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MANUAL DE PRCTICAS DE
MICROBIOLOGA SANITARIA
PLAN 2010
Introduccin
Reglamento interno para el uso de los laboratorios del rea de ingeniera bioqumica
I.- Practica N1 Seleccin y preparacin de materiales y soluciones para el anlisis
microbiolgico
1.0 Introduccin
3
1.1 Material y soluciones
4
1.2 Preparacin del material para la toma de muestra
5
1.3 Procedimiento par ala toma, manejo y transporte de la muestra
6
1.4 Manejo de las muestras
9
1.5 Tcnicas de muestreo para determinar la sanidad de una planta
procesadora de alimentos.
14
1.6 Tcnicas de muestreo para microorganismos anaerobios
20
1.7 Seleccin, preparacin y medicin de la alcuota
21
1.8 Preparacin y dilucin de muestras
22
II.- Practica N2
27
Cuenta estndar de Microorganismos Mesoflicos Aerobios (CEMMA)
2.0 Introduccin
27
2.1 Materiales
27
2.2 Medios de cultivo
28
2.3 Procedimiento para anlisis de alimentos congelados, enfriados,
precocinados o comida preparada
28
2.4 Gua para calcular y reportar CEMMA en casos no comunes
29
2.5 Reporte de colonias
30
2.6 Normas aplicadas
33
III.- Practica N3
Determinacin de bacterias del grupo coliforme
35
3.0
3.1
3.2
3.3
Introduccin
35
Material
36
Medios de cultivo y reactivos
36
Procedimiento para la determinacin del numero mas probable {NMP}
de bacterias coliformes en agua potable, purificada y hielo.
37
3.4 Determinacin de bacterias coliformes totales y coliformes fecales
43
en alimentos
3.5 Tcnica de filtracin por membrana para agua
48
3.6 Determinacin de la actividad de la Beta-Glucuronidasa para detectar la presencia de
Escherichia coli en alimentos
50
3.7 Normas aplicadas
52
IV.- Practica N4
Determinacin de Staphylococcus aureus
4.0 Introduccin
54
54
9
20
55
55
56
57
57
57
58
58
59
59
V.- Practica N5
Determinacin de hongos y levaduras (mohos)
5.0 Introduccin
5.1 Material
5.2 Medios de cultivo y reactivos
5.3 Procedimiento
5.4 Normas aplicadas
62
62
63
63
63
64
VI.- Practica N6
Determinacin de microorganismos proteolticos y lipolticos
6.0 Introduccin de microorganismos proteolticos
6.1.2 Material
6.1.3 Medios de cultivo y reactivos
6.1 Determinacin de la presencia de microorganismos proteoliticos
6.2 Determinacin de la presencia de microorganismos lipiliticos
6.2.2 Material
6.2.3 Medios de cultivo y reactivos
VII.- Practica N7
Determinacin de Salmonella sp
7 Introduccin
71 Material
7.2 Medios de cultivo t reactivos
7.3 Preparacin de las muestras
7.4 Diferenciacin de las colonias de Salmonella
66
66
67
67
67
68
69
69
71
71
72
72
73
76
VIII.- Practica N8
Determinacin de Vibrio cholerae
8.0 Introduccin
8.1 Material
8.2 Medios de cultivo y reactivos
8.3 Procedimiento
8.4 Pruebas diferenciales
78
78
79
79
79
80
IX.- Practica N9
Determinacin de Listeria monocytogenes
9.0 Introduccin
9.1 Material
9.2 Medios de cultivo y reactivos
9.3 Procedimiento
9.4 confirmacin de la presencia de Listeria
82
82
83
84
84
86
88
88
88
89
89
92
92
92
95
96
96
96
Apndice 1.
Formulacin y preparacin de medios de cultivo para Microbiologa Sanitaria
Apndice 2
119
Preparacin de reactivos y soluciones para Microbiologa Sanitaria
ndice de tablas y figuras
123
ndice de medios de cultivo, reactivos y soluciones12
Bibliografa.
126
Temario
No.
Temas
Nombre
I.
Introduccin a la
Microbiologa
sanitaria
II.
Cadena
epidemiolgica
Fuentes y
mecanismos de
contaminacin de
los alimentos.
III.
Grupos
microbianos de
inters sanitario y
factores que
afectan la
sobrevivencia y
desarrollo
microbianos.
IV.
Enfermedades
transmitidas por
alimentos
Subtemas
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
2.1.
Agua
Tierra
Aire.
Equipo y utensilios.
Envases.
Fauna.
Manipuladores.
Contaminacin de origen.
Contaminacin cruzada
3.1. Indicadores de la calidad e inocuidad microbiolgicas de los alimentos.
Bacterias mesfilas aerobias.
Enterococos, Psicrotrofos, Psicrfilos, Termfilos y Termodricos en
alimentos.
Osmotolerantes, halotolerantes, xenotolerantes, mucgenos, acidricos,
esporulados y anaerobios.
Bacterias lcticas, amilolticas, pectinolticas, lipolticas, proteolticas,
putrefactivas, hongos y levaduras.
3.2.
Introduccin
3.3.
Factores intrnsecos
3.4.
Factores extrnsecos
4.1.
Enfermedades transmitidas por alimentos.
4.2.
Patgenos transmitidos por agua y alimentos
4.3.
Microbiologa del agua y NOMs
Hielo.
V.
Procesamiento
Sanitario de
productos
biticos.
4.4.
4.5.
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.
Bebidas no alcohlicas
Microbiologa de alimentos y NOMs
Medidas para el control de la contaminacin.
Fuentes de contaminacin en el procesamiento de alimentos y otros productos.
Planes y Programas de limpieza y desinfeccin en plantas de productos biticos.
Buenas prcticas de manufactura.
Programas de HACCP en plantas de productos biticos.
Confirmacin de la calidad.
Preparar, mejorar y controlar los microorganismos necesarios para la obtencin de productos industriales,
as como desarrollar procesos microbianos para su realizacin.
Realizar anlisis microbiolgicos con finalidades diagnsticas, en materiales de origen humano, animal y
vegetal
Todas las dems personas que autoricen los directivos de rea, para proyectos de investigacin o
vinculacin.
b) Orientacin a todos los usuarios en cuanto a la utilizacin de los recursos del laboratorio.
4.- Son responsables de exigir la aplicacin del presente reglamento, los directivos, Jefe de laboratorio, auxiliares de
laboratorio y profesores que dentro de sus actividades requieran del servicio.
a)
c)
Proveer de acuerdo con los recursos disponibles el equipo y materiales necesarios para el buen
funcionamiento del laboratorio.
e)
f)
Dar a los alumnos las explicaciones e indicaciones necesarias para el desarrollo de sus prcticas.
Difundir y vigilar que los alumnos cumplan con las medidas de disciplina, seguridad y operacin,
indicados en el presente.
En coordinacin con el Coordinador del rea, determinar las necesidades en los laboratorios y
solicitar los equipos y materiales o buscar el medio para obtenerlos.
Organizar a los alumnos en equipos de trabajo de acuerdo con los recursos disponibles.
Corresponde al Laboratorista:
Distribuir y controlar los equipos y materiales que se requieran para el desarrollo de prcticas.
Vigilar que los alumnos cumplan con las medidas de disciplina, seguridad y operacin indicados
en el presente.
No manejar o utilizar las instalaciones, equipo o materiales sin la autorizacin del laboratorista o
los profesores correspondientes.
10
Solicitar en caso de duda, las aclaraciones necesarias antes del desarrollo de sus prcticas.
Presentar antes de iniciar una prctica un reporte preliminar de las actividades a realizar, el cual
incluye:
Objetivo de la prctica. (Dado por el profesor e indica lo que se pretende comprobar con
la prctica).
Desarrollo de la prctica (en esta seccin se debe explicar con detalle los pasos necesarios
para resolver el problema planteado por el profesor como son: anlisis del problema,
clculos, resultados de simulacin y diagramas de diseo).
Conclusiones (en esta seccin el alumno debe proporcionar su punto de vista y conjeturas
con respecto a las experiencias obtenidas durante los procesos anteriores).
Bibliografa (esta seccin presenta la literatura que fue utilizada en la solucin del
problema, el objetivo de esta seccin es proporcionar al lector interesado, un punto de
partida para profundizar en el mismo proyecto u otros proyectos similares).
Adems el reporte de la prctica debe tener una buena redaccin y no presentar faltas de ortografa.
Los trabajos que no presenten las observaciones anteriores sern penalizados de acuerdo al criterio
del profesor.
CAPTULO II DE LA ORGANIZACIN
5.- En el laboratorio deber haber un encargado (Jefe de laboratorio o auxiliar del mismo), quien es responsable del
funcionamiento del laboratorio.
6.- El encargado del laboratorio ser responsable del control de los equipos, as como de su mantenimiento
preventivo y correctivo.
7.- Es obligatorio para el encargado del laboratorio conocer el funcionamiento y manejo de las instalaciones y equipo
con la finalidad de garantizar su operatividad.
11
Trabajar dentro de los laboratorios con zapatos abiertos, faldas cortas, pantaln corto.
f)
g) Hacer uso del equipo de laboratorio sin autorizacin y cuando no se haya establecido en el protocolo de la
prctica.
h) Retirar del laboratorio material biolgico a menos que as lo indique el profesor.
Artculo 9o.Los profesores debern entregar durante la primera semana del semestre la informacin de los protocolos
de las prcticas a realizar en los formatos que les proporcione el responsable del rea.
Artculo 10o. En caso de que el profesor requiera emplear el laboratorio para ensayar prcticas o realizar
actividades de investigacin, deber consultar con el responsable del rea los horarios disponibles y hacer la
solicitud formal del espacio para trabajar.
12
Para alumnos:
Nombre completo y nmero de control (de todos los integrantes del equipo, o el nombre de una
persona que solicita el material en forma individual, si no cabe en el frente, por el reverso).
Fecha
c)
Nombre
Fecha
Es responsabilidad del usuario reportar cualquier desperfecto sufrido por el equipo antes de empezar a
trabajar, de esta forma se le deslindar de toda responsabilidad. Por ningn motivo el usuario deber tratar
de resolver un mal funcionamiento en el equipo.
d) En caso de que el equipo presentar alguna descompostura durante la realizacin de la prctica y sta sea
por alguna causa ajena al alumno, como deterioro de los componentes, picos de voltaje en la lnea, etc., el
usuario deber reportar este problema y pedir un reemplazo de equipo. En este caso no se har cargo alguno
al estudiante.
e)
En caso de que el equipo sufra de algn desperfecto por causas directamente imputables al usuario, ste ser
responsable de liquidar el monto de su reparacin e incluso su reposicin total del equipo si ste no tuviera
reparacin. Para esto se realizar una investigacin en la que participaran el encargado, el profesor
responsable y el alumno implicado con el fin de deslindar responsabilidades.
Artculo 14o. Al finalizar la prctica, todo material y/o equipo que se haya utilizado deber entregarse limpio al
encargado del laboratorio o se solicitar una inspeccin del estado del mismo, para equipos fijos, segn sea el caso;
las herramientas y los manuales que se hayan solicitado, deben devolverse con cancelacin del vale correspondiente,
adems dejar limpia su rea de trabajo. En el caso de que el equipo haya sido averiado, debern reportarlo
inmediatamente a la persona responsable del laboratorio. Desde el momento en que es entregado el equipo y hasta
que ste sea devuelto, queda bajo la responsabilidad del usuario. Si por algn motivo el equipo devuelto no es el
mismo que solicito, el equipo solicitado quedar an bajo la responsabilidad de quien lo solicit.
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Artculo 22o. No almacenar material en el refrigerador sin ser etiquetado correctamente con nombre del
alumno o profesor, Materia y fecha. Cualquier material no etiquetado ser desechado al finalizar el semestre.
Artculo 23o. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la propipeta correspondiente. Queda prohibido
pipetear con la boca.
Artculo 24o. Dejar siempre tapado el reactivo que se est utilizando y tomar una cantidad ligeramente superior a la
necesaria en un vaso de precipitado limpio y seco; medir del vaso con pipeta o probeta, no regresar los remanentes
a los frascos de origen.
Artculo 25o. Antes de usar un reactivo verificar los datos anotados en la etiqueta y consultar sus propiedades fsicas,
qumicas y toxicolgicas para manejarlos adecuadamente.
Artculo 26o. No tocar directamente con las manos los productos qumicos slidos, especialmente aquellos que,
adems de su toxicidad, pueden producir quemaduras graves. Todo manejo se har mediante esptulas.
Artculo 27o. El manejo de cidos se realizar en la campana de extraccin o una mesa limpia y bien ventilada,
utilizando guantes y lentes de seguridad o careta.
Artculo 28o. Todos los compuestos voltiles o que desprendan vapores txicos debern manejarse en las
campanas o en un lugar ventilado.
VII: DEL CONTROL DE EQUIPOS Y REACTIVOS
Artculo 29o. Cada equipo y reactivo que se encuentre en el laboratorio tendr asignada una bitcora de uso o
registro de descarga.
Artculo 30o. Las bitcoras de los equipos y las descargas de reactivos son tiles para la administracin de los
mismos, por lo que es necesario mantener actualizados estos registros. Todo usuario deber asentar en ellos los datos
de uso una vez concluida la prctica.
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Artculo 37o. Los frascos que contengan sustancias txicas, combustibles o corrosivas; deben identificarse con un
smbolo de peligro en una etiqueta visible.
Artculo 38o. El laboratorista dar instrucciones precisas para el manejo, cuidado y transporte de los equipos y
materiales.
Artculo 39o. No se permitir la entrada al laboratorio, a personal ajeno al mismo.
Artculo 40o. En caso de accidentes graves, los profesores debern controlar las causas del accidente, asegurarse
que la atencin mdica del accidentado sea inmediata o reciba los primeros auxilios necesarios e informar
inmediatamente a las autoridades del plantel.
VII: TRANSITORIOS
Artculo 41o. Este reglamento ser vigente a partir de la fecha de su publicacin.
Artculo 42o. Los aspectos no contemplados en este reglamento sern resueltos en primer trmino por el responsable
del rea, el jefe de Departamento y, si el estudiante requiere atencin mdica, por el Jefe del Departamento de
Servicios Escolares y el Jefe de la Divisin de Estudios Superiores, segn sea el caso.
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Es obligatorio preparar un diagrama de actividades, que debe ser conocido y discutido por
todos los integrantes del equipo; puede hacer dibujos o esquemas cuando se considere necesario,
para aclarar dudas sobre manejo de material o equipo.
Revisar materiales biolgicos y de consumo que deber traer cada equipo para la realizacin
de cada prctica o sesin de laboratorio.
Cualquier duda sobre el trabajo de Lab. debe hacerse al maestro antes de iniciar la prctica.
2. Material personal Cada estudiante debe tener bata blanca de manga larga que cubra el frente, una Bitcora
de trabajo, lpices de colores, un rollo de cinta adhesivo, tijeras, pinzas de diseccin de punta roma, asa y
porta-asa, botes de lamina (de los usados para conservas y alimentos enlatados de 300, 600mL. y 1L) y
cerillos o encendedor.
3. El estudiante debe llevar una Bitcora de trabajo en donde cualquier observacin relevante, para anotar
cualquier cambio en las condiciones de la prctica y los resultados deben ser siempre anotados
cuidadosamente apenas se conozcan.
4. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia:
16
Del lado izquierdo colocar las gradillas con tubos, los matraces, las cajas de Petri estriles y
toda clase de recipientes que se habrn de manipular.
Del lado derecho deben estar cerillos o encendedor, asa y portaasa, marcador, tijeras, pipetas
y un recipiente de dimensiones apropiadas para desechar los diferentes materiales que se
debern esterilizar, principalmente pipetas y los tapones de algodn que se ponen al final de
estas.
7. Al frente, a unos 30 cm del borde de la mesa se coloca el mechero, cuya llama debe ser estable y de
unos 15 cm de altura. Para el trabajo en condiciones aspticas, si no se dispone de una campana de
flujo laminar, se deben hacer las manipulaciones a una distancia horizontal no mayor de20 cm y a
una altura de 5 a 10 cm de la base de la llama. Este espacio constituye la zona de seguridad del
mechero.
17
La boca de tubos y matraces se debe flamear, con objeto de quemar los filamentos de algodn que
puedan adherirse provenientes del tapn, igualmente para destruir los contaminantes de la mano,
que se adhieren en el momento de retirar el tapn, esta operacin se realiza inmediatamente antes
de volverlo a colocar.
No se debe exagerar esta operacin sobrecalentando, ya que esto puede hacer que el tapn se
queme, o que cualquier manejo subsecuente del material ocasione una quemadura al operador.
8. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se
necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin.
9. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el
profesor. Existen frascos con cidos o lcalis de reuso.
10. No tocar con las manos o con la boca los productos qumicos. Use guantes o pipeteros cuando lo requiera.
11. Todo el material y equipo, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben
manejarse con cuidado, evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. El profesor y el personal de
laboratorio asesorarn a los estudiantes en el correcto manejo de material y equipo. Cualquier duda,
consltenlos.
12. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los
mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca
directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las
llaves de paso al apagar la llama, apague el mechero cuando no lo est usando.
13. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar
que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los matraces, vasos o tubos de
ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared.
14. Cuando se quiera diluir un cido, siempre se debe echar cido sobre agua, dejando resbalar
suavemente por la pared del recipiente. Nunca al contrario: agua sobre ellos.
15. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta
quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda
identificar el contenido del frasco.
16. Est estrictamente prohibido pipetear con la boca en el laboratorio. Deben utilizarse los bulbos de
goma, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el laboratorio.
17. Las pipetas se tomarn de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada
de lquido.
18. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada en pipetas, frascos
volumtricos o probetas, debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la
altura de los ojos para que el menisco de enrase sea horizontal. En el caso de buretas debe montarse
18
Materia-Grupo,
Equipo,
19
Abrelatas estriles.
Algodn
Bata, cubre bocas, cofia y guantes
estriles.
Bolsas de plstico de 18 x 20 cm. tipo
Ziploc o estriles para muestreo
microbiolgico.
Cajas de Petri con medio para muestreo
por contacto.
Cerillos.
Cinta testigo.
Cucharitas y esptulas de acero
inoxidable estriles.
Cuchillo estril.
Esponjas estriles.
Etiquetas.
Frasco de 250 500mL. boca ancha
estriles.
Hielera para el transporte de muestras.
Hielo potable o bolsas refrigerantes.
Hisopos estriles.
Mechero bunsen.
Plantillas de 15 x 15cm de aluminio estriles.
Plumn de tinta indeleble.
Solucin amortiguadora de fosfatos.
Solucin germicida.
Solucin sal - Glicerina.
Solucin de tiosulfato de sodio al 10%
Todo material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de las muestras,
que van a estar en contacto directo con los alimentos (frasco, cuchillo, esptulas, bolsas, pinzas) deben estar
limpios, estriles y libres de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.
2.
El material par ala toma de muestra que requiera esterilizacin, se envuelve en forma individual con papel
de estraza o aluminio y debidamente identificado. Los medios de cultivo y soluciones preparadas, se
esterilizan en una autoclave. El material metlico y de cristal es ms conveniente esterilizarse un horno a
una temperatura de 170c durante 2 horas. Para evitar agua condensada que pueda afectar la confiabilidad
del anlisis.
3.
Es conveniente colocar un pedazo de cinta testigo en los materiales para asegurar que la esterilizacin fue
efectiva. Cuando se esterilizan frascos de boca ancha, su tapa se protege con papel aluminio para evitar que
se contamine esta parte del frasco.
20
Las pipetas y las cajas Petri, se pueden esterilizar en recipientes de acero inoxidable.
5.
Una vez esterilizado el material debe ser guardado en gavetas o espacios donde no puedan contaminarse con
el polvo o corrientes de aire del medio ambiente.
6.
Algunos materiales como esptulas, varillas de vidrio, cuchillos y cucharillas, pueden reutilizarse, despus
de lavarlas, humedecerlas con etanol o isopropanol al 70% y flamearlas, utilizndolas en el momento o bien
pueden guardarse en recipientes estriles.
7.
Cuando se muestrea agua de la red municipal la cual ha sido desinfectada con sales de cloro, en necesario,
antes de esterilizar los frascos para muestreo, adicionar 0.8mL. de una solucin al 10% de to sulfato de
sodio por cada litro de agua muestreada.
2.3
1.
La persona encargada de realizar un muestreo de alimento, deber utilizar cofia, cubre bocas, guantes
cuando sean necesarios, no debern tener puestos accesorios como anillos, aretes, pulseras, ni elementos
sueltos que en determinado momento puedan caer a los productos, inmediatamente antes del muestreo
deber lavar las manos con agua y jabn y enjuagrselas con un liquido germicida, secndoselas con toallas
de papel desechables.
2.
La toma de muestra de los productos envasados se llevan a cabo en forma aleatoria, tomndose del mismo
lote y en cantidad suficiente {25-500 g} para el anlisis, envindose al laboratorio tal como se presentan al
consumidor
3.
tratndose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir estos y extraer muestras en
condiciones aspticas para evitar una contaminacin extrema.
4.
los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precaucin estrictamente
asptica.
5.
cuando se requiere y tomar muestras aspticamente, estas no deben tomarse en reas donde las condiciones
sanitarias puedan dar lugar a la contaminacin de las mismas.
6.
la toma de muestras deben hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de
muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir esta y cerrarlos de inmediato, no tocando el
interior de los envases y evitando que la tapa se contamine.
7.
cuando sea necesario, se toma la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin debern ser diferentes de
la que se enva para el anlisis microbiolgico.
8.
para los alimentos preparados sin envasar, de consumo inmediato, se recomienda que la persona que los
prepara sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea
normalmente. Los alimentos que se muestrean estando calientes, se deben conservar y trasladar a la
temperatura en que se muestrearon, estos nicamente se el traslado es menor de una hora, de lo contrario
deber enfriarse a temperatura ambiente y trasladar en condiciones de refrigeracin.
9.
10. en alimentos slidos cuando sea necesario se corta el producto y se muestrea con ayuda de instrumentos
estriles como sacabocados, cucharas y cuchillos.
11. en productos a granel se toma la muestra de varias fuentes del contenedor para obtener una muestra
representativa.
12. .-cuando la toma de muestra se realice en un ducto de salida o una compuerta, antes de obtener la muestra se
debe dejar paras las primeras fracciones del producto para limpiar la salida del flujo.
2.3.2 Identificacin de la muestra.
21
2.
La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, en forma tal que se evite que la muestra sea
alterada o violada.
2.3.3 Conservacin y transporte.
1.
El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida se ruptura, alteracin
o contaminacin, evitando adems se exposicin a la luz solar directa.
2.
Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se
transportan bajo condiciones de temperatura de 2 a 8C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el
momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su
recoleccin. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0c, empleado para
conservarla hielo seco, para la refrigeracin es recomendable el empleo de recipientes con hielo
REFRIGERANTE O HIELO POTABLE contenido en bolsas de plstico impermeables, para evitar que el
agua de hielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.
3.
Los productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura
ambiente, siempre y cuando esta no exceda de 45c
4.
Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no esta permitido el empleo de sustancias
qumicas.
5.
Las muestras que se entreguen al laboratorio, debern acompaarse de un informe que adems de contener
la identificacin de la muestra, incluya los siguientes datos:
a. Nmero de unidades y/o cantidad.
b. Clave nica que permita la identificacin del domicilio del fabricante, representante y/o
distribuidor.
c. Indicar nombre genrico y especfico del producto, as como la marca comercial y cualquier
otra informacin que se considere importante.
6.
Observaciones, en donde se seale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de
efectuar la toma de muestra o algn otro dato que sea significativo para determinar los anlisis
microbiolgicos que sean necesarios.
Etiqueta de identificacin
Muestra de:
N de muestra:
Cantidad de muestra:
Lote:
Lugar de muestreo:
Hora de muestreo:
Muestreado por:
Observaciones:
Figura 1 Etiquetado de muestras.
EQUIPO 1
Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodn impregnada de solucin de hipoclorito de
sodio con una concentracin de 100mg/l, tallando hasta que no se desprenda ms suciedad u oxido. Cuando
22
3.
Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultneamente el tapn del frasco y el papel de proteccin,
manejando los como unidad, evitando que recontaminen el tapn, o el papel de proteccin, o el cuello del
frasco
4.
Debern lavarse las manos y antebrazos con agua y jabn, INMEDIATAMENTE ANTES DE LA TOMA
DE MUESTRA y despus de acondicionar el rea de muestreo y los materiales.
2.
3.
Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo sosteniendo por la base. Girar el frasco e impulsarlo
suavemente hacia arriba, de manera tal que al salir a la superficie se haya yendo partes de volumen. (En
todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superior o del fondo donde puede haber nata o
sedimento; en el caso de captacin en cuerpos de aguas superficiales (no deben tomarse muestras muy
prximas a la orilla o muy distantes del punto de extraccin). Si existe corriente en el cuerpo de agua, la
toma de muestra debe, efectuarse con la boca del frasco en contracorriente.
4.
Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapn, sacar el frasco del agua y colocar el papel de
proteccin.
5.
Anlisis solicitados:
Cuando no es posible tomar la muestra con la extensin del brazo. Debe atarse al frasco un sobrepeso
usando el extremo de un cordel limpio.
2.
Debe quitarse simultneamente el tapn y el papel de proteccin, manejndolos como unidad, evitando que
se contamine el tapn. O el papel de proteccin, o el cuello del frasco
3.
Con el cuello del frasco manteniendo hacia abajo, se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro
del pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo.
4.
5.
Anlisis solicitados:
a.
b.
c.
23
Tomar varios envases, de preferencia poco despus de haber sido embotellado el producto.
2.
Limpiar la tapa con jabn bactericida, enjuagar con agua clorada y limpiar con alcohol.
3.
Retirar l tapa e introducir una pipeta estril al garrafn o envase, tomar la muestra y llevarla a un frasco
estril.
4.
5.
Anlisis solicitados:
a)
b)
c)
d)
1.
La muestra de hielo en cubos, hielo frape o cualquier forma fraccionada, se toma con pinzas o cucharas
estriles depositndola en frascos de boca ancha de 1 litro de capacidad. Es preferible tomar la muestra de
hielo directamente de la maquina que lo esta produciendo.
2.
3.
Para hielo en bloque, lavar perfectamente la superficie exterior con agua estril
4.
Para eliminar la contaminacin superior. Fraccionar con un picahielo estril y transferir al frasco utilizando
instrumentos estriles como pinzas, cucharas, etc., procurando no volver a contaminar las fracciones, o
enjuagarlas con agua estril.
5.
Anlisis solicitados:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) NMP de bacterias coliformes.
c) Vibrio cholerae.
2.4.2 Muestras slidas. EQUIPO
2
24
1.
2.
3.
1.
2.
1.
2.
3.
4.
2.5 Tcnicas de muestreo para determinar la sanidad en una planta procesadora de alimentos.
EQUIPO 3
2.5.1 Introduccin.
Actualmente en la industria alimentara se aplican programas de control de calidad apoyados en los anlisis de
riesgos y control de puntos crticos (HACCP). Estos sistemas completan la importancia que se debe tener en la
interrelacin de todos los elementos del proceso: materias primas, equipo de procesamiento, personal
involucrado y medio ambiente.
El medio ambiente puede construir una fuente importante para la contaminacin microbiana en los procesos de
los alimentos, es por eso que hay que disear programas efectivos para su control. Los puntos crticos mas
comnmente encontrados como focos de contaminacin microbiana, son las superficies de las mesas, los
25
2.5.2 Procedimientos.
2.5.2.1 Muestra de aire.
Para determinar si una fuente de contaminacin proviene del aire, se utilizan cajas Petri con medios selectivos
para los microorganismos que se desee determinar, se dejan destapadas entre 15-20 minutos en lugares de
trabajo, durante las horas que haya ms movimiento, se cierran y se incuban. Se envan al laboratorio y se
procede hacer los siguientes anlisis:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) Coliformes totales.
2.5.2.2 Muestreos de superficies y utensilios
A. Mtodo del hisopo
Esta tcnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas; consiste en frotar un aplicador de
madera u otro material con algodn (hisopo) estril, humedecido con la solucin diluyente en un rea
determinada.
15cm
15mm
Colocar una plantilla estril de aluminio o tefln (figura2) sobre la superficie que se va a muestrear y
destapar aspticamente un hisopo estril.
26
3.
4.
5.
1.
2.
3.
4.
5.
Si la superficie est seca, humedecer el hisopo en la solucin amortiguadora y presionar contra la pared
del frasco para quitar el exceso de lquido, con un movimiento de rotacin; si la superficie est hmeda,
no es necesario hacer sto.
Con el hisopo inclinado en un ngulo de 30 frotar 3 veces la superficie delimitada por la plantilla, cada
una en direccin opuesta. Enjuagar el hisopo en la solucin amortiguadora regresar el exceso del
liquido y repetir la operacin con el mismo hisopo sobre 3 superficies mas.
Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.
Colocar el envase sobre el hielo picado o en una caja con refrigerante y enviar al laboratorio.
B. Mtodo de la esponja
EQUIPO 4
Esta tcnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en reas grandes.
b.1 Toma de muestra.
1.
2.
3.
4.
5.
Sacar la esponja con pinzas estriles o con guantes desechables (figura 4), o bien utilizar una bolsa nueva de
polietileno invertida a manera de guante; humedecerla con solucin amortiguadora de fosfatos estriles o
bien con agua peptona al 0.1% estril.
Frotar vigorosamente con la esponja el rea en la que se va a tomar la muestra.
SI LA SUPERFICIE ES PLANA, se puede aplicar la solucin directamente sobre la superficie y recogerla
con la esponja frotando.
Colocar la esponja en la bolsa de plstico con todo el lquido de muestreo. Cerrar la bolsa
TRANSPORTAR AL LABORATORIO en refrigeracin para realizar los siguientes anlisis:
27
Se prepara la placa Rodac con agar sobresaliendo en forma cncava del borde de la base.
Se toma de la base con guantes estriles, se invierte y se frota en un ocho sobre la superficie a muestrear, se
voltea y se cubre con la tapa.
Se incuba sin invertir.
En superficies donde se sospeche que se encuentran un poco mas contaminadas, y que pueden originar mas de
300 UFC por placa, se deben tomar suficientes muestras para obtener datos representativos, la seleccin del sitio
al azar permitir comparaciones adicionales y eliminara posibles interferencias.
28
1.
2.
3.
Este mtodo se emplea para tomar muestras de objetos pequeos como son cucharas, tenedores, mamilas de
biberones, etc. O para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plstico, etc.
d.1 Muestreo de utensilios de comedor.
1.
2.
3.
4.
Sumergir la superficie de los utensilios que estn en contacto con la boca (cucharas, tenedores, etc.) en un
frasco de boca ancha con 40mL. de solucin amortiguadora de fosfatos.
Agitar el utensilio en el lquido para que se enjuague perfectamente; repetir la operacin con 3 utensilios
ms para obtener el lavado de 4 utensilios iguales por frasco. En caso de muestrear menor numero de
utensilios indicarlo en la etiqueta.
Cuando se trate de mamilas, enjuagar cada una de ellas, introducindola en el frasco, tapndolo y agitndolo
fuertemente.
El nmero de mamilas enjuagadas debe ser 4 salvo que se desee muestrear una sola, y se debe especificar en
el frasco.
1.
2.
3.
4.
29
1.
2.
3.
4.
30
31
Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de
microorganismos es homognea o fcilmente homogenizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).
Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao
de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa
de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
10mL
10-1
10g
10mL
10mL
10-3
10-2
10mL
10-4
10mL
10-5
10-6
10-1
Figura 7 Diluciones.
1.
2.
3.
Preparar frascos de dilucin con 90mL. de lquido de dilucin, estril. Nota. El diluyente debe encontrarse a
una temperatura similar a la muestra, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
Medir 10 mL. de muestra liquida bien homogenizada.
Mezclar aspticamente la muestra con los 90 mL. lquidos. Para sto agitar el frasco con 25 movimientos de
lateralmente, en un arco de 30 efectuados en un tiempo de 7 segundos. En este primer frasco se tiene una
dilucin de la muestra de 1:10 o 10-1. Si la muestra contiene slidos es necesario dejar en reposo por 5
minutos para que sedimenten.
La preparacin de las diluciones decimales adicionales posteriores, si son necesarias, tienen como objeto reducir
el nmero de microorganismos para unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin
de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
32
5.
Del sobrenadante de la primera dilucin, tomar una alcuota de 1 mL para 10 mL totales. o 10 mL. para
realizar una segunda dilucin en 90mL. de lquido diluyente estril, para 100 mL. totales. Agitar el frasco
lateralmente para homogenizar. Esta constituye la segunda dilucin de 1:100 o 10 -2. Se utiliza el mismo
procedimiento para las dems diluciones {ver figura5}.Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos
de laterales en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL.. de la muestra y
diluir con 9 mL...
Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11
mL., diluidos con 90 o 99 mL., de la misma forma que se describi anteriormente
2.8.1.2 A partir de muestras slidas o semislidas.
33
Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el
microorganismo en 10 mL. de la dilucin ms alta.
Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias
en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el
caso de otros grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la Norma Oficial
Mexicana correspondiente.
34
35
fecha:
III.- Practica N 2
cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos
RELACIN DE CONOCIMIENTOS:
Conocimientos / habilidades requeridos
- Clasificacin de las bacterias
- Caractersticas de las bacterias
- Alimentos que contaminan las bacterias.
Competencias por adquirir
- Conocimiento y habilidades para aplicar las metodologas adecuadas para aislar y cuantificar las bacterias
contenidas en un alimento.
- Importancia del aislamiento y cuantificacin de bacterias contaminantes de alimentos. Criterios de este grupo
microbiano como indicador sanitario. Lmites mximos permisibles y criterios de aceptacin y rechazo para
materiales biolgicos con cargas elevadas.
3.0 introduccin.
Bacterias mesfilas. Estas bacterias son las de mayor abundancia en la naturaleza y tambin las que con mayor
frecuencia estn presentes en forma natural o contaminando los alimentos. Su temperatura ptima de
crecimiento es de 35c aunque el rango de crecimiento es de 20c a 40C. Este tipo de bacterias pueden adaptar
su metabolismo a las temperaturas bajas de los psicrfilo y cuando se desarrollan se dicen que son bacterias
psicrotrofas. Su importancia en los alimentos reside en que son las responsables del deterioro de los alimentos
conservados en refrigeracin.
3.1 material.
Frascos de dilucin con 90 mL. de
lquido de dilucin estril.
Pipetas de 1.0 y 10 mL. estriles.
Cajas de Petri estriles
Papel aluminio estril {15x15 cm} o
contenedor estril para pesar la muestra.
Esptula estril.
Balanza
Autoclave.
Cuenta colonias.
Incubadora a 35c.
36
CEBMA/mL. o g
37
13, 000
12, 400
12, 000
15, 500
16, 000
14, 500
14, 000
1:1000 CBMA/mL. o g
18
<2,500
<2,500
38
39
Alimentos
Agua purificada
Agua potable
Jugos y nctares pasteurizados
Leche pasteurizada
Leche condensada azucarada
Leches deshidratadas
crema
mantequilla
Queso procesado
Mermeladas, purs, jaleas, ates
Productos carnicos: curados, emulsio-nados y
cocinados {salchichas, pasteles, mortadelas,
etc.}
Aves frescas-refrigerados y congelados
Pescados frescos-refrigerados y congelados
Huevo fresco-refrigerado
Huevo liquido refrigerado o congelado
Huevo, yema y clara congelados
Huevo, yema y clara deshidratados
Huevo, yema y clara pasteurizadas y
envasadas aspticamente.
Cuestionario
1.- A QUE TEMPERATURA SE DEBE mantener el agar para mtodos estndares antes del vaciado en
al caja con ls muestras?
2.- porque se le llama agar para mtodo estndar?
3.- defina el trmino microorganismo (bacteria) mesoflico(a) aerobico(a).
4.- en funcin de la temperatura de crecimiento, como se clasifican las bacterias?
5. Por qu el mtodo de las diluciones es cualitativo y cuantitativo?
6. Por qu es importante el mtodo de la estra cruzada para verificar la pureza de un cultivo?
7. Mencione dos tcnicas fsicas y dos qumicas de enriquecimiento para microorganismos que estn en
baja concentracin en una muestra.
4. Si como se menciona en la introduccin, el oxgeno molecular es un agente oxidante muy txico,
cmo es que los microorganismos aerotolerantes lo soportan a concentraciones tan altas como la
atmosfrica del 21%?
BIBLIOGRAFIA
-Diario Oficial de la Federacin Mexicana. NOM-014-ssa1-1993
40
41
FECHA
IV.- PRACTICA N. 3
DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES Y COLIFORMES FECALES EN
AGUAS Y BEBIDAS
4.0 INTRODUCCION
Las bacterias del grupo coliforme podemos encontrarlas formando parte de la Microflora natural de los vegetales y
de los intestinos de los animales y el hombre.
Durante los ltimos aos estos microorganismos y especficamente Escherichia coli, Han sido considerados como
microorganismos indicadores de cuando un alimentos ha sido contaminado directa o directamente por materiales
fecales. La importancia De su determinacin radica pues, en establecer si un alimento estuvo o no propenso A su
contaminacin por este tipo de microorganismos. La mayora de las bacterias De este grupo poseen el sistema
enzimtico llamado beta- galactosidasa, por medio Del cual llevan acabo la fermentacin de la lactosa. Con
produccin de cidos Orgnicos y gas. Para la determinacin del nmero de bacterias coliformes totales
En los alimentos se utilizara la capacidad de produccin de cidos orgnicos en Medio slidos; y la produccin de
gas la determinacin de coliformes en General se realiza en medios lquidos para determinar el numero mas
probable de bacterias coliformes y coliformes fecales (NMP ).
Un indicador especfico de contaminacin directa o indirecta de un alimento por Materias fecales es la determinacin
de la presencia de Escherichia coli, para lo cual Se utiliza sus capacidades tanto de fermentacin de lactosa.
Crecimiento a 44.5C, y u actividad enzimtica de beta glucuronidasa (GUD).
4.1 MATERIAL.
Frascos de dilucin con 90 mL. de solucin
diluyente estril.
Tubos con tapn de baquelita de 15 x 100.
Pipetas de 1. 0, 5. 0 y 10.0 mL.. estriles.
Caja de Petri estriles.
Papel aluminio estril (15 x 15 cm.) contenedores
estriles para pesado de muestras.
4.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.
Agar Violeta- Rojo- Bilis (VRB).
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB).
Caldo Lactosado (CL).
Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST).
Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (caldo BRILA
2%).
Caldo Escherichia coli (EC).
Caldo Lauril Sulfato Triptosa + MetilumbeliferilB-D-glucurnido (CLST- MUG ).
Caldo Lactosado + MUG (CL - MUG).
Caldo Escherichia coli + MUG (EC MUG).
Caldo Rojo de Metilo Voges Proskauer (MR
VP).
Esptulas estriles.
Balanza.
Auto clave.
Incubadoras calibradas a 35 y 44. 5 C.
Homogenizador de alimentos.
Lmpara de luz UV (365 nm ).
Lentes protectores de luz UV.
Caldo Citrato de Koser (CK).
Caldo m HD Endo
4.3 Procedimiento para la determinacin del Nmero Ms Probable (NMP) de bacterias coliformes en agua
potable, purificada y hielo.
42
10 mL.. De muestra
1 mL.. De muestra
20 mL.. De CL
concentrado
15 mL.. CL
normal
FIGURA 6: Diagrama de la prueba presuntiva para determinar el NMP de coliformes en agua purificada y hielo
43
FIGURA 7: El tubo del centro es positivo, indica una produccin de gas dentro de la campana de Durham.
TABLA N0. 8
TUBOS INOCULADOS: 5 CON 10.0 ML.. 1 CON 0.1 ML..
N0. DE TUBOS POSITIVOS
( 95%) LIMITES DE CONFIANZA
5 10.0 mL..
1 1.0 mL..
1 0.1 mL..
NMP / 100 mL..
MINIMO
0
0
0
<2
0
0
1
0
2
0.05
1
0
0
2.2
0.05
1
1
0
4.4
0.52
2
0
0
5
1.54
2
1
0
7.6
1.5
3
0
0
8.8
1.6
3
1
0
12
3.1
4
0
1
15
3.3
4
0
0
20
5.9
4
1
0
21
6.0
5
0
0
38
6.4
5
0
1
96
12
5
1
0
240
12
MAXIMO
5.9
13
13
14
19
19
29
30
40
48
55
330
370
3700
FUENTE: Standard Methods for the Examination of Water and W. 11 th. Edition 1960 A.P. H.
Ejemplo:
MUESTRA ( ML..)
10
0.1
TUBOS POSITIVOS
RESULTADOS= 12 NM / mL..
RESULTADOS = 12 NMP/ML..
4.3.3
1.- De cada uno de los tubos que resultado positivos de la prueba confirmativa para
coliformes, se toma una asada y se resiembran para tener colonias aisladas
44
pruebas bioqumicas para presencia de E.coli. { se realiza esta serie de pruebas por cada colonia a
confirmar.}
45
Voges-proskauer
rojo de metilo
citrato.
biotipo 1
biotipo 2
4.4
4.4.1 introduccin.
Las bacterias consideradas como del grupo coliforme, se encuentran ampliamente distribuidas en al naturaleza,
de tal manera que los alimentos principalmente de origen vegetal, pueden contenerlos en numero considerable
antes de su limpieza los productos alimenticios procesados y que despus son distribuidos a granel, tambin
pueden presentar este tipo de microorganismos, de tal manera que , las normas APLICADAs y dependiendo del
tipo de producto, concede cierta tolerancia el numero, siempre y cuando estn ausentes aquellas bacterias
coliformes de origen fecal. En general el grupo coliforme, se determina cuando se hace un recuento de
bacterias coliformes totales.
4.4.2 determinacin de bacterias coliformes totales.
1.- se inocula por duplicado en cajas de Petri estriles, 1.0 mL. de cada una de tres diluciones realizadas a la
muestra de alimentos a analizar. Las diluciones se hacen de acuerdo al grado de contaminacin que se sospeche
tenga el alimento.
2.- se vaca el medio de agar violeta-rojo-bilis, estril y enfriando aproximadamente 45-50C y se homogeniza
bien al muestra.
3.- una vez solidificada la mezcla del medio y la muestra, se adiciona una capa delgada del medio y se deja
solidificar.
4.- se incuban las cajas en posicin invertida, durante 24 h a 35C
5.- despus de este tiempo, se cuentan las colonias desarrolladas de un color rojo intenso; escogiendo para la
lectura las cajas que presenten un nmero de colonias comprendidas entre 25-30 a 250-300.
6.- se hace el reporte en UFC/g o mL. de producto.
4.4.3 determinacin del numero mas probable {NMP} de bacterias coliformes fecales.
4.4.3 prueba presuntiva.
1.- se toman 10 g de la muestra previamente homogenizada y se hacen diluciones de 1:10, 1:100 y 1:1000.
2.- previamente, se prepara una serie de nueve tubos baquelita y tubos invertidos para fermentacin, conteniendo
15mL. de caldo laurel sulfato, esterilizando todo el sistema.
3.- se inoculan tres tubos preparados de CLS con 1.0 mL. cada uno de la segunda y los otros tres tubos con 1.0
mL. cada uno de la tercera dilucin. ROTULACION cada uno de los tubos de acuerdo a la dilucin adicionada
para identificarlos posteriormente
4.- una vez realizadas las inoculaciones se incuban los tubos durante 24-48 h a una Temp. 35C {figura 10}
5.- transcurrido este tiempo, se revisan los tubos y se separan los positivos que presenten una produccin de gas
46
FIGURA 10: diagrama de la prueba presuntiva, para determinar el NMP de coliformes fecales en alimentos.
1.- se prepara un nmero similar a los tubos de la prueba anterior, de tubos con tapn de baquelita conteniendo
tunos para fermentacin invertidos y 15mL. de caldo E-C esterilizado todo el sistema.
2.- a partir de los tubos positivos con CLS y utilizando un asa, se inoculan los tubos con caldo E-C
ROTULADOS a que dilucin de la muestra corresponde cada uno de los tubos inoculados.
3.- una vez inoculados, se incuba en un bao de agua a una temperatura de 44.5C durante 24 h.
4.- al trmino de Este tiempo se revisan los tubos y se registran a que dilucin original corresponden los que
resulten positivos con formacin de gas.
5.- la combinacin de las diluciones de los tubos positivos, se leen en la tabla correspondiente del NMP de
coliformes fecales por g o mL. de muestra (ver ejemplo).
6.- de cada uno de los tubos positivos, se resiembran en cajas con agar EMB para separar colonias y a partir de
estas se procede a realizar las pruebas bioqumicas para identificar los biotipos de E. coli presentes.
Ejemplo:
47
diluciones
10-1
10-2
10-3
48
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
3.0
3.0
6.0
9.0
3.0
6.1
9.2
12.0
6.2
9.3
12.0
16.0
9.4
13.0
16.0
19.0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3
3
NMP/g o 3
0.01 0.001 ml
{0.1}
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
3.6
7.2
11.0
15.0
7.3
11.0
15.0
19.0
11.0
15.0
20.0
24.0
16.0
20.0
24.0
29.0
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
0
0
0
1
1
1
0
1
2
2
2
2
3
3
3
3
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
3
0.01
3 NMP/g
0.001o ml
9.1
14.0
20.0
26.0
15.0
20.0
27.0
0
34.0
21.0
28.0
35.0
42.0
29.0
36.0
44.0
53.0
9.1
0
14.0
1
20.0
2
26.0
3
15.0
0
20.0
1
27.0
2
3 con 1 ml dilucin 1:10 = 0.1g muestra 3 34.0
21.0
3 con 1 ml dilucin 1:100 = 0.01g muestra 10 28.0
Tubos inoculados:
3 con 1 ml dilucin 1:1000 = 0.001g muestra 35.0
2
42.0
3
Tubos positivos Tubos positivos
Tubos positivos
Tubos positivos
29.0
0
36.0
1
3
3
NMP/g o 3
44.0
2
0.01 0.001 ml 3
{0.1}
53.0
3
3
NMP/g o 3
0.01 (0.001) ml
{0.1}
0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3
49
3
{0.1}
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
4.5.2 procedimiento.
4.5.1 introduccin.
50
4.6.3
Prueba confirmativa.
1.- Tomar con una asa una muestra de cada uno de los tubos positivos resultantes de la prueba presuntiva, y
resembrarlos en agar EMB
.
2.- Incubar las placas durante 24 horas a 35C.
3.- Observar si hubo desarrollo de colonias caractersticas de E. coli y realizar las pruebas IMVIC (pg. 42) para
determinar su biotipo.
4.6.4
Interpretacin.
Todos los cultivos que muestren fluorescencia, fermentan la lactosa con produccin de gas en 48 horas a 35C y
den los patrones del biotipo 1 (++--) biotipo 2 (-+--) se consideran como E. coli. Se calculan tambin el NMP
de acuerdo a la utilizada anteriormente (pg. 47).
51
52
Alimentos
Agua potable
<100
No detectable NMP/100mL.
Mantequilla
100
Leche pasteurizada
10 en planta
20 en el mercado
Crema
100
queso fresco
100
Quesos madurados
50
Quesos procesados
10
Pescados frescos-refrigerados
congelados
400
<10
Productos
carnicol
cocidos, crudos
50
maduros,
Huevo fresco-refrigerado
Huevo liquido
congelado
refrigerado
10
o
10
10
10
100
100
53
1.2.3.4.-
Bibliografa
-Borrad R.G. 1989. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Edit. Acribia. Espaa.
-Carl, Vanderzant, Phd,.Don F.Splittstoesser, Phd. 1992. Compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 3th edition.
-David, A. Power., and Peggy, J. McCuen. 1988. Products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.
United States of America.
54
fecha:
Autoclave.
Un contador de colonias.
Incubadora a 35C.
Varilla de vidrio doblada para sembrado en
superficie.
55
Prueba de coagulasa
1.- Transferir colonias sospechosas de S. aureus en un tubo pequeo conteniendo 0.2-0.3 mL. de caldo infusin
cerebro de corazn ( BHI )y emulsionar cuidadosamente.
2.- De esta suspensin inocular tubos con agar triptosa de soya inclinados.
3.- Adicionar 0.5 mL. de plasma de conejo en los tubos con BHI, mezclar cuidadosamente.
4.- Incubar la suspensin en BHI y los tubos con TSA de 18-24 horas a 35C.
5.- Observar peridicamente durante 6 horas se hay formacin de cogulos. Un coagulo que permanezca estable
en el tubo cuando este se inclina, es considerado positivo para S. aureus ( figura 13 ).
5.5 Prueba de la catalasa
1.- Adicionar 1.0 mL. de perxido de hidrogeno al 30% sobre un cultivo en agar inclinado ( TSA ).
2.- La produccin de burbujas de gas se interpreta como una prueba positiva.
Alternativamente se puede emulsificar una colonia con una gota de perxido de hidrogeno al 30% sobre un
portaobjetos (figura 14 ).
5.6
1.- Inocular un tubo conteniendo medio con glucosa como fuente de carbono (0.5%).
2.- si es medio slido inocular hasta el fondo del tubo.
3.- Cubrir la superficie de agar con una capa de aceite de parafina estril de por lo menos 25 mm de espesor; e
incubar 5 das a 37C.
La produccin de cido anaerobicamente se ve por un cambio de color amarillo en el agar, indicando la
presencia de S. aureus (figura 15).
5.7
Repetir el paso 2 usando manitol como fuente de carbono en el medio. S. aureus generalmente de una reaccin
positiva, aunque en ocasiones pueden presentarse variedades que dan la prueba negativa.
5.8
Esta prueba pretende ser especfica como la prueba de coagulasa pero menos subjetiva porque involucra un
cambio de color azul a rosa brillante. Esta no es un sustituto para la prueba de coagulasa, ms bien es como una
prueba de apoyo para la reaccin de coagulasa.
56
5.9
Caractersticas
S. aureu
S. epidermidis S. micrococcii
Actividad de la catalasa
Produccion de coagulasa
<100
Ausente
Queso fresco
1000
Quesos madurados
100
Quesos procesados
<100
Huevo fresco-refrigerado
<100
<100
<100
<100
Huevo, yema
aspticamente.
clara
pasteurizadas
envasadas
<100
57
Observaciones y conclusiones:
Cuestionario
1.- Que caractersticas de Staphylococcus aureus hace que este microorganismo se considere como
enteropatgeno?
2.- Cul es la enzima involucrada en la actividad sobre el H2O2
3.- Qu funcin tiene el telurito de potasio adicionado al agar Bair- Parker
4.- Cul es la principal fuente de contaminacin por S. aureus en una planta de productos lcteos
Bibliografa
-Board R.G. 1989. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Edit Acrabia. Espaa.
-Carl, Vanderzant, Phd,. Don F. Splittstoesser, Phd. 1992. Compendium of methods for the mocrobiological
examination of toods. 3th edition.
-David, A. Power, and. Peggy, J. McCuen. 1988. Products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.
United States of America.
-Diario Oficial de la Federacin Mexicana. NOM-115.SSA1-94.
58
59
FECHA
VI.- Practica N 5
determinacin de mohos y levaduras
6.0 introduccin.
Los hongos de inters en la industria alimenticia son aquellos que estn involucrados tanto en el deterioro de los
alimentos como en la produccin de mico toxinas dainas para la salud humana. Se desarrollo vegetativo mas
comn en una forma levaduriforme a las que se les conoce con el nombre de levaduras o bien formado
estructuras ramificadas o micelios conocindose como mohos. Estos microorganismos quimiorganotrofos tienen
la caracterstica de reproducirse en forma mas lenta que las bacterias, es necesario acondicionar el medio de
cultivo para inhibir inicialmente el crecimiento de estas y propiciar el crecimiento de los hongos.
6.1 Material
Cajas de Petri estriles.
Frascos con 90 mL. de solucin diluyente estril.
Pipetas de 10 y 1.0 mL. estriles
Contador de colonias
Microscopio.
procedimiento.
alimentos
Queso fresco
500
Quesos maduros
500
Quesos procesados
100
<10
<10
25
Harina de trigo
300
60
mohos
1000
1000
Harina de centeno
200
Harina de avena
100
Harina de cednada
200
Harinas integrales
500
Harina de arroz
200
20
Pan dulce
50
50
Bibliografa.
-carl, vanderzant, phd,. Don F splittstoesser, phd. 1992. compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 3th edition.
-david, A. Power., and peggy, j. Mccuen. 1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.
United states on america.
-diario oficial de la federacin mexicana. NOM-111-SSA1-94
66
61
NOMBRE
FECHA
VII.- Practica N6
Determinacin de microorganismos proteoliticos y lipoliticos
7.1 Determinacin de la presencia de microorganismos proteoliticos.
7.1.1 introduccin.
Los microorganismos proteoliticos son aquellos que son capaces de utilizar las protenas como una fuente de
nitrgeno y carbono, debido a que sintetizan enzimas que van a hidrolizar los enlaces peptodicos presente. Los
productos finales de esta hidrlisis van hacer los aminocidos, los cuales van hacer aprovechados como tales
para la biosntesis de sus protenas o bien pueden ser desaminados para obtener los esqueletos de carbono
necesarios para la biosntesis de otros compuestos como los lpidos y carbohidratos.
El estudio de las bacterias proteoliticas en los alimentos es importante debido a la degradacin que puedan sufrir
estos (carnes rojas, pollos y pescado) bajando la calidad nutricional y organolptica de los alimentos.
Los organismos proteoliticos constituyen un grupo muy heterogneo, en el cual se pueden encontrar bacterias de
los gneros: clostridium, bacillus, proteus, pseudomonas, como proteoliticos activos. LOS
MICROORGANISMOS que efectan hidrlisis de protenas y fermentacin se les conoce como cidoproteoliticos, por ejemplo: streptococcus faecalis, var licuefaciens y micrococcus casseolvticus.
En los hongos encontramos proteoliticos activos entre ellos aspergillus, penicilium, mucor etc., que en algunos
casos se utilizan por su capacidad de formar proteasas en al industria.
7.1.2 material.
Pipetas estriles de 1.0 mL.
Homogenizador de alimentos estriles
Frasco con 90mL. de diluyente estril
Esptula estril
Cajas de Petri estriles
62
Medio base
Tampn fosfato
Sulfato de cobre a 0.2%
Solucin amortiguadora.
Mantequilla
63
71
64
FECHA
VIII.- Practicas N7
Determinacin de Salmonella sp
8.0 introduccin.
El genero Salmonella pertenece a la familia etobacteriaceae. Es un bacilo Gram. negativo. Anaerobio facultativo,
la mayora de las especies son mviles mediante flagelos peritricos. Es un microorganismos quimiorganotrofico
que puede llevar un metabolismo respiratorio y fermentativo, es oxidasa negativo y catalasa positivo, puede
crecer con citrato como fuente de carbono, descarboxila la alisina y la ornitina, no hidroliza la urea y
generalmente produce cido sulfhdrico. Produce cido y gas a partir de glucosa en agar fierro triple azcar (TSI),
xilosa lisina desoxicolato (XLD), SALMONELLA-SHIGELLA (SS), hektoen y aquellos en los que tengan verde
brillante.
En los ltimos aos se ha detectado una gran variedad y gentica en Salmonella lo que ha hecho que este
microorganismo se este adaptando a condiciones extremas del medio ambiente as sepas mutantes pueden crecer
en rangos de temperaturas de 4C hasta 50C y a PH de 4.5 A 9.5.
Las infecciones por especies de salmonera, producen en el humano las enfermedades conocidas como fiebre
tifoidea y paratifoidea. La presencia de estos microorganismos en los alimentos se debe a la contaminacin de
estos cuando son manipulados por personas con malos hbitos higinicos. La contaminacin puede ser directa o
indirecta por medio del polvo y utensilios contaminados previamente. Su distribucin en los alimentos es amplia
ya que se han reportado en productos lcteos, derivados de carne, alimentos a base de huevo, hortalizas crudas y
cosidas y bebidas preparadas.
8.1 material.
Cajas de Petri estriles.
Matraces erelenmeyer 500mL.
Frascos de dilucin con 90mL. de lquido de
solucin estril.
Balaza
Esptula estril.
1.- pesar aspticamente 25gr de muestra y adicionarla aun recipiente de 500mL. conteniendo 225mL. de caldo
lactosado esteril.
2.- mezclar bien y dejar reposar por 60min a temperatura ambiente.
3.- ajustar el PH a6.8 con NaOH 1N o HCl 1N esteriles. Incubar a 35C durante 24hrs
65
leche en polvo:
1.- preparar en un recipiente de 500mL., 225mL. de una solucion acuosa de verde brillante (2mL. de una solucion
al 1% de verde brillante en 1lt de agua destilada esteril)
2.- adicionar 25g de lamuestra. Incubar 24hrs a 25C
c)
1.- pesar aspticamente 25g d emuestra y depositarlos en 225mL. de caldo soya triplicasa esteril.
2.- mezclar perfectamente y ajustra el PH 6.8
3.- incubar a 35C durante 24hrs.
d)
1.- pesar aspticamente 25g de muestra y mezclarla con 225mL. de caldo soya tripticasa conteniendo 0.5%
K2SO3
2.- incubar a 35C durante 24hrs.
e)
carnes y derivados:
1.- pesar aspticamente 25g de muestra y homogeneizarla con 225mL. de caldo lactosado estril.
2.- ajustar el PH a 6.8
3.- adicionar 2.25mL. de tergitol 7 aniomico o triton x-100 esterilizados con vapor.
4.- incubar 24horas a 35C
8.3.1 aislamiento
1.- despus de la incubacin anterior transferir 1mL. a un tubo con tapn conteniendo 10mL. de caldo selenito
cistina y otro mL. a 10mL. de caldo tretationato
2.- incubar los tubos 24hrs a 35C
3.- mezclar y resembrar del caldo tretrationato en placas de agar sulfito de bismuto (BS), agar xilosa desoxilato
(XLD). Repetir el mismo resembrado con la muestra del tubo con caldo selenito cistina.
4.- incubar en placas 24hrs a 35C (ver diagrama)
8.3.2 interpretacin: las colonias tpicas o sospechosas de ser Salmonella son de un color gris oscuro o negras en
agar sulfito bismuto, puede tambin presentar un brillo metlico.
En el agar XLD las colonias de Salmonella se presentan de un color rosa-rojo con o son centro negro (figura 17)
66
resembrar 2-4 colonias tpicas de las placas de BS y XLD en tubos con agar triple azcar (TSI) y agar de
hierro (LIA) inoculando la superficie y el fondo del tubo.
b) Incubar los tubos con TSI 254hrs a 35C y los LIA a 35C durante 48hrs.
c) Interpretacin: caractersticamente salmonellla forma un medio alcalino en la superficie (rojo) y cido
en el fondo del tubo (amarillo) en TSI con o sin produccin de H 2S (figura 18)
67
10mL.
Caldo selenito
10mL.
caldo tetrationato
BS
XLD
LIA
Incubar a 35C x 48hrs
TSI
1.-Incubar
agar verde
brillante:
este medio contiene lactosa y sacarosa, un indicador el rojo de fenol, el inhibidor es el
a 35C
x 24hrs.
verde brillante. Los microorganismos lactosa negativos como Salmonella y ocasionalmente proteus, forman
colonias de color rosa plido transparente y rodeadas de un halo rojo brillante. Las bacterias fermentadoras de la
lactosa, producen colonias verde amarillentas, opacas y rodeadas de un halo amarillento.
2.- agar sulfito y bismuto: este medio contiene sulfito de bismuto como agente selectivo. La mayora de las
cepas de sallmonella son capaces de reducir sulfato y el sulfito a sulfuro, produciendo colonias negras con un
brillo metlico, rodeadas de un halo caf, que posteriormente se torna negro. En ocasiones las colonias pueden ser
de color caf o pardo.
3.- agar para Salmonella y shigelia (S.S): las colonias son traslucidas transparentes u opacas algunas veces con
centro negro.
4.- agar de Mc conkey: las colonias son transparentes e incoloras o ambas.
5.- agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD): las colonias de Salmonella son rojas transparentes y bordes amarillos
con centro negro si producen H2S, sin centro negro si no son productoras de H2S.
Dibujos y observaciones:
Cuestionario
1.- Por qu se debe hacer un enriquecimiento previo al aislamiento e identificacin de Salmonella sp?
2.- Cul seria un foco de contaminacin por Salmonella sp en una planta deshidratadora de productos vegetales?
3.- Cul es la cantidad mxima de Salmonella sp. Permitida en un alimento?
4.- Por qu no se debe esterilizar en autoclave el caldo tetrationato?
68
david, A. powen, and pegy, J. M. 1998. products and laboratory procededures. Manual of BBL. 6 th
edition. United states of america.
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed acribia, Zaragoza, Espaa.
James, T. Peeler., and larry, J. Maturin. 1992. Aerobic Plate count. FDA, bacteriologica analitical
manual. 7th edition.
Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de Mxico, S.A de C.V
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed. Acribia, Zaragoza, Espaa.
78
69
NOMBRE
FECHA
IX.- Practica N8
Determinacin de la presencia de vibrio cholerae
9.0 Introduccin.
El genero vibrio son bacilos Gram. Negativas que miden de 0.5 micras a 0.8 micras
De dimetro por 1.4-2.6 micras de largo, las formas involucionadas usualmente se presentan en cultivos viejos
( en fase estacionarias) o bajo condiciones adversas de cultivo, no forman endoesporas, ni micro quistes, en
medio liquido son mviles por flagelos polares, son anaerobias facultativos, poseen ambos metabolismos,
respiratorio y fermentativo, no fijan ni desnitrifican el nitrgeno, todos son quimiorganotrofos, muchos son
capaces de crecer en medio mineral contenido D-glucosa y NH4Cl, solo unas cuantas capas necesitan factores
orgnicos de crecimiento. Los iones sodio estimulan el crecimiento de todas las especies y son un requerimiento
para la mayora, la mnima concentracin necesaria para un ptimo crecimiento es del orden de 5-700 mM;
muchas especies crecen bien en medio contenido una base de agua de mar.
Fermentan la D-glucosa dando como resultado produccin de cido pero no de gas. Todos utilizan D-glucosa,
D_fluctuosa, maltosa y gliserol. La mayoris de las especies son oxidasa positiva y todas crecen a 20C y muchas
a 30C
El clera es una infeccin intestinal aguda, grave que se caracteriza por al aparicin brusca de diarrea acuosa y
abundante vmitos, deshidratacin rpida, acidosis, colapso circulatorio y el los casos no tratados se produce la
muestre dentro de las 24hrs de su aparicin. Hoy se sabe que la infeccin tambin puede ser asintomtico o solo
provoca una leve asintomatologia. La letalidad en los casos graves no tratados puede exceder el 50%, pero si se
aplica l debido tratamiento, se reducen a menos del 1%
9.1 material.
Homogenizador de alimentos estriles.
Balanza.
Frasco de dilucin con 90mL. de solucin diligente
estril.
Cuchillo estril.
Caja de Petri estril.
70
-: negativo
R: alcalino
Dibujos y observaciones:
Cuestionario.
1.- Cules son los habitantes naturales de Vibrio cholerae?
2.- Qu caracterstica le da la propiedad de ser toxico a Vibrio cholerae?
3.- Qu funcin tiene la incubacin en agua peptonada alcalina previa a el aislamiento de Vibrio cholerae?
Bibliografa
- Carl, vanderzant, phd,. Don F. splittstoesser, phd. 1992. compedium of methods for the microbiological
examination of foods. 3th edition.
- Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de Mxico, S.A de C.V
71
NOMBRE
FECHA
X.- Practica N9
Determinacin de la presencia de Listeria monocytogenes
10.0 Introduccin.
El genero Listeria lo constituyen bacilos cortos Gram., positivos, mviles, no formadores de esporas, anaerobios
facultativos, catalasa positivos. Existen especies patgenas y no patgenas para el hombre, la mas importante
desde el punto de vista de salud publica y relacionada con infecciones por alimentos contaminados es Listeria
monocytogenes. las incidencias de listeriosis han ocurrido principalmente en el verano. Existen portadores sanos
que son individuos que estn en contacto rutinario con animales en la granja o en rastros de sacrificios. En
general se ha observado que los vegetales, principalmente hortalizas que son regadas con aguas negras presentan
una alta incidencia de especies de Listeria. Entre los alimentos procesados se han reportado los quesos fabricados
con leche no pasteurizada. La diferencinciacin bioqumica de las diferentes especies de Listeria se muestra en la
tabla 19.
especies
Listeria
monocytogenes
L. ivanovil
L. innocua
L. welshimeri
L. seeligeri
L. grayli
L. murrayi
(beta)
hemoliticos
+
reduccin
de
nitrato
-
+
+
-
manitol
ramnosa
xilosa
virulencia
(ratn)
+
+
variable
variable
variable
+
+
+
-
+
-
Triple
Espejo
Autoclave
Homogenizador de alimentos.
Esptula
Incubadora calibrada a 30 y 35C
cido sulfanilico
Agar Oxford (OXA)
Agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM)
Agar soya tripticasa con 0.6% de extracto de
levadura (ASTEL)
Caldo carbohidratado.
72
73
Caja
Tripie
Espejo
Figura 20: observacin de las placas por iluminacin indirecta de colonias de Listeria.
10.4 Confirmacin de la presencia de Listeria.
1.- de las colonias aisladas en las placas de OXA y LPM, resembrar al menos 5 de cada una de ellas a placas con
agar soya tipticasa con 0.6% de extracto de levadura (ASTEL).
2.- incubar las placas de ASTEL a 30C por 24-48hrs.
3.- utilizando el dispositivo de la figura 9, las colonias tpicas de Listeria se observan de un color azul o azulgrisaseo.
4.- hacer frotis de varias colonias y teirlas con el medio de gram para confirmar que son bacilos cortos gram
positivos.
5.- realizar la prueba de catalasa, para confirmar su positividad.
6.- resembrar en placas de agar-sangre. Las colonias formadas por las especies de Listeria monocytogenes y L.
ivanovil presentan una zona de hemolisis.
7.- las especies patgenas para el hombre no reducen los nitratos. para confirmar esto, se incuban tubos con 3-5
mL. de caldo nitrato, incubndose a 35C durante 5 das. Depuse de este tiempo se adiciona 0.2mL. del reactivo
de cido sulfanilico y 0.2mL. de reactivo de N-(1-naftil) etilendiamina. El desarrollo de un color rojo nos indica
una prueba positiva.
8.- pueden tambin realizarse pruebas de fermentacin, inoculando tubos con 3-5mL. de caldo para fermentacin
conteniendo 0.5% de cada una de los carbohidratos probados. La produccin de cido se interpreta como una
prueba positiva.
Comparar los resultados en al tabla 19, para identificar la especie presente.
Dibujos y observaciones
Cuestionario
1.- Cules son las caractersticas morfolgicas de Listeria sp?
2.- Por qu es importante la deteccin de Listeria monocytogenes en una planta congeladora de vegetales?
3.- cuales serian las fuentes de contaminacin por lsiteria monocytogenes en una planta de productos lcteos?
4.- Cul es le ingrediente selectivo para Listeria en el medio de cultivo agar LPM?
74
James, T. peeler., and Larry, J. M. 1992. aerobic plate count. FDA, bacteriological analitical manual. 7 th
edition.
David, A. Power., and peggy, J. Mccuen.1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th
edition. United states of america.
Warburton, D.W., J. M. Farber. A. Armostrong, R. Caderia, NP. Tiwari, T. Babiuk, P. Lacasse & S.
Read 1991. A canadian comparative study of modified version of the EDA & USDA methods for
the detection of Listeria monocytogenes. J. Food Prot.
75
NOMBRE
FECHA
XI.- Practica No 10
Determinacin de bacterias anaerobias
11.0 Introduccin.
Las bacterias anaerobias de importancia en al Microbiologa Sanitaria, son las especies del genero clostridiu. Este
genero se caracteriza por ser bacilos gram positivos, formadores de esporas que varan de tamao desde 0.5-1
micras de dimetro por 3.0-10.0 micras de largo, al mayora de sus especies son niveles, reducen los nitratos a
nitritos, licuan la gelatina, producen cido y gas. El hbitat natural de estos microorganismos es el suelo y los
productos vegetales, de ah que los alimentos contaminados con polvo y agua contaminada, pueden contener
esporas las cuales posteriormente germinan para producir clulas vegetativas. Las dos especies ms importantes
en Microbiologa Sanitaria, por sus capacidades de producir intoxicaciones son: clostridium perfringens y
clostridium botulinum. Las caractersticas principales de estas dos especies es la formacin de esporas termo
resistentes y la sntesis de enteroroxinas y neorotoxinas.
11.1 Determinacin de la presencia de clortridium perfringens.
11.1.1 Material.
Asa de platino
Bolsas o frascos de boca ancha estriles
Baos Maria a 46C
Cajas de Petri 100 x 15 mm estriles
Contador de colonias Qubec
89
76
77
11.2.3 Enriquecimiento.
1.- al medio de enriquecimiento se le remueve previamente el oxigeno disuelto, poniendo el medio en una
corriente de vapor durante 10-15min, enfriando rpidamente, procurando no agitarlo.
2.- inocular 2 tubos conteniendo 15mL. del caldo de enriquecimiento (MCC) con 1-2g o mL. de muestra. Incubar
a 35C.
3.- inocular 2 tubos de caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY) como en el paso 2. Incubar
a 26C
4.- despus de 7 das de incubacin examinar los tubos y observar si hay turbidez, produccin de gas y digestin
de las partculas de carne.
5.- hacer una tincion de gram de cada cultivo y examinar los frotis al microscopio.
6.- observe la morfologa de los microorganismos. Las clulas tpicas de clostridium botulinum, tienen una
estructura semejante a una raqueta de tenis.
11.2.4 Aislamiento de cultivo puro.
11.2.4.1 pretratamiento de las muestras.
1.- en un tubo con tapn de baquelita estril, mezclar 1 o 2mL. del cultivo enriquecido o de la muestra original
con igual volumen de alcohol absoluto estril. Mezclar bien e incubarlo a temperatura ambiente durante 1 hora.
2.- alternativamente, el cultivo enriquecido se calienta a 80C durante 10-15min para destruir las clulas
vegetativas. Este tratamiento no se recomienda para tipos de C. botulinum no proteo lticos.
3.- de los tubos con el tratamiento con alcohol y de los tratados trmicamente resembrar para obtener colonias
aisladas, en placas con agar hgado de ternera yema de huevo o agar yema de huevo para anaerobiosis. Incubarlas
a 35C durante 48 horas en condiciones de anaerobiosis.
4.- las colonias tpicas de C. botulinum tienden a extenderse con bordes irregulares rodeadas de una zona de
precipitado amarillo.
Dibujos y observaciones:
Cuestionario.
1.- Por qu la bacteria anaerobia no se reproduce en medio aerbico?
2.- en que productos alimenticios procesados es probable el desarrollo de anaerobios?
3.- Qu caractersticas de clostridium perfringens le da el carcter de ser patgeno para el hombre?
4.- Qu previsin APLICADA deben tener las personas de una planta de alimentos que pudieran infectarse con
clostridium taten?
Bibliografa.
- David, A. Power., and peggy, J. Mccuen.1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th
edition. United states of america.
78
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed. Acribia zaragoza, Espaa.
James, T. Peeler., and larry, J. Maturin. 1992. Aerobic Plate Count. FDA, bacteriological Analitical
Manual. 7th edition.
- Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de Mxico, S.A de C.V
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed. Acribia zaragoza, Espaa.
79
NOMBRE
FECHA
XII.- Practica No 12
Efecto de los agentes desinfectantes sobre los microorganismos
12.0 Introduccin.
Desde el inicio de la conservacin de los alimentos por el hombre, se han empleado una serie de agentes fsicos y
qumicos para destruir y/o inhibir el crecimiento de los microorganismos sobre los alimentos y de esta manera
poder conservarlos por tiempos mas prolongados. Los agentes fsicos mas ampliamente utilizados en la
actualidad es la deshidratacin y las radiaciones. Dentro de los agentes qumicos se encuentran toda la amplia
gama de conservadores utilizados hoy en da.
Sin embargo no es nicamente el hecho de aplicar agentes fsicos o qumicos sobre los alimentos para el control
de los microorganismos; tambin hay que tener presente el medio ambiente en el que se estn procesando los
alimentos y que esta formado por la maquinaria, utensilios, superficies, aire y operadores de un sistema de
transformacin de alimentos.
Actualmente es de primordial importancia la implantacin en la industria alimentara de programas de
sanitizacion del equipo y materiales utilizados, as como programas de buenas practicas de manufactura y de
higiene dentro del personal involucrado en su manipulacin.
En la presente practica se observara el efecto de algunos desinfectantes comnmente utilizados en programas de
sanitizacion en plantas procesadoras de alimentos, sobre microorganismos que con mas frecuencia determinan el
deterioro de los alimentos y aquellos causantes de infecciones e intoxicaciones alimenticias.
12.1 Soluciones
Solucin de hipoclorito de calcio (200ppm de cloro activo)
Solucin de cido dodecilbensulfonico (200ppm)
Solucin de yodo (25ppm de yodo libre titulable)
12.2 Medios de cultivo y microorganismos.
Agar de papa y dextrosa acidificado.
Agar violeta rojo bilis
Agar de baird-parker
Agar para mtodos estndar
12.3 Procedimiento.
1.- en 100mL. de agua peptonada al 1%, ajustar los inculos de los microorganismos hasta obtener una concentracin de
clulas aproximadas de 10-3/mL..
2.- con un hisopo estril, impregnar la superficie de tres mesas de acero inoxidable, cada una con uno de los
microorganismos.
3.- despus de 30min. Realizar un muestreo en un rea de 20x20 cm. para determinar la cuenta estndar de microorganismos
mesoflicos arerbicos, cuenta de coliformes totales y cuenta total de staphylococcus, para el caso de las mesas donde se
inoculo E. coli y S. aureus y cuenta total de levaduras para la mesa que fue inoculada con S. cereviceae.
4.- una vez realizado el muestreo, aplicar a cada una de las terceras partes de cada mesa cada uno de los sanitizantes en
concentracin y tiempo de accin de acuerdo a las indicaciones del proveedor. Cada mesa representara la actividad de tres
diferentes sanitizantes sobre un solo microorganismo.
5.- retirar de la mesa el sanitizante siguiendo las instrucciones del proveedor.
6.- realizar nuevamente un muestreo en un rea de 20x20cm para cada uno de los sanitizantes en las tres mesas, haciendo las
determinaciones como en el punto 3
80
Cuestionario
1.- que es un agente bacteriosttico?
2.- Cul es el mecanismo de accin de un detergente en un proceso de sanitizacion?
3.- Cmo se define una sanitizacion IN SITU?
4.- Cmo determina la actividad de un sanitizante sobre el piso de un a rea de embutidos?
5.- Por qu se debe hacer un muestreo de superficie del equipo antes y despus de sanitizar?
Bibliografa
-
Zargo, G. 1993: manual de aplicacin del anlisis de riesgos, identificacin y control de puntos crticos. Secretaria
de la salud, Mxico, D.F.
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NOMBRE
FECHA
XII.- Practica No 12
DESARROLLO DE UN ECOSISTEMA. COLUMNA DE WINOGRADSKY
http://faca.uncoma.edu.ar/academica/materias/microbiologia_agricola/Guia_Microbiologia_Agricola_2007.pdf
Objetivo: Observar el desarrollo de un ecosistema utilizando como modelo diferentes columnas de Winogradsky.
Una columna ideal de Winogradsky se podra representar con el siguiente esquema.
LUZ
O2
PROCESO
PRINCIPAL
Fotosntesis
oxignica
Fotosntesis
anoxigenica
Quimiolitotrofis
mo
SH2,
CO2
Los alumnos construirn una columna de Winogradski. En ella podrn comprender la importancia de los distintos tipos de
metabolismos que caracterizan a los microorganismos del suelo (autotrfico, litotrfico, organotrfico y heterotrfico) y que
permiten, entre otras actividades microbianas, la transformacin de la materia orgnica. La columna de Winogradsky es un
medio muy simple que le permitir observar el desarrollo de distintos tipos de microbios del suelo.
La columna de Winogradsky es en esencia un pequeo estanque artificial donde se facilita la eutrofizacin. La capa de lodo
est formada por una fuente de carbono, que puede ser de distinto origen (papel, material vegetal, etc), una fuente de azufre y
carbonato de calcio como fuente de dixido de carbono. Las bacterias que reducen el sulfato, a travs de una respiracin
anaerbica, producen sulfuro el cual en su momento sirve como donante de electrones para las bacterias prpura y verdes del
azufre. Simultneamente, otras bacterias descomponen la celulosa, en forma fermentativa, liberando cidos que reaccionan
con el carbonato de calcio produciendo dixido de carbono. Los otros productos de descomposicin que se producen, tales
como acetato, piruvato, citrato, etc., son utilizados por algunos microorganismos fottrofos que desarrollan en la columna.
En la interfase aerbica-anaerbica, aparecen al cabo de los das manchas de distintos colores, que tienen su origen en
bacterias no sulfurosas. La capa acuosa aerobia permite el desarrollo de algas verdes y verde-azuladas (cianobacterias),
hongos, bacterias aerobias y protozoos. En la naturaleza, bacterias fotosintticas viven en el fondo de un estanque junto a
restos orgnicos y sulfuros de distinto tipo. Aunque tenemos oscuridad en ese lugar, cierta cantidad de luz perteneciente al
infrarrojo cercano puede penetrar y ser utilizada por las bacterias prpura y verdes del azufre o sea por miembros de las
familias Chromatiaceae y Chlorobiaceae, respectivamente. Estos organismos captan luz que no es absorbida por las
cianobacterias que viven en las capas superiores de los estanques. Las bacterias usan donadores de electrones tales como
sulfuro de hidrgeno y construyen carbohidratos a partir del CO2 y no utilizan O2. Una vez que el nivel de sulfuro disminuy,
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Apndices
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1g
125mL.
5.0g
100.0mL.
12.0g
16.0g
80,0 mL.
40.0g
100.0mL.
120
Hidrxido de sodio 1.0N
Hidrxido de sodio
Agua destilada
4g
100mL.
5.0g
75.0mL.
25.0mL.
99
0.1g
300.0mL.
500.0mL.
100mL.
12.4g
4g
4.2g
900mL.
Mezclar el cloruro de sodio y el agua destilada. Adicionar la glicerina y los fosfatos. Ajustar en pH a 7.2. Esterilizar en
autoclave 15minutos a 121C. Para una doble concentracin utilizar 200mL. de glicerina y 800mL. de agua destilada.
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Buffer oTampn fosfato
Fosfato monopostasico
Fosfato dipotasico
Agua destilada
6.0g
16.0g
1000mL.
Tripsina (1:250)
a) solucin al 1%
b) disolver 200mg en 20mL. de agua destilada. No almacenar
Soluciones diluyentes
Agua destilada
Agua peptonada
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada
1g
8.5g
1000mL.
Preparacin:
1.- disolver los componentes en 1 litro de agua
2.- ajustar el pH a 7 con hidrxido de sodio 1.0N
3.- distribuir en porciones de 99,90 y 9 mL. segn se requiera
4.- esterilizar a 121C durante 15min.
5.- despus de la esterilizacin. El pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no
mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composicin.
100
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Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada)
KH2PO4
Agua destilada
34g
1000mL.
Preparacin:
1.- disolver el fosfato en 500mL. de agua y ajustar el pH a 7.2 con solucin de hidrxido de sodio 1.0N
2.- aforar con agua en 1lt.
3.- esterilizar durante 15min a 121C.
4.- conservar en refrigeracin (solucin concentrada)
5.-tomar 1.25mL. de solucin concentrada y llevar a 1lt con agua (solucin de trabajo)
6.- esterilizar a 121C durante 15min.
7.- despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales.
2g
4g
1000mL.
Solucin salina.
Cloruro de sodio
Agua destilada
8.5g
1000mL.
Preparacin:
1.- disolver y distribuir en tubos o frascos.
2.- esterilizar a 121C durante 20min.
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ndice de tablas y figuras
pg
fig 1.- etiqueta de identicacion para muestras....8
fig 2.- plantilla estril para muestreo de superficies.15
fig 3.- fotografas de muestreo de la superficie de manos....17
fig 4.- fotografa donde se indica la manera de pesar una muestra...24
fig 5.- diagrama del mtodo de las diluciones ..25
normas APLICADAs de mesofilos aerobios...33
Fig 6.- diagrama de la prueba presuntiva de la tcnica del NNP de coliformes.
en agua purificada y hielo.39
fig 7.- confirmacin de burbujas de gas en campanas de deurham39
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Se esteriliza el asa, se toma el tubo con la mano izquierda, con el dedo meique y la palma de la mano
derecha se sostiene firmemente el tapn y se retira rotando el tubo suavemente y con firmeza.
Se flamea la boca del tubo. Con el tubo inclinado aproximadamente 30, nunca en posicin
horizontal, se introduce el asa, tocando la pared del tubo hasta entrar en el lquido A 1/3 de
profundidad, cuidadosamente se retira el asa con un movimiento que permita la adhesin de una gotita
en el circulo de alambre. No basta con que se forme una pelcula.
Se saca el asa sin tocar la pared del tubo, seflamea la boca del tubo y se tapa.
b) A menudo, el destino de una gota tomada con el asa es servir de inculo, para lo cual se deben
seguir los pasos siguientes:
Si es a un medio slido, se hace una estra con el asa, observando que parte del
material tornado quede extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se
debe romper la superficie del medio slido.
Si se va a hacer una preparacin para observar al microscopio, el material se suspende en una pequea
gota de agua destilada colocada previamente en el centro de un portaobjetos.
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Si es a un medio slido, se hace una estra con el asa, observando que parte del material tornado queda
extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se debe romper la superficie del medio
slido.
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Por lo anterior, se recomienda que al realizar la ebullicin del mismo, la boca del matraz nunca apunte en
direccin del operador o de otras personas o equipo, y que ste utilice guantes de asbesto para su proteccin
y est atento en todo momento del matraz.
El paso siguiente consiste en envasar los volmenes convenientes en los tubos de cultivo y esterilizarlos en
autoclave. Si el medio se va a utilizar en cajas de Petri, se tapa con algodn el recipiente en que se disolvi,
se cubre con papel y se esteriliza en autoclave.
10. Despus de esterilizar.
a) Medios de cultivo lquidos
Los tubos y otros recipientes con medio de cultivo lquido se sacan del autoclave y se dejan enfriar a
temperatura ambiente.
b) Medios de cultivo slidos
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Si son tubos, se dejan enfriar en posicin inclinada de tal modo que se forme el pico de flauta, una
superficie plana larga y que no alcance el lmite del tapn de baquelita. Al enfriarse se solidifica el
medio de cultivo cuando alcanza una temperatura entre 40 y 45C.
Si son recipientes cuyo contenido se va a utilizar en cajas Petri, se dejan enfriar hasta alcanzar una
temperatura de 45 a 50C, y se procede a verter el medio todava lquido en las cajas estriles, en
una operacin asptica cerca de la llama del mechero, evitando la formacin de burbujas. En caso
de que se formen burbujas, se pueden romper flameando ligeramente la superficie con el mechero.
Cada caja puede contener de 12 a 15 mL. Se dejan enfriar sobre la mesa hasta que el medio
solidifique. Se invierten para que la tapa quede abajo y la base arriba. Si no se utilizan en ese
momento, las cajas pueden mantenerse en refrigeracin, debidamente etiquetadas y selladas con
papel parafilm, con la tapa hacia abajo y la base de la caja en la parte superior.
11. Rotulado.
En todos los casos, se debe rotular cada portaobjetos, tubo, matraz, caja de Petri o cualquier otro recipiente
en el que se haga un cultivo, reactivo o prueba, con el fin de conocer sin lugar a dudas lo que se tiene entre
manos.
Nunca se debe depositar toda la confianza en la memoria. En caso de que no hubiera espacio suficiente para
poner todos los datos necesarios, se debe utilizar una clave simple y confiable, que contenga la iniciales del
operador, material, cultivo, cepa, muestra o prueba y fecha. Esto mismo debe registrarse en la bitcora de
trabajo en donde estarn explcitos todos los datos.
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