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DISEO, PREPARACION Y ESTERILIZACIN DE MEDIOS DE FERMENTACIN.

K. Corbett. Beecham Pharmaceuticals, Worthing, Sussex, U.K. pg: 127-138
Comprehensive Biotechnology The Principles, Applications and Regulations of
Biotechnology in industry, Agriculture and medicine. Vol. I. Pergamon Press.

Comentarios: El presente texto fue revisado en el curso de Cultivo de Clulas, por

considerarlo pertinente y actual en los conceptos que aborda, y que forman parte de los
contenidos del curso en cuestin. Precisa con claridad las diferentes etapas que deben
considerarse cuando queremos producir biomasa o algn metabolito derivado de ella.
Explica con precisin la constitucin de los medios de cultivo pertinentes para cada etapa,
desde si se trata de crecimiento en matraces, hasta si lo que interesa es la escala
industrial. Esto permiti al estudiante entender mejor los contenidos y ver la aplicacin de
los mismos.
INTRODUCCIN.
El uso de vino para producir alimentos y bebidas data de la antigedad, y existen registros
que sugieren que los Sumerios usaban los procesos de fermentacin desde hace 6000
aos. A travs de los siglos, ms civilizaciones han desarrollado procesos
microbiolgicos, muchos de los cuales han sobrevivido hasta nuestros das. Con el
incremento en el conocimiento cientfico y la presin de aumentar la industrializacin,
nuevos procesos se desarrollaron en la primera mitad de este siglo para la produccin de
cido ctrico, acetona, y butanol. El boom de la biotecnologa fue catalizado por el
descubrimiento y el xito a gran escala de la produccin de antibiticos, as como por los
avances en las tcnicas en modificacin de genes.
Los materiales y medios usados en los procesos tradicionales han sido desarrollados por
cientos de aos. Esto origin la produccin casera a pequea escala de alimentos y
bebidas, las cuales formaban parte de la dieta de al familia productora.
Actualmente, estos mtodos han sido redefinidos y adaptados a gran escala, utilizando
principalmente materias primas tradicionales, pero el mejoramiento de los procesos de
control ha conducido a productos ms consistentes. Esto genera mayor preisn de
mejorar la productividad y reducir los costos. Recordemos que el objetivo de la
biotecnologa moderna es la produccin de materiales que requiere la sociedad a un costo
que permita al productor tener un beneficio. Si este ltimo criterio no se satisface, el
proceso en particular se convierte en un fsil moderno.
Los requerimientos primarios de un proceso biotecnolgico, es un organismo
productivamente eficiente, pero las condiciones ptimas de cultivo deben desarrollarse
para todas las etapas del proceso si se busca la produccin mxima. PIRT (1975) ha
enlistado cinco criterios para el crecimiento ptimo de microorganismos: a) fuente de
energa, b) nutrientes, c) ausencia de inhibidores, d) inculo viable, y e) condiciones
fisicoqumicas disponibles.
De estos parmetros, el diseo y preparacin del medio gobiernan los primeros tres, y
junto con los procesos fsicos contribuyen significativamente al quinto parmetro. Sin
embargo, para la prctica de la biotecnologa moderna, el diseo del medio que satisfaga
los requerimientos del organismo en lnea con estos criterios, slo constituye parte de la
historia. Los fabricantes deben esforzarse en mejorar los organismos productores,
especies que fueron consideradas altos productores en la produccin de penicilina G en
los 50s, seran totalmente inaceptables hoy da.
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Una familia completa de medios especializados se requiere para las varias etapas del
mejoramiento de especies, mantenimiento del cultivo y preparacin del inculo. An para
la etapa inicial y final de los procesos, los parmetros indicados deben ser considerados
tanto econmicamente, como de disponibilidad de materiales en las cantidades
necesarias que conduzcan a un proceso comercial a gran escala. Adems, la naturaleza
del producto final afectar la filosofa del diseo del medio de la etapa final; mientras que
uno debe mantener una velocidad de crecimiento alta a travs de un proceso de protena
unicelular, es necesario limitar las velocidades de crecimiento en etapas finales de los
procesos productores de metabolitos secundarios.
El desarrollo del medio es por lo tanto, algo mucho ms elaborado, esta operacin
compleja afecta crticamente el xito del proceso total. Habiendo diseado una serie de
medios satisfactorios es importante asegurar que las ventajas creadas sobre los procesos
no son disipados por el descuido en la preparacin o en la esterilizacin; la clave del xito
en estas reas es la consistencia de operacin que asegure que cada lote de medio sea
tan similar como sea posible. Esto puede parecer un simple criterio de satisfacer bajo
condiciones de laboratorio, pero se requiere considerable atencin cuando se trabaja a
gran escala. Adems, uno debe asegurarse de satisfacer los criterios de regulacin que
marcan las autoridades cuando se disea la operacin de la preparacin de medios y
esterilizacin, en la produccin a escala.
DISEO DEL MEDIO
Un proceso de fermentacin consiste de un nmero de operaciones y etapas por los
cuales una familia completa de medios interrelacionados debe ser desarrollada. Antes de
disear cualquier medio, uno debe tener claro el objetivo de la etapa especfica del
proceso. La tabla 1, enlista las varias etapas involucradas en el mantenimiento de un
proceso exitoso.
Un medio debe ser diseado especficamente para alcanzar los objetivos inherentes en
cada etapa, y en ciertos casos, por ejemplo, en la seleccin de un medio lquido, varios
medios diferentes debern ser empleados para mejorar las oportunidades de
identificacin de una especie que ha sido mejorada. Una amplia variedad de objetivos
est presente, desde el requerimiento para el crecimiento ptimo, por ejemplo, el
crecimiento de colonias sobre superficie de agar seguida de mutacin, o la inhibicin del
crecimiento de todos los organismos excepto aquellos que tienen caractersticas
especficas; para poder distinguirlas entre aquellos organismos que crecern y los que no
lo harn. Obviamente, una diversidad amplia de medios necesarios para conocer la
variedad de objetivos que se buscan, son mostrados en la tabla1.
El paso de la mutacin es alcanzado por aplicacin de mtodos qumicos o fsicos
capaces de daar el material gentico. Obviamente en el caso de dao qumico, un
qumico disponible deber ser incorporado al medio. An cuando el dao fsico sea el
objetivo, al usar por ejemplo luz UV, es necesario usar un qumico adjunto para inhibir la
reparacin del DNA daado, por ejemplo cido nalidxico o cafena.
Habiendo llevado a cabo la mutacin, es necesario seleccionar los mutantes que
desarrollaron las caractersticas que muestran una mejorada productividad del producto
deseado. En tales casos, sustancias inhibitorias son adicionadas al medio para prevenir el
crecimiento de todos aquellos organismos resistentes al compuesto adicionado. Ejemplos
de la aplicacin de esta tcnica son la adicin de altas concentraciones de aminocidos
txicos anlogos en la seleccin de productores de aminocidos altamente productivos, y
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la adicin de altos niveles del antibitico o precursor requerido, como el cido fenilactico
en la bsqueda altos productores de penicilina G.
Tabla 1. Gua de objetivos para la seleccin de medios para cada etapa de un
proceso de fermentacin industrial.
OPERACION
ETAPA
Modificacin del Mutacin
genoma
Formacin de protoplastos

OBJETIVO
1. Dao al material gentico
Mxima produccin del nmero de protoplastos
viables
Almacenamiento de protoplastos
2. Almacenamiento de protoplastos en condiciones
no dainas
Fusin de protoplastos
3. Mejoramiento de proptoplastos por fusin con
produccin de progenie viable
4. Regeneracin del nmero mximo de clulas
Regeneracin de clulas a partir de intactas a partir de protoplastos
protoplastos
5. Mejorar la entrada de vectores relacionando
genes clonados con la mxima viabilidad celular
Mtodos de recombinacin
Seleccin
de Crecimiento al azar
1. Estimular el crecimiento de todos los
mutantes
sobrevivientes
Crecimiento selectivo
2. Permitir el crecimiento de organismos con
caractersticas especficas
Pruebas
de Matraces agitados
1. Identificar cualquier especie con habilidad
productividad
mejorada para producir el producto deseado
2. Desarrollo de las condiciones ptimas de la
Fermentadores
especie seleccionada
Preservacin
Preservacin
1. Preparar especies mejoradas para almacenar
por perodos largos con retencin de la mxima
viabilidad y productividad
Preparacin
de Inculo vegetativo
1. Rpido crecimiento para generar suficientes
inculo
clulas en la etapa iniciadora
2. Produccin mxima del nmero de esporas
Formacin de esporas
3. Colectar esporas uniformemente dispersadas
para tener un mximo nmero de centros de
Cosecha de esporas
crecimiento potencial
4. Cortos perodos de almacenamiento de esporas
con retencin de la mxima viabilidad y
productividad
Almacenamiento de esporas
Etapa iniciadora
Etapa iniciadora
1. Rpida produccin de biomasa en la etapa
metablica ptima para inculo de la etapa
fermentativa final
Etapa final
Etapa final
1. Mxima produccin del producto deseado al
mnimo costo

Junto a estas operaciones dirigidas a la inhibicin y modificacin del crecimiento, habr

otras etapas que se requerirn para promoverlo. La seleccin al azar de mutantes
requiere medios slidos que estimulen el crecimiento de todos los organismos que
sobreviven a la etapa de mutacin. As mismo, la etapa para evaluar la productividad, al
menos inicialmente, debe soportar el crecimiento activo, an dependiendo del producto,
ser necesario restringir el crecimiento total si uno es tratado con la produccin de
metabolitos secundarios.
Ya que es difcil reproducir condiciones exactas de fermentacin a pequea escala,
particularmente si se trata de matraces, es necesario desarrollar diferentes medios para
mejorar las oportunidades de seleccionar mutantes altamente productivas. Es costumbre
usar un medio de seleccin en matraces agitados que sea cercano al medio de seleccin

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en matraces agitados. Sin embargo, debido a las diferencias en escala, la condicin

limitante en los matraces puede ser diferente para que persista a gran escala, siendo
necesario disear medios especficos para escala pequea que permitan a los mutantes
expresar su potencial completo, por ejemplo, si la transferencia de oxgeno es un factor
limitante en los matraces, es necesario usar un medio ms diluido que el usado a gran
escala.
Tambin, en los sistemas de matraces no es posible monitorear y controlar las
condiciones continuamente a travs de la fermentacin, por lo tanto para el paso de
seleccin, el medio debe ser diseado especficamente para vencer este problema. Dos
ejemplos se encuentran en la seleccin de organismos para la produccin de penicilina G
y cido clavulnico. En este caso es necesario mantener un continuo pero limitado
suministro de glucosa a travs de la fermentacin.
En grandes fermentadores una cantidad pequea de glucosa es adicionada inicialmente
al medio, la concentracin es monitoreada y el nivel correcto se mantiene por la lenta
alimentacin de glucosa durante la fermentacin. En matraces el suministro limitado de
glucosa a partir de una hidrlisis baja de lactosa que es incorporada al medio, alcanza un
resultado final similar. El control de pH es importante en la produccin de cido
clavulnico. Adiciones de cido o lcali son sencillas de realizar en un fermentador, pero
en numerosos matraces es necesario adicionar un agente buffer para lograr el efecto
deseado (Aharonowitz y Demain, 1977).
Las etapas de preservacin y preparacin de inculo requieren igualmente de medios
diferentes. La preservacin de organismos para almacenar por perodos largos, es una
parte necesaria de cualquier proceso industrial para asegurar que exista un adecuado
stock del organismo productor para un gran nmero de corridas de operaciones de
produccin.
Es esencial disear condiciones que retengan ambas caractersticas, viabilidad y alta
productividad del organismo. Varias tcnicas de congelacin o secado son la base de
tales sistemas, ejemplo, la liofilizacin o congelacin en nitrgeno lquido, pero el medio a
partir del cual el organismo va a ser secado o congelado debe tener una influencia crucial
en el xito de la operacin.
La preparacin del inculo para gran escala debe estar en forma de clulas vegetativas o
esporas. Las esporas generalmente se producen sobre una superficie slida que podra
ser agar o algn material en forma de partculas remojadas en un medio disponible,
ejemplo: granos de arroz o perlita. El medio debe contener todos los factores necesarios
para proporcionar un buen crecimiento sobre la superficie compacta antes que la
esporulacin sea inducida. Habiendo obtenido esporulacin abundante, se requiere un
medio para remover las esporas de la superficie slida y del material vegetativo. Debe
tambin prevenirse la agregacin de esporas sin causar dao o que la germinacin
ocurra. Soluciones buffer de sales conteniendo un surfactante son a menudo usadas,
pero este ltimo debe ser muy cuidadosamente escogido para evitar dao a las esporas,
particularmente si las esporas son almacenadas en ese medio por tiempos prolongados.
Todas las operaciones hasta ahora mencionadas son a escala de laboratorio. En algunas
casos, la cantidad de medio requerida debera ser muy pequea, del orden de unos
cuantos litros por ao, pero la importancia de estas etapas para la continuacin de la
explotacin comercial exitosa del proceso est en duda. A menos que la alta produccin
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de mutantes mejoradas pueda ser generada, los procesos se estancarn, y los

competidores comerciales avanzarn; por ello, el nmero de compaas manufactureras
de penicilina ha cado dramticamente desde los aos 50s. En gran parte el xito de la
operacin depender de escoger los medios ms idneos para cada etapa del proceso.
La mayora de los procesos comerciales operan como sistemas por lote en tanques de
fermentacin agitados, entre 10 y 200 m3 de capacidad. Sin embargo, la ventaja de la
produccin a gran escala de SCP ha conducido al desarrollo de nuevos fermentadores
con capacidades superiores a 4000 m3. Tpicamente, el medio de produccin es una
compleja mezcla heterognea con un contenido de slidos en exceso de 10% del
volumen. An para los tanques de fermentacin agitados tradicionales, varias toneladas
de materia prima son requeridas para cada produccin por lote, ejemplo:
aproximadamente 10-15 ton de licor de maz y jarabe de glucosa se requieren para cada
lote de medio en un fermentador de 200 m3 para la fermentacin de penicilina G.
Mientras sea necesario satisfacer los requerimientos nutricionales del organismo, es
esencial a gran escala disear un medio con constituyentes que sean econmicos y
rpidamente disponibles durante el ao. As como tambin, es deseable que sean
consistentes, estables y fciles de manipular y almacenar.
El primer paso en la etapa a gran escala es generalmente la fermentacin en la etapa
inicial, la cual es diseada para producir una gran cantidad de inculo para la produccin
en el fermentador. No hay requerimientos para la formacin de productos finales, por lo
tanto, el medio puede ser diseado nicamente para satisfacer los requerimientos de
crecimiento del organismo. Un rpido crecimiento es tambin un requerimiento para la
primera fase en la etapa de produccin fermentativa. Si SCP es el producto, una alta
velocidad de crecimiento se requerir durante la etapa final, pero si un metabolito
secundario es deseado por ejemplo un antibitico, entonces el crecimiento debe ser
limitado antes de que sea formado.
Para obtener un rpido crecimiento en ambas etapas inicial y final, el medio debe
contener fuentes de energa carbono, nitrgeno y fosfato, elementos traza y cualquier
factor de crecimiento especfico que no pueda sintetizar el organismo por s mismo. Un
simple carbohidrato puede actuar como fuente de carbono y de energa, aunque un
segundo material, generalmente un lpido puede ser usado, y el esqueleto carbonado de
compuestos orgnicos nitrogenados puede contribuir a ambos requerimientos. Tanto
como el 15% de biomasa en peso seco puede estar compuesto de nitrgeno, por tanto, el
medio debe proveer al menos esta cantidad de material disponible. No obstante, muchos
organismos industriales utilizan nitrgeno inorgnico, su crecimiento y productividad es
invariablemente estimulada por la adicin de material nitrogenado orgnico. Los
requerimientos de fosfatos es generalmente suministrado como sales de sodio o potasio o
cido ortofosfrico.
Es comn la prctica de adicionar factores de crecimiento como parte de una mezcla
compleja, ejemplo extracto de levadura o destilados solubles; as que la naturaleza y
mucho menos la cantidad requerida, no son perfectamente entendidas. Entonces para
obtener un buen crecimiento es necesario disear un medio balanceado conteniendo
nutrientes apropiados en proporciones especficamente seleccionadas para un organismo
en particular.

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Es ms fcil disear medios para un buen crecimiento inicial que para las subsecuentes
etapas. Este es el caso donde un metabolito secundario es requerido. Los
microorganismos solo parecen ser capaces de producir tales compuestos cuando la
velocidad de crecimiento especfico desciende. Por tanto, la clave para una buena
produccin de metabolitos secundarios es el desarrollo de un medio en la etapa final, el
cual llega a ser deficiente en uno o ms nutrientes despus de una rpida fase inicial de
crecimiento. El agotamiento de cualquier nutriente hace imposible un crecimiento
balanceado y causa diferenciaciones bioqumicas.
El fosfato es el nutriente ms ampliamente estudiado por su efecto en la produccin de
metabolitos secundarios. Mientras que el crecimiento vegetativo es posible en el rango de
0.1-500 mM, la produccin de metabolitos secundarios es generalmente inhibida a niveles
de fosfato superiores a 10 mM. La biosntesis de muchos antibiticos importantes,
particularmente aquellos producidos por estreptomicetos, es controlada por fosfatos.
Weinberg enlist ms de 30 de tales compuestos y Martin revis la regulacin de
antibiticos formados por bacterias. Los metabolitos secundarios producidos por hongos
pueden tambin ser controlados por este nutriente, por ejemplo, el cido ctrico y
alcaloides.
Estos ejemplos de fermentacin dan una buena demostracin de la diferenciacin
bioqumica en respuesta a la disminucin de fosfatos, adems no solamente es la
produccin de alcaloides, sino tambin un cambio en el tipo de clulas, la cual es
acompaada por un incremento y un cambio en la composicin de lpidos intracelulares.
Para fermentaciones controladas por fosfatos es necesario establecer la concentracin
ptima de fosfato que dar un adecuado crecimiento para proporcionar la productividad
mxima de producto requerido. Este ptimo puede ser solamente establecido
empricamente usando muestras de nutrientes grado analtico que sern usados en la
produccin a escala, adems de que deben contener cantidades significativas de fosfato
inorgnico y orgnico.
Como con el fosfato, es necesario agotar del medio un elemento traza especfico antes de
que ciertos compuestos sean producidos. La mxima produccin de cido ctrico y cido
itacnico solamente ocurre si el medio es deficiente en hierro. Cuando una fuente de
carbohidratos impura es usada por ejemplo melasas, es necesario remover los elementos
traza, para estimular la sntesis. Resinas intercambiadoras de iones y tratamientos con
ferrocianuro han sido mtodos usados para este propsito. Similarmente, varios
organismos solo sobreproducen riboflavina cuando el contenido de hierro del medio est
restringido.
Estudios recientes en el desarrollo de medios en el proceso de penicilina mostr que los
oligosacridos o polisacridos suministran mejor la produccin, que la glucosa. El efecto
inhibitorio de la glucosa es debido a la represin catablica y es evidente en la produccin
de otros antibiticos. De igual forma, citrato y glicerol inhiben la produccin de
novobiocina y cefamicina respectivamente. Una situacin ms complicada existe con la
biosntesis de alcaloides por Claviceps. El medio debe tener ambos, un azcar o un poliol,
adems de un intermediario del TCA o un compuesto relacionado, en una relacin
aproximada de 10:1, ejemplo, sacarosa y cido ctrico para produccin de ergotamina.
No hay efecto diuxico, pero s un metabolismo simultneo de los dos componentes. Sin
embargo, si el componente del TCA est ausente hay crecimiento masivo y poca
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produccin del alcaloide. En ambos casos es necesario disear el medio, as el

crecimiento ser restringido por agotamiento de un nutriente o por suministro controlado
cuidadosamente durante la fase de produccin.
La adicin de compuestos orgnicos especficos para estimular la productividad ha sido
encontrada con limitado xito y es generalmente el resultado al azar en la bsqueda de un
material disponible. La adicin de precursores es una posibilidad obvia, aunque es
necesario tener un conocimiento detallado de la secuencia biosinttica. Las
fermentaciones de penicilina proporcionan el mejor caso conocido de adicin de
precursores, pero an en este caso el hallazgo inicial fue debido a la casualidad.
El uso de licor de maz para reemplazar el medio de Czapek-Dox, no solamente
proporcion nutrientes nitrogenados disponibles sino tambin estimul la sntesis de
penicilina G por el suministro de una fuente de cido fenilactico de cadena. Este
descubrimiento condujo a un rpido desarrollo comercial de tal proceso. Un rango
completo de precursores ha mostrado que pueden ser incorporados con resultante en la
sntesis dirigida del producto final. No todos los precursores son tan tiles como el cido
fenilactico, ya que estos pueden ser ms costosos que el producto deseado, ejemplo, la
cistena es un precursor muy costoso del ncleo de la penicilina y falla para estimular la
productividad en un medio de produccin complejo.
La literatura contiene referencias acerca de un nmero de ejemplos de otros compuestos
que estn siendo adicionados como precursores para estimular la productividad. Se ha
demostrado que la metionina y la norleucina incrementan la sntesis de cefalosporina, y el
tiosulfato fue reportado que tiene un efecto similar sobre la produccin de penicilina. Estos
compuestos no son incorporados al antibitico pero ejercen una influencia regulatoria
sobre la productividad. Aparte de los reportes establecidos, existen muchos rumores
industriales de los efectos benficos de compuestos particulares. Cada fabricante debe en
algn momento conocer las propiedades de los agentes quelantes, surfactantes y aceites
exticos.
Una propiedad bien conocida de las soluciones proteicas es su carcter propenso a la
espuma cuando son agitadas, un efecto que es acrecentado si el aire circulado a travs
de la solucin. Como se ha visto, el medio en la etapa inicial y final de un proceso de
produccin generalmente contiene protenas y pueden ser agitadas y aireadas. Si el
medio es alcanzado por la espuma, ocupar un gran volumen, ms que un medio que no
hace espuma, por tanto, el volumen de trabajo efectivo del fermentador es reducido. Es
necesario entonces una menor velocidad de agitacin y de aireacin, as se reducir la
velocidad de transferencia de oxgeno con posible limitacin del crecimiento y de la
productividad. Si la formacin excesiva de espuma ocurre, debe entrar al fermentador un
sistema de ventilacin que evite posible riesgo de contaminacin.
El control de la formacin de espuma es esencial, por tanto, es una prctica comn
adicionar un agente qumico para este propsito. Los materiales ms comnmente
usados son cidos grasos, poliglicoles, alcoholes superiores y silicones. Una gran
variedad de stos estn disponibles como preparaciones apropiadas, pero se requiere de
un gran cuidado en la seleccin de cualquiera, adems muchos de estos compuestos
pueden inhibir el crecimiento o la germinacin de esporas y todas degasifican el lquido
reduciendo la disponibilidad de oxgeno.

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El grado de control de espuma exhibido por diferentes compuestos y sus proporciones

vara ampliamente. Algunos reducirn la espuma por un corto perodo pero permitirn
restablecerla despus de un corto tiempo, mientras que otros lo harn por perodos
largos. La naturaleza de los fermentadores gobierna el tipo de antiespumante a ser usado.
En casos donde la formacin de espuma slo ocurre por un perodo corto, es conveniente
adicionar cantidades pequeas de antiespumantes hasta que el dao haya pasado. En
casos donde la espuma es una constante amenaza, un antiespumante de accin
prolongada debe ser usado. Inevitablemente materiales ms eficaces son ms caros, por
tanto, es necesario balancear los costos totales de adiciones mltiples de material barato
contra la menor utilizacin de un compuesto costoso. Adems cada tipo de fermentacin
se comporta diferente, el tipo de antiespumante y su mtodo de uso deben ser
especficamente seleccionados para circunstancias individuales.
La seleccin de medios disponibles para la produccin de procesos a escala depende de
factores adicionales para optimizar la productividad del organismo. Costos y disponibilidad
de un suministro regular son los dos factores crticos que afectan la disponibilidad de
cualquier material. Adicionalmente se debe tomar en cuenta la consistencia y estabilidad
del material, facilidad de manejo durante la transportacin, almacenamiento y preparacin
del medio, y tambin la aprobacin de las autoridades regulatorias.
Ya que el medio para la etapa final es uno de los mayores costos centrales del proceso,
junto con la utilizacin de energa, las fluctuaciones en los costos pueden tener un
dramtico efecto sobre las utilidades, por tanto es admisible investigar medios
alternativos. Habiendo seleccionado los materiales disponibles es necesario balancearlos
en las proporciones correctas para obtener la productividad mxima, lo cual se realiza
utilizando mtodos estadsticos.

PREPARACIN DEL MEDIO.

La principal gua que gobierna la preparacin de medios es un proceso de operacin
consistente de manera que habiendo establecido el medio ptimo, cada lote ser tan
similar como sea posible al ideal. Hay un pequeo punto en el tiempo de consumo y
esfuerzo para desarrollar un medio altamente calificado para establecer las mejores
condiciones solo a travs de las ventajas y la preparacin cuidadosa. No es un rea que
requiera un conocimiento erudito, pero si de la planeacin y supervisin tcnica
cuidadosa. Es esencial disear procesos de almacenamiento, manejo y registro, los
cuales reduzcan la posibilidad de error en el medio.
El almacenamiento y manejo de la materia prima est sujeto a un reconocimiento
correcto. En principio esos polvos residuales deben ser almacenados en condiciones de
secado, de otra manera muestras como fosfatos se endurecen como rocas, o en el caso
de protenas forman masas aglutinantes. No solamente estos materiales hacen difcil el
proceso, tambin hacen impredecible la subsecuente esterilizacin.
Muchos volmenes de lquido contienen un alto contenido de slidos y deben ser
almacenados en condiciones clidas para prevenir que solidifiquen, por ejemplo, jarabes
de glucosa (Fig. 1). Si tales materiales solidifican, es costoso y consume tiempo
regresarlos al estado lquido. Sin embargo la temperatura de almacenamiento no debe ser
demasiado alta, en otras palabras puede haber degradacin del material con un
resultante perjuicio en la fermentacin.

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El manejo de materiales voluminosos posee problemas de salud y seguridad para los

operadores. Uno debe proporcionarles ropa protectora combinada con una instruccin
adecuada, particularmente para el manejo de materiales corrosivos, por ejemplo, cidos,
lcalis y polvos que pudieran inflamarse y producir alergias.
Mientras que uno razonablemente puede esperar estndares de laboratorios tcnicos
para preparar medios y reproducirlos con supervisin limitada, los mismos no siempre
pueden ser efectivos para la produccin en planta. El uso de labores poco hbiles para
preparar medios, a menudo bajo condiciones hmedas y calientes en medio de la noche,
requiere que cada lote de medio sea acompaado por instrucciones explcitas, acopladas
con una supervisin cuidadosa.
Los operadores deben ser entrenados para seguir las instrucciones, ya que no solamente
el medio puede ser producido equivocadamente si los pesos o volmenes usados son
incorrectos, sino que tambin reacciones diferentes pueden darse si los ingredientes son
adicionados en orden incorrecto, por ejemplo, el medio para la produccin de penicilina
debe contener ambas sales, sulfato de amonio y calcio los cuales no deben ser
mezclados juntos antes que otros ingredientes sean adicionados; en otras palabras el
amoniaco debe evolucionar.
Es comn la prctica de preparar el medio en tanques separados para la subsecuente
transferencia al fermentador. Es esencial asegurar que el medio es agitado as no se
permitir la separacin de fases, es decir, materiales slidos o lquidos que pueden estar
causando distorsin del medio en el fermentador.
Aunque la preparacin del medio puede parecer un paso trivial en el proceso, la
composicin correcta de cada lote de medio es fundamental para alcanzar
consistentemente fermentaciones altamente productivas, las cuales son esenciales para
una operacin comercial exitosa.
ESTERILIZACIN.
La etapa preliminar de todo proceso fermentativo es la esterilizacin del medio para
remover organismos no deseados, los cuales podran tener un efecto contrario sobre la
productividad. El rpido crecimiento de organismos contaminantes puede reducir el nivel
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de nutrientes disponibles para el organismo productor, generalmente las fuentes de

carbohidrato y nitrgeno, pero tambin los costosos precursores de metabolitos
secundarios, por ejemplo, el cido fenilactico para la produccin de penicilina G pueden
ser rpidamente utilizados por los organismos contaminantes, como es el caso de
Paecilomyces.
El crecimiento de un organismo aerbico puede limitar la cantidad de oxgeno disponible y
resultar en otros cambios ambientales, por ejemplo, el pH, lo cual es nocivo para el
proceso. La excrecin de materiales extraos puede resultar en una inhibicin del
crecimiento del organismo seleccionado o contaminacin del producto requerido al final
de la fermentacin. Si el material contaminante es una enzima, puede destruir al producto
final, por ejemplo, la -lactamasa producida puede destruir todo el producto de una
fermentacin de penicilina G en materia de horas.
Finalmente, los organismos contaminantes pueden producir una masa de crecimiento tal
que incrementa la viscosidad del medio de modo que una agitacin es perjudicial o la
eficiencia del equipo se ve reducida. Esto es particularmente el caso si un organismo no
deseado tiene una forma de crecimiento filamentosa.
Tericamente sera posible preparar medios estriles por filtracin, radiacin, tratamientos
ultrasnicos, qumicos, calor o por varias combinaciones de estos procesos. En la prctica
grandes volmenes involucrados en los procesos de produccin excluyen el uso de
radiacin o mtodos ultrasnicos. La naturaleza daina de agentes qumicos junto con la
necesidad de remover o destruirlos antes de la inoculacin del organismo deseado, tiene
severamente limitado su uso.
Solamente en circunstancias especiales el tratamiento qumico ha sido usado para
prevenir dao excesivo al medio, por ejemplo, el crecimiento de levaduras en alimentos es
inhibido por la desnatuarlizacin de las protenas del suero de leche, por tanto para
alcanzar el crecimiento en un medio conteniendo slidos de suero de leche, el medio
debe ser esterilizado por perxido de hidrgeno a 60C. En casos donde un medio
totalmente soluble es usado, particularmente si contiene materiales lbiles, como puede
ser el caso del crecimiento de clulas animales en cultivo sumergido, el medio debe ser
esterilizado por filtracin. Similarmente, alimentos para la alimentacin de procesos por
lote o agua para llegar al medio deseado de volumen debe ser esterilizado por filtros. Un
mayor riesgo de contaminacin es asociado con este mtodo de esterilizacin que con el
proceso ms comnmente usado, el uso de calor.
El mtodo universal para la esterilizacin de medios industriales heterogneos es por
corrientes de calor bajo presin. En presencia de humedad es posible esterilizar el
recipiente, el equipo asociado y el medio a una temperatura de 120C mientras
temperaturas de 400C seran requeridas si se usara calor seco. Si el medio contiene solo
clulas vegetativas, estas pueden ser muertas a bajas temperaturas, pero cuando
esporas estn presentes una mayor temperatura es requerida.
Conglomeraciones de materiales y la presencia de gotas de aceite son comunes en los
medios industriales y reducen la eficiencia de la esterilizacin por proporcionar un
ambiente que es resistente a la penetracin de humedad. Humedades relativas tan
mnimas como 20% han sido reportadas con grandes materiales, resultando en
velocidades de muerte que van de 2-3 rdenes de magnitud menor que en la fase acuosa.

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La destruccin de esporas las cuales son encapsuladas en tales ambientes hidrofbicos

puede depender del tamao de la partcula, la distancia de la espora hacia la superficie, la
termoconductiviad del material, y la permeabilidad a la corriente y al agua.
Medios conteniendo tales materiales requieren ms extensin del calor que un medio
totalmente soluble. Es a menudo necesario determinar empricamente los tiempos
disponibles para la esterilizacin de medios heterogneos, un tratamiento terico bajo
estas condiciones de esterilizacin debe ser planteado.
El calentamiento de mezclas qumicas complejas a temperaturas arriba de 120C por
perodos de 20 minutos puede causar la destruccin de los constituyentes del medio ya
sea por degradacin trmica directa o por reacciones qumicas no deseadas. El caso
mejor conocido es la destruccin de la glucosa por la reaccin de oscurecimiento de
Maillard cuando se calienta en presencia de aminas.
La tabla 2 muestra el efecto de un largo tiempo de esterilizacin en las concentraciones d
eglucosa cuando un medio CSI fue esterilizado despus de la adicin de glucosa. No
solamente la glucosa es destruda por la reaccin, sino tambin, productos txicos son
formados e interfieren con la subsecuente fermentacin. En tales casos es comn
esterilizar la solucin de glucosa separadamente y adicionarla al medio que ya ha sido
esterilizado.
Tabla 2. Efecto de la esterilizacin sobre la concentracin de glucosa y la velocidad de
produccin del antibitico
T (min) a
Glucosa adicionada
V relativa de
121 C
remanente (%)
excrecin
60
35
90
40
46
92
30
64
100

Las condiciones prevalentes durante la esterilizacin pueden afectar no solamente la

estabilidad de los componentes, sino tambin la forma y viabilidad del organismo.
Menores componentes del medio por ejemplo, los elementos traza, pueden ejercer una
influencia en la solubilidad de componentes mayores, por ejemplo, la fuente de nitrgeno
(Tabla 3).
Se ha visto que ambas, temperatura y tiempo de calentamiento tambin afectan la
solubilidad de los componentes del medio. El grado de solubilidad puede ser una
influencia determinante en la subsecuente fermentacin y principalmente en la
productividad del proceso.
Tabla 3. Efecto de las condiciones de esterilizacin en el contenido de nitrgeno de un
medio
pH
T(min) a
Adicin de
Nitrgeno
121C
elem. traza
total soluble
(%)
6.4
20
Si
33
6.4
40
Si
42
7.0
20
Si
67
7.0
40
Si
68
6.4
20
No
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Aunque la esterilidad es de gran importancia, es conveniente investigar el rango de las

condiciones de esterilizacin para sus efectos sobre la productividad.
La muerte trmica de microorganismos sigue una cintica de primer orden, esto es la
velocidad de reaccin (velocidad de muerte) es directamente proporcional a la
concentracin de la sustancia reactante:
-dc/dt = kc

(1)

En la ec. 1, c = concentracin de la sustancia reactante;

especfica de la reaccin.

t = tiempo; k = velocidad

La velocidad de reaccin especfica k, es una constante a una temperatura definida.

Integrando la ecuacin anterior:
c = c0e-kt .
(2)
En la ec. 2, c0 = la concentracin inicial y c = la concentracin al tiempo t. Se ha
observado que la cantidad de reactante cae exponencialmente y llega a cero solo en un
cierto tiempo finito.
El efecto de la temperatura sobre la constante de la velocidad de reaccin est expresada
por la ecuacin de Arrhenius:
Ln k = A E/RT
k = Ae-E/RT.

(3)
(4)

A = constante de Arrheniues; E = energa de activacin; R = Constante de Boltzman;

T = temperatura absoluta.
Si se grafica ln k contra 1/T (Fig. 2), la pendiente de la lnea es igual a E/R y y la
intercepcin es igual a la constante A. Al ser R constante es posible calcular E. Por lo
tanto, la pendiente de la lnea depende de la energa de activacin, a mayor inclinacin,
mayor energa de activacin, por tanto, ms rpida la velocidad de la reaccin a mayores
temperaturas.

El trmino esterilizacin implica la muerte de todos los microorganismos contaminantes

sin embargo, hemos visto que para que una reaccin de primer orden se encamine a la
totalidad, esto es para asegurar la muerte de todos los microorganismos, sera necesario
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calentar por un tiempo infinito. La principal falla en el calentamiento de grandes

volmenes de medio por largos perodos, son la prdida de nutrientes y los costos altos
debido al uso excesivo de energa, por lo tanto, es necesario usar otro criterio ms que el
de la esterilidad absoluta. Uno debe comprometerse y aceptar la probabilidad de un cierto
porcentaje de contaminacin, 1/100 o 1/1000 contaminaciones en una planta comercial.
Obviamente se considera la sobrevivencia de algunos organismos en la masa total del
cultivo, por lo tanto, en la aplicacin de la cintica de primer orden para la esterilizacin es
usual considerar el volumen total como unidad de volumen y el nmero total de
organismos o esporas ms que como concentracin. La ecuacin se convierte entonces
en la ec. 5.
N = N0e-kt
(5)
Donde N0 = nmero de organismos presentes al tiempo cero; N = nmero de organismos
al tiempo t.
Si se acepta la probabilidad de fermentaciones contaminadas de 1/100 o 1/1000, se
puede asignar un valor a N de 10-2 o 10-3. Ahora es posible determinar un factor
equivalente para el tratamiento con calor necesario para acercarse a una reduccin desde
N0 a N, es decir, 10-2 o 10-3. Este factor es el D, o criterio de esterilizacin y se define en
la ec. 6.
D = V = ln No /N
(6)
Sin embargo, la ec. 7 puede ser derivada de la ec. 5
Ln No/N = kt

(7)

Por lo tanto, de la ec. 4, se obtiene la ec. 8

Kt = A/ e-E/RT = V

(8)

Conociendo la energa de activacin y la constante de Arrhenius para cualquier

organismo, es posible calcular el tiempo a una temperatura fija, la cual es necesaria para
alcanzar el grado de muerte durante la esterilizacin. Sin embargo, el medio sin esterilizar
contendr tanto clulas vegetativas como esporas de muchos diferentes organismos, por
tanto, es difcil calcular un valor especfico. En la prctica es usual tomar los valores para
Bacillus stearothermophillus que tiene el mayor calor de resistencia de sus esporas
conocido, y la base de clculo en esto valores ( E 0 287.2 KJ/mol; A = 7.94 x 10-30 s-1).
La cantidad de calor requerido para matar una razn aceptable de organismos depende
del nmero inicial de ellos, grandes volmenes de medio requerirn ms tiempo de
esterilizacin, y mayor ser el tiempo de calentamiento y enfriamiento y no es usual
mantener grandes volmenes de medio arriba de 100 C por varias horas (Fig. 3).

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La constante de velocidad para la destruccin de los componentes del medio sigue una
cintica de primer orden como se indic arriba, sin embargo, la energa de activacin para
reacciones qumicas est en el rango de 40 130 KJ/mol (la hidrlisis de la casena es de
86.1 KJ/mol, la destruccin de la riboflavina es de 85.7 KJ/mol, B. stearothermophilus
287.2 KJ/mol. Un incremento en la temperatura causa un mayor incremento en la
velocidad de estas reacciones que tienen altas energas de activacin, por lo que un
aumento en la temperatura incrementar la velocidad de destruccin de las esporas
comparado con la degradacin de los componentes del medio.
La aplicacin prctica de este fenmeno es la esterilizacin continua del medio, lo que
comprende una serie de flujo continuo de intercambiadores de calor y serpentines (Fig. 4).
Actualmente, con los altos costos de energa y el incremento en la competitividad, la
esterilizacin contnua ofrece una alternativa a la esterilizacin por lote. Menores costos
de calentamiento y enfriamiento junto con una buena seguridad y tiempos, ofrecen una
alternativa ms econmica al mtodo por lote. Adems, ya que la degradacin de
nutrientes sensibles al calor es reducida puede ser posible incrementar la productividad o
al menos obtener la misma con menores niveles de prdida de nutrientes, as se reduce el
costo del medio.

Adems para la reduccin de costos, la esterilizacin continua de medios ofrece las

ventajas de operaciones de escalamiento ms sencillas ya que tiempos de calentamiento
alto y enfriamiento asociados con grandes volmenes son eliminados. Todas las ventajas
estn ahora a favor de la esterilizacin continua, la cual es ahora el mtodo
principalmente escogido para una fermentacin a gran escala.
CONCLUSIN.
Es necesario disear el medio ptimo para cada etapa de proceso desde la etapa de
seleccin de mutantes hasta la etapa final de fermentacin. Habiendo establecido el mejor
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medio, es importante que sea cuidadosa y exactamente preparado. Tradicionalmente, la

esterilizacin por lote ha sido usada para remover organismos no deseados del medio de
fermentacin, pero esto puede conducir a una destruccin excesiva de nutrientes y es
ms caro operar que con el procedimiento alternativo de esterilizacin continua que va
ganando terreno en la industria.
Mientras que la productividad juega un papel crucial, el costo es un factor principal en la
seleccin de la composicin del medio ya que en todo proceso es un factor principal la
seleccin de la composicin del medio, pues todo proceso de fermentacin finalmente
depende de la viabilidad econmica en relacin a otros mtodos de manufactura para el
mismo producto.

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