1

Facultad de Farmacia

io Modular de Biotecnologa y Formas Farm

Practica No. 2
e un banco de clulas bacterianas competentes y prod
Catedrtico: M. en F. Lorena Uribe Toledo
Equipo No.3:
Alfaro Mares Diana Guadalupe
lvarez Salgado Adriel
Baeza Figueroa Dante Treoveane
Brcenas Arriaga Javier
Mondragn Guillen Maximiliano Jess
Realizacin: 27 de agosto y 3 de septiembre 2015
Entrega: /septiembre/2015

PRACTICA NO. 1 GENERACIN DE UN BANCO DE CLULAS

BACTERIANAS COMPETENTES Y PRODUCTORAS DE PLSMIDO.

INTRODUCCION
Los bancos de clulas sirven para mantener una lnea celular en un cultivo
continuo por largos periodos de tiempo. Si bien existe la tcnica de la
criopreservacin que tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad y
funcionabilidad celular a temperaturas bajas. La criobiologa se refiere a entender
los efectos de las temperaturas bajas sobre los sistemas celulares ya que el
tiempo biolgico es una consecuencia de determinadas reacciones bioqumicas y
el fro prolonga el tiempo biolgico puesto que enlentece estas reacciones. Sin
embargo, este no es un proceso exento de problemas ya que puede inducir
variaciones extremas en las propiedades qumicas, trmicas y elctricas las cuales
pueden alterar las membranas celulares, los organelos y la delicada interaccin
clula-clula inherente en las clulas y tejidos a criopreservar.
La estructura y composicin de las membranas plasmticas determinan los
principales eventos celulares que tienen lugar durante los procesos de
criopreservacin, su comportamiento durante la congelacin y descongelacin
definir los ndices de supervivencia de la clula congelada. Los periodos crticos
para la sobrevida celular durante la criopreservacin son la fase inicial del
congelamiento y el periodo de retorno a condiciones fisiolgicas.

La transformacin es un proceso por el cual las clulas captan DNA libre presente
en el medio. Es un fenmeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias,
pero la eficacia del proceso vara enormemente de unas especies a otras. Para
que la transformacin tenga lugar, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado
estado de competencia (capaces de incorporar plsmidos, para lo cual se puede
usar el mtodo de Hanahan (1985)) que ocurre en determinadas condiciones
fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y
membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula.
La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que
nos permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular o
superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria.

Existen varias cepas de bacterias de Escherichia Coli que pueden ser utilizadas
ara conservar y aumentar la poblacin de un plsmido especifico; incluso a
veces se recomienda el uso de algunas de ellas para algn plsmido en especial.
Se recomienda la E. coli DH5-, la cual presenta varias ventajas para el manejo
de la mayora de los plasmidos, ya que es muy eficiente para ser transformada
(introduccin del plsmido), se multiplica con facilidad, y es resistente a
condiciones de almacenamiento.

Resultados:
ACTIVIDAD 1. Cultivo de clulas DH5 en medio LB slido.

se incubo en 45ml de medioLB

liquido(37c,3h)

Muestra de clulas DH5alfa

Si se tiene 0.4-0.5 unidades de

densidad ptica (D.O.), iniciar el
protocolo para clulas competentes

Medicin de densidad ptica

ACTIVIDAD 2: Protocolo de clulas competentes:

Colocar 1.2 mL del cultivo en 6 microtubos de 1.5 mL estriles. Centrifugar a 12000 rpm por 5 min a temperatura
ambiente.

Colocar los tubos

conteniendo el
botn celular en
hielo. Aadir 500 uL
de CaCl2 0.1 M
fro. Resuspender
los tubos con
mucho cuidado,
utilizar solamente la

Colocar los tubos en hielo. Eliminar

el sobrenadante, succionando con
la punta de la micropipeta. Aadir
50 uL de CaCl2 0.1 M fro.
Resuspender los tubos con mucho
cuidado, utilizar solamente la yema
del dedo ndice

Aadir a 3 de los microtubos

10 L de glicerol concentrado
y estril. Mezclar suavemente.
Colocar en hielo. A los
microtubos restantes adicionar
10 L de NaCl 0.9% estril.
Colocar en hielo. 9. Almacenar
los tubos en un
ultracongelador a -80C.

Reactivar cepas E.coli DH5alfa en medio LB liquido

colocar 12 l

Centrifugar 37C ,200rpm

agregar 500 l de
CaCl2 0.1 M

incubar 20-25min

agregar 50 l de NaCl
0.9 %

Almacenar los tubos en un

ultracongelador a -80C.

ACTIVIDAD 3: Resiembra de la clulas DH5 competentes y con NaCl 0.9% 1.

Colocar en hielo por 5 min los

siguientes tubos obtenidos del
ultracongelador

Asegurarse que las clulas han sido

descongeladas

Bibliografa
Jorge Zabala Castro. (2005). Manual de Tcnicas Bsicas de Biologa
Molecular. Merida: Departamento Editorial. Pg. 59-60
Aurora Galvn Cejudo, Manuel Tejada, Antonio Camargo, Jos Javier
Higuera, Emilio Fernndez Reyes. (2014). Transformacin de Escherichia
coli con un plsmido recombinante. 01/09/2015, de Departamento de
Bioqumica y Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales Sitio
web:
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biolmol/pdfs/48%20TRANSFORMACI%C3%93N%20E%20COLI%20CON
%20PL%C3%81SMIDO%20RECOMBINANTE.pdf

Luz Mbel vila-Portillo, Bacter.*, Jos I. Madero, M.D., MSc**, Claudia

Lpez, Bacter.***, Mara Fernanda Len, Bacter.***, Luca Acosta,
Bacter.****, Claudia Gmez, M.D.****, Lucy Gabriela Delgado, PhD*****,
Claudio Gmez, PhD*****, Jos Manuel Lozano, PhD*****, Mara T.
Reguero, PhD*****. (2006). FUNDAMENTOS DE CRIOPRESERVACIN .
01/09/15, de Revista Colombiana Obstetricia y ginecologia Sitio web:
http://www.researchgate.net/publication/242707051_FUNDAMENTOS_DE_
CRIOPRESERVACIN_Basic_points_in_cryopreservation