Rekayasa Genetika

Elisabeth
1306371035

CARA MEMBUAT PRIMER

Primer yaitu suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida) yang
mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA
templat, dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates), buffer PCR, dan enzim DNA
polimerase (Reece 2004: 153). Primer berfungsi sebagai pembatas fragmen DNA
target yang akan diamplifikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH)
pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi DNA. Pemilihan primer
yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak terjadinya reaksi polimerasi antara
gen target dengan primer. Terdapat dua dua jenis primer dalam suatu reaksi
PCR yaitu primer reverse dan forward yang bekerja pada dua untai berbeda
(sense dan antisense) dalam satu DNA (Nicholl 2002: 121).

Langkah umum membuat primer:

1. Mengetahui untai DNA yang akan kita amplifikasi.
2. Membuat dua jenis primer, yaitu primer forward dan reverse.
3. Menentukan primer berdasarkan syarat-syarat membuat primer yang ideal
(dibahas dibawah).
Membuat desain primer menggunakan aplikasi, sbb.

Primer merupakan komponen PCR yang sangat menentukan akurasi sekuen DNA
yang ingin diamplifikasi. Urutan nukleotida primer akan menjadi penentu pada
bagian mana primer akan menempel (anneal) pada genom. Jika urutan
nukleotidanya tidak sesuai dengan kode gen yang kita inginkan, dapat dipastikan
produk PCR yang dihasilkan akan keliru. Oleh sebab itu, sebelum melangkah pada
tahap amplifikasi dengan PCR, primer yang akan digunakan harus dipastikan dahulu
spesifitasnya. Caranya ialah dengan membuat desain primer.

Primer yang digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis, yakni
forward dan reverse. Forward primer bergerak dengan arah 5 > 3 untai DNA
template. Sementara reverse primer bergerak dengan arah 3 > 5 untai DNA
template. Kedua primer ini dapat didesain dengan mengunakan program aplikasi
yang terdiri dari BIOEDIT, GENAMICS EXPRESSION, OLIGOCALCULATOR, dan
FAST PCR. Untuk memahami cara kerjanya, berikut ini contoh langkah mendesain
primer untuk gen selulase pada Bacillus subtilis atau bglC.
1. Menentukan posisi bglC dalam whole genom Bacillus subtilis.
2. Mencari tahu enzim restriksi yang tidak memotong sekuen gen dengan
menggunakan program aplikasi BIOEDIT.
3. Memilih enzim restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan
mempelajari peta sirkuler dan situs pemotongan pET-21b. Restriksi yang
sesuai
dengan
pET-21
ialah NdeI, NheI, BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII,NotI, XhoI, EagI, AvaI,
4. Menentukan posisi forward primer dan reverse primer dengan Genamics
Expresion. Posisi primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon
serta mengarah ke situs pemotongan enzim restriksi.
Keterangan: Data sumber gen selulase diperoleh B.subtilis str. DLG

5. Jika situs pemotongan enzim restriksi di dekat start dan stop kodon sulit
disesuaikan dengan posisi primer, dapat dilakukan mutasi situs pemotongan
pada 2-3 nukleotida. Mutasi 2-3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak
akan mengurangi daya lekat primer terhadap untai DNA asalkan presentase
Guanin (G) dan Sitosin (C) primer cukup tinggi.

6. Mengecek desain primer dengan Primer Calculator (pada Genamics

Expression) dan atau dengan Oligocalculator.
contoh tampilan:

Hasil oligo shelf complimentary untuk reverse primer

7. Mengecek desain primer dengan Fast PCR untuk mengetahui tingkat

spesifitas primer dan ukuran produk PCRnya.

SYARAT MEMBUAT PRIMER YANG IDEAL

Pertimbangan desain yang penting yang diuraikan di bawah ini sebagai kunci untuk
amplifikasi spesifik dengan hasil tinggi.
1. Panjang Primer: Hal ini secara umum diterima bahwa panjang optimal primer
PCR adalah 18-22 mer (basa).
Also keep in mind that most oligonucleotide synthesis reactions are only 98%
efficient. This means that each time a base is added, only 98% of the oligos
will receive the base. This is not often critical with shorter oligos, but as
length increases, so does the probability that a primer will be missing a base.

This is very important in mutagenesis or cloning reactions. Purification by

HPLC or PAGE is recommended in some cases.

2.

Oligonucleotide length

Percent
sequence

with

10 bases

(0.98)10 = 81.7%

20 bases

(0.98)20 = 66.7%

30 bases

(0.98)30 = 54.6%

correct
Primer
Melting

40 bases
(0.98)40 = 44.6%
Temperature: Primer Melting Temperature (Tm) merupakan temperatur
yang diperlukan oleh separuh primer dupleks mengalamai disosiasi/lepas
ikatan. Primer dengan Tm berkisar antara 52-58 oC sangat ideal,
sedangkan Tm diatas 65oC akan mengurangi efektifitas aneling sehingga
proses amplifikasi DNA kurang berjalan baik. Tm ini sangat ditentukan
oleh jumlah basa GC (GC contains).
Tm primer dapat dihitung dengan formula:
a. Tm ( oC) = ((G+C) x4) + ((A+T) x2)).secara kasar (kurang
akurat)
b. Tm( oC) = {H/ S + R ln(C)} - 273.15..secara akurat
3. Primer annealing temperature : The primer annealing temperature (Ta)
merupakan suhu yang diperkirakan primer dapat berikatan dengan
template (DNA) dengan stabil (DNA-DNA hybrid stability). Jika suhu
aneling tinggi akan menyulitkan terjadinya iktan primer dengan DNA
template sehingga akan menghasilkan produk PCR yang rendah (kurang
efisien). Namun jika Ta terlalu rendah akan menyebabkan terjasinya
penempelan primer pada DNA template yang tidak spesifik. Ta dapat
dihitung dengan menggunakan formula di bawah ini:
Ta = 0.3 x Tm(primer) + 0.7 Tm (product) 14.9 Tm(primer) = Tm primer
Tm(product) = Tm produk PCR
4. GC Content : Jumlah Basa G dan C (GC content) di dalam primer yang
ideal sekitar 40-60%.
The GC content of a primer is the percentage of nucleotides that are either
a G or C nucleotides. G-C base pairs have 3 hydrogen bonds rather than
just 2 like A-T base pairs. Thus, in comparing two primers with equal
length, the one with the higher GC content will have a higher melting
temperature.
5. GC Clamp : Jumlah basa G dan C yang terdapat pada 5 basa terakhir (3)
disebut dengan GC clamp. GC clamp yang baik sekitar 3 basa G/C dan
tidan melebihi 5 basa G/C. keberadaan G/C di ujung 3 primer sangat
membantu terjadinya stabilitas iktan antara primer dengan DNA template
yang diperlukan untuk inisiasi polymerase DNA (proses PCR). Meletakkan

3 atau lebihCs atau Gs pada ujung 3 primer akan memicu mispriming. Hal
ini harus dihindari.
6. Primer Secondary Structures : i) Hairpins : terbentuknya struktur
loop/hairpin pada primer sebaiknya dihindari, namun sangat sulit untuk
memperoleh primer tanpa memiliki struktur hairpin. Hairpin pada ujung 3'
dengan G (energy yang dipelukan untuk memecah struktur hairpin) = -2
kcal/mol dan hairpin internal dengan G = -3 kcal/mol masih dapat
ditoleransi. ii) Self Dimer : primer dapat beriktan dengan primer lainnya
yang sejenis disebut dengan self-dimer . Self-dimer pada ujung 3' dengan
G = -5 kcal/mol dan self- dimer pada bagian internal dengan G= -6
kcal/mol masih dapat ditoleransi. iii) Cross Dimer : Primer dapat beriktan
dengan primer pasangannya (reverse dan forward) sehingga disebut cross
dimmers. Cross dimmer re homologous. Optimally a 3' end cross dimer
with a G of - 5 kcal/mol and an internal cross dimer pada ujung 3' dengan
G = -5 kcal/mol dan self- dimer pada bagian internal dengan G= -6
kcal/mol masih dapat ditoleransi.
7. Repeats : primer sebaiknya tidak memiliki urutan pengulangan dari 2 basa
dan maksimum pengulangan 2 basa sebanyak 4 kali masih dapat di
toleransi. Misalnya ATATATAT.
8. Runs : Primers sebaiknya tidak memiliki urutan basa yang di ulang terus
menerus. Pengulangan basa berurutan sampai 4 kali masih dapat di
toleransi. Misalnya AGCGGGGGATGGGG memiliki urutan basa G diulang
5 kali berturut-turut.
9. Avoid Cross homology : untuk meghindari cross homologi dapat dilakukan
dengan cara menganalisis homologi primer dengan DNA genome melalui
BLAST-NCBI.
10. Amplicon Length : Panjang PCR produk yang ideal berkisar antara 100500 basang basa.
11. Optimum Annealing temperature (Ta Opt): Suhu annealing optimum
sangat mempengaruhi hasil pcr. TaOpt ini dapat dihitung dengan cara Ta
Opt = 0.3 x(Tm of primer) + 0.7 x(Tm of product) - 25 5. Primer Pair Tm
12. Mismatch: Perbedaan Tm sepasang primer sebaiknya tidak lebih dari 5 o
C.

MENGHITUNG MELTING POINT SUATU PRIMER

The melting temperature of a primer, abbreviate T m is defined as the temperature at
which 50% of that same DNA molecule species form a stable double helix and the
other 50% have been separated to single strand molecules. The melting temperature
depends on both primer length and sequence. A good rule of thumb for calculating
melting temperatures is 4C*(# G/C nucleotides) + 2C*(# A/T nucleotides). [This is
the rule used to calculate melting temperature in the primer catalog tables. However,
to more accurately calculate melting temperature, you can also use one of
several online tools. For PCR and sequencing applications, primers should have a

melting temperature of 55-65C, which generally corresponds to a primer 20-25

nucleotides in length with about 40% GC content.
The melting temperature can also be known as the annealing temperature in
reference to the temperature at which primers start to bind template DNA during
PCR.

The main factors affecting Tm are salt concentration, strand concentration, and the
presence of denaturants (such as formamide or DMSO). Other effects such as
sequence, length, and hybridization conditions can be important as well.
Equations
The simplest equation for Td is the Wallace rule2:
(1) Td = 2C(A+T) + 4C(G+C)
Td is a filter-based calculation where A, G, C, and T are the number of occurrences of
each nucleotide. This equation was developed for short DNA oligos of 14-20 base
pairs hybridizing to membrane bound DNA targets in 0.9M NaCl.
The melting temperature for the sequence TGCTCA is, 2(1+2) + 4(1+2) = 18C. The
nature of the immobilized target strand provides a net decrease in the T m observed
when both target and probe are free in solution. The magnitude of the decrease is
approximately 7-8C.
Another familiar equation3 for DNA which is valid for oligos longer than 50
nucleotides from pH 5 to 9 is:
(2) Tm = 81.5 + 16.6 log M + 41(XG+XC) - 500/L - 0.62F
Where M is the molar concentration of monovalent cations, XG and XC are the mole
fractions of G and C in the oligo, L is the length of the shortest strand in the duplex,
and F is the molar concentration of formamide.
This is a far more useful equation to most researchers, as it includes adjustments for
salt (although the equation is < when M=0) and formamide , the two most common
agents for changing hybridization temperatures.
Thus, at M = 0.9, and F = 0, Tm = 81.5+16.6(log(0.9))+41(.17+.33)-500/60.62(0)=17.9 C. Similar equations apply for RNA
Definitions
Tm - The temperature at which 50% of the oligonucleotide and its perfect complement
are in duplex.
Td - The temperature at a particular salt concentration, and total strand concentration
at which 50% of an oligo and its perfect filter-bound complement are in duplex.

Theoretical
Several studies have derived accurate equations for T m using thermodynamic basis
sets for nearest neighbor interactions.5The equation for DNA and RNA is:

Where H (Kcal/mol) is the sum of the nearest neighbor enthalpy changes for
hybrids, A is a small, but important constant containing corrections for helix initiation,
S (eu) is the sum of the nearest neighbor entropy changes, R is the Gas Constant
(1.987 cal deg-1 mol-1) and Ct is the total molar concentration of strands. If the strand
is self complementary, Ct /4 is replaced by Ct.
H and S values for nearest neighbor interactions of DNA and RNA are shown in
Table 1. Please note that this equation includes a factor to adjust for salt
concentration.
For example, our sample sequence would result in the following expression
assuming 200 nM strand concentration at 900 mM NaCl:
1000*(-5.8-11.1-7.8-5.6-5.8)
---------------------------------------------------------- 273.15 +
16.6log(0.9)
[(-10.8)+(-12.9-26.7-20.8-13.5-12.9)+(1.987)ln[(2.0E -7)/4]]
Therefore: Tm = 1.725C
Notice the considerable difference between the results of equations (1) and (3) in
this case. This shows how much of an effect sequence can have on the Tm.
Comparisons
So which value do we use? Remember that Equation 1 was derived for 14-20mers
used in membrane hybridizations and may be expected to have a limited range of
applicability - an important point, as this equation is used by almost all researchers
for oligos used for PCR as well as blots. Equation 3 is certainly more appropriate in
this case. On the other hand, Equation 3 becomes inappropriate for oligos longer
than a 50-mer. For long oligos, equation 2 is probably the best choice. The best
equation for a particular researcher will depend on the oligo and the type of
experiment involved.
Solution based amplification strategies can use the Wallace rule for convenience, but
one should add 8 C to the result to convert T d to Tm. Accuracy will also be
compromised if the salt concentration varies much from 0.9 M. Researchers doing
Southern, Northern or other filter hybridizations can use equation (1) as is. As with
any theoretical approach, the results of these equations should be used with caution.
Many experiments involve reagents or conditions that invalidate the results of these
equations. Sometimes only an empirical approach provides a satisfactory answer.

For instance, in situ hybridizations provide sufficiently different environments from

case to case that anomalous results may occur.
Counter ion identity, solvation effects, conjugated groups (biotin, digoxigenin, alkaline
phosphatase, fluorescent dyes, etc.), and impurities may also affect the T m. In these
cases, theoretical equations are inaccurate, but still provide a useful estimate to
begin development.
ANOTHER BASIC MELTING TEMPERATURE (TM) CALCULATIONS
The two standard approximation calculations are used. For sequences less than 14
nucleotides the formula is
Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4
For sequences longer than 13 nucleotides, the equation used is
Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC)
ASSUMPTIONS:
Both equations assume that the annealing occurs under the standard conditions of
50 nM primer, 50 mM Na+, and pH 7.0.
Salt Adjusted Melting Temperature (Tm) Calculations
A variation on two standard approximation calculations are used. For sequences less
than 14 nucleotides the same formula as the basic calculation is use, with a salt
concentration adjustment
Tm= (wA+xT)*2 + (yG+zC)*4 - 16.6*log10(0.050) + 16.6*log10([Na+])
where w,x,y,z are the number of the bases A,T,G,C in the sequence, respectively.

The term 16.6*log10([Na+]) adjusts the Tm for changes in the salt concentration, and
the term log10(0.050) adjusts for the salt adjustment at 50 mM Na+. Other
monovalent and divalent salts will have an effect on the Tm of the oligonucleotide,
but sodium ions are much more effective at forming salt bridges between DNA
strands and therefore have the greatest effect in stabilizing double-stranded DNA,
although trace amounts of divalent cations have significant and often overlooked
affects
For sequences longer than 13 nucleotides, the equation used is
Tm= 100.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (820/(wA+xT+yG+zC)) +
16.6*log10([Na+])
This equation is accurate for sequences in the 18-25mer ra
OligoCalc uses the above equation for all sequences longer than 13 nucleotides.

The following equation is provided only for your reference. It is not actually used by
OligoCalc. It is reportedly more accurate for longer sequences.
Tm= 81.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (500/(wA+xT+yG+zC)) +
16.6*log10([Na+]) - 0.62F
This equation is most accurate for sequences longer than 50 nucleotides. It is valid
for oligos longer than 50 nucleotides from pH 5 to 9. Symbols and salt adjustment
term as above, with the term (41 * (yG + zC-16.4)/(wA + xT + yG + zC)) adjusting for
G/C content and the term (500/(wA + xT + yG + zC)) adjusting for the length of the
sequence, and F is the percent concentration of formamide.

REFERENSI
http://science.lecture.ub.ac.id/files/2012/04/design-primer.pdf
https://bioweb.uwlax.edu/GenWeb/Molecular/seq_anal/primer_design/primer_design
.htm
http://oomyceteworld.net/protocols/primer%20designing2.pdf
http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/articles/biology/oligos-meltingtemp.html
http://www.entelechon.com/2008/08/dna-melting-temperature/
http://parts.igem.org/Help:Primers/Glossary
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html