Anexo 2.

Evaluacin del intervalo de respuesta lineal, de la linealidad y de la

sensibilidad de los mtodos titulomtricos
La linealidad es la capacidad del mtodo para proporcionar resultados que son
directamente proporcionales a la concentracin del analito en la muestra dentro de un
rango establecido.
El rango se define como el intervalo entre la concentracin superior e inferior de analito
para el cual se ha demostrado la correcta precisin, exactitud y linealidad del mtodo
descrito.
Con los resultados del estudio de la linealidad se prepara una tabla relacionando las
cantidades o concentraciones x (variable independiente o predictiva) y la respuesta y
(variable dependiente). La relacin entre ambas variables se expresa matemticamente
como una recta de regresin de tipo y= b*x + a, obtenida por un mtodo de ajuste (por lo
general el de mnimos cuadrados). En algunos casos podra ser necesaria alguna
transformacin matemtica previa (uso de logaritmos, recprocos de las variables, etc.)
para obtener funcionales lineales.
La representacin grfica de la recta de regresin en un sistema de coordenadas junto
con los valores experimentales, permite visualizar la bondad del ajuste. Si la recta no pasa
cerca del origen de coordenadas significa que el mtodo a evaluar est afectado por un
error sistemtico por defecto o por exceso en el intervalo estudiado. Si existen diferencias
apreciables entre los valores experimentales y los puntos de la recta significa que la
linealidad no es buena (existe falta de ajuste) o bien que el error experimentalmente es
importante y los intervalos de confianza sern amplios (hiprbolas anchas).
Evaluacin estadstica de la linealidad:
El estudio de la linealidad no slo implica una representacin grfica sino que es
necesario realizar una comprobacin estadstica. Para realizar sta evaluacin las
frmulas que se pueden aplicar son las siguientes:
v Ecuacin de la recta: En la recta de regresin , es la concentracin,
la respuesta, el valor de la pendiente y, el trmino independiente.
La pendiente se encuentra relacionada con la sensibilidad del mtodo de forma
que a mayor pendiente, mayor sensibilidad (respuesta del mtodo frente a los
cambios de la concentracin del analito). El trmino independiente , u ordenada
en el origen, es la intercepcin de la recta con el eje de ordenadas y es indicativo
del error sistemtico, no difiriendo estadsticamente de cero en caso de no tener
sesgo.
v Intercepto:

v Pendiente:

118

v Coeficiente de correlacin: El coeficiente de correlacin indica el grado de

relacin entre la variable ( concentracin), y la variable ( respuesta). Su valor
mximo es 1,00. Si es cercano a la unidad significa que existe correlacin
con una probabilidad elevada. Un valor nulo indica ausencia de relacin lineal
entre las variables.
El valor recomendable es 0,999, aunque en el caso de impurezas se admite
el 0,990.

v Coeficiente de determinacin: El coeficiente de determinacin es el que aporta

una mayor significacin estadstica ya que expresa la proporcin de la
variacin total de explicada por el modelo.

v Clculo de la varianza residual: La representacin de los residuales aporta

mucha informacin acerca de la validez del modelo.

v Clculo de la varianza de la pendiente:

v Clculo de la varianza del intercepto:

Anlisis de la varianza: ANOVA

Para poder realizar un ANOVA se deben cumplir los siguientes supuestos:

119

v Homogeneidad de varianzas: Se puede comprobar aplicando, por ejemplo, un

test de Cochran que indicar si el factor concentracin tiene alguna influencia
en la variabilidad de los resultados. Estadsticamente sera ms correcto
normalizar previamente las respuestas, ya que de lo contrario se comparan
coeficientes de variacin que corresponden a medias de concentracin
diferentes entre s. De todas formas es habitual efectuar el test sin cumplir este
requisito cuando el intervalo de concentraciones no es excesivamente amplio.
El valor de Gexp se calcula de la siguiente forma:

Donde:
= Varianza mxima de los grupos.
Varianza de cada grupo.

Las varianzas no deben ser estadsticamente diferentes entre s para el grado

de significacin escogido, generalmente =0,05.
En caso de que la homogeneidad no se cumpla, caben dos posibilidades:
-

Si se debe a la mayor variabilidad de uno de los extremos del rango, ste

se puede acortar siempre y cuando los mrgenes de especificaciones lo
permitan.
Puede plantearse el anlisis a otro nivel de concentraciones que favorezca
una menor variabilidad.

v Normalidad de los residuales: Se puede comprobar mediante la representacin

grfica que algunos programas estadsticos realizan de los mismos o bien
aplicando un test de normalidad.
Una vez estos supuestos, se calcularn los estadsticos F1 y F2 como se indic
del ANOVA.
F1exp > F1tablas Demuestra la existencia de una pendiente distinta de 0
Los valores tabulados para F se obtienen de las tablas estadsticas de acuerdo
a los grados de libertad correspondientes y a un grado de significacin
normalmente igual a 0,05.

120

Fuentes de
variacin
Regresin

Suma de cuadrados

Grados
de
libertad

Cuadrados
medios

Error

n-2

Total

n-1

Test de linealidad:
Existen varios procedimientos para verificar la linealidad:
v Coeficientes de variacin de los factores de respuesta (): El factor de
respuesta () expresa la relacin entre la lectura o la respuesta (volumen) y la
concentracin y puede tomarse como una expresin aproximada de la
sensibilidad de calibrado. En una calibracin lineal los factores de respuesta
deben ser semejantes entre s y cercanos al valor de la pendiente. Valores del
coeficiente de variacin superior al 5% seran indicativos de una posible falta
de linealidad, siendo recomendables valores no superiores al 2%.



Donde:
Desviacin de los factores de respuesta.
Valor medio de los factores de respuesta.

v Significacin estadstica de la desviacin estndar de la pendiente: Se trata de

comprobar que existe una pendiente significativamente distinta de cero
mediante una prueba t de Student.

 

La pendiente tiene que ser estadsticamente distinta de cero para un grado de

significacin igual a 0,05.
Tambin es habitual calcular los intervalos de confianza a partir de la expresin
, siendo en este caso el valor de la distribucin de Student para n-2
grados de libertad y un grado de significacin igual a 0,05.
Estos intervalos de confianza no deberan incluir el cero.
121

 Test de proporcionalidad:
El test de proporcionalidad permite evaluar si la recta pasa por el origen de
coordenadas determinando si la variable independiente es significativamente
distinta de cero.
Para llevar a cabo este test se recurre como en el caso anterior a una prueba de
significacin de Student (n-2 grados de libertad, =0,05).

La ordenada en el origen tiene que ser estadsticamente igual a cero para el grado
de significacin escogido.

En los intervalos de confianza ( ) debe estar incluido el cero.

122

Anexo 3. Evaluacin del intervalo de respuesta lineal, de la linealidad y de la

sensibilidad de los mtodos titulomtricos
La precisin expresa el grado de concordancia (grado de dispersin) entre una serie de
medidas de tomas mltiples a partir de una misma muestra homognea.
El objetivo del estudio de la precisin es conocer la variabilidad del mtodo de ensayo.
Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo mtodo de ensayo.
Como consecuencia de la existencia de estos errores, los anlisis efectuados sobre
muestras idnticas, en las mismas circunstancias, no conducen generalmente a
resultados idnticos. Los factores susceptibles a influir sobre los resultados de un ensayo
no pueden ser siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, tiempo, etc.)
de aqu la importancia del estudio de la precisin.
La precisin engloba diferentes tipos de estudios.

Precisin

Repetibilidad

Repetibilidad
instrumental

Precisin
intermedia

Reproducibilidad

Repetibilidad del
mtodo

v Repetibilidad: Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de

anlisis sobre la muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo
analista con los mismos aparatos y reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y
en un periodo de tiempo corto.
La repetibilidad se expresa matemticamente por el coeficiente de variacin de
una serie de medidas.
123

Uno de los factores que ms pueden influir en la repetibilidad del mtodo de

anlisis es la concentracin del analito, ya que la desviacin estndar de las
respuestas obtenidas aumenta al disminuir la concentracin del analito. Por
ejemplo, cuando se trabaja a concentraciones altas se aceptan valores de
coeficientes de variacin ms bajos que cuando se trabaja a concentraciones
ms bajas.
La estimacin de la repetibilidad del instrumento se realiza con el clculo del
coeficiente de variacin de las respuestas obtenidas.
Por otro lado, la estimacin de la repetibilidad del mtodo se realiza con el
clculo del coeficiente de variacin de las respuestas obtenidas y con los
intervalos de confianza a cada nivel de concentracin estudiado. Los intervalos
de confianza se calculan a partir de:




Donde:
Media de una serie de resultados obtenidos en un mismo nivel de
concentracin.
Valor de la t de Student de tablas para n-1 grados de libertad y =0,05.
Nmero de anlisis.
Desviacin estndar.

v Precisin intermedia: Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie

de anlisis sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes
(diferentes analistas, aparatos, das, etc.) y en un mismo laboratorio.
En el estudio de la precisin intermedia se deben considerar aquellas
circunstancias en las que se pretende desarrollar el mtodo de ensayo. El
analista debe evaluar los efectos causados al variar una serie de factores.
Tpicos factores a estudiar incluyen el da, el analista, el instrumento, etc. No
es necesario estudiar cada uno de estos factores individualmente sino que es
suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el conjunto de factores
est dentro de los lmites establecidos.
La estimacin de la precisin intermedia se realiza con el clculo del
coeficiente de variacin global de las respuestas obtenidas, es decir,
considerando cada resultado independientemente.
v Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del mtodo bajo condiciones
operativas diferentes y en distintos laboratorios.

Estas condiciones operativas y ambientales diferentes pueden ser:

Humedad y temperatura ambiental diferente.
124

Analistas con diferente experiencia.

Instrumentos de caractersticas diferentes.
Variaciones de condiciones instrumentales.
Equipos de diferente antigedad.
Disolventes y reactivos de diferente calidad.

En resumen, la precisin de un mtodo analtico se expresa generalmente como el

coeficiente de variacin ( )de una serie de medidas y se calcula matemticamente de la
siguiente manera:

Donde:

Desviacin estndar.

Media aritmtica de los resultados.

125

Anexo 4. Evaluacin de la exactitud de los mtodos titulomtricos

La exactitud de un procedimiento analtico expresa la proximidad entre el valor que es
aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor
experimental encontrado.
No deben confundirse exactitud y precisin. La precisin est relacionada con la
dispersin de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicacin de lo cerca que
est el valor verdadero. Se pueden tener mediciones muy precisas, pero poco exactas;
sin embargo, para que un mtodo sea exacto se requiere un cierto grado de precisin.
La exactitud debe demostrarse en todo el rango especificado para el mtodo analtico. Se
recomiendan un mnimo de 9 determinaciones sobre 3 niveles de concentracin del
analito que cubran el rango especificado, por ejemplo 3 determinaciones en cada uno de
los 3 niveles de concentracin, que podran ser la concentracin central y las
concentraciones en los extremos del rango.
La exactitud se expresar como porcentaje de recuperacin en la valoracin de una
cantidad conocida de analito aadida sobre la muestra.

Teniendo en cuenta que:

Por tanto,

Donde:

Valor experimental.

Valor terico.

= Volumen muestra real.

= Concentracin muestra real.

= Volumen patrn.

= Concentracin patrn.

= Volumen final de la solucin.

= Concentracin final que equivale al valor terico.

126

 Mtodo de adicin de patrn:

Se aaden sobre una o varias muestras cantidades conocidas de un analito
patrn a 3 niveles de concentracin dentro del rango a estudiar. Se realizan como
mnimo 3 rplicas para cada nivel y se analizan las muestras adicionadas y no
adicionadas segn el mtodo analtico calculando finalmente la recuperacin.
Para confirmar que la recuperacin ha sido satisfactoria se aplica un test de t, el
cual es:

Donde:



Media aritmtica de los porcentajes de recuperacin.

Nmero de muestras.
Coeficiente de variacin de la precisin intermedia.
No siempre se obtienen valores de recuperacin cercanos al 100%, ya que sta depende
de la matriz de la muestra, de la efectividad del mtodo de preparacin y extraccin y de
la concentracin del analito.
La desviacin de la exactitud por exceso se produce cuando existen interferencias y la
selectividad del mtodo no es la adecuada, entonces se obtienen resultados superiores al
valor verdadero. En este caso, si es posible, se deberan modificar las condiciones del
mtodo para optimizar la selectividad o bien cambiar a otro alternativo que sea selectivo.
La desviacin de la exactitud por defecto suele producirse cuando la matriz de la muestra
es compleja y la extraccin del analito requiere varios pasos obtenindose recuperaciones
ms bajas.

127

Anexo 5. Evaluacin de los lmites de deteccin y cuantificacin de los mtodos

titulomtricos
Se entiende por lmite de cuantificacin (LC) de un mtodo analtico, la mnima cantidad
de analito presente en la muestra que se puede cuantificar bajo las condiciones
experimentales descritas, con adecuada precisin y exactitud; y por lmite de deteccin
(LD) la mnima cantidad de analito en la muestra que se puede detectar aunque no
necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones experimentales.
El lmite de cuantificacin es por tanto un trmino cuantitativo mientras que el lmite de
deteccin es slo cualitativo.
No deben confundirse estos trmiinos con otro al que normalmente se asocian, la
sensibilidad, puesto que sta es la capacidad de un mtodo de anlisis para discriminar
pequeas diferencias en concentracin o masa del analito. En trminos prcticos, la
sensibilidad es la pendiente de la curva de calibracin obtenida al representar la
respuesta frente a la concentracin. Por tanto:

Donde:

Concentracin de analito en el lmite de cuantificacin o deteccin.

Promedio correspondiente a la seal del blanco.

 Desviacin estndar correspondiente a la seal del blanco.

Constante que usualmente se considera igual a 10 para el LC e igual a 3 para el LD.

Por otra parte, el lmite de cuantificacin corresponde a la cantidad o concentracin de

analito que proporciona una seal que es diez veces, es decir, la desviacin
estndar del blanco. Es as como los LD y LC de cada uno de los mtodos desarrollados
se determinan involucrando todos los factores que afectan la medida, y se calculan en
unidades de concentracin.



Donde:
Desviacin estndar correspondiente a la seal del blanco.

Pendiente

de

la

curva

de

128

calibracin

de

cada

mtodo.