FACULTAD DE QUMICA

EDUCACIN CONTINUA
DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA

DIPLOMADO DEL REA DE FARMACIA

Bioqumica y Biologa Molecular para la Industria

Farmacutica y Biotecnolgica

Laura Carmona Salazar

Este material es exclusivamente para uso educativo y no de lucro

MDULO II. Mtodos de Purificacin

y Anlisis de Protenas

Objetivos.

Revisar los fundamentos en los que se basan los
distintos mtodos de purificacin de protenas y
cmo la combinacin de stos permite el
enriquecimiento sustancial de una protena a partir
de una fuente natural o un organismo que la sobre
expresa.

Revisar los fundamentos de los distintos mtodos
de anlisis de protenas que permiten la
caracterizacin fisicoqumica y biolgica de
protenas que son empleadas como frmacos.

Revisar la fisiologa y aplicaciones de algunos
productos biotecnolgicos en la terapia.

ORGANIZACIN DEL MDULO

TEMATICA

PONENTES

PURIFICACIN

LAURA CARMONA SALAZAR

NATLLELY GARCA CARREO
LUIS T. SNCHEZ LINARES

ANLISIS

NATLLELY GARCA CARREO

SOBEIDA SNCHEZ NIETO
LEN P. MARTINEZ CASTILLA
ROGELIO RODRIGUEZ SOTRES
ANGEL G. DAZ SNCHEZ
VICTOR ZALDIVAR MACHORRO

EJEMPLOS

LAURA CARMONA SALAZAR

NATLLELY GARCA CARREO

PURIFICACIN DE PROTENAS
Lisis celular y extraccin de protenas
Precipitacin diferencial de protenas por
salado, pH y temperatura

PARA LA DETERMINACIN DE LA COMPOSICIN,

ESTRUCTURA Y FUNCIN YA SEA DE UN TIPO
CELULAR, ORGANELO, BIOMOLCULA

SE REQUIERE PURIFICARSE
PARA SU ESTUDIO

REQUERIMIENTO BSICO PARA EL ESTUDIO

ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE UNA PROTENA

PURIFICACIN

CONSIDERACIONES BSICAS PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

1. Conocer las caractersticas propias de la protena:

carga, tamao, solubilidad, localizacin celular,
funcin
2. La cantidad, es decir la abundancia celular
3. Costos

CARACTERSTICAS ESTRUCTURALES COMUNES DE LOS AMINOCIDOS

Grupo carboxilo

Grupo
amino
Carbono

EL VALOR DE pK NOS AYUDA A SABER EL ESTADO DE PROTONACIN Y

LA CARGA DE UN GRUPO QUMICO A CIERTO pH. Disociacin del grupo R de
un aminocido

Forma que predomina

abajo del pKR

Aspartato

Glutamato

Histidina

Cistena

CH2

3.9

COOH

COO-

CH2

CH2

CH2

C
H2

NH

8.4

SH

CH2

CH2

NH3

CH2

CH2

CH2 NH

C
NH2

H+

H+

H+

H+

H+

H+

H+

NH

CH2S-

10.5

CH2

6.0

OH

CH2

COO-

CH2 CH2

H
+
N

C
H2

CH2

COOH

+
NH2
Arginina

Forma que predomina

por arriba del pKR

4.1

Tirosina

Lisina

pKR

10.5

O-

CH2

CH2

CH2

CH2

NH3

NH
12.5

CH2

CH2

CH2 NH

C
NH2

EL AMINO, CARBOXILO Y LOS RESIDUOS DE AMINOCIDOS CON CADENAS LATERALES

CON CARGA CONTRIBUYEN EN LA DETERMINACIN DE LA CARGA TOTAL DE LA PROTENA

RESIDUO

CONSIDERACIONES GENERALES PARA LA PURIFICACIN

DE UNA PROTENA
1. Definir los objetivos de la purificacin: grado de pureza, cantidad y nivel de
actividad requeridos
2. Seleccionar el material biolgico de inicio: Depender de la localizacin de la
protena tanto en tejidos como en compartimentos subcelulares
3. Desarrollar una tcnica de anlisis: Para la determinacin de la pureza, actividad o
contenido total de protena.
4. Minimizar la manipulacin de la muestra
5. Remover desde el inicio posibles contaminantes: por ejemplo proteasas
6. Reducir el uso de aditivos
7. Apoyarse en el uso de tcnicas diferentes en cada paso: Para ello se debe
considerar las propiedades fisicoqumicas de la protena.
8. Minimizar el nmero de pasos.

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

I. Ruptura o lisis celular

II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad

CRITERIOS PARA LA SELECCIN DE LA FUENTE PROTEICA

Varias pueden ser las fuentes biolgicas

Facilidad para la obtencin de la biomasa

La cantidad de la protena en el tejido o clula

Estabilidad

MATERIAL BIOLGICO

MATERIAL

SISTEMA
Animal

Vegetal

QU ES EL MATERIAL BIOLGICO?
QU ES EL SISTEMA BIOLGICO?

LOS SERES VIVOS SE CLASIFICAN EN TRES DOMINIOS

CARACTERSTICAS COMUNES DE LAS CLULAS BACTERIANAS

Envoltura celular

LAS CLULAS EUCARIONTES POSEEN DIVERSOS ORGANELOS

MEMBRANOSOS

LAS CLULAS PROCARITICAS Y EUCARITICAS EXHIBEN DIFERENCIAS

EN SU MORFOLOGA Y FUNCIN
PROCARIONTES

EUCARIONTES

Aproximadamente 1 m
5-100 m
El material gentico no se Material gentico en el
localiza en el ncleo
ncleo
Carece de organelos

Organelos determinados
por membranas y tienen
funciones especficas:
Mitocondrias
Retculo endoplasmtico
Complejo de Golgi
Lisosomas
Vacuolas

I. RUPTURA O LISIS CELULAR

AISLAMIENTO CELULAR

MATERIAL
BIOLGICO

AISLAMIENTO SUBCELULAR

I. RUPTURA O LISIS CELULAR

FRACCIONAMIENTO SUBCELULAR

1) LISADO

2) SEPARACIN

ASPECTOS BSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O

RUPTURA CELULAR
Homogenizacin
Mecnica
No Mecnica

ASPECTOS BSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O

RUPTURA CELULAR
Medio homogenizacin
Na+

Cl-

-Na+
Cl
Na+
+
Na
Cl
Cl-

H+
H+ H+
H+ H+

H+

EDTA

TRIZMA
Fosfatos
Mg2+
Inhibidores
de
proteasas

DTT,
-mercaptoetanol

ASPECTOS BSICOS A CONSIDERAR DURANTE LA LISIS O

RUPTURA CELULAR

Medio homogenizacin
Ruptura celular
Medio de resuspensin
Mantenimiento de integridad
de organelos

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

I. Ruptura o lisis celular

II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad

FRACCIONAMIENTO
SUBCELULAR
1.Homogenizacin
(medio isotnico)
2. La separacin
por tamao
Fundamento de la centrifugacin
diferencial:
Se basa en las propiedades de tamao,
forma y densidad de las partculas para
la separacin, donde el efecto de la
gravedad es diferente para cada
molcula.

Centrifugacin Diferencial

S
E
P
A
R
A
C
I

P
R
O
P
I
E
D
A
D
E
S

S
I
C
A
S

Fracciones parcialmente enriquecidas

Velocidad de sedimentacin (s)

Peso
Tamao
Forma

SEPARACIN POR GRADIENTES

DE DENSIDAD
1) Centrifugacin isopcnica
Requiere de un gradiente de
sacarosa y en la parte superior
se adiciona una mezcla de organelos,
los cuales se van a ir separando
acorde a su densidad

MEDIOS DE DENSIDAD DISPONIBLES PARA LA

SEPARACIN DE LOS SISTEMAS BIOLGICOS
ALCOHOLES POLIHIDRATADOS: Son gradientes no inicos, inertes, estables y de bajo costo
Sacarosa, Sorbitol, Glicerol, Polietilenglicol PEG
POLISACRIDOS: Tienen una fuerza osmtica elevada
Ficoll (Sacarosa polimerizada con epiclorohidrina), Dextrn
MEDIOS DE SILICA COLOIDAL: No son soluciones, son suspensiones de partculas de silica
cubierta de polivinilpirrolidona PVP (15 a 30 nm de dimetro). Presentan una
fuerza osmtica baja y cambia poco con cambios en la densidad.
Percoll
GRADIENTES DE DENSIDAD MEDIA QUE CONTIENEN YODO Y SON NO-INICOS
Basados en el cido triyodobenzoico, tiene un grupo hidroflico que favorece
la solubilizacin.
Nycodenz, Optiprep
SALES INORGNICAS: Son gradientes inicos de sales de metales pesados usados para
separaciones de cidos nucleicos en gradientes isopcnicos

Centrifugacin en gradiente de densidad

De: Organelles and membranes of animal cells, Biological membranes,

W. H. Evans

PUREZA
Marcadores: Actividades, caractersticas
morfolgicas o reactividad especfica
a un tipo membranal

Para qu?
Distribucin
Recuperacin
Enriquecimiento
Contaminacin

VISUALIZACIN DE LA PURIFICACIN
A TRAVS DE LA TABLA DE RECUPERACIN

DETERMINACIN DE LA CANTIDAD RECUPERADA.

CUANTIFICACIN DE LA PROTENA
Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas donde cada uno se
basa en alguna propiedad especfica de las protenas, lo cual puede tener ventajas y
desventajas.
Cuantificacin por medicin de absorbencia a 280 nm: depende de
la presencia de residuos aromticos tirosina y triptfano. Tiene la desventaja de
que otros componentes no proteicos pueden absorber en el UV.

Ensayo de Biuret: Las protenas reducen los iones cprico (Cu3+) en

iones cuproso (Cu1+) el cual reacciona con los enlaces peptdicos y
da una coloracin azul. Ventajas no interfiere el PEG y desventaja a pH
alcalinos hay interferencia

Ensayo de Lowry: Es una extensin del ensayo de Biuret, donde los iones
cuprosos reaccionan con el reactivo Folin-Ciocalteu formando un complejo de
fosfato-tungnsteno-molibdato que da un color azul intenso. Ventaja es ms sensible
y requiere una menor cantidad de protena, pero es ms sensible a la interferencia

DETERMINACIN DE LA CANTIDAD RECUPERADA.

CUANTIFICACIN DE LA PROTENA
Existen diversos mtodos para la cuantificacin de las protenas donde cada uno se
basa en alguna propiedad especfica de las protenas, lo cual puede tener ventajas y
desventajas.

Ensayo de Bradford: Es el ms ampliamente utilizado, es sensible, sencillo, rpido

y resistente a la interferencia, se basa en el colorante azul de Coomassie G-250 en
una solucin cida, conforme reacciona con las protenas se torna caf-rojizo.
Desventaja es que reacciona con las celdas de lectura para el espectroscopio.
CURVA PATRN

ENZIMTICOS: Actividad especfica asociada a un organelo

particular

RE: NADPH-citocromo c reductasa

MIT:,Cit c oxidasa,
ATPasa sensible a NaN3
GOLGI: GSI
TONOPLASTO: ATPasa sensible
a NO3MEMBRANA PLASMTICA: GSII,
ATPasa sensible VO43-

MORFOLGICOS:
Grosor de membrana
Reactividad

INMUNOLGICOS:
Endosomas tempranos
Endosonas tardos
MP basolateral
REGIC
RE

C. Pasquali et al., J. Chromatogr B, 722 (1999)

VESCULAS DE MICROSOMAS

VESCULAS DE MEMBRANA
PLASMTICA

FUNCIONALIDAD E INTEGRIDAD
Capacidad crear y mantener gradientes pH

Transporte de electrones

Transporte de solutos

Permeabilidad al agua (Coef.permeabilidad

osmtica)

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

I. Ruptura o lisis celular

II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad

MTODOS DE PRECIPITACIN SELECTIVA DE PROTENAS

Fundamento.- Para precipitar una protena se debe modificar el ambiente que le rodea,
debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena pueden interaccionar
con las molculas de agua como con los iones que se encuentran en solucin.
TODA MOLCULA SE ENCUENTRA SOLVATADA

PRINCIPIOS DE PRECIPITACIN DE PROTENAS POR SALES

SALTING IN
Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la
concentracin de sales.
SALTING OUT
Disminuye la solubilidad cuando se aumenta en exceso la
concentracin de sales y entonces precipitan. Es decir, se basa en la
exclusin del cosolvente, en este caso la sal.
La precipitacin con Sulfato de amonio (NH4)2SO4
es el mtodo ms ampliamente utilizado

POR QU EL SULFATO DE AMONIO?

Se pueden utilizar aniones y cationes polivalentes y monovalentes, la preferencia es
un anin polivalente y un catin monovalente.
Preferencia de la serie Hofmeister de aniones en concentraciones molares equivalentes:

citrato > sulfato> fosfato > cloruro > nitrato > tiocianato
Tendencia de la estabilidad de las protenas
Considerando que es muy utilizado, se han diseado tablas
y frmulas para determinar las concentraciones de (NH4)2SO4
que se pueden emplear para adicionar a las protenas
y obtener una concentracin especfica.

TCNICAS PARA EL DESALADO

Una vez que se ha precipitado la protena por sales, el siguiente paso consiste en
Remover la sal de la muestra:

DILISIS: Celulosa o celofn con un poro determinado

ULTRACENTRIFUGACIN

PRINCIPIOS DE PRECIPITACIN DE PROTENAS

POR SOLVENTES
Las protenas se mantienen en solucin por la interaccin de los grupos hidroflicos
de su superficie con el solvente

Si la polaridad del solvente se reduce por la adicin de un

solvente orgnico menos polar que el agua,
MENOR
la protena se vuelve menos soluble
ESTABILIDAD
LA PRECIPITACIN POR SOLVENTES SE REALIZA CON TEMPERATURAS BAJAS

PRECIPITACIN DE PROTENAS POR SOLVENTES

Los dos solventes ampliamente utilizados son el Etanol y la Acetona
Ambos logran precipitar adecuadamente a la s protenas, pero la Acetona preserva
mejor las propiedades de las protenas

Los rangos de temperatura usualmente utilizados son:

Temperaturas cercanas a 0 oC hasta -20 oC
Para la recuperacin de la protena se debe centrifugar y puede resuspenderse en un
amortiguador apropiado
Desventaja: Bajos rendimientos y puede haber desnaturalizacin

PROTOCOLO GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

I. Ruptura o lisis celular

II. Centrifugacin diferencial
III.Centrifugacin en gradientes de densidad
IV.Precipitacin selectiva de protenas por
adicin de sales o solventes
V. Separacin proteica por carga, tamao
y afinidad
TCNICAS DE ELECTROFORESIS
Y CROMATOGRAFA
Sobeida y Luis

ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE UNA PROTENA

PORTOCOLO PARA EL ESTUDIO

+
DE LA ATPasa DE H DE LA
MEMBRANA PLASMTICA
DE CLULAS VEGETALES

LA ATPasa H+ SE ECUENTRA EN LA MEMBRANA

PLASMTICA DE CLULAS VEGETALES

Apoplasto

Citoplasma

= 120 a 160 mV

pH = 1.5 a 2 unidades

ESTRUCTURA DE LA ATPasa DE H+ DE MEMBRANA

PLASMTICA
Exterior celular
MP

Citoplasma

Gonzlez--Halphen
Gonzlez

Polipptido de 100 kDa

MECANISMOS DE REGULACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA ATPasa DE H+

a) Expresin gnica
Cantidad de enzima
b) Regulacin traduccional

Tipos de isoformas

c) Expresin diferencial
d) Fosforilacin/defosforilacin

Modificaciones
en la enzima

e) Interaccin con la protena 14-3-3

f) Oligomerizacin
g) Interaccin con lpidos membranales

SELECCIN DEL MATERIAL BIOLGICO PARA OBTENER

EL SISTEMA BIOLGICO

OBJETIVO: PURIFICAR LA MEMBRANA PLASMTICA

DE TEJIDOS VEGETALES

Edidin, 2003

PURIFICACIN DE UNA FRACCIN SUBMEMBRANAL

Fase lquida
desordenada (ld)
Fluidez
Movilidad lateral

Fosfatidilserina
Fosfatidilglicerol
Fosfatidilinositol
Fosfatidiletanolamina

Fase lquida
ordenada (lo)
Fluidez
Movilidad lateral
Esfingomielina
Cerebrsidos
Globsidos
Ganglisidos
Esteroles

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
TEJIDO VEGETAL CON DISMINUCIN EN
LOS NIVELES DE ESFINGOLPIDOS ENDGENOS

Obtencin de FM/MP
Obtencin de DRMs
Caracterizacin:
1) Ultraestructura por MET
2) Anlisis protemico
3) Cuantificacin e identificacin
de ceramida y de esfingolpidos
4) Cuantificacin de cidos grasos de cadena larga
5) Cuantificacin e identificacin de esteroles

ESQUEMA GENERAL PARA LA PURIFICACIN DE VMP

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIN DE DRM

MP

CRITERIOS PARA LA SELECCIN DE LOS AMORTIGUADORES DE HOMOGENIZACIN

Y SUSPENSIN

VISUALIZACIN DE LA PURIFICACIN
A TRAVS DE LA TABLA DE RECUPERACIN

CARACTERIZACIN DE LA PURIFICACIN DE LAS VMP

CARACTERIZACIN DE LA PURIFICACIN DE LAS DRM

TAREA PARA EVALUACIN:

1. Protena asignada por la profesora.
2. Determinar el material y sistema biolgico para el estudio. Criterios
3. Elaboracin del protocolo de purificacin de la protena de inters:
a. Establecer las condiciones de homogenizacin en especfico: soluciones y fundamento.
b. Centrifugacin diferencial/por densidad: precisar los pasos requeridos
c. Determinacin de la protena. Seleccin del mtodo
d. Aislamiento de la protena: seleccin de la precipitacin
e. Purificacin: Determinacin de la electroforesis, cromatografa, etc.
f. Pruebas de evaluacin de la pureza en especfico para el sistema biolgico
g. Pruebas de evaluacin de la funcionalidad en especfico para la protena de inters.