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TEMA:
TOMA DE MUESTRAS, STAPHYLOCOCCUS Y STREPTOCOCCUS
1. OBJETIVOS
Identificar las caractersticas macromorfolgicas de las colonias
de Staphylococcus y Streptococcus en los medios de cultivo.
Determinar los diferentes tipos de hemlisis que se producen en
el agar sangre por las especies del gnero Staphylococcus y
Streptococcus.
Realizar pruebas bioqumicas para poder identificar y diferenciar
las especies del Gnero Staphylococcus.
Realizar pruebas bioqumicas para poder identificar y diferenciar
las especies del Gnero Streptococcus.
2. MARCO TERICO
EXUDADO NASAL:
Esta muestra solo se utiliza para buscar portadores de S.aureus o en el
diagnstico etiolgico de imptigo. No es til para el diagnstico etiolgico en
casos de rinitis, rinosinusitis ni en casos de otitis media ni cuadros respiratorios
altos prolongados
Alrededor del 30% de la poblacin es portadora de este microorganismo a nivel
nasofarngeo por lo cual su hallazgo no tiene habitualmente significancia clnica
salvo en situaciones especiales. En el personal de salud slo se realizar la
bsqueda de portadores en el caso de brotes de infecciones en los que no se
ha encontrado otra fuente de infeccin. Este tipo de investigacin se realizar
en coordinacin con el
D. TRANSPORTE Y CONSERVACION.
Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).
EXUDADO FARINGEO
Se utiliza para el diagnstico de faringitis estreptocccica. Excepcionalmente se
pueden requerir bsqueda de otros patgenos (por ejemplo: Neisseria
gonorrhoeae) consultar con el laboratorio.
D. TRANSPORTE Y CONSERVACION.
Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas).
Si no es posible, conservar en heladera a 4C hasta 12 horas.
D. OBSERVACIONES.
Se investigar rutinariamente la presencia de Streptococcus beta-hemoltico del
grupo A (S.
pyogenes) y otros grupos beta hemolticos como C y G.
Gnero Staphylococcus
STAPHYLOCOCCUS AUREUS, STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS Y
STAPHYLOCOCCUS SAPROPHYTICUS.
Los Staphylococcus que se asocian con infecciones humanas son colonizadores
principalmente de superficies cutneas y mucosas. El crecimiento de las colonias
bacterianas son visibles casi sobre todos los medios de cultivo, en especial en agar
sangre.
Son bacterias en forma de coco Gram positivas producen catalasa, son aerobios
facultativos.
La
temperatura
ideal
de
crecimiento
es
de
37C,
Consumen lpidos, protenas y fermenta una gran variedad de azucares, no es
formadora de esporas y crecen en niveles de salinidad 7.5-10%.
Dentro del gnero Staphylococcus hay 52 especies, siendo las ms importantes desde
el punto de vista clnico las siguientes:
Morfologa colonial.
En agar sangre, nutritivo chocolate, soya tripticasa, etc, se ven colonias pequeas,
blanquecinas, de forma circular, bordes redondeados, superficie lisa y convexa.
Algunas cepas producen un pigmento carotenoide que les da un color dorado
(Staphylococcus aureus).
Cultivos
Los estafilococos crecen rpidamente en casi
todos los medios bacteriolgicos bajo condiciones
aerobias o microaeroflicas.
Se desarrollan con ms rapidez a una temperatura
de 37C pero forman pigmento mejor a una temperatura ambiente (20 a 25C).
Las colonias en medios slidos son redondas, lisas, elevadas y brillantes.
Staphylococcus aureus
Algunas cepas de S. aureus pueden producir
un pigmento carotenoide que les da un color
amarillo, el color es ms evidente en agares
nutritivos como agar sangre, agar chocolate,
agar infusin cerebro corazn, agar nutritivo,
entre otros.
Las cepas de S. aureus son productoras de
coagulasa y beta-hemolisinas (algunas cepas
carecen de hemolisina) presenta colonias de 1 a 3 mm de dimetro, lisas, levemente
elevadas, de bordes enteros, levemente convexas.
DNAasa: positiva.
Staphylococcus saprophyticus.
Casi nunca se asocia a enfermedades nosocomiales, muchas cepas son manitol
positivo, no producen beta-hemolisis en agar sangre, es causante de infecciones
urinarias,
carece de coagulasa y no produce ninguna
pigmentacin.
DNAasa: negativo.
Staphylococcus epidermidis.
.
Las infecciones por S. epidermidis son
oportunistas, nosocomiales y generalmente
est asociado a los implantes de prtesis,
catteres e intervenciones quirrgicas.
Las colonias de S. epidermidis por lo
general
son
aislamiento
grises
primario;
blancas
muchas
en
el
colonias
Pruebas bioqumicas
epidermidis.
para
la
identificacin
de
Staphylococcus
Catalasa: positiva.
Oxidasa: positiva.
O/F: F
Manitol.
Coagulasa.
Novobiocina.
DNAasa.
S. aureus
Positivo
Positivo
Sensible
Positivo
S.saprophyticus
Variable
Negativo
Resistente
Negativo
S. epidermidis
Negativo
Negativo
Sensible
Negativo
GNERO STREPTOCOCCUS
El gnero Streptococcus es un grupo formado por diversos cocos
grampositivos que normalmente se disponen en parejas o en cadenas.
La mayora de las especies son anaerobios facultativos, y algunos crecen
nicamente en una atmsfera enriquecida con dixido de carbono. Sus
exigencias nutricionales son complejas, y su aislamiento requiere el uso de
medios enriquecidos con sangre o suero. Son capaces de fermentar
hidratos de carbono, proceso que produce cido lctico, y son catalasanegativos, a diferencia de las especies del gnero Staphylococcus
Un gran nmero de especies estreptoccicas destacan por su papel como
patgenos humanos. Lamentablemente, la diferenciacin de las especies que
componen este gnero es complicada debido a que se utilizan los tres sistemas
diferentes
parcialmente coincidentes enumerados
a continuacin para clasificar a estos microorganismos:
STREPTOCOCCUS PYOGENES.
El S. pyogenes (tambin conocido como GAS) pertenece al GRUPO A y es el
agente causal en las infecciones estreptoccicas del Grupo A, (GAS)
incluyendo faringitis estreptoccica ("amigdalitis"), fiebre reumtica aguda,
fiebre escarlata, glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante
El hidrato de carbono especfico de grupo, es el antgeno del grupo A, es un
dmero de N-acetilglucosamina y de ramosa.
La infeccin por Estreptococo Grupo A es diagnosticada generalmente con una
Prueba
Rpida
de
Estreptococos
o
mediante
Cultivo.
El mtodo ms comnmente empleado en los laboratorios clnicos para la
identificacin presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemoltico del grupo
A (Streptococcus pyogenes) es la prueba de susceptibilidad a la bacitracina o
Taxo A. Otra manera es detectar el antgeno A mediante enzimoinmunoanlisis
o inmunoaglutinacin.
STREPTOCOCCUS AGALACTIAE
Caractersticas generales
S. agalactiae, o GBS, pertenece al grupo B y causa neumona y meningitis en
neonatos y en las personas ms jvenes, con bacteremia sistmica ocasional.
Estos tambin pueden colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino,
incrementando el riesgo de ruptura prematura de membranas y la transmisin
al infante.
Es un coco grampositivo, catalasa y oxidasa negativo, anaerobio facultativo,
que se presenta formando cadenas de longitud variable. En medios
suplementados con sangre o suero se favorece su crecimiento. Tras 18-24 h de
incubacin en agar sangre, las colonias son de unos 2 mm de dimetro, lisas y
rodeadas por un halo de -hemlisis, aunque existen algunas cepas no
hemolticas.
El empleo de medios selectivos favorece la recuperacin del EGB. Como
agentes selectivos se emplean, gentamicina, cido nalidxico, colistina o cristal
violeta.
IDENTIFICACIN
Las pruebas bioqumicas ms utilizadas son el CAMP-test, la hidrlisis del
hipurato y la resistencia a discos debacitracina y cotrimoxazol, aunque ninguna
de ellas es especfica. En medios de cultivo especiales, el EGB produce un
pigmento de color rojo naranja, que es caracterstico, y que permite su
identificacin directa, sin necesidad de otras pruebas.
STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE
Se trata de una bacteria Gram. Positiva que presenta una forma oval y el
extremo distallanceolado. Es inmvil, no forma endosporas, y es un miembro
alfa hemoltico del gnero Streptococcus. Generalmente, se presenta en forma
de diplococo, aunque existen algunos factores que pueden inducir la formacin
de cadenas. Neumococo es un patgeno casi exclusivamente humano
causante de un gran nmero de infecciones como neumona, endocarditis y de
procesos invasivos severos como meningitis, septicemia, etc. particularmente
en ancianos, nios y personas inmunodeprimidas. El hbitat natural de
neumococo es la faringe
El estreptococo pneumoniae se puede diferenciar del estreptococo viridans en
que solo el primero es soluble en bilis,el viridans no. Y la otra diferencia es que
el estreptococo pneumoniae se inhibe en la presencia de optoquina.
Elestreptococo viridans no se inhibe con la optoquina
Actividad Hemoltica
La hemlisis observada en los aislamientos de Streptococcus y Enterococcus
en diferentes muestras clnicas es una de las primeras caractersticas
PRUEBA DE CAMP
La prueba de CAMP se utiliza para la identificacin presuntiva de S. agalactiae
(grupo B de Lancefield). En esta prueba se observa un efecto sinrgico que se
produce al interactuar el factor CAMP producido por cepas de S. agalactiae con
la hemolisina de Staphylococcus aureus. Ambos son productos extracelulares
que difunden en el medio de cultivo para producir dicho efecto en forma de
flecha cuando se utilizan placas de agar sangre preparada con eritrocitos
ovinos o bovinos. Una vez inoculados, los medios de cultivo deben ser
incubados a 35-37C por 18-24 horas. Algunos autores recomiendan no incubar
las placas de agar sangre para la prueba de CAMP en una atmsfera
enriquecida con CO2 debido a un probable efecto inhibitorio sobre el
sinergismo.
PRUEBA DEL DISCO DE OPTOQUINA
Prueba
de
resistencia
al
optoquina.
La prueba de resistencia a la optoquina (hidrocloruro de hidrocuprena) permite
la diferenciacin de Streptococcus pneumoniae (sensible al optochin) de otros
Streptococcus - hemolticos como los Streptococcus del grupo viridans
(resistentes al optochin). Para la realizacin de esta prueba el microorganismo
en estudio debe ser inoculado densamente en una placa de agar sangre y
sobre el inculo se coloca un disco conteniendo optochin (rotulado con una P) ,
el cual se presiona levemente para que se adhiera a la superficie del medio.
Las placas de agar sangre son posteriormente incubados a 35-37oC por un
perodo de 18-24 horas en una atmsfera enriquecida con CO2. La mayora de
los discos conteniendo optochin disponibles comercialmente tienen un dimetro
de 6 mm. Utilizando estos discos de 6 mm para la prueba de resistencia al
3. RECURSOS
Toma de muestra
STAPHYLOCOCCUS
Bacitracina 0.04
Pinza
Asas bacteriolgicas
Regla milimetrada
Microscopio
Estufa a 35oC
Cajas con agar (sangre,
chocolate, Muller-Hinton)
Caldo de Tripticase soya
Estndar de turbidez
Macfarland 0.5
Colorantes para coloracin
Gram
Perxido de hidrgeno al 3%
Discos de Novobiocina 5mcg
STREPTOCOCCUS
Microscopio
Estufa a 35oC
Bilis esculina
4. PROCEDIMIENTO
Exudado nasal
Tomar muestra profunda de ambas fosas nasales con el mismo hisopo,
previamente embebido en suero fisiolgico estril.
Exudado farngeo
Bajo visin directa, con la ayuda del bajalengua, se tocar con el hisopo en
todas las partes con
exudado, membranas o inflamacin. Se deben frotar las criptas tonsilares y la
faringe posterior. En
lo posible no tocar la mucosa oral, lengua, vula ni dientes.
STAPHYLOCOCCUS
Tincin de Gram
Con medios de cultivos ya crecidos realizamos la prctica
correspondiente a Sthaphylococcus
Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen
y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.
Con la ayuda de la asa realizamos un extendido sobre un portaobjetos
de la colonia que cogimos.
Realizamos la tincin de Gram y esperamos que se seque la placa.
Observamos la placa en el microscopio con la lente de 100x con la
ayuda del aceite de inmersin.
Observamos y anotamos la micromorfologa de la colonia.
Prueba de la catalasa
Colocamos en un portaobjetos limpio una gota de Perxido de
Hidrgeno
Cogemos un asa de siembra, la esterilizamos en el mechero de Bunsen
y con dicha asa cogemos una colonia del agar sangre.
Mezclamos la colonia con la gota de Perxido de Hidrgeno que se
encuentra en la placa y observamos que sucede.
Prueba de la coagulasa
Realizar la prueba de la coagulasa la ligada y la libre
En la C. Ligada:
Prueba de sensibilidad
Cogemos con el asa de siembra una colonia de Staphylococcus.
Prueba de Manitol
Cogemos con el asa estril una colonia
Realizamos la picada en el tubo con manitol y la estriacin.
STREPTOCOCCUS
Prueba de CAMP
Con un asa estril cogemos una colonia se Staphylococcus aureus betahemoltico y de manera vertical en la primera divisin inoculamos.
Esterilizamos el asa y cogemos una colonia de Streptococcus betahemoltico del grupo A e inoculamos de manera horizontal al otrolado de
la lnea verical.
Esterilizamos el asa y cogemos una colonia de Streptococcus betahemoltico del grupo B e inoculamos de manera horizontal a un lado de
la lnea verical.
Prueba de sensibilidad a la optoquina
5. RESULTADOS
STAPHYLOCOCCUS
Prueba de Catalasa
Resultado: debido a la aparicin de burbujas el resultado es positivo, ya que el
perxido de hidrgeno (H2O2) se convierte en agua y oxgeno.
Prueba de Manitol
Resultado: la prueba es positiva debido al cambio de color de rojo a amarillo.
STREPTOCOCCUS
Prueba de Bilis esculina
Resultado: La prueba es positiva debido al cambio de color a marrn obscuro.
6. CONCLUSIONES
Se diferenci la micromorfologa de los Staphylococcus (racimos) con
los Streptococcus (cadenas) con la ayuda del microscopio.
Se conoci que para diferenciar entre Staphylococcus y Streptococcus
debemos realizar la prueba de la catalasa, ya que los Staphylococcus
son catalasa positiva, mientras que los Streptococcus son catalasa
negativos.
La prueba de coagulasa ya sea ligada o libre es fundamental para la
identificacin de Staphylococcus
Se determin que con la prueba de Bilis esculina se identifica
Streptococcus y Enterococcus
Se concluy que una prueba para la diferenciacin rpida del
Staphylococcus aureus es mediante la prueba de la coagulasa, ya que
el S. aureus es el nico coagulasa positivo.
7. RECOMENDACIONES
Debemos leer la prueba de la coagulasa a su debido tiempo, ya que
si pasa mucho tiempo el cogulo puede disolverse.
Al coger la colonia con el asa de siembra no se debe tomar parte del
agar sangre porque la catalasa presente en los eritrocitos pueden
producir falsos positivos
Masson. Capitulos
http://s-pneumoniae.blogspot.com/
http://es.slideshare.net/kevinemmelarroyogarrafa/11streptococcus
http://www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf