al tamao de cada
uno. Tanto la agarosa como la
acrilamida forman una especie de
red con agujeros de tamaos
diferentes, por la cual se obliga a
pasar los fragmentos de ADN,
jalndolos a travs de corriente
elctrica, hacia el polo positivo,
ya que la carga de una molcula
de ADN es negativa por la
presencia de grupos fosfato. Los
fragmentos
ms
pequeos

pasarn primero a travs de la

red de agujeros, mientras que los
ms grandes se irn retrasando y
atorando en los hoyos; de esta
manera los fragmentos de
tamaos similares migrarn a
ritmos similares (Quevedo, 1996).
Si hay muchos fragmentos de un
mismo tamao se agruparn
todos juntos, por lo que se
podrn ver formando lo que
llamamos una banda en el gel.
Por el mtodo para geles de
agarosa, es necesario tener en el
laboratorio equipo que permita
trabajar con los geles: una
cmara de electroforesis, una
fuente
de
poder,
un
transiluminador de luz UV y
equipo de fotografa (lo ms
sencillo: una cmara polaroid, un
filtro para luz UV y un cono
adaptado a la cmara, o tambin
existen cmaras especiales y
equipo de cmputo especfico
para ello) para guardar la imagen
del gel. Para empezar hay que
preparar el buffer de corrida, el
cual tendr el pH requerido y los
iones necesarios para que fluya
la corriente y pueda migrar el
ADN. Si en lugar de buffer se
utilizara agua, el ADN se
quedara inmvil y no se vera la
migracin en los geles, y si por el
contrario se utilizara un exceso
de sales, el gel se calentara
tanto que al final acabara por
derretirse. El buffer ms comn
es el TBE (Tris Boratos EDTA),
que por ser muy estable puede
reutilizarse
varias
veces.
Tambin se utiliza con frecuencia
el buffer TAE (Tris Acetatos
EDTA), que es menos estable
que el TBE y tiende a ionizarse
ms rpido, pero permite obtener
mejor separacin de bandas,
sobre todo si son de gran tamao

(1 kb o ms) (Strachan & Read,

1999). Dependiendo del tamao
de los fragmentos que se espera,
se utilizar una concentracin de
agarosa mayor o menor para
obtener agujeros menos o ms
grandes y una mejor resolucin
de bandas. La agarosa se
disuelve en el mismo buffer que
se utiliza para la corrida, y se
calienta hasta ebullicin para
disolver bien el polvo. Hay que
tener cuidado de retirarla del
calor o del microondas en cuanto
comienza a hervir, pues podra
derramarse. Si es un gel muy
importante, en el laboratorio se
pesa el matraz donde se prepara
el gel antes y despus de
calentarlo, y se le agrega el agua
que haya perdido durante el
calentamiento, para asegurar que
la concentracin de agarosa sea
la correcta. La solucin se agitar
suavemente para evitar la
formacin de burbujas, y cuando
se
enfre
un
poco
(aproximadamente a 60 C) se
vierte de una sola vez en el
contenedor de geles al que ya se
le colca el peine para que se
formen los pozos en donde se
cargan las muestras (Strachan &
Read, 1999). Si quedan algunas
burbujas, rpidamente con la
punta de una pipeta se pueden
picarlas y quitarlas; si se dejan
pueden
hacer
que
la
electroforesis no migre en forma
homognea. Cuando se enfre y
solidifique se agrega el buffer
necesario hasta cubrir bien el gel
(se ha visto que de esta forma el
peine se puede quitar ms
fcilmente), y despus se retira el
peine con cuidado para no
romper el fondo de los pozos.
Con una pipeta, cada muestra se
vierte en un pozo, mezclada
previamente con 1 2 microlitros

de
colorante
de
corrida.
Generalmente los colorantes de
corrida llevan alguna sustancia
espesa,
como
Glicerol
o
Sacarosa, que permite que la
muestra caiga hacia el fondo del
pozo, y los colorantes (como el
Xilen-Cianol
o
azul
de
Bromofenol) dan una idea de
como
van
migrando
los
fragmentos (en un gel de agarosa
al 1 %, el azul de Bromofenol
migra junto con los fragmentos
de 300 pb, y el Xilen-Cianol migra
igual que los fragmentos de 4
kb). No es necesario utilizar toda
la muestra de PCR en una
corrida, puede utilizarse del 10 %
al 20 % de la cantidad total del
PCR hecho. En un parafilm se
depositan unas gotitas de
colorante (las necesarias para el
nmero de muestras que se
usen) y despus se agrega la
gota de la muestra a cargar sobre
la gota de colorante. Con cuidado
de no hacer burbujas se mezcla
subiendo y bajando con la pipeta.
La punta de la pipeta se mete un
poco en el pozo y lentamente se
vaca la pipeta para cargar el gel.
Para que las muestras no se
derramen y no se mezclen unas
con otras hay que evitar llenar el
pozo hasta arriba. Tampoco debe
olvidarse poner en el gel los
controles negativo y positivo.
Cuando el gel est listo se
conectan los cables, lo ms
comn es un cable rojo para
conectarlo al polo positivo y uno
negro en el negativo (Strachan &
Read, 1999). El ADN migrar
hacia el polo positivo ya que los
fosfatos de la molcula le
confieren carga negativa, por lo
que hay que asegurarse que la
corrida del gel sea hacia el cable
rojo, o polo positivo.

En conclusin, es importe tener

en cuenta que cuando se valla a
utilizar PCR la secuencia de
oligonucletidos que se usar
como cebador es uno de los
parmetros ms importantes
debido a su alta sensibilidad y a
que puede ser muy susceptible a
contaminarse,
por
eso
es
importante tener un ADN de
control negativo para controlar
esta variable, se deben separar
las reas de las muestras pre
PCR, los productos de la
reaccin
post
PCR,
las
soluciones y esterilizar los
materiales.
El
PCR
es
una
tcnica
aparentemente sencilla y fcil de
hacer. El problema es que no
siempre es as. La reaccin de
PCR es muy sensible a cambios
de
iones,
temperaturas,
contaminantes que pueden estar
en el ADN o en el agua, de un
termociclador a otro puede haber
variaciones
Bibliografa citada
Bartlett J., Stirling D. (2003); A
Short History of the Polymerase
Chain Reaction; Methods Mol.
Biol. 226:3-6; Estados Unidos.
Sambrook J., Russel D. (2001);
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Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring
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Castagnino
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