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INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYA

MANUAL DE PRCTICAS DE
MICROBIOLOGA SANITARIA
PLAN 2010

Celaya, Gto. Enero 2013

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYA


CONTENIDO TEMATICO.
Contenido temtico

Curso de Microbiologa Sanitaria

Introduccin

Reglamento interno para el uso de los laboratorios del rea de ingeniera bioqumica
I.- Practica N1 Seleccin y preparacin de materiales y soluciones para el anlisis
microbiolgico
1.0 Introduccin
3
1.1 Material y soluciones
4
1.2 Preparacin del material para la toma de muestra
5
1.3 Procedimiento par ala toma, manejo y transporte de la muestra
6
1.4 Manejo de las muestras
9
1.5 Tcnicas de muestreo para determinar la sanidad de una planta
procesadora de alimentos.
14
1.6 Tcnicas de muestreo para microorganismos anaerobios
20
1.7 Seleccin, preparacin y medicin de la alcuota
21
1.8 Preparacin y dilucin de muestras
22
II.- Practica N2
27
Cuenta estndar de Microorganismos Mesoflicos Aerobios (CEMMA)
2.0 Introduccin
27
2.1 Materiales
27
2.2 Medios de cultivo
28
2.3 Procedimiento para anlisis de alimentos congelados, enfriados,
precocinados o comida preparada
28
2.4 Gua para calcular y reportar CEMMA en casos no comunes
29
2.5 Reporte de colonias
30
2.6 Normas aplicadas
33
III.- Practica N3
Determinacin de bacterias del grupo coliforme

35

3.0
3.1
3.2
3.3

Introduccin
35
Material
36
Medios de cultivo y reactivos
36
Procedimiento para la determinacin del numero mas probable {NMP}
de bacterias coliformes en agua potable, purificada y hielo.
37
3.4 Determinacin de bacterias coliformes totales y coliformes fecales
43
en alimentos
3.5 Tcnica de filtracin por membrana para agua
48
3.6 Determinacin de la actividad de la Beta-Glucuronidasa para detectar la presencia de
Escherichia coli en alimentos
50
3.7 Normas aplicadas
52
IV.- Practica N4
Determinacin de Staphylococcus aureus
4.0 Introduccin

54
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9
20

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4.1 Material
4.2 Medios de cultivo y reactivos
4.3 Aislamiento y conteo
4.4 Pruebas de la coagulasa
4.5 Pruebas de la catalasa
4.6 Utilizacin anaerobia de glucosa
4.7 Utilizacin anaerobia de manitol
4.8 Produccin de nucleasa termoestable
4.9 Caractersticas bioqumicas
4.10 Normas aplicadas

55
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56
57
57
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58
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59
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V.- Practica N5
Determinacin de hongos y levaduras (mohos)
5.0 Introduccin
5.1 Material
5.2 Medios de cultivo y reactivos
5.3 Procedimiento
5.4 Normas aplicadas

62
62
63
63
63
64

VI.- Practica N6
Determinacin de microorganismos proteolticos y lipolticos
6.0 Introduccin de microorganismos proteolticos
6.1.2 Material
6.1.3 Medios de cultivo y reactivos
6.1 Determinacin de la presencia de microorganismos proteoliticos
6.2 Determinacin de la presencia de microorganismos lipiliticos
6.2.2 Material
6.2.3 Medios de cultivo y reactivos
VII.- Practica N7
Determinacin de Salmonella sp
7 Introduccin
71 Material
7.2 Medios de cultivo t reactivos
7.3 Preparacin de las muestras
7.4 Diferenciacin de las colonias de Salmonella

66
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71
71
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VIII.- Practica N8
Determinacin de Vibrio cholerae
8.0 Introduccin
8.1 Material
8.2 Medios de cultivo y reactivos
8.3 Procedimiento
8.4 Pruebas diferenciales

78
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79
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80

IX.- Practica N9
Determinacin de Listeria monocytogenes
9.0 Introduccin
9.1 Material
9.2 Medios de cultivo y reactivos
9.3 Procedimiento
9.4 confirmacin de la presencia de Listeria

82
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83
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X.- Practica N10
Determinacin de bacterias anaerobias
10.0 Introduccin
10.1 Determinacin de la presencia de C. perfringens
10.1.1 Material
10.1.2 Medios de cultivo y reactivos
10.2 Determinacin de la presencia de c. botulinum
10.2.1 Material
10.2.2 Medios de cultivo y reactivos

88
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89
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92
92
92

XI.- Practica N11


95
Efecto de los agentes desinfectantes sobre los microorganismos
11.0 Introduccin
11.1 Soluciones
11.2 Medios de cultivo y reactivos
11.3 Procedimiento

95
96
96
96

Apndice 1.
Formulacin y preparacin de medios de cultivo para Microbiologa Sanitaria
Apndice 2
119
Preparacin de reactivos y soluciones para Microbiologa Sanitaria
ndice de tablas y figuras
123
ndice de medios de cultivo, reactivos y soluciones12
Bibliografa.
126

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Curso de Microbiologa Sanitaria
Objetivo.
Reconocer, cuantificar y controlar los agentes microbiolgicos y los procesos de contaminacin y descomposicin
biolgica de los alimentos dentro de un proceso productivo, para mantener su idoneidad y evitar enfermedades al
consumidor. Aplicar los conocimientos adquiridos en los procesos y/ o proyectos que involucren a los
microorganismos en la mejora de la inocuidad de los alimentos; mediante la generacin y aplicacin innovadora de
conocimiento sobre el manejo microbiolgico de agua y alimentos.
Promover la adquisicin de los conocimientos bsicos relativos a la aplicacin de los microorganismos en
procesos biotecnolgicos de produccin de alimentos, control de la contaminacin ambiental, de aplicacin
agrcola e industrial, as como los relacionados con los riesgos asociados a su presencia en instalaciones,
procesos y materiales propios de la industria biotecnolgica.
Adicionalmente, se deber propiciar el desarrollo de las habilidades necesarias para el manejo y control de
los microorganismos en los aspectos antes mencionados.

Temario
No.

Temas
Nombre

I.

Introduccin a la
Microbiologa
sanitaria

II.

Cadena
epidemiolgica
Fuentes y
mecanismos de
contaminacin de
los alimentos.

III.

Grupos
microbianos de
inters sanitario y
factores que
afectan la
sobrevivencia y
desarrollo
microbianos.

IV.

Enfermedades
transmitidas por
alimentos

Subtemas
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
2.1.

La microbiologa sanitaria del agua y alimentos.


Saneamiento Ambiental, higiene de los alimentos, calidad-inocuidad.
Situacin en Mxico y el resto del mundo.
Factores propiciadores y determinantes de la calidad sanitaria de los alimentos.
Cadena epidemiolgica. Introduccin a las fuentes y mecanismos de
Contaminacin.
2.2.
Mecanismos de contaminacin.
2.3.
Fuentes y mecanismos de contaminacin de los microorganismos a los alimentos

Agua

Tierra

Aire.

Equipo y utensilios.

Envases.

Materias primas y aditivos.

Fauna.

Manipuladores.

Contaminacin de origen.

Contaminacin cruzada
3.1. Indicadores de la calidad e inocuidad microbiolgicas de los alimentos.
Bacterias mesfilas aerobias.
Enterococos, Psicrotrofos, Psicrfilos, Termfilos y Termodricos en
alimentos.
Osmotolerantes, halotolerantes, xenotolerantes, mucgenos, acidricos,
esporulados y anaerobios.
Bacterias lcticas, amilolticas, pectinolticas, lipolticas, proteolticas,
putrefactivas, hongos y levaduras.
3.2.
Introduccin
3.3.
Factores intrnsecos
3.4.
Factores extrnsecos
4.1.
Enfermedades transmitidas por alimentos.
4.2.
Patgenos transmitidos por agua y alimentos
4.3.
Microbiologa del agua y NOMs

Agua natural y procesada.

Hielo.

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V.

Procesamiento
Sanitario de
productos
biticos.

4.4.
4.5.
5.1.
5.2.
5.3.
5.4.
5.5.

Bebidas no alcohlicas
Microbiologa de alimentos y NOMs
Medidas para el control de la contaminacin.
Fuentes de contaminacin en el procesamiento de alimentos y otros productos.
Planes y Programas de limpieza y desinfeccin en plantas de productos biticos.
Buenas prcticas de manufactura.
Programas de HACCP en plantas de productos biticos.
Confirmacin de la calidad.

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Prcticas de Microbiologa Sanitaria
1.- Introduccin
El laboratorio de esta materia pretende generar conocimientos, habilidades y experiencias que permitan al estudiante
establecer los diferentes tipos de asociaciones simbiticas entre los microorganismos y los seres vivos superiores.
Estudiar los mecanismos mediante los cuales las bacterias y otros microorganismos se adhieren e invaden las clulas
hospedadoras durante el establecimiento de distintos tipos de relacin, as como comprender las bases moleculares
que rigen dichos procesos.
Organismos pluricelulares como animales y vegetales en forma natural estn en una constante interaccin como
microorganismos, los cuales en forma genrica van a construir lo que se denomina como su microflora natural o
normal; los vegetales y animales guardan un equilibrio sobreviene el deterioro de los tejidos a la invasin de estos
por los microorganismos. En ocasiones en estas microfloras naturales pueden presentarse microorganismos que
pueden ser potencialmente dainos para el desarrollo de las plantas y los animales o bien para el hombre que
consume stos.
Las fuentes de alimentacin para el hombre son bsicamente de origen animal y vegetal, siendo estos alimentos
consumidos tal como se encuentran en forma natural, o bien, despus de haber sido sometidos a algn proceso de
transformacin.
Durante la obtencin de los vegetales - cosecha y de los productos animales ordea, pesca y sacrificio estos
pueden contaminarse con microorganismos de otras fuentes y llegar as contaminados al consumidor y/o a la planta
de procesamiento, se consideran en este punto como materias primas contaminadas,
Actualmente, la sanidad de los procesos alimentarios, farmacuticos y cosmticos es de primordial importancia para
su aceptacin y competitividad en los mercados de distribucin nacionales e internacionales. Dentro de las prcticas
aplicadas que se deben establecer en todo proceso biotecnolgico, estn las de eliminar a los microorganismos que
deterioran estos productos y a los microorganismos que puedan ser dainos para la salud de los consumidores, es
decir se deben de ofrecer productos inocuos microbiolgicamente para le hombre.
El presente trabajo tiene como objetivo que el estudiante de la materia de Microbiologa Sanitaria, cuente con una
gua de tcnicas que pueden ser aplicadas, para determinar observar, cultivar e identificar la presencia de los
microorganismos de importancia ecolgica o que afecten la calidad microbiolgica de productos de origen
biotecnolgico, as como su presencia en los materiales y equipos empleados en estas industrias.
Todo lo anterior los capacitar para desarrollar actividades de investigacin y profesionales en centros de
investigacin, empresas y entidades que tengan la Microbiologa como finalidad o como instrumento de trabajo y
que puedan insertarse en el mundo industrial, de servicios, en el sanitario o ambiental tanto en sus vertientes de
produccin y analtica como en las de Investigacin y Desarrollo.
Lo cual les permitir:

Preparar, mejorar y controlar los microorganismos necesarios para la obtencin de productos industriales,
as como desarrollar procesos microbianos para su realizacin.

Seleccionar, mejorar genticamente y controlar cepas de microorganismos para su utilizacin en


biotecnologa y produccin agropecuaria.

Realizar anlisis microbiolgicos con finalidades diagnsticas, en materiales de origen humano, animal y
vegetal

Realizar el control microbiolgico de medicamentos, alimentos, y materias primas utilizadas en la


elaboracin de los mismos.

Realizar asesoramientos, peritajes y arbitrajes que requieran conocimientos de microbiologa.

Realizar control microbiolgico de los niveles de contaminacin y de asepsia de cualquier ambiente.

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En cada prctica se plantea un objetivo general de aprendizaje, que puede ser planteado de otra manera por el
estudiante, conforme logra diversos niveles de desarrollo, o puede ser dividido en aprendizajes tericos, habilidades
y actitudes genricas o especficas, para explicitar ms la intencin de aprendizaje en cada apartado. De igual manera
se plantea una breve introduccin a fin de ubicar al aprendiente en el tema.
Se incluyen Materiales y mtodos propios de cada prctica, en el que se incluye el material biolgico o algunos
materiales de consumo que debe traer el estudiante. De igual manera se incluyen varios experimentos entre los cuales
algunos sern realizados por el estudiante, de acuerdo a las instrucciones del Profesor titular de la Materia.
Se incluyen esquemas y figuras para facilitar la implementacin experimental, de igual manera se proponen
esquemas o formas de presentacin de resultados, en los que se privilegia la discusin apoyada en conceptos tericos
o metodolgicos, teniendo el enfoque de destacar las partes y la capacidad de integrarlas como un aprendizaje global
de cada experiencia. Para hacer un anlisis ms detallado de cada tema, se incluye un cuestionario que debe ser
contestado previamente o durante la realizacin de la prctica, consultando los materiales disponibles o los sugeridos
por el profesor.
Este manual adems incluye dos anexos, el primero consigna las indicaciones de composicin y preparacin de
reactivos y colorantes. El segundo incluye lo mismo para medios de cultivo necesarios para estas prcticas.
Consideramos que esta material es de gran ayuda para el desarrollo de la parte experimental de este curso, tanto para
estudiantes, profesores y Responsables del Laboratorio de Microbiologa.
Atentamente
IBQ Ana Florina Villagmez Torres
Jefe de Lab. de Microbiologa
Departamento de Ing. Bioqumica
Celaya Gto. 01 de febrero de 2013.

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REGLAMENTO INTERNO PARA EL USO DE LOS LABORATORIOS DEL REA DE
INGENIERA BIOQUMICA
REGLAMENTO DE LOS LABORATORIOS DE DOCENCIA
MISION:
Tiene como misin principal proporcionar a los profesores y alumnos la garanta de que cuentan con equipo,
manuales y herramientas, en forma precisa, oportuna y en ptimas condiciones de uso; y en el cual se desarrollen las
prcticas contempladas en los programas de las materias, as como la realizacin de proyectos de investigacin.
CONSIDERANDO:
1. Que en el Departamento de Ingeniera Bioqumica se cuenta con infraestructura de laboratorios, los cuales
son parte integral de los cursos terico - prcticos en la parte demostrativa y de investigacin de las ciencias
experimentales.
2. Que en el proceso educativo que incluye laboratorios se procura una formacin de investigacin,
comprobacin, as como conocimientos significativos; para lograr una formacin ms integral en el
estudiante propiciando en ellos un mejor desarrollo de aptitudes, hbitos, habilidades, destrezas y disciplina.
3. Que lo laboratorios son una representacin muy similar a la realidad y que es necesario que cuenten con una
organizacin y funcionamiento adecuado, que permita el mejoramiento continuo del proceso educativo que
en ellos se imparte.
CAPTULO I DISPOSICIONES GENERALES
1. El presente reglamento es de observancia obligatoria para todos los usuarios del laboratorio de Microbiologa:
a)

Todo el personal directivo y docente de la Licenciatura en Ingeniera Bioqumica.

b) Todos los estudiantes regulares.


c)

Todas las dems personas que autoricen los directivos de rea, para proyectos de investigacin o
vinculacin.

2. Sus objetivos son:


a)

Lograr el adecuado y mximo aprovechamiento de equipo, manuales, herramientas, componentes e


instalaciones con que cuenta el laboratorio para obtener los mejores resultados individuales y de
conjunto en el aspecto educativo.

b) Fomentar en el usuario el desarrollo de sus facultades creativas, hbitos de investigacin, organizacin y


responsabilidad.
c)

Propiciar la disciplina entre los usuarios.

3. El laboratorio ofrece los siguientes servicios a los usuarios:


a)

Prstamo de equipo, manuales, y herramientas para el desarrollo de prcticas, proyectos finales e


investigaciones.

b) Orientacin a todos los usuarios en cuanto a la utilizacin de los recursos del laboratorio.

4.- Son responsables de exigir la aplicacin del presente reglamento, los directivos, Jefe de laboratorio, auxiliares de
laboratorio y profesores que dentro de sus actividades requieran del servicio.
a)

Existe un Jefe de Proyecto de Docencia a quien le corresponde:

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Supervisar los laboratorios peridicamente para verificar el ptimo aprovechamiento de los


equipos y materiales existentes.

Supervisar que las prcticas programadas se lleven a cabo.


a)

Vigilar el cumplimiento del presente.

b) Verificar la ejecucin y el avance de prcticas de acuerdo al tiempo y al programa


marcado.
c)

Informar al Jefe de Deaprtamento de las anormalidades y necesidades que se presenten


en el funcionamiento de los laboratorios.

b) Corresponde a la Direccin del Plantel:

c)

Verificar el cumplimiento del presente reglamento.

Proveer de acuerdo con los recursos disponibles el equipo y materiales necesarios para el buen
funcionamiento del laboratorio.

Proporcionar los medios necesarios para el mantenimiento adecuado del laboratorio.

Proporcionar, va el Departamento de Servicios Generales, el personal de intendencia, para que los


laboratorios se encuentren en condiciones ptimas de limpieza, para sto se proveer capacitacin,
un horario, recursos materiales y un programa de trabajo adecuado para tal fin.

Corresponde a al Jefe de Laboratorio:

Informar Jefe de Proyecto de Docencia los avances de prcticas, anomalas y necesidades de


reactivos, medios y equipo en el laboratorio, as como de mantenimiento preventivo y correctivo de
las instalaciones.

d) Corresponde a los Profesores:

e)

f)

Cumplir invariablemente con las prcticas programadas.

Permanecer en el laboratorio durante el tiempo que se desarrollen sus prcticas.

Dar a los alumnos las explicaciones e indicaciones necesarias para el desarrollo de sus prcticas.

Difundir y vigilar que los alumnos cumplan con las medidas de disciplina, seguridad y operacin,
indicados en el presente.

En coordinacin con el Coordinador del rea, determinar las necesidades en los laboratorios y
solicitar los equipos y materiales o buscar el medio para obtenerlos.

Organizar a los alumnos en equipos de trabajo de acuerdo con los recursos disponibles.

Corresponde al Laboratorista:

Distribuir y controlar los equipos y materiales que se requieran para el desarrollo de prcticas.

Vigilar que los alumnos cumplan con las medidas de disciplina, seguridad y operacin indicados
en el presente.

Informar al Jefe de Laboratorio del avance de prcticas realizadas.

Asesorar al usuario en las tcnicas sobre el uso del material y equipo.

Procurar la utilizacin ptima de equipos, instrumentos e instalaciones del laboratorio.

Vigilar que el laboratorio este siempre en condiciones de operacin.

Corresponde a los Alumnos:

No manejar o utilizar las instalaciones, equipo o materiales sin la autorizacin del laboratorista o
los profesores correspondientes.

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Dejar su mochila y/o utensilios escolares en el lugar asignado.

Atender las instrucciones dadas por sus profesores.

Solicitar en caso de duda, las aclaraciones necesarias antes del desarrollo de sus prcticas.

Presentar antes de iniciar una prctica un reporte preliminar de las actividades a realizar, el cual
incluye:

Hoja de presentacin (fecha, nombre de la facultad, nombre de la materia, nombre de la


prctica, nombre del participante(s), nombre del profesor).

Objetivo de la prctica previamente establecido por el profesor (describir brevemente qu


problemas a resolver se plantean durante la sesin).

Desarrollo de la prctica (Por medio de un diagrama de flujo o esquemas, explicar con


detalle los pasos necesarios para resolver el problema planteado por el profesor como son:
anlisis del problema, clculos, etc.).

Entregar al profesor de la materia un reporte con los siguientes puntos:


o

Hoja de presentacin (fecha, nombre de la facultad, nombre de la materia, nombre de la


prctica, nombre del participante(s), nombre del profesor).

Objetivo de la prctica. (Dado por el profesor e indica lo que se pretende comprobar con
la prctica).

Introduccin terica (breve panorama sobre el tema, basado principalmente en


investigacin de artculos, manuales y libros).

Desarrollo de la prctica (en esta seccin se debe explicar con detalle los pasos necesarios
para resolver el problema planteado por el profesor como son: anlisis del problema,
clculos, resultados de simulacin y diagramas de diseo).

Resultados (se presentan los resultados obtenidos en el circuito prctico, comparando el


desempeo de los sistemas reales con los simulados).

Conclusiones (en esta seccin el alumno debe proporcionar su punto de vista y conjeturas
con respecto a las experiencias obtenidas durante los procesos anteriores).

Bibliografa (esta seccin presenta la literatura que fue utilizada en la solucin del
problema, el objetivo de esta seccin es proporcionar al lector interesado, un punto de
partida para profundizar en el mismo proyecto u otros proyectos similares).

Adems el reporte de la prctica debe tener una buena redaccin y no presentar faltas de ortografa.

Los trabajos que no presenten las observaciones anteriores sern penalizados de acuerdo al criterio
del profesor.

Observar en todo momento seriedad en su trabajo as como en el trato a sus compaeros.

Entregar limpio al trmino de la prctica tanto el equipo como su rea de trabajo.

Informar cualquier desperfecto en los equipos e instalaciones.

CAPTULO II DE LA ORGANIZACIN
5.- En el laboratorio deber haber un encargado (Jefe de laboratorio o auxiliar del mismo), quien es responsable del
funcionamiento del laboratorio.
6.- El encargado del laboratorio ser responsable del control de los equipos, as como de su mantenimiento
preventivo y correctivo.
7.- Es obligatorio para el encargado del laboratorio conocer el funcionamiento y manejo de las instalaciones y equipo
con la finalidad de garantizar su operatividad.

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8.- Las sesiones de prctica debern ser coordinadas, supervisadas y realizadas, por el profesor de materia.
9.- Debern realizarse sesiones de prcticas de laboratorio de acuerdo con el tiempo indicado para las asignaturas en
el plan de estudios de la carrera. En el tiempo no asignado del laboratorio, el usuario podr trabajar por su cuenta
bajo la supervisin del encargado de laboratorio o del director del proyecto (Asesor interno).
CAPTULO III DE LA OPERACIN
I: DE LA DISCIPLINA
Artculo 1o. Por seguridad queda estrictamente prohibido:
a)

Fumar, comer o beber dentro de los laboratorios.

b) Jugar dentro de los laboratorios.


c)

Trabajar dentro de los laboratorios con zapatos abiertos, faldas cortas, pantaln corto.

d) El ingreso a personas ajenas o no autorizadas.


e)

El ingreso a alumnos y personas ajenas al cubculo de reactivos y material de vidrio.

f)

La entrada de alumnos o visitas en horarios que no correspondan a los de su prctica.

g) Hacer uso del equipo de laboratorio sin autorizacin y cuando no se haya establecido en el protocolo de la
prctica.
h) Retirar del laboratorio material biolgico a menos que as lo indique el profesor.

Artculo 2o. Si el profesor no se presenta a la hora asignada, la prctica no podr realizarse.


Artculo 3o. Los alumnos podrn ingresar a los laboratorios nicamente cuando el profesor titular se encuentre
presente.
Artculo 4o. El profesor debe permanecer en todo momento con sus alumnos cuando estos estn realizando
actividades dentro del laboratorio.
Artculo 5o.- El alumno no podr abandonar el laboratorio durante el desarrollo de su prctica, Los alumnos slo
podrn entrar y salir del laboratorio con autorizacin del profesor
Artculo 6o.- El laboratorio es un lugar de estudio y por tanto se debe propiciar el silencio y un ambiente adecuado
para tal fin. El alumno deber guardar en todo momento una actitud respetuosa hacia el profesor, el asistente tcnico,
y sus compaeros. Se expulsar del laboratorio a los alumnos que no guarden el comportamiento debido
Artculo 7o. El alumno y el profesor debern utilizar el mobiliario y equipo en forma adecuada y siguiendo las
indicaciones del instructivo de uso del equipo que van a emplear.
IV: DE LA PLANEACIN DE LAS PRCTICAS
Artculo 8o. Los profesores debern entregar al inicio del semestre la calendarizacin de las prcticas
programadas para su materia al responsable del rea, a fin de optimizar el uso de los laboratorios.

Artculo 9o.Los profesores debern entregar durante la primera semana del semestre la informacin de los protocolos
de las prcticas a realizar en los formatos que les proporcione el responsable del rea.
Artculo 10o. En caso de que el profesor requiera emplear el laboratorio para ensayar prcticas o realizar
actividades de investigacin, deber consultar con el responsable del rea los horarios disponibles y hacer la
solicitud formal del espacio para trabajar.

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Artculo 11o. Los maestros y alumnos deben planear su trabajo de manera que la prctica se complete
puntualmente y puedan salir del laboratorio 10 minutos antes de la siguiente clase o prctica, previendo el
tiempo que utilizarn para recoger, ordenar el material y limpiar su mesa.
V: DEL DESARROLLO DE LAS PRCTICAS
Artculo 12o.Para trabajar en los laboratorios es obligatorio que los estudiantes y el personal acadmico usen bata.
El alumno que no tenga bata no podr permanecer en el mismo.
Artculo 13o.Los alumnos sern asignados el primer da del curso a una mesa de trabajo para todo el semestre.
El maestro entregar una copia de su lista oficial con la relacin de estudiantes por equipo, para llevar el
control de trabajo en el Laboratorio.
El alumno o equipo de alumnos deber(n) llenar un vale de Lab. al solicitar el material y equipo necesarios
para la prctica, mismo que deber entregar en buen estado al concluir la sesin.
Para hacer uso de equipo, manuales, herramientas y componentes del laboratorio, se deber llenar completamente el
vale con la siguiente informacin:
a)

Para alumnos:

Vale de prstamo para alumnos con los siguientes datos:

Nombre completo y nmero de control (de todos los integrantes del equipo, o el nombre de una
persona que solicita el material en forma individual, si no cabe en el frente, por el reverso).

Fecha

Materia y nombre de la prctica

Descripcin y cantidad de material a utilizar

b) Profesores: Vale de prstamo a profesores con los siguientes datos:

c)

Nombre

Fecha

Descripcin y cantidad de material a utilizar.

Es responsabilidad del usuario reportar cualquier desperfecto sufrido por el equipo antes de empezar a
trabajar, de esta forma se le deslindar de toda responsabilidad. Por ningn motivo el usuario deber tratar
de resolver un mal funcionamiento en el equipo.

d) En caso de que el equipo presentar alguna descompostura durante la realizacin de la prctica y sta sea
por alguna causa ajena al alumno, como deterioro de los componentes, picos de voltaje en la lnea, etc., el
usuario deber reportar este problema y pedir un reemplazo de equipo. En este caso no se har cargo alguno
al estudiante.
e)

En caso de que el equipo sufra de algn desperfecto por causas directamente imputables al usuario, ste ser
responsable de liquidar el monto de su reparacin e incluso su reposicin total del equipo si ste no tuviera
reparacin. Para esto se realizar una investigacin en la que participaran el encargado, el profesor
responsable y el alumno implicado con el fin de deslindar responsabilidades.

Artculo 14o. Al finalizar la prctica, todo material y/o equipo que se haya utilizado deber entregarse limpio al
encargado del laboratorio o se solicitar una inspeccin del estado del mismo, para equipos fijos, segn sea el caso;
las herramientas y los manuales que se hayan solicitado, deben devolverse con cancelacin del vale correspondiente,
adems dejar limpia su rea de trabajo. En el caso de que el equipo haya sido averiado, debern reportarlo
inmediatamente a la persona responsable del laboratorio. Desde el momento en que es entregado el equipo y hasta
que ste sea devuelto, queda bajo la responsabilidad del usuario. Si por algn motivo el equipo devuelto no es el
mismo que solicito, el equipo solicitado quedar an bajo la responsabilidad de quien lo solicit.

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Artculo 15o. El material o equipo que sea destruido o perdido ser restituido por el o los alumnos responsables en un
herido mximo de 15 das. La persona que no cumpla con el tiempo especificado para su entrega, no podr
reinscribirse. El Jefe de laboratorio expedir una relacin de adeudos de los alumnos y profesores al final de cada
semestre, aquellos que se encuentren en esta lista no se podrn inscribir en el siguiente semestre. Los profesores
podrn recibir un extraamiento dirigido a su expediente.
Artculo 16o. El aseo del laboratorio es de primordial importancia, por lo que los alumnos deben de cooperar en el
mantenimiento de la limpieza de su mesa de trabajo y el material que as lo requiera. La basura debe
colocarse en los recipientes correspondientes.
Artculo 17o. Las substancias corrosivas o contaminadas se dejarn en depsitos adecuados sobre las mesas. Por
ningn motivo deben desecharse residuos o desperdicios a los lavabos.
Artculo 18o. Antes de desechar cultivos de microorganismos o muestras biolgicas, deber proceder a su
inactivacin o destruccin, ver artculo 17.
Artculo 19o. El material punzo-cortante y material de vidrio roto debern colocarse en los recipientes especiales
para ello. Est prohibido depositar este tipo de material en los cestos de basura.
Artculo 20o.Los alumnos deben abstenerse de colocar en las mesas de trabajo cualquier material que no sea el
requerido para la realizacin de la prctica (por ejemplo: ropa, bolsas de mano, libros, etc). Slo podrn tener en
la mesa su bitcora de trabajo y una pluma para hacer sus anotaciones.
VI: DEL MANEJO DE MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Artculo 21o. En caso de cualquier accidente personal, de equipo o material de trabajo debe notificarse
inmediatamente al profesor o al auxiliar tcnico. Despus de atender al accidentado y de resolver la contingencia,
debe levantarse un reporte de incidencia dirigido al Jefe de Departamento para notificar y que de seguimiento del
caso.

Artculo 22o. No almacenar material en el refrigerador sin ser etiquetado correctamente con nombre del
alumno o profesor, Materia y fecha. Cualquier material no etiquetado ser desechado al finalizar el semestre.
Artculo 23o. Para transferir lquidos con pipetas, deber utilizarse la propipeta correspondiente. Queda prohibido
pipetear con la boca.
Artculo 24o. Dejar siempre tapado el reactivo que se est utilizando y tomar una cantidad ligeramente superior a la
necesaria en un vaso de precipitado limpio y seco; medir del vaso con pipeta o probeta, no regresar los remanentes
a los frascos de origen.
Artculo 25o. Antes de usar un reactivo verificar los datos anotados en la etiqueta y consultar sus propiedades fsicas,
qumicas y toxicolgicas para manejarlos adecuadamente.
Artculo 26o. No tocar directamente con las manos los productos qumicos slidos, especialmente aquellos que,
adems de su toxicidad, pueden producir quemaduras graves. Todo manejo se har mediante esptulas.
Artculo 27o. El manejo de cidos se realizar en la campana de extraccin o una mesa limpia y bien ventilada,
utilizando guantes y lentes de seguridad o careta.
Artculo 28o. Todos los compuestos voltiles o que desprendan vapores txicos debern manejarse en las
campanas o en un lugar ventilado.
VII: DEL CONTROL DE EQUIPOS Y REACTIVOS
Artculo 29o. Cada equipo y reactivo que se encuentre en el laboratorio tendr asignada una bitcora de uso o
registro de descarga.
Artculo 30o. Las bitcoras de los equipos y las descargas de reactivos son tiles para la administracin de los
mismos, por lo que es necesario mantener actualizados estos registros. Todo usuario deber asentar en ellos los datos
de uso una vez concluida la prctica.

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Artculo 31o. Las bitcoras y descargas son consideradas material de laboratorio, por lo que, si son sustradas del
laboratorio por algn usuario, se considerar como adeudo al laboratorio.
Artculo 32o. La persona a quien se sorprenda haciendo mal uso de equipos, materiales o instalaciones de los
laboratorios, ser sancionada segn la gravedad de la falta cometida y conforme al Reglamento Interno
correspondiente.
VIII: HIGIENE Y SEGURIDAD
Artculo 33o. El laboratorio debe estar equipado con botiqun de primeros auxilios y extinguidores colocados en
lugares accesibles.
Artculo 34o. Toda persona que se introduzca a las reas de trabajo, deber abstenerse de ingerir alimentos, bebidas
y fumar durante su permanencia en stas.
Artculo 35o. Se abstendrn de tirar papeles, colocar material o equipo en el piso del laboratorio que pueda
obstaculizar la libre circulacin o ser causa de accidente.
Artculo 36o. Todos los objetos de desperdicio, debern depositarse en los recipientes destinados para tal fin.

Artculo 37o. Los frascos que contengan sustancias txicas, combustibles o corrosivas; deben identificarse con un
smbolo de peligro en una etiqueta visible.
Artculo 38o. El laboratorista dar instrucciones precisas para el manejo, cuidado y transporte de los equipos y
materiales.
Artculo 39o. No se permitir la entrada al laboratorio, a personal ajeno al mismo.
Artculo 40o. En caso de accidentes graves, los profesores debern controlar las causas del accidente, asegurarse
que la atencin mdica del accidentado sea inmediata o reciba los primeros auxilios necesarios e informar
inmediatamente a las autoridades del plantel.
VII: TRANSITORIOS
Artculo 41o. Este reglamento ser vigente a partir de la fecha de su publicacin.
Artculo 42o. Los aspectos no contemplados en este reglamento sern resueltos en primer trmino por el responsable
del rea, el jefe de Departamento y, si el estudiante requiere atencin mdica, por el Jefe del Departamento de
Servicios Escolares y el Jefe de la Divisin de Estudios Superiores, segn sea el caso.

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RECOMENDACIONES PARA UN BUEN DESEMPEO EN EL TRABAJO
DE LABORATORIO.
Las personas que trabajan con agentes infecciosos pueden adquirir infecciones en el laboratorio, como resultado de
accidentes o incidentes no reconocidos.
El grado de riesgo depende sobre todo de la virulencia del agente biolgico en cuestin y de la resistencia del
husped. En el laboratorio, las infecciones se adquieren por ingestin, inhalacin o introduccin de microorganismos
en los tejidos de manera inadvertida. Los laboratoristas que realizan pruebas con cepas de Haemophilus influenzae y
Streptococcus pneumoniae estn relativamente a salvo. Sin embargo, los que trabajan con aerosoles de Neisseria
meningitidis tienen un riesgo mayor de adquirir una infeccin meningocccica.
El riesgo asociado con agentes patgenos entricos, tales como Shigella, Vibrio o Salmonella, es la ingestin
accidental, por ello es tan importante no tocarse el cuerpo y sobre todo la cara, no ingerir alimentos o bebidas y tener
la bata y utensilios de Lab. aislados de los materiales comunes de trabajo de otras materias.
Las recomendaciones especiales de seguridad son apropiadas para el trabajo con estos agentes, que presentan un
peligro moderado para el personal y el ambiente. En relacin con el personal de laboratorio que trabaja en estas
instalaciones, se han establecido las siguientes directrices:
1. El personal de laboratorio debe recibir adiestramiento especfico en cuanto al manejo de los agentes
patgenos y estar dirigido por cientficos competentes.
2. El acceso al laboratorio tiene que ser limitado en horas de trabajo.
3. Deben tomarse precauciones extremas con respecto a los objetos afilados contaminados.
4. El personal que realiza ciertos procedimientos que requieren la creacin de aerosoles infecciosos o
salpicaduras tiene que utilizar equipo y ropa de proteccin adecuados (Cubrebocas, mascarilla, guantes
quirrgicos, campana de flujo laminar).
Para el desarrollo de las prcticas es conveniente tener en cuenta algunas normas elementales que deben ser
observadas para lograr un buen nivel de aprendizaje en el trabajo prctico.
1. Antes de realizar una prctica, debe leerse detenidamente para adquirir una idea clara de su objetivo,
fundamento y tcnica.

Es obligatorio preparar un diagrama de actividades, que debe ser conocido y discutido por
todos los integrantes del equipo; puede hacer dibujos o esquemas cuando se considere necesario,
para aclarar dudas sobre manejo de material o equipo.

Revisar materiales biolgicos y de consumo que deber traer cada equipo para la realizacin
de cada prctica o sesin de laboratorio.

Cualquier duda sobre el trabajo de Lab. debe hacerse al maestro antes de iniciar la prctica.

2. Material personal Cada estudiante debe tener bata blanca de manga larga que cubra el frente, una Bitcora
de trabajo, lpices de colores, un rollo de cinta adhesivo, tijeras, pinzas de diseccin de punta roma, asa y
porta-asa, botes de lamina (de los usados para conservas y alimentos enlatados de 300, 600mL. y 1L) y
cerillos o encendedor.
3. El estudiante debe llevar una Bitcora de trabajo en donde cualquier observacin relevante, para anotar
cualquier cambio en las condiciones de la prctica y los resultados deben ser siempre anotados
cuidadosamente apenas se conozcan.
4. El orden y la limpieza deben presidir todas las experiencias de laboratorio. En consecuencia:

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El ingreso al laboratorio debe ser puntual para atender cualquier observacin para el desarrollo de
la prctica, con la bata puesta, limpia y abotonada, aquellas personas con cabello largo deben
mantenerlo sujeto y el rostro despejado.
Todo material, mochilas y objetos ajenos al laboratorio deben quedar en anaqueles y mesas de
guardado, a la entrada del laboratorio.
No comer, fumar, mascar chicle o tener ningn objeto en la boca durante el trabajo en el
laboratorio. No deben jugar, maquillarse, peinarse o realizar actividades ajenas al trabajo de
laboratorio.
Al iniciar la prctica debe lavar su material y limpiar su rea de trabajo. Para microbiologa
adems se requiere desinfectar mesas y utensilios con solucin de cloro al 6% o con fenol
alcohol antes de iniciar el trabajo y al terminar cada prctica, se proceder a limpiar o lavar
cuidadosamente el material que se ha utilizado.
Cuando maneje microscopios, procure sentarse frente al microscopio para evitar vibraciones.
Para sembrar y otras actividades, busque la posicin que le permita un trabajo prolongado y sin
riesgo.
Depositar en los botes para basura todo el material de desecho no contaminado, como papel,
algodn, cerillos, etc.
Al finalizar cada sesin, deber colocarse el material debidamente separado en los lugares
asignados para ello: material contaminado para esterilizar, en el refrigerador de material
contaminado, se esteriliza sin etiquetas; material sucio para lavar, se lava, se seca y se guarda;
material para incubar, se coloca en la incubadora correspondiente; y reactivos debidamente
cerrados y ordenados.
Colocar los bancos debajo o sobre de la mesa al terminar la sesin y lavarse las manos, antes de
salir del laboratorio.
5. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su material.
6. Es muy importante delimitar el rea de trabajo en condiciones de esterilidad y:

Del lado izquierdo colocar las gradillas con tubos, los matraces, las cajas de Petri estriles y
toda clase de recipientes que se habrn de manipular.

Del lado derecho deben estar cerillos o encendedor, asa y portaasa, marcador, tijeras, pipetas
y un recipiente de dimensiones apropiadas para desechar los diferentes materiales que se
debern esterilizar, principalmente pipetas y los tapones de algodn que se ponen al final de
estas.

7. Al frente, a unos 30 cm del borde de la mesa se coloca el mechero, cuya llama debe ser estable y de
unos 15 cm de altura. Para el trabajo en condiciones aspticas, si no se dispone de una campana de
flujo laminar, se deben hacer las manipulaciones a una distancia horizontal no mayor de20 cm y a
una altura de 5 a 10 cm de la base de la llama. Este espacio constituye la zona de seguridad del
mechero.

Siempre debe esterilizarse el asa bacteriolgica, antes y despus de usarla. El procedimiento


consiste en introducir en la llama del mechero el alambre en posicin inclinada a unos 45 y dejar

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que alcance el rojo vivo, despus se flamea el porta asa hasta una distancia igual a la profundidad
de los recipientes que se utilicen, sean tubos o matraces.

La boca de tubos y matraces se debe flamear, con objeto de quemar los filamentos de algodn que
puedan adherirse provenientes del tapn, igualmente para destruir los contaminantes de la mano,
que se adhieren en el momento de retirar el tapn, esta operacin se realiza inmediatamente antes
de volverlo a colocar.

No se debe exagerar esta operacin sobrecalentando, ya que esto puede hacer que el tapn se
queme, o que cualquier manejo subsecuente del material ocasione una quemadura al operador.

8. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que es el que se
necesita y de los posibles riesgos de su manipulacin.
9. No devolver nunca a los frascos de origen los sobrantes de los productos utilizados sin consultar con el
profesor. Existen frascos con cidos o lcalis de reuso.
10. No tocar con las manos o con la boca los productos qumicos. Use guantes o pipeteros cuando lo requiera.
11. Todo el material y equipo, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios, deben
manejarse con cuidado, evitando los golpes o el forzar sus mecanismos. El profesor y el personal de
laboratorio asesorarn a los estudiantes en el correcto manejo de material y equipo. Cualquier duda,
consltenlos.
12. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben mantenerse alejados de las llamas de los
mecheros. Si hay que calentar tubos de ensayo con estos productos, se har al bao Mara, nunca
directamente a la llama. Si se manejan mecheros de gas se debe tener mucho cuidado de cerrar las
llaves de paso al apagar la llama, apague el mechero cuando no lo est usando.
13. Cuando se manejan productos corrosivos (cidos, lcalis, etc.) deber hacerse con cuidado para evitar
que salpiquen el cuerpo o los vestidos. Nunca se vertern bruscamente en los matraces, vasos o tubos de
ensayo, sino que se dejarn resbalar suavemente por su pared.
14. Cuando se quiera diluir un cido, siempre se debe echar cido sobre agua, dejando resbalar
suavemente por la pared del recipiente. Nunca al contrario: agua sobre ellos.
15. Cuando se vierta un producto lquido, el frasco que lo contiene se inclinar de forma que la etiqueta
quede en la parte superior para evitar que si escurre lquido se deteriore dicha etiqueta y no se pueda
identificar el contenido del frasco.
16. Est estrictamente prohibido pipetear con la boca en el laboratorio. Deben utilizarse los bulbos de
goma, una jeringuilla o artilugio que se disponga en el laboratorio.
17. Las pipetas se tomarn de forma que sea el dedo ndice el que tape su extremo superior para regular la cada
de lquido.
18. Al enrasar un lquido con una determinada divisin de escala graduada en pipetas, frascos
volumtricos o probetas, debe evitarse el error de paralaje levantando el recipiente graduado a la
altura de los ojos para que el menisco de enrase sea horizontal. En el caso de buretas debe montarse

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el equipo de manera que la parte media de la bureta quede a la altura del rostro y bajar e subir el cuerpo
de manera que el menisco quede siempre en lnea horizontal, a la altura de los ojos.
19. Cuando se calientan a la llama tubos de ensayo que contienen lquidos o materiales que pueden
proyectarse debe evitarse producir salpicaduras, ya sea por ebullicin violenta o sobrecalentamiento
brusco. El tubo de ensayo se acercar a la llama inclinado y procurando que sta acte sobre la mitad
superior del contenido y agitando para distribuir el calor, cuando se observe que se inicia la ebullicin
rpida, se retirar, acercndolo nuevamente a los pocos segundos y retirndolo otra vez al producirse una
nueva ebullicin, realizando as un calentamiento intermitente. En todo momento, se evitar dirigir la
boca del tubo hacia usted o hacia otra persona.
20. Ningn material de vidrio debe enfriarse bruscamente justo despus de haberlos calentado con el fin de
evitar roturas.
21. Los cubreobjetos y portaobjetos deben cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.
22. Las agujas o asas de inoculacin se deben enfriar sostenindolas en el aire durante 510 segundos
antes de que toquen las colonias o el material clnico. Las asas que contienen material infeccioso tienen
que secarse en aire caliente sobre un mechero antes de flamearlas.
23. Cuando se lleven a cabo procedimientos con alto riesgo de generar aerosoles infecciosos, o cuando el
procedimiento que se utiliza puede resultar en una salpicadura de la cara con material infeccioso u otro
material peligroso, el trabajo de laboratorio debe realizarse en gabinetes de seguridad o por
laboratoristas que usen los equipos apropiados de proteccin de la cara (por ejemplo, anteojos, mscara u
otros protectores). Entre los procedimientos que pueden ser de riesgo tenemos la centrifugacin,
pulverizacin, zarandeo, agitacin o mezcla vigorosa, disrupcin snica, recipientes abiertos de materiales
infecciosos cuyas presiones internas puedan ser diferentes de las presiones del ambiente, inoculacin
intranasal de animales y cosecha de tejidos infectados de animales o huevos. Las mscaras protectoras
deben tambin utilizarse cuando se trabaja con altas concentraciones o grandes volmenes de agentes
infecciosos.
24. El material para incubar debe llevar la siguiente identificacin:

Materia-Grupo,

Equipo,

Nombre de un (o los) alumno (s),

fecha y nombre del microorganismo o experimento.

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PRCTICAS DE MICROBIOLOGA SANITARIA
Practica N1: Seleccin y preparacin de los materiales y soluciones para un
anlisis microbiolgico
Introduccin
En el anlisis microbiolgico para determinar la calidad sanitaria de los procesos, reas de trabajo,
maquinaria, utensilios, materias primas, lneas de produccin, productos terminados y personal involucrado en todo
el proceso, la adecuada seleccin de la muestra, el muestreo correcto, el transporte al laboratorio y su conversacin
adecuada hasta el momento de su anlisis, es de primordial importancia para obtener resultados confiables y
reproducibles.
Una muestra idnea, es aquella que va a representar las caractersticas de todo un lote del producto.
Los materiales utilizados para la recoleccin de las muestras, debern ser los apropiados y cumplir con las
medidas de esterilidad para evitar emitir resultados falsos positivos.
El anlisis microbiolgico de las muestras se debe de analizar lo ms pronto posible a partir del momento
en que fue tomada la muestra. Cuando el muestreo se realiza en lugares distantes al laboratorio, es indispensable
mantener las muestras a bajas temperaturas, bajas el momento en que van a ser analizadas, lo anterior es con fin de
inhibir el crecimiento de los microorganismos potencialmente presentes.
Otro punto importante en un muestreo, es la rotulacin de las muestras que nos indiquen las caractersticas
microscpicas el estado fsico del producto, el nmero o clave asignada para su identificacin en el laboratorio, el
lugar, fecha y hora de muestreo.

2.1 Materiales y Soluciones.

Abrelatas estriles.
Algodn
Bata, cubre bocas, cofia y guantes
estriles.
Bolsas de plstico de 18 x 20 cm. tipo
Ziploc o estriles para muestreo
microbiolgico.
Cajas de Petri con medio para muestreo
por contacto.
Cerillos.
Cinta testigo.
Cucharitas y esptulas de acero
inoxidable estriles.
Cuchillo estril.

Esponjas estriles.
Etiquetas.
Frasco de 250 500mL. boca ancha
estriles.
Hielera para el transporte de muestras.
Hielo potable o bolsas refrigerantes.
Hisopos estriles.
Mechero bunsen.
Plantillas de 15 x 15cm de aluminio estriles.
Plumn de tinta indeleble.
Solucin amortiguadora de fosfatos.
Solucin germicida.
Solucin sal - Glicerina.
Solucin de tiosulfato de sodio al 10%

2.2 Preparacin del material para la toma de muestra


1.

Todo material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de las muestras,
que van a estar en contacto directo con los alimentos (frasco, cuchillo, esptulas, bolsas, pinzas) deben estar
limpios, estriles y libres de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos.

2.

El material par ala toma de muestra que requiera esterilizacin, se envuelve en forma individual con papel
de estraza o aluminio y debidamente identificado. Los medios de cultivo y soluciones preparadas, se
esterilizan en una autoclave. El material metlico y de cristal es ms conveniente esterilizarse un horno a
una temperatura de 170c durante 2 horas. Para evitar agua condensada que pueda afectar la confiabilidad
del anlisis.

3.

Es conveniente colocar un pedazo de cinta testigo en los materiales para asegurar que la esterilizacin fue
efectiva. Cuando se esterilizan frascos de boca ancha, su tapa se protege con papel aluminio para evitar que
se contamine esta parte del frasco.

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4.

Las pipetas y las cajas Petri, se pueden esterilizar en recipientes de acero inoxidable.

5.

Una vez esterilizado el material debe ser guardado en gavetas o espacios donde no puedan contaminarse con
el polvo o corrientes de aire del medio ambiente.

6.

Algunos materiales como esptulas, varillas de vidrio, cuchillos y cucharillas, pueden reutilizarse, despus
de lavarlas, humedecerlas con etanol o isopropanol al 70% y flamearlas, utilizndolas en el momento o bien
pueden guardarse en recipientes estriles.

7.

Cuando se muestrea agua de la red municipal la cual ha sido desinfectada con sales de cloro, en necesario,
antes de esterilizar los frascos para muestreo, adicionar 0.8mL. de una solucin al 10% de to sulfato de
sodio por cada litro de agua muestreada.

2.3

Procedimiento para la toma. Manejo y transporte de las muestras.


2.3.1 Obtencin

1.

La persona encargada de realizar un muestreo de alimento, deber utilizar cofia, cubre bocas, guantes
cuando sean necesarios, no debern tener puestos accesorios como anillos, aretes, pulseras, ni elementos
sueltos que en determinado momento puedan caer a los productos, inmediatamente antes del muestreo
deber lavar las manos con agua y jabn y enjuagrselas con un liquido germicida, secndoselas con toallas
de papel desechables.

2.

La toma de muestra de los productos envasados se llevan a cabo en forma aleatoria, tomndose del mismo
lote y en cantidad suficiente {25-500 g} para el anlisis, envindose al laboratorio tal como se presentan al
consumidor

3.

tratndose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir estos y extraer muestras en
condiciones aspticas para evitar una contaminacin extrema.

4.

los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precaucin estrictamente
asptica.

5.

cuando se requiere y tomar muestras aspticamente, estas no deben tomarse en reas donde las condiciones
sanitarias puedan dar lugar a la contaminacin de las mismas.

6.

la toma de muestras deben hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de
muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir esta y cerrarlos de inmediato, no tocando el
interior de los envases y evitando que la tapa se contamine.

7.

cuando sea necesario, se toma la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin debern ser diferentes de
la que se enva para el anlisis microbiolgico.

8.

para los alimentos preparados sin envasar, de consumo inmediato, se recomienda que la persona que los
prepara sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea
normalmente. Los alimentos que se muestrean estando calientes, se deben conservar y trasladar a la
temperatura en que se muestrearon, estos nicamente se el traslado es menor de una hora, de lo contrario
deber enfriarse a temperatura ambiente y trasladar en condiciones de refrigeracin.

9.

en el caso de alimentos lquidos o semilquidos se deber agitar o mezclar hasta conseguir su


homogenizacin y despus efectuar el muestreo en diferentes niveles {250-500mL.}

10. en alimentos slidos cuando sea necesario se corta el producto y se muestrea con ayuda de instrumentos
estriles como sacabocados, cucharas y cuchillos.
11. en productos a granel se toma la muestra de varias fuentes del contenedor para obtener una muestra
representativa.
12. .-cuando la toma de muestra se realice en un ducto de salida o una compuerta, antes de obtener la muestra se
debe dejar paras las primeras fracciones del producto para limpiar la salida del flujo.
2.3.2 Identificacin de la muestra.

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1.

En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus


de colocar en le muestra, mediante rotulo o etiqueta (Figura1)

2.

La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, en forma tal que se evite que la muestra sea
alterada o violada.
2.3.3 Conservacin y transporte.

1.

El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida se ruptura, alteracin
o contaminacin, evitando adems se exposicin a la luz solar directa.

2.

Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se
transportan bajo condiciones de temperatura de 2 a 8C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el
momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 horas siguientes a su
recoleccin. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0c, empleado para
conservarla hielo seco, para la refrigeracin es recomendable el empleo de recipientes con hielo
REFRIGERANTE O HIELO POTABLE contenido en bolsas de plstico impermeables, para evitar que el
agua de hielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados.

3.

Los productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura
ambiente, siempre y cuando esta no exceda de 45c

4.

Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no esta permitido el empleo de sustancias
qumicas.

5.

Las muestras que se entreguen al laboratorio, debern acompaarse de un informe que adems de contener
la identificacin de la muestra, incluya los siguientes datos:
a. Nmero de unidades y/o cantidad.
b. Clave nica que permita la identificacin del domicilio del fabricante, representante y/o
distribuidor.
c. Indicar nombre genrico y especfico del producto, as como la marca comercial y cualquier
otra informacin que se considere importante.

6.

Observaciones, en donde se seale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de
efectuar la toma de muestra o algn otro dato que sea significativo para determinar los anlisis
microbiolgicos que sean necesarios.
Etiqueta de identificacin
Muestra de:
N de muestra:
Cantidad de muestra:
Lote:
Lugar de muestreo:
Hora de muestreo:
Muestreado por:
Observaciones:
Figura 1 Etiquetado de muestras.

2.4 Manejo de las muestras.

EQUIPO 1

2.4.1 Muestras lquidas


2.4.1.1 Agua de la red de distribucin.
1.

Debe limpiarse el orificio de salida con una torunda de algodn impregnada de solucin de hipoclorito de
sodio con una concentracin de 100mg/l, tallando hasta que no se desprenda ms suciedad u oxido. Cuando

22

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se obtngase el material de salida esta limpio. nicamente es necesario humedecer con una torunda
impregnada de alcohol y prenderle fuego hasta el consumo del alcohol.
2.

Dejar correr el agua aproximadamente 1 a 3 minutos

3.

Cerca del orificio de salida, deben quitarse simultneamente el tapn del frasco y el papel de proteccin,
manejando los como unidad, evitando que recontaminen el tapn, o el papel de proteccin, o el cuello del
frasco

4.

DEBE MANTENERSE EL TAPON HACIA ABAJO PARA EVITAR CONTAMINACION y proceder a


tomar la muestra sin prdida de tiempo y sin enjuagar el frasco; se debe dejar el espacio libre requerido par
ala agitacin de la muestra previa al anlisis {aproximadamente 10% de volumen del frasco}. Efectuada la
toma de muestra, deben colocarse el tapn y el papel de proteccin al frasco. Trasladarlo al laboratorio
inmediatamente, conservndolo a una temperatura de 4 a 10c
5.- anlisis solicitados:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) NMP de bacterias coliformes
c) Vibrio cholerae
2.4.1.1 Agua estancada (tanque de almacenamiento, lagos, cisternas.)
1.

Debern lavarse las manos y antebrazos con agua y jabn, INMEDIATAMENTE ANTES DE LA TOMA
DE MUESTRA y despus de acondicionar el rea de muestreo y los materiales.

2.

Quitar el papel de proteccin evitando que se contamine.

3.

Sumergir el frasco en el agua con el cuello hacia abajo sosteniendo por la base. Girar el frasco e impulsarlo
suavemente hacia arriba, de manera tal que al salir a la superficie se haya yendo partes de volumen. (En
todos los casos debe evitarse tomar la muestra de la capa superior o del fondo donde puede haber nata o
sedimento; en el caso de captacin en cuerpos de aguas superficiales (no deben tomarse muestras muy
prximas a la orilla o muy distantes del punto de extraccin). Si existe corriente en el cuerpo de agua, la
toma de muestra debe, efectuarse con la boca del frasco en contracorriente.

4.

Efectuada la toma de muestra debe colocarse el tapn, sacar el frasco del agua y colocar el papel de
proteccin.

5.

Anlisis solicitados:

a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.


b) NMP de bacterias coliformes.
c) Vibrio cholerae.
2.3.1.3 Agua de pozo.
1.

Cuando no es posible tomar la muestra con la extensin del brazo. Debe atarse al frasco un sobrepeso
usando el extremo de un cordel limpio.

2.

Debe quitarse simultneamente el tapn y el papel de proteccin, manejndolos como unidad, evitando que
se contamine el tapn. O el papel de proteccin, o el cuello del frasco

3.

Con el cuello del frasco manteniendo hacia abajo, se procede a tomar la muestra, bajando el frasco dentro
del pozo, y desenrollando el cordel lentamente, evitando que el frasco toque las paredes del pozo.

4.

Efectuada la toma de muestra, debe colocarse el tapn y el papel de proteccin al frasco.

5.

Anlisis solicitados:
a.
b.
c.

Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.


NMP de bacterias coliformes.
Vibrio cholerae.

23

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Figura 2: Botella de inmersin.


2.3.1.4 Agua y Bebidas embotelladas.
1.

Tomar varios envases, de preferencia poco despus de haber sido embotellado el producto.

2.

Limpiar la tapa con jabn bactericida, enjuagar con agua clorada y limpiar con alcohol.

3.

Retirar l tapa e introducir una pipeta estril al garrafn o envase, tomar la muestra y llevarla a un frasco
estril.

4.

Cerrar el frasco inmediatamente despus de tomar la muestra.

5.

Anlisis solicitados:
a)
b)
c)
d)

Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.


NMP de bacterias coliformes.
Vibrio cholerae.
Hongos y levaduras.
2.4.1.5 Hielo.

1.

La muestra de hielo en cubos, hielo frape o cualquier forma fraccionada, se toma con pinzas o cucharas
estriles depositndola en frascos de boca ancha de 1 litro de capacidad. Es preferible tomar la muestra de
hielo directamente de la maquina que lo esta produciendo.

2.

En caso de hielo envasado, tomar el paquete cerrado.

3.

Para hielo en bloque, lavar perfectamente la superficie exterior con agua estril

4.

Para eliminar la contaminacin superior. Fraccionar con un picahielo estril y transferir al frasco utilizando
instrumentos estriles como pinzas, cucharas, etc., procurando no volver a contaminar las fracciones, o
enjuagarlas con agua estril.

5.

Anlisis solicitados:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) NMP de bacterias coliformes.
c) Vibrio cholerae.
2.4.2 Muestras slidas. EQUIPO

2
24

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1.
2.

1.
2.
3.

1.
2.

1.
2.
3.
4.

2.4.2.1 Embutidos, quesos, alimentos preparados.


Para este tipo de alimentos, deben retirarse porciones de diferentes partes del alimento, cortando con un
cuchilllo estril del centro, los extremos, de la superficie y del interior.
Anlisis solicitados:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) Coliformes totales.
c) Coliformes fecales.
d) Hongos y levaduras.
e) Staphylococcus aureus.
f) Listeria monocytogenes.
g) Vibrio cholerae
2.4.2.2 Enlatados.
Limpiar la tapa de la lata con jabn bactericida, enjuagar con agua clorada, limpiar con alcohol y flamear.
Abrir el recipiente con un abrelatas estril.
Anlisis solicitados:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) Coliformes totales.
c) Coliformes fecales.
d) Hongos y levaduras.
e) Staphylococcus aureus.
f) Listeria monocytogenes.
g) Vibrio cholerae.
h) Clostridium.
2.4.2.3 Deshidratados.
Abrir el recipiente con asepsia y tomar la muestra con esptulas de acero inoxidable estriles e introducirla
en una boca estril.
Anlisis solicitados:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) Coliformes totales.
c) Coliformes fecales.
d) Hongos y levaduras.
2.4.2.4 Helados.
Tomar de los envases originales a granel, porciones representativas de 50g.
Si el recipiente esta abierto, tomar 1 cm de espesor de la superficie y desecharla, despus con una cucharilla
estril, proceder a tomar la muestra.
Si al muestra es muy viscosa se deja derretir a una temperatura ambiente durante 15 minutos
Anlisis solicitados:
a) Coliformes totales.
b) Staphylococcus aureus

2.5 Tcnicas de muestreo para determinar la sanidad en una planta procesadora de alimentos.
EQUIPO 3

2.5.1 Introduccin.
Actualmente en la industria alimentara se aplican programas de control de calidad apoyados en los anlisis de
riesgos y control de puntos crticos (HACCP). Estos sistemas completan la importancia que se debe tener en la
interrelacin de todos los elementos del proceso: materias primas, equipo de procesamiento, personal
involucrado y medio ambiente.
El medio ambiente puede construir una fuente importante para la contaminacin microbiana en los procesos de
los alimentos, es por eso que hay que disear programas efectivos para su control. Los puntos crticos mas
comnmente encontrados como focos de contaminacin microbiana, son las superficies de las mesas, los

25

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utensilios, la maquinaria, los pisos, techos y paredes, el aire, las manos y en general el personal portador de
microorganismos patgenos.

2.5.2 Procedimientos.
2.5.2.1 Muestra de aire.
Para determinar si una fuente de contaminacin proviene del aire, se utilizan cajas Petri con medios selectivos
para los microorganismos que se desee determinar, se dejan destapadas entre 15-20 minutos en lugares de
trabajo, durante las horas que haya ms movimiento, se cierran y se incuban. Se envan al laboratorio y se
procede hacer los siguientes anlisis:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos aerbicos.
b) Coliformes totales.
2.5.2.2 Muestreos de superficies y utensilios
A. Mtodo del hisopo
Esta tcnica se puede utilizar en superficies que sean regulares, lisas, pulidas; consiste en frotar un aplicador de
madera u otro material con algodn (hisopo) estril, humedecido con la solucin diluyente en un rea
determinada.

15cm

15mm

rea que se muestrea 15x15(cm, rea limpia, o mm en rea


contaminada)

Figura 2 Plantilla de plstico o aluminio estril y muestreo con torunda o hisopado.

a.1 Muestreo de superficies.


1.

Colocar una plantilla estril de aluminio o tefln (figura2) sobre la superficie que se va a muestrear y
destapar aspticamente un hisopo estril.

26

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2.

3.

4.
5.

1.
2.
3.
4.
5.

Si la superficie est seca, humedecer el hisopo en la solucin amortiguadora y presionar contra la pared
del frasco para quitar el exceso de lquido, con un movimiento de rotacin; si la superficie est hmeda,
no es necesario hacer sto.
Con el hisopo inclinado en un ngulo de 30 frotar 3 veces la superficie delimitada por la plantilla, cada
una en direccin opuesta. Enjuagar el hisopo en la solucin amortiguadora regresar el exceso del
liquido y repetir la operacin con el mismo hisopo sobre 3 superficies mas.
Regresar el hisopo al tubo o frasco y romper la parte que estuvo en contacto con los dedos.
Colocar el envase sobre el hielo picado o en una caja con refrigerante y enviar al laboratorio.

a.2 Muestreo de utensilios de comedor.


Utilizar frascos de 50mL..
Tomar una torunda con pinzas o un hisopo estril (figura 3), sumergirla (o) en la solucin amortiguadora,
exprimirla (o) contra las paredes del frasco.
Limpiar bien con la torunda (o hisopo) la superficie del utensilio, enjuagar la torunda (o hisopo) y
exprimirla (o) contra las paredes del frasco {figura3}
Limpiar 3 utensilios iguales o diferentes y agregar las muestras a la misma solucin.
Colocar la torunda dentro del frasco de la muestra, enviar el laboratorio para realizar los siguientes anlisis:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos.
b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli
c) Staphylococcus aureus.
d) Salmonella y Listeria.

Figura 3: Muestreo de utensilios, hisopado, torunda estril.

B. Mtodo de la esponja

EQUIPO 4

Esta tcnica se puede aplicar eficientemente para tomar muestras de superficies en reas grandes.
b.1 Toma de muestra.
1.

2.
3.
4.
5.

Sacar la esponja con pinzas estriles o con guantes desechables (figura 4), o bien utilizar una bolsa nueva de
polietileno invertida a manera de guante; humedecerla con solucin amortiguadora de fosfatos estriles o
bien con agua peptona al 0.1% estril.
Frotar vigorosamente con la esponja el rea en la que se va a tomar la muestra.
SI LA SUPERFICIE ES PLANA, se puede aplicar la solucin directamente sobre la superficie y recogerla
con la esponja frotando.
Colocar la esponja en la bolsa de plstico con todo el lquido de muestreo. Cerrar la bolsa
TRANSPORTAR AL LABORATORIO en refrigeracin para realizar los siguientes anlisis:

27

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a)
b)
c)
d)

Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos.


Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli
Staphylococcus aureus.
Salmonella y Listeria.

Figura 4. Muestreo por el mtodo de la esponja.

C. Mtodo de la placa por contacto.


Este mtodo se recomienda para obtener datos cuantitativos en superficies planas e impermeables. Idealmente la
placa se debe utilizar sobre superficies que han sido previamente saneadas y desinfectadas. En lugares con alto
grado de contaminacin, resultar en un crecimiento masivo en la placa que dificultara los recuentos.
En los casos de muestreo en superficies previamente tratadas con germicida, es necesario que se agregue al
medio de cultivo un agente neutralizante adecuado.
1.
2.
3.

Se prepara la placa Rodac con agar sobresaliendo en forma cncava del borde de la base.
Se toma de la base con guantes estriles, se invierte y se frota en un ocho sobre la superficie a muestrear, se
voltea y se cubre con la tapa.
Se incuba sin invertir.

En superficies donde se sospeche que se encuentran un poco mas contaminadas, y que pueden originar mas de
300 UFC por placa, se deben tomar suficientes muestras para obtener datos representativos, la seleccin del sitio
al azar permitir comparaciones adicionales y eliminara posibles interferencias.

28

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Muestreo de superficie

Placa RODAC. Observe la base con


borde. La tapa queda sostenida sobre
ste, permitiendo espacio entre el agar y
la tapa

Figura 5: Placa RODAC y muestreo.

1.
2.
3.

c.1 Toma de muestra.


Quitar la tapa de plstico y presionar cuidadosamente el agar contra la superficie, mediante movimientos
rotatorios uniform, presionar sobre la parte de atrs de la placa para efectuar el contacto.
Colocar de nuevo la tapa e incubar en posicin invertida a 34c durante 24 48 horas.
Transportar al laboratorio en refrigeracin para realizar los siguientes anlisis:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos.
b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli
c) Staphylococcus aureus.
d) Salmonella
e) E. coli.
f) Listeria.
D. Mtodo de enjuague.

Este mtodo se emplea para tomar muestras de objetos pequeos como son cucharas, tenedores, mamilas de
biberones, etc. O para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plstico, etc.
d.1 Muestreo de utensilios de comedor.
1.
2.

3.
4.

Sumergir la superficie de los utensilios que estn en contacto con la boca (cucharas, tenedores, etc.) en un
frasco de boca ancha con 40mL. de solucin amortiguadora de fosfatos.
Agitar el utensilio en el lquido para que se enjuague perfectamente; repetir la operacin con 3 utensilios
ms para obtener el lavado de 4 utensilios iguales por frasco. En caso de muestrear menor numero de
utensilios indicarlo en la etiqueta.
Cuando se trate de mamilas, enjuagar cada una de ellas, introducindola en el frasco, tapndolo y agitndolo
fuertemente.
El nmero de mamilas enjuagadas debe ser 4 salvo que se desee muestrear una sola, y se debe especificar en
el frasco.

d.2 Muestreo de superficies interiores. EQUIPO 5

1.
2.
3.
4.

Introducir en el envase o bolsa. 10-100mL. de solucin amortiguadora estril.


Enjuagar haciendo correr el lquido por toda la superficie, agitar bien.
Regresar el lquido de enjuague al recipiente original.
Rotular el recipiente y enviarlo al laboratorio para realizar los siguientes anlisis:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos.
b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli
c) Staphylococcus aureus.
d) Salmonella y Listeria.

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Figura 6. Toma de muestra en manos.

d.3 Muestreo en superficie de manos.

1.

2.
3.
4.

d.3.1 Mtodo del enjuague


Vaciar el contenido del frasco, 50mL. de solucin estril de fosfato con triton x-100, en una bolsa
nueva de polietileno, donde se pueda introducir la mano que se va a muestrear y cerrar a la altura
de la mueca.
Frotar los dedos particularmente alrededor de las uas y la palma de la mano a travs de las paredes
de la bolsa durante un minuto.
Regresar el contenido de la bolsa al frasco.
Transportar al laboratorio en refrigeracin para realizar los siguientes anlisis:
a) Cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos.
b) Coliformes totales y NMP de coliformes fecales y E. coli
c) Staphylococcus aureus.
d) Salmonella y Listeria.

d.3.2 Mtodo del hisopo o la torunda


1. Utilizar frascos de 50mL..
2. Tomar una torunda con pinzas o un hisopo estril, sumergirla (o) en la solucin amortiguadora,
exprimirla (o) contra las paredes del frasco.
3. Limpiar bien con la torunda (o hisopo) la superficie interna de los dedos y el contorno de las uas,
enjuagar la torunda. {no es necesario limpiar el dorso de la mano}.
Se puede repetir la operacin tomando la muestra de la otra mano, indicarlo en la etiqueta.
2.6 Tcnicas de muestreo para microorganismos anaerobios. EQUIPO

2.6.1.1 Muestreos para Clostridium perfringens.


1. Tomar una porcin representativa de 25g, del alimento a muestrear {pollo asado entero, salsas,
vegetales crudos, sopas deshidratadas, etc.}
2. Transferir la muestra a bolsas estriles o frascos de 200mL.
2.6.1.2 transporte y almacenamiento.
1. Si el transporte de la muestra es rpido, basta con conservarla a 10c hasta su anlisis.
2. Si al muestra no es analizada en un lapso de 8 horas, adicionar 25mL. de solucin sal-glicerina (ver
apndice 2), y conservar inmediatamente a 20-32C durante su transporte al laboratorio.
3. Cuando las muestras son lquidas como salsa o jugo de carne, debern mezclarse bien con un volumen
equivalente de doble concentracin de solucin sal-glicerina. Almacenar inmediatamente la muestra a
20-32c o en hielo para su transporte al laboratorio.
4. Transferir la muestra con l solucin sal-glicerina a un frasco estril y adicionar 200mL. de agua
peptonada.

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2.6.2 muestreo para Clostridium botulinum
1. Tomar una porcin representativa de 25g del aliento a muestrear.
2. Transferir la muestra a bolsas estriles o frascos y conservarla en refrigeracin, excepto las conservas
las cuales no necesitan ser refrigeradas a menos que estn daadas o quebradas.
3. Aspticamente transferir la muestra a un homogenizador de alimentos adicionando igual volumen de
solucin amortiguadora de fosfatos con gelatina.
4. Conservar la muestra homognea en refrigeracin, hasta su anlisis.
2.7 seleccin. Preparacin y medicin de la alcuota.
2.7.1 seleccin y toma de la alcuota.
1. La muestra colectada de un lote debe ser representativa de este. Esa muestra a su vez es objeto de un
nuevo muestreo cuando se extrae de ella la alcuota que va a ser analizada. La muestra deber estar
perfectamente homogeneizada, para que la alcuota tomada sea representativa y evitar que esta
represente nicamente un aparte especifica del producto. Deber ser manejada de tal manera que se
eviten contaminaciones externas.
2.7.1.1 muestras lquidas.
1. Cuando el producto es lquido, se tiene ms facilidad para homogenizarlo, ya que con agitacin se
puede lograr el objetivo. nicamente hay que considerar los productos que contienen grasa, los cuales,
deben emulsificarse completamente debido a que los glbulos de grasa tienden a adsorber bacterias en
su superficie. Es conveniente tener u obtener muestras no menores a 1 litro, en alimentos y aguas
purificadas y de 250mL. en agua de red municipal.
2.7.1.2 muestras slidas.
1. Algunas muestras {carne molida, leche en polvo, helado de crema} son fcilmente homogeneizables.
Otras que se presentan en nicamente empacadas {quesos, salchichas, etc.} requieren del retiro de
porciones de diferentes partes de la pieza constituir la alcuota: del centro y los extremos, de la
superficie y del interior.
2. Cuando el producto es slido y muy heterogneo {alimentos cocinados} macerar o dividir finamente
una masa grande {100-500g} y a partir de esa obtener la alcuota por analizar. Eventualmente puede
resultar mas conveniente examinar por separado cada componente del alimento. No es recomendable
licuar el alimento slido sin diluyente para homogenizarlo; la temperatura se eleva rpidamente de
manera que despus de 5 minutos pasa de 25 a 55c y despus de 10 minutos a 75c.
3. El tamao de las muestras debern ser entre 250- 500g.
2.8 preparacin y dilucin de muestras. EQUIPO 1-6
Debido a que los alimentos son ricos en elementos nutritivos para los microorganismos, en muchas ocasiones el
nmero de estos por gramo de producto es muy elevado, por lo cual es necesario realizar diluciones de la
muestra original para poder cuantificarlos.
El mtodo recomendado es el de las diluciones decimales, para lo cual se procede de la siguiente manera.
Procedimiento
2.8.1 Preparacin de la dilucin primaria.
2.8.1.1 A partir de muestras lquidas:

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Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de
microorganismos es homognea o fcilmente homogenizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).
Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao
de agua de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa
de la muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).

Forma de pesar la muestra slida.

10mL

10-1

10g

10mL

10mL
10-3

10-2

10mL
10-4

10mL
10-5

10-6

10-1

Figura 7 Diluciones.

1.
2.
3.

Preparar frascos de dilucin con 90mL. de lquido de dilucin, estril. Nota. El diluyente debe encontrarse a
una temperatura similar a la muestra, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
Medir 10 mL. de muestra liquida bien homogenizada.
Mezclar aspticamente la muestra con los 90 mL. lquidos. Para sto agitar el frasco con 25 movimientos de
lateralmente, en un arco de 30 efectuados en un tiempo de 7 segundos. En este primer frasco se tiene una
dilucin de la muestra de 1:10 o 10-1. Si la muestra contiene slidos es necesario dejar en reposo por 5
minutos para que sedimenten.

La preparacin de las diluciones decimales adicionales posteriores, si son necesarias, tienen como objeto reducir
el nmero de microorganismos para unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin
de la prueba en el caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.

32

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4.

5.

Del sobrenadante de la primera dilucin, tomar una alcuota de 1 mL para 10 mL totales. o 10 mL. para
realizar una segunda dilucin en 90mL. de lquido diluyente estril, para 100 mL. totales. Agitar el frasco
lateralmente para homogenizar. Esta constituye la segunda dilucin de 1:100 o 10 -2. Se utiliza el mismo
procedimiento para las dems diluciones {ver figura5}.Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos
de laterales en un arco de 30 cm efectuados en un tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL.. de la muestra y
diluir con 9 mL...
Siempre que la cantidad de muestra lo permita, tomar alcuotas mayores, por ejemplo volmenes de 10 u 11
mL., diluidos con 90 o 99 mL., de la misma forma que se describi anteriormente
2.8.1.2 A partir de muestras slidas o semislidas.

Las muestras slidas y semislidas congeladas, deben descongelarse en refrigeracin de 4 a 8C durante 18


horas y no ms de 24 horas antes de proceder a su anlisis.
1. Pesar una cantidad de 10 - 11 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estriles de
tamao adecuado (figura 5).
2. Adicionar un volumen de 90 mL. del diluyente llevado a una temperatura similar a la de la muestra.
3. Mezclar de la forma ya descrita para homogenizar la muestra o bien utilizar una licuadora u
homogenizador Stomacher durante 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea
segn se indique en la tcnica correspondiente para cada alimento. An en los equipos ms lentos, este
tiempo no debe exceder de 2,5 minutos.
4. Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada tomando de las capas
superiores de la suspensin.
Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta
para las operaciones subsecuentes o expresin de resultados.
El homogeneizador peristltico (Stomacher) puede no ser adecuado para algunos productos (por ejemplo,
aquellos con partculas agudas o constituyentes que no se dispersen fcilmente). Debe ser utilizado slo cuando
exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren
significativamente con aquellos obtenidos con licuadora.
2.8.2 Preparacin de las diluciones decimales adicionales.
1. Transferir 1 mL. o un mltiplo, por ejemplo, 10 u 11 mL. de la dilucin primaria 1 + 9 (10-1), en otro
recipiente conteniendo nueve veces el volumen del diluyente estril a la temperatura apropiada,
evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente.
2. Mezclar cuidadosamente cada botella de diluyente siempre de la misma manera que se describe en
2.8.1.1. (1).
3. La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del
nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de
la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de
informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta.
4. Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan
seleccionado. El volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la
pipeta.
5. Si la pipeta es terminal y se transfiere un volumen de lquido equivalente a su capacidad total, escurrir
aplicando la punta de la pipeta una sola vez en una rea de la caja Petri sin lquido.
6. Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello del
frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario.
Nota: En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en
0,1 mL. o 0,1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.

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El criterio para seleccionar las diluciones a preparar de acuerdo con el nmero de microorganismos esperado es:

Para la tcnica del nmero ms probable utilizar tres tubos: donde sea posible demostrar el
microorganismo en 10 mL. de la dilucin ms alta.

Para la tcnica de cuenta en placa, considerar aquellas en las que se puedan contar de 25 a 250 colonias
en un mnimo de una de tres diluciones en el mtodo de cuenta de bacterias aerobias en placa. En el
caso de otros grupos microbianos, considerar el nmero especificado de colonias en la Norma Oficial
Mexicana correspondiente.

2.8.3 Duracin del procedimiento.


En general, las diluciones de la muestra deben ser preparadas inmediatamente antes del anlisis y stas deben ser
usadas para inocular el medio de cultivo dentro de los 20 minutos posteriores a su preparacin.
OBSERVACIONES Y CONCLUSIONES:
CUESTIONARIO
1.- cmo puedes estar seguro de que el material para tomar la muestra, esta efectivamente estril ?.
2.- qu funcin tiene el to sulfato de sodio adicionado al envase para el muestreo de agua de la red municipal?
3.- por qu es necesario con algunas muestras hacer diluciones?
4.- qu funcin tiene un agente neutralizante agregado al medio de cultivo en un muestreo de superficie
5.- Qu importancia tiene la transportacin adecuada de las muestras del sitio muestreado al laboratorio?
Bibliografa.
-Board R.G. 1989. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Edit. Acribia. Espaa.
-Peclzar M. J. Jr. Reid R.D. y chan E. C. S. 1996. MICROBIOLOGIA. Edit. Mc. Graw Hill. Mexico.
Secretara de Comercio y Fomento Industrial. NOM-110-SSA1-1994, Bienes y servicios. Preparacin y dilucin
de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Diario oficial de la federacin mexicana.
Secretara de Comercio y Fomento Industrial. NOM-109-SSA1-1994 Procedimientos para la toma, Manejo y
Transporte de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Diario oficial de la federacin mexicana.
Secretara de Comercio y Fomento Industrial. 1992. Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Diario
Oficial de la Federacin. Mxico, D.F.
Secretara de Salud. 1984. Ley General de Salud. Diario Oficial de la Federacin. Mxico, D.F.
Secretara de Salud. 1988. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de
Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios. Diario Oficial de la Federacin. Mxico, D.F.
Secretara de Comercio y Fomento Industrial. NOM-008-SCFI-1993. Norma Oficial Mexicana. Sistema General
de Unidades de Medida.
Norma ISO 6887-1983 (E). Microbiology General guidance for the preparation of dilutions for microbiological
examination. International Organization for Standardization.
NORMA-Z-013/02. 1981. Gua para la Redaccin, Estructuracin y Presentacin de las Normas Oficiales
Mexicanas. (Secretara de Comercio y Fomento Industrial.)

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Bacteriological Analitycal Manual. 1984. Food and Drugs Administration FDA. Bureau of Foods. Division of
Microbiology. 6a. Ed. Washington, D.C.
Vanderzant F., Carland S., y Don F. 1992. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods. American Public Health Association. Washington, D.C.

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Instituto tecnolgico de Celaya
Practicas de Microbiologa Sanitaria
Nombre:

fecha:

III.- Practica N 2
cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos
RELACIN DE CONOCIMIENTOS:
Conocimientos / habilidades requeridos
- Clasificacin de las bacterias
- Caractersticas de las bacterias
- Alimentos que contaminan las bacterias.
Competencias por adquirir
- Conocimiento y habilidades para aplicar las metodologas adecuadas para aislar y cuantificar las bacterias
contenidas en un alimento.
- Importancia del aislamiento y cuantificacin de bacterias contaminantes de alimentos. Criterios de este grupo
microbiano como indicador sanitario. Lmites mximos permisibles y criterios de aceptacin y rechazo para
materiales biolgicos con cargas elevadas.
3.0 introduccin.
Bacterias mesfilas. Estas bacterias son las de mayor abundancia en la naturaleza y tambin las que con mayor
frecuencia estn presentes en forma natural o contaminando los alimentos. Su temperatura ptima de
crecimiento es de 35c aunque el rango de crecimiento es de 20c a 40C. Este tipo de bacterias pueden adaptar
su metabolismo a las temperaturas bajas de los psicrfilo y cuando se desarrollan se dicen que son bacterias
psicrotrofas. Su importancia en los alimentos reside en que son las responsables del deterioro de los alimentos
conservados en refrigeracin.
3.1 material.
Frascos de dilucin con 90 mL. de
lquido de dilucin estril.
Pipetas de 1.0 y 10 mL. estriles.
Cajas de Petri estriles
Papel aluminio estril {15x15 cm} o
contenedor estril para pesar la muestra.

Esptula estril.
Balanza
Autoclave.
Cuenta colonias.
Incubadora a 35c.

3.2 medios de cultivo.


Agar para mtodos estndar.
La cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos {CEBMA} esta designada para indicar
los niveles de microorganismos en un producto.
3.3 procedimiento para anlisis de alimentos congelados, enfriados, precocinados o comida preparada.
1.- preparar diluciones 10-2 10-3, 10-4, usando para cada dilucin una pipeta estril.
2.- transferir 10 mL. de dilucin previa para 90 mL. de diluyente. Evitando produccin de espuma.
3.- agitar todas las diluciones 25 veces en un arco de 30 cm en 7 segundos.
4.- tomar 1.0 mL. de cada dilucin separadamente y por duplicado en cajas de Petri marcadas
apropiadamente.
5.- agregar de 12-15 mL. de agar en cada placa enfriado a 44-46C, antes de 15 minutos de haber hecho
la dilucin original.
6.- agregar agar inmediatamente a la caja Petri cuando la muestra diluida contenga material giroscpico,
por ejemplo: harina y almidn.
7.- inmediatamente mezclar la muestra diluida y el agar uniformemente por rotacin alternada, y con
movimientos de un lado a otro de las placas en superficie lisa.
8.- dejar que solidifique el agar e incubar a 35C durante 24.-48 horas.

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3.4 gua para calcular y reportar la cuenta estndar de microorganismos mesoflicos arerbicos {CEBMA}
en casos no comunes:
1.- placas normales de {25-250} colonias:
Seleccione placas con colonias separadas. Cuente todas las unidades formadas de colonias
{UFC}.incluyendo aquellas de tamao pequeo, en las placas seleccionadas. Registre las diluciones
usadas y el nmero total de colonias contadas.
2.-placas con ms de 250 colonias:
Cuando un numero UFC por placa excede de 2501, cuente las UFC en las porciones de las placas que
son representativas de la distribucin de colonias. Marque las CEBMA calculadas con asteriscos, para
indicar que fueron estimadas en placas que tenan un rango fuera de 25-250 colonias por placa.
3.- bacterias que forman colonias que se expanden en al superficie del agar:
Estas colonias son comnmente de 3 tipos:
1} una de cadena de colonias, no muy separadas, que parecen ser causadas por desintegracin de grupos
de bacterias.
2} colonias que se distribuyen entre el agar y el fondo de la caja.
3} colonias que se forman en la superficie del agar.
El reporte de estas placas se estima como colonias extendidas que cubrieron el 100%, 50% o 25% de la
caja.
Cuando sea necesario contar las placas con colonias extendidas, se cuenta cada uno de los tres distintos
tipo:
Para el primer tipo: solo si existe una cadena, cuntela como una colonia simple. Si una o mas cadenas
aparecen para originar fuentes separadas, cuente cada fuente como una colonia. No cuente cada
crecimiento individual como cadena sino como una colonia separada.
Para los tipos 2 y 3: usualmente resulta en distintas colonias y son contadas como totales. Conviene el
conteo de colonias expandidas y el conteo de colonias para registrar la CEBMA.
4.- placas sin crecimiento:
Cuando en las placas de todas las diluciones no hay crecimiento, se reporta la CEBMA o UFC de la
dilucin mas baja realizada. Cuando las placas de una muestra fueron contaminadas o no satisfactorias,
registre el resultado {s} como un accidente del laboratorio {LA}.
3.5 reporte de colonias.
Para evitar crear una impresin ficticia de precisin y exactitud cuando se cuentan CEBMA, reporte solo
los 2 primeros dgitos significativos. Redondee el segundo digito al prximo numero superior; cuando el
tercer digito es 6, 7, 8 o 9 y use ceros para cada digito sucesivo hacia la derecha del segundo digito.
Redondee hacia abajo cuando el tercer digito es 1, 2, 3, o 4 cuando el tercer digito es 5, redondee hacia
arriba, cuando el segundo digito es impar y redondee hacia abajo cuando el segundo digito es par.
Ejemplo:
Conteo
Calculado

CEBMA/mL. o g

37

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12, 700

13, 000

12, 400

12, 000

15, 500

16, 000

14, 500

14, 000

1.- placas con 25-250 UFC:


a} calcule la CEBMA como sigue:
N= E c/ [{1 x n1} + {0.1 x n2}] x {d}
Donde.
N= numero de colonias por mL. o g de producto.
Ec= sumatoria de todas las colonias en todo el conteo de placas.
N1= numero de placas en la primera dilucin contada.
N2= numero de placas en la segunda dilucin contada.
D= dilucin para la cual la primera cuanta fue obtenida.
Ejemplo:
1:100
1:1000
232,244
33,28
N= {232+244+33+28} / [{1 x 2} + {0.1 x 2}] 10 -2
= 537/0.022
= 24,409
= 24,000 UFC/mL. o g.
2.- todas las placas con menos de 25 UFC:
Cuando las placas de ambas diluciones son menores de 25 UFC cada una, registre la cantidad como
menor que 25 x 1/d, cuando d es el factor de dilucin para la dilucin del cual primera cantidad fue
obtenida.
Ejemplo:
1:100

1:1000 CBMA/mL. o g

18

<2,500

<2,500

3.- todas las placas con ms de 250 UFC:


Cuando las placas de varias diluciones son mayores de 250 UFC cada una, pero menores que 100/cm 2.
Estime la CEBMA, cercana a 250 y multiplicada por la ultima dilucin.
Ejemplo:
Numero de colonias de la primera dilucin {1:100} = 640
Ultima dilucin =1:1000
640 x 1000 = 640,000
Resultado: 640,000 UFC/mL. o g

38

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4.- todas las placas con colonias expandidas y/o accidentes de laboratorio:
cuando el promedio del numero de colonias es aproximadamente a 100 UFC/cm2, se considera el tamao
de la placa que puede ser de 59 o 65 cm2 y se estima la CEBMA mayor que 100 veces la ultima dilucin.
Ejemplo:
Numero de colonias x cm2 = 100 {promedio}
Tamao de la caja = 65 cm2
Ultima dilucin = 1:1000
65 x 100 x 1000= 6,500 000
Resultado = >6,500 000 UFC/mL. o g

39

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3.6 especificaciones APLICADAs de mesofilos aerobios.
Limite mximo per-misible
UFC/mL. o g
<100
<200
100
30 000
100
100
50 000
10 000
10 000
50

Alimentos
Agua purificada
Agua potable
Jugos y nctares pasteurizados
Leche pasteurizada
Leche condensada azucarada
Leches deshidratadas
crema
mantequilla
Queso procesado
Mermeladas, purs, jaleas, ates
Productos carnicos: curados, emulsio-nados y
cocinados {salchichas, pasteles, mortadelas,
etc.}
Aves frescas-refrigerados y congelados
Pescados frescos-refrigerados y congelados
Huevo fresco-refrigerado
Huevo liquido refrigerado o congelado
Huevo, yema y clara congelados
Huevo, yema y clara deshidratados
Huevo, yema y clara pasteurizadas y
envasadas aspticamente.

100 000 en planta y/o frontera


600 000 en el momento de venta
10 000 000
10 000 000
100 000
15 000
15 000
25 000
1 000

FUENTE: diario de la federacin mexicana. NOM-014-SSA1-1993


DIBUJOS Y OBSERVACIONES:

Cuestionario
1.- A QUE TEMPERATURA SE DEBE mantener el agar para mtodos estndares antes del vaciado en
al caja con ls muestras?
2.- porque se le llama agar para mtodo estndar?
3.- defina el trmino microorganismo (bacteria) mesoflico(a) aerobico(a).
4.- en funcin de la temperatura de crecimiento, como se clasifican las bacterias?
5. Por qu el mtodo de las diluciones es cualitativo y cuantitativo?
6. Por qu es importante el mtodo de la estra cruzada para verificar la pureza de un cultivo?
7. Mencione dos tcnicas fsicas y dos qumicas de enriquecimiento para microorganismos que estn en
baja concentracin en una muestra.
4. Si como se menciona en la introduccin, el oxgeno molecular es un agente oxidante muy txico,
cmo es que los microorganismos aerotolerantes lo soportan a concentraciones tan altas como la
atmosfrica del 21%?
BIBLIOGRAFIA
-Diario Oficial de la Federacin Mexicana. NOM-014-ssa1-1993

40

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-Eduardo Fernndez escartin. Agua y alimentos. Microbiologa Sanitaria. Volumen 1.
-James, T. Peeler., AND LARRY, MATURIN. 1992. AEROBIC PLATE COUNT. FDA Bacteriological
Analitical Manual 7th Edition

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INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYA
PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA APLICADA
NOMBRE

FECHA

IV.- PRACTICA N. 3
DETERMINACION DE BACTERIAS COLIFORMES Y COLIFORMES FECALES EN
AGUAS Y BEBIDAS

4.0 INTRODUCCION
Las bacterias del grupo coliforme podemos encontrarlas formando parte de la Microflora natural de los vegetales y
de los intestinos de los animales y el hombre.
Durante los ltimos aos estos microorganismos y especficamente Escherichia coli, Han sido considerados como
microorganismos indicadores de cuando un alimentos ha sido contaminado directa o directamente por materiales
fecales. La importancia De su determinacin radica pues, en establecer si un alimento estuvo o no propenso A su
contaminacin por este tipo de microorganismos. La mayora de las bacterias De este grupo poseen el sistema
enzimtico llamado beta- galactosidasa, por medio Del cual llevan acabo la fermentacin de la lactosa. Con
produccin de cidos Orgnicos y gas. Para la determinacin del nmero de bacterias coliformes totales
En los alimentos se utilizara la capacidad de produccin de cidos orgnicos en Medio slidos; y la produccin de
gas la determinacin de coliformes en General se realiza en medios lquidos para determinar el numero mas
probable de bacterias coliformes y coliformes fecales (NMP ).
Un indicador especfico de contaminacin directa o indirecta de un alimento por Materias fecales es la determinacin
de la presencia de Escherichia coli, para lo cual Se utiliza sus capacidades tanto de fermentacin de lactosa.
Crecimiento a 44.5C, y u actividad enzimtica de beta glucuronidasa (GUD).
4.1 MATERIAL.
Frascos de dilucin con 90 mL. de solucin
diluyente estril.
Tubos con tapn de baquelita de 15 x 100.
Pipetas de 1. 0, 5. 0 y 10.0 mL.. estriles.
Caja de Petri estriles.
Papel aluminio estril (15 x 15 cm.) contenedores
estriles para pesado de muestras.
4.2 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.
Agar Violeta- Rojo- Bilis (VRB).
Agar Eosina-Azul de Metileno (EMB).
Caldo Lactosado (CL).
Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST).
Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante (caldo BRILA
2%).
Caldo Escherichia coli (EC).
Caldo Lauril Sulfato Triptosa + MetilumbeliferilB-D-glucurnido (CLST- MUG ).
Caldo Lactosado + MUG (CL - MUG).
Caldo Escherichia coli + MUG (EC MUG).
Caldo Rojo de Metilo Voges Proskauer (MR
VP).

Esptulas estriles.
Balanza.
Auto clave.
Incubadoras calibradas a 35 y 44. 5 C.
Homogenizador de alimentos.
Lmpara de luz UV (365 nm ).
Lentes protectores de luz UV.
Caldo Citrato de Koser (CK).
Caldo m HD Endo

Solucin diluyente de fosfatos.


Solucin de alfa naftol.
Solucin de hidrxido de potasio al 40%.
Solucin de rojo de metilo.
Reactivo de Kovac.
Reactivo de Voges Proskauer.

4.3 Procedimiento para la determinacin del Nmero Ms Probable (NMP) de bacterias coliformes en agua
potable, purificada y hielo.

42

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4.3.1 Prueba Presuntiva.
1.- La muestra se agita para homogenizarla bien.
2.- Se adiciona volmenes de 10 mL. de muestra a cada uno de cinco tubos con Tapn de baquelita y tubo de
fermentacin, contenido 20 mL. de caldo lactosado 1.5 veces la concentracin normal deacuerdo a la cantidad
indicada en la etiqueta del frasco.
3.- Se adicionan 1.0 y 0.1 mL.. de la muestra a respectivos tubos con tapn de baquelita y tubos de fermentacin,
conteniendo 15 mL.. de caldo lactosado de Concentracin Normal (diagrama 6).
4.- Una vez adicionada la muestra de la serie de los siete tubos, se revisan para asegurarse de que no presentan
burbujas de aire, si esto ocurre, se invierten los tubos ya cerrados para expulsarlas (todos los tubos se rotulan para
su identificacin posterior en casa de que den una reaccin positiva.)
5.- Los tubos se incuban durante 24 48 hs. a una temperatura de 35 C. Si alas 24 hs. se observa la formacin de
gas los tubos invertidos, se procede a realizar la prueba confirmativa (figura 7). Si a las 48 hs. de incubacin, no
hay la presencia de gas, se considera como una prueba negativa y se reporta la ausencia de bacterias coliformes.
4.3.2 Prueba Confirmativa
1 Se registran los tubos de la prueba presuntiva.
2.- Se agitan suavemente los tubos y mediante un asa estril, se procede a inocular
Una asada a igual numero de tubos con tapn de baquelita con tubo o campana de fermentacin, conteniendo
15 mL.. de caldo bilis verde brillante al 2% (caldo BRILA AL 2%).
3.- Una vez inoculados los tubos, se incuban durante 24 48 hs. a una temperatura de 35 C.
4.- Si alas 24 hs. se observa una clara formacin de gas, se registran los tubos positivos y con la combinacin de
estos, se determina el Numero Mas Probable (NMP) de bacterias coliformes de acuerdo a la tabla 8 (ver ejemplo).
5.- A partir de cada uno de los tubos positivos en esta prueba, se proceder a determinar la presencia de
Escherichia coli en el siguiente paso.
6.- cuando despus de transcurridas 48 hs. de incubacin, no se observa la formacin de gas en ninguno de los
tubos inoculados, se considera negativa la prueba y se reporta la ausencia de bacterias coliformes.

10 mL.. De muestra
1 mL.. De muestra

0.1 mL.. De muestra

20 mL.. De CL
concentrado

15 mL.. CL
normal
FIGURA 6: Diagrama de la prueba presuntiva para determinar el NMP de coliformes en agua purificada y hielo

43

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FIGURA 7: El tubo del centro es positivo, indica una produccin de gas dentro de la campana de Durham.

TABLA N0. 8
TUBOS INOCULADOS: 5 CON 10.0 ML.. 1 CON 0.1 ML..
N0. DE TUBOS POSITIVOS
( 95%) LIMITES DE CONFIANZA
5 10.0 mL..
1 1.0 mL..
1 0.1 mL..
NMP / 100 mL..
MINIMO
0
0
0
<2
0
0
1
0
2
0.05
1
0
0
2.2
0.05
1
1
0
4.4
0.52
2
0
0
5
1.54
2
1
0
7.6
1.5
3
0
0
8.8
1.6
3
1
0
12
3.1
4
0
1
15
3.3
4
0
0
20
5.9
4
1
0
21
6.0
5
0
0
38
6.4
5
0
1
96
12
5
1
0
240
12

MAXIMO
5.9
13
13
14
19
19
29
30
40
48
55
330
370
3700

FUENTE: Standard Methods for the Examination of Water and W. 11 th. Edition 1960 A.P. H.
Ejemplo:
MUESTRA ( ML..)

10

0.1

TUBOS POSITIVOS

RESULTADOS= 12 NM / mL..
RESULTADOS = 12 NMP/ML..
4.3.3

presencia de Escherichia coli.

1.- De cada uno de los tubos que resultado positivos de la prueba confirmativa para
coliformes, se toma una asada y se resiembran para tener colonias aisladas

44

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En placas conteniendo agar eosina azul de metileno (EMB).
2.- se incuban las placas en posicin invertida durante 24 hrs. A una temperatura de 35 C.
3.- El desarrollo de colonias oscuras con brillo verde metlico, nos indica la
Presencia de Escherichia coli (figura 9).
4.- A partir de estas colonias se realizan las pruebas bioqumicas para su confirmacin.

FIGURA 9: caractersticas se E. coli en el agar EMB.


4.3.4

pruebas bioqumicas para presencia de E.coli. { se realiza esta serie de pruebas por cada colonia a
confirmar.}

4.3.4.1 produccin de indol.


1.- inocular un tubo con 4.0 mL. de caldo triptosa e incubarlo 24 h a 35C.
2.- despus de la incubacin se adicionan 0.2-0.3 mL. de reactivo kovac.
3.- el desarrollo de un color rojo en la superficie es considerada como prueba positiva.
4.3.4.2 prueba voges-proskauer {VP}
1.- inocular un tubo con 4.0 mL. de caldo MR-VP e incubarlo 48h a 35C
2.- despus de la incubacin se transfiere 1.0 mL. a un tubo de 13 x 100 mm.
3.- se adiciona 0.6 mL. de una solucin de alfa-naftol, y 0.2 mL. de una solucin de hidrxido de potasio al 40%
se agitan los tubos.
4.- adicionar unos cristales de creatina, agitar y dejar reposar por 2h.
5.- la prueba es positiva si se desarrolla un color rosado.
4.3.4.3 prueba de rojo de metilo.
1.- incubar un tubo con 4.0 mL. de medio MR-VP durante 48h a 35C
2.- adicionar 5 gotas de un solucin de rojo de metilo al tubo.
3.- el desarrollo de un color rojo se interpreta como prueba positiva. Un color amarillo nos indica un resultado
negativo.
4.3.4.4 crecimientos con citrato.
1.- se inocula un tubo con 4 mL. calco citrato koser, el cual de be de presentar un aspecto completamente claro.

45

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2.- incubar el tubo inoculado durante 96h a 36C
3.- si hay crecimiento el tubo presentara un aspecto turbio considerndose la prueba como positiva.
4.3.4.5 interpretaciones de las pruebas bioqumicas.
Resultado: E. coli
INDOL

Voges-proskauer

rojo de metilo

citrato.

biotipo 1

biotipo 2

4.4

determinacin de bacterias coliformes totales y coliformes fecales en alimentos.

4.4.1 introduccin.
Las bacterias consideradas como del grupo coliforme, se encuentran ampliamente distribuidas en al naturaleza,
de tal manera que los alimentos principalmente de origen vegetal, pueden contenerlos en numero considerable
antes de su limpieza los productos alimenticios procesados y que despus son distribuidos a granel, tambin
pueden presentar este tipo de microorganismos, de tal manera que , las normas APLICADAs y dependiendo del
tipo de producto, concede cierta tolerancia el numero, siempre y cuando estn ausentes aquellas bacterias
coliformes de origen fecal. En general el grupo coliforme, se determina cuando se hace un recuento de
bacterias coliformes totales.
4.4.2 determinacin de bacterias coliformes totales.
1.- se inocula por duplicado en cajas de Petri estriles, 1.0 mL. de cada una de tres diluciones realizadas a la
muestra de alimentos a analizar. Las diluciones se hacen de acuerdo al grado de contaminacin que se sospeche
tenga el alimento.
2.- se vaca el medio de agar violeta-rojo-bilis, estril y enfriando aproximadamente 45-50C y se homogeniza
bien al muestra.
3.- una vez solidificada la mezcla del medio y la muestra, se adiciona una capa delgada del medio y se deja
solidificar.
4.- se incuban las cajas en posicin invertida, durante 24 h a 35C
5.- despus de este tiempo, se cuentan las colonias desarrolladas de un color rojo intenso; escogiendo para la
lectura las cajas que presenten un nmero de colonias comprendidas entre 25-30 a 250-300.
6.- se hace el reporte en UFC/g o mL. de producto.
4.4.3 determinacin del numero mas probable {NMP} de bacterias coliformes fecales.
4.4.3 prueba presuntiva.
1.- se toman 10 g de la muestra previamente homogenizada y se hacen diluciones de 1:10, 1:100 y 1:1000.
2.- previamente, se prepara una serie de nueve tubos baquelita y tubos invertidos para fermentacin, conteniendo
15mL. de caldo laurel sulfato, esterilizando todo el sistema.
3.- se inoculan tres tubos preparados de CLS con 1.0 mL. cada uno de la segunda y los otros tres tubos con 1.0
mL. cada uno de la tercera dilucin. ROTULACION cada uno de los tubos de acuerdo a la dilucin adicionada
para identificarlos posteriormente
4.- una vez realizadas las inoculaciones se incuban los tubos durante 24-48 h a una Temp. 35C {figura 10}
5.- transcurrido este tiempo, se revisan los tubos y se separan los positivos que presenten una produccin de gas

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15 mL.. Para c/tubo


con caldo de laurel sulfato.
1mL. de la dilucin 10-1

1mL. de la dilucin 10-2

1mL. de la dilucin 10-3

FIGURA 10: diagrama de la prueba presuntiva, para determinar el NMP de coliformes fecales en alimentos.
1.- se prepara un nmero similar a los tubos de la prueba anterior, de tubos con tapn de baquelita conteniendo
tunos para fermentacin invertidos y 15mL. de caldo E-C esterilizado todo el sistema.
2.- a partir de los tubos positivos con CLS y utilizando un asa, se inoculan los tubos con caldo E-C
ROTULADOS a que dilucin de la muestra corresponde cada uno de los tubos inoculados.
3.- una vez inoculados, se incuba en un bao de agua a una temperatura de 44.5C durante 24 h.
4.- al trmino de Este tiempo se revisan los tubos y se registran a que dilucin original corresponden los que
resulten positivos con formacin de gas.
5.- la combinacin de las diluciones de los tubos positivos, se leen en la tabla correspondiente del NMP de
coliformes fecales por g o mL. de muestra (ver ejemplo).
6.- de cada uno de los tubos positivos, se resiembran en cajas con agar EMB para separar colonias y a partir de
estas se procede a realizar las pruebas bioqumicas para identificar los biotipos de E. coli presentes.
Ejemplo:

47

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N tubos

diluciones

10-1

10-2

10-3

Resultados = 28 NMP/g o mL.

48

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0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
3.0
3.0
6.0
9.0
3.0
6.1
9.2
12.0
6.2
9.3
12.0
16.0
9.4
13.0
16.0
19.0

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

3
3
NMP/g o 3
0.01 0.001 ml
{0.1}

0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3

0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3

3.6
7.2
11.0
15.0
7.3
11.0
15.0
19.0
11.0
15.0
20.0
24.0
16.0
20.0
24.0
29.0

2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2

0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3

0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3
0
1
2
3

0
0
0
0
1
1
1
0
1
2
2
2
2
3
3
3
3

0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3

3
0.01

Esta tcnica es apropiada para muestras lquidas que


de antemano se consideren con un bajo numero o
ausencia de bacterias coliformes, debido a que es posible analizar en un solo paso hasta volmenes de 100mL. de
la muestra.

3 NMP/g
0.001o ml

9.1
14.0
20.0
26.0
15.0
20.0
27.0
0
34.0
21.0
28.0
35.0
42.0
29.0
36.0
44.0
53.0

9.1
0
14.0
1
20.0
2
26.0
3
15.0
0
20.0
1
27.0
2
3 con 1 ml dilucin 1:10 = 0.1g muestra 3 34.0
21.0
3 con 1 ml dilucin 1:100 = 0.01g muestra 10 28.0
Tubos inoculados:
3 con 1 ml dilucin 1:1000 = 0.001g muestra 35.0
2
42.0
3
Tubos positivos Tubos positivos
Tubos positivos
Tubos positivos
29.0
0
36.0
1
3
3
NMP/g o 3
44.0
2
0.01 0.001 ml 3
{0.1}
53.0
3
3
NMP/g o 3
0.01 (0.001) ml
{0.1}

0
0
0
0
1
1
1
1
2
2
2
2
3
3
3
3

49

3
{0.1}
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0

4.5.2 procedimiento.

4.5 Tcnica de filtracin por membrana para agua.

4.5.1 introduccin.

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CELAYA


1.- colocar el cojinete de papel filtro en la caja de Petri previamente identificada con el nmero de la muestra y la
fecha de anlisis.
2.- depositar 2 mL. de medio (caldo-m-HD endo) con una pipeta estril.
3.- extraer el embudo porta-filtro esterilizando en autoclave, de su envoltura.
4.- montar el embudo en un matraz kitasato conectado a una fuente de vaci.
5.- colocar la membrana, con la cuadricula hacia arriba, en el embudo porta-filtro, tomndola con una pinza
estril, y teniendo la precaucin de no daarla.
6.- medir con una probeta estril 100mL. de agua y filtrarla aplicando vaci.
7.- retirar la membrana con una pinza y colocarla sobre el cojinete de papel filtro. La cuadricula de la membrana
debe quedar hacia arriba.
En caso de tener que filtrar varias muestras con un solo embudo, este puede sumergirse en agua a ebullicin con
el fin de desinfectarlo. Una vez sanitizando, colocar el embudo en el matraz y enjuagarlo con agua estril para
enfriarlo, haciendo uso de presin negativa. Cuando el embudo este fri puede procederse a filtrar la siguiente
muestra. Hay que tener en cuidado en al manipulacin del embudo, a fin de no tocar su interioro con las manos.
Si no se dispone de medio liquido, una alternativa es utilizar medio slido de endo, vaciando una capa de 5 mL. a
una caja de Petri de 50x9mm, y una vez solidificada, depositar sobre su superficie la membrana.
8.- incubar a 35C por 22 a 24 horas.
9.- retirar la membrana y colocarla sobre un papel filtro; dejar secar al aire.
10.- auxilindose de una lupa o microscopio y con iluminacin perpendicular, contar las colonias que presenten
un color rojo oscuro, con brillo metlico verdoso, (que puede estar en toda la superficie de la colonia, en el centro
o en la periferia de la misma)
1..- informe: numero de colonias/ 100mL. de la muestra.
4.5.3 ventajas.
1.- los recursos se obtienen en 24 horas.
2.- La cantidad de muestra probada es mayor y por lo tanto, mas significativa.}
3.- la tcnica tiene mayor precisin y responsabilidad.
4.- el volumen de medio de cultivo requerido es muy bajo.
4.5.4 desventajas.
1.- el alto costo de las membranas y del equipo de filtracin.
2.- la interferencia en el crecimiento de los organismos coliformes, por bacterias de otro tipo, ms abundantes en
la muestra.
3.- la produccin de resultados falsos positivos debido a sinergismo bacteriano.
4.- la dificultad de la lectura en muestras muy contaminadas que pueden dar origen a colonias confluentes o
suceder que la calidad de medio de cultivo sea insuficiente para el desarrollo de todas ellas.
4.6 determinacin de la actividad de la beta-glucuronidasa para detectar la presencia de E. coli en alimentos.
4.6.1 introduccin.
Esta prueba se basa en que la mayora de las cepas de E. coli patgenas poseen una actividad de betaglucuronidasa la cual en presencia de un beta-glucuronido es capas de hidrolizarlo y el resultado puede
observarse en 24 horas. El sustrato utilizado para esta prueba es el 4-metilumbliferil-beta-glucuronido (MUG),
cuando este compuesto es hidrolizado por la enzima se obtiene como uno de los subproductos la 4metilumbiliferona, este compuesto es detectable por su fluorescencia cuando se observa con luz ultravioleta de
una longitud de onda de 356nm.
ADVERTENCIA: Lo ms conveniente es utilizar una lmpara manual de 6 watts de potencia; cuando se usa Un
fuente de mayor potencia el personal deber utilizar anteojos protectores. Es conveniente una vez preparado el

50

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medio con este sustrato revisar los tubos para determinar que no hay una fluorescencia previa y esto nos de un
resultado felso positivo.
4.6.2 Prueba presuntiva
1.- Se preparan los tubos con caldo LST-MUG.
2.- Preparar la muestra del alimento haciendo las 3 disoluciones de acuerdo a la tcnica de MNP.
3.- Inocular la serie de los 9 tubos.
4.- Incubar los tubos 24+2 horas a 35C.
5.- En un espacio oscuro utilizando la lmpara de luz UV se observa la fluorescencia presentada en los tubos en
que hubo desarrollo de E. coli
En este periodo de incubacin se puede tener una confiabilidad de un 83-95% de pruebas positivas, aumentando
el tiempo de incubacin a 48 horas se tiene una confiabilidad del 96-100%.

4.6.3

Prueba confirmativa.

1.- Tomar con una asa una muestra de cada uno de los tubos positivos resultantes de la prueba presuntiva, y
resembrarlos en agar EMB
.
2.- Incubar las placas durante 24 horas a 35C.
3.- Observar si hubo desarrollo de colonias caractersticas de E. coli y realizar las pruebas IMVIC (pg. 42) para
determinar su biotipo.
4.6.4

Interpretacin.

Todos los cultivos que muestren fluorescencia, fermentan la lactosa con produccin de gas en 48 horas a 35C y
den los patrones del biotipo 1 (++--) biotipo 2 (-+--) se consideran como E. coli. Se calculan tambin el NMP
de acuerdo a la utilizada anteriormente (pg. 47).

51

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4.7

Especificacin APLICADA de coliformes en alimento

Alimentos

Coliformes totales UFC/g o mL.

Coliformes fecales NMP/g o mL.

Agua potable

<100

No detectable NMP/100mL.

Mantequilla

100

Leche pasteurizada

10 en planta
20 en el mercado

Crema

100

queso fresco

100

Quesos madurados

50

Quesos procesados

10

Pescados frescos-refrigerados
congelados

400

Mermeladas, purs, ates y jaleas.

<10

Productos
carnicol
cocidos, crudos

50

maduros,

Huevo fresco-refrigerado
Huevo liquido
congelado

refrigerado

10
o

10

Huevo, yema y clara congelado

10

Huevo, yema y clara deshidratados

10

Huevo, yema y clara pasteurizados


y envasados aspticamente

100

Harina de: maz, centeno, cedaba


avena y de arroz

100

Fuente: diario oficial de la federacin mexicana NOM-112-SSA1-94


Observaciones y dibujos:

53

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Cuestionario

1.2.3.4.-

Escriba los gneros del grupo Coliforme.


Qu actividad enzimatica del grupo Coliforme se manifiesta en las pruebas presuntivas y confirmativa
Cual es la actividad enzimatica que diferencia a E. coli de las dems Coliformes?
Defina de los trminos.
a) Coliformes totales.
b) Coliformes fecales.

Bibliografa

-Borrad R.G. 1989. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Edit. Acribia. Espaa.

-Carl, Vanderzant, Phd,.Don F.Splittstoesser, Phd. 1992. Compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 3th edition.
-David, A. Power., and Peggy, J. McCuen. 1988. Products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.
United States of America.

-Diario Oficial de la Federacin Mexicana. NOM-112-SSA1-1994.

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Practicas de Microbiologa Sanitaria
Nombre:

fecha:

V.- Practica No. 4


Determinacin de la presencia de Staphylococcus aureus
5.0 Introduccin
El gnero Staphylococcus est ampliamente distribuido en la naturaleza y forman parte algunas de sus especies
de la flora normal de la piel y mucosa del hombre y los animales. Staphylococcus aureus es la especie que con
ms frecuencia ha sido relacionada con las intoxicaciones alimenticias debido a la produccin de enterotoxinas.
En general los cocos gram positivos son relativamente resistentes a bajas actividades de agua, tolerantes a la
deshidratacin y a concentraciones de hasta 6-7.5 % de NaCl.
Staphylococcus aureus a diferencia de otras especies de Staphylococcus produce un pigmento por lo cual se le ha
conocido comnmente tambin como Staphylococcus dorado , la presencia de este pigmento de naturaleza
carotenoide le permite cierta resistencia a la destruccin por parte de los elementos fagocitarios presentes en el
hombre y animales.
Desde el punto de vista de Microbiologa Sanitaria, Staphylococcus aureus es vulnerable a su destruccin por
tratamientos trmicos y a los agentes sanitizantes, por lo tanto su presencia en una planta procesadora de
alimentos nos indica que se estn aplicando de una manera deficiente los sistemas de sanitizacion bien una
manipulacin por personal con pobres prcticas de higiene.
Este mtodo es apropiado para el anlisis de alimentos en los cuales se encuentran ms de 100 bacterias de
Staphylococcus aureus / g.
5.1 Material.
Frascos de dilucin con 90 mL. de solucin
diluyente estril.
Tubos con tapn de baquelita estriles de 15x100.
Cajas de Petri estriles.
Esptula estril.
Balanza.
5.2

Autoclave.
Un contador de colonias.
Incubadora a 35C.
Varilla de vidrio doblada para sembrado en
superficie.

Medios de cultivo y reactivos.

Agar Baird- Parker.


Agar triptosa de soya ( TSA ).
Agar de azul de toluidina-DNA.

Aceite de parafina estril.


Caldo infusin cerebro de corazn ( BHI ).
Perxido de hidrogeno al 30%.

5.3 Aislamiento y conteo.


1.- Para cada dilucin en placa:
1.- Aspticamente transferir 1.0 mL. de muestra para 3 placas de agar Baird-Parker, distribuyendo 1.0 mL. de
inoculo equivalente para 3 placas (0.4 mL., 0.3 mL. y 0.3 mL.).
2.- Extender l inoculo sobre la superficie del agar baird-parker, usando una varilla de vidrio estril ( figura 12 ).
3.- Mantener las placas en posicin vertical hasta que l inoculo es absorbido por el agar ( alrededor de 10
minutos propiamente ).
4.- Si l inoculo no es realmente absorbido; colocar las placas verticalmente en la incubadora alrededor de 1 hora.

55

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5.- Invertir las placas e incubarlas de 45-48 horas a 35C.
6.- Seleccionar las placas que contengan de 20-200 colonias.
Las colonias de Staphylococcus aureus son circulares, planas, convexas, hmedas, de 2-3 mm de dimetro, de
grises a negro rodeadas por una zona clara. Las colonias tienen consistencia pegajosa y grasosa.
Cepas aisladas de alimentos congelados deshidratados que son almacenados por extensos periodos,
frecuentemente desarrollan una coloracin menos negra, con apariencia pera y textura seca.
2.- Conteo de colonias:
Si varios tipos de colonias parecen ser S. aureus, contar el nmero de colonias de cada tipo. Cuente las placas de
baja dilucin, que contenga < 20 colonias. Si la placa contiene > 200 colonias tpicas de S. aureus, y las placas de
dilucin ms altas no contienen colonias tpicas, use estas placas para enumerar S. aureus. Seleccione ms de una
colonia de cada tipo y haga la prueba de la coagulasa. Sume el nmero de colonias en las tres placas que den
positivo la prueba de cuagulasa, y multiplique la muestra por el factor de la dilucin. Reportar este nmero como
nmero de Staphylococcus aureus/g. de producto muestreado.
5.3

Prueba de coagulasa

1.- Transferir colonias sospechosas de S. aureus en un tubo pequeo conteniendo 0.2-0.3 mL. de caldo infusin
cerebro de corazn ( BHI )y emulsionar cuidadosamente.
2.- De esta suspensin inocular tubos con agar triptosa de soya inclinados.
3.- Adicionar 0.5 mL. de plasma de conejo en los tubos con BHI, mezclar cuidadosamente.
4.- Incubar la suspensin en BHI y los tubos con TSA de 18-24 horas a 35C.
5.- Observar peridicamente durante 6 horas se hay formacin de cogulos. Un coagulo que permanezca estable
en el tubo cuando este se inclina, es considerado positivo para S. aureus ( figura 13 ).
5.5 Prueba de la catalasa
1.- Adicionar 1.0 mL. de perxido de hidrogeno al 30% sobre un cultivo en agar inclinado ( TSA ).
2.- La produccin de burbujas de gas se interpreta como una prueba positiva.
Alternativamente se puede emulsificar una colonia con una gota de perxido de hidrogeno al 30% sobre un
portaobjetos (figura 14 ).

5.6

Utilizacin anaerobia de glucosa

1.- Inocular un tubo conteniendo medio con glucosa como fuente de carbono (0.5%).
2.- si es medio slido inocular hasta el fondo del tubo.
3.- Cubrir la superficie de agar con una capa de aceite de parafina estril de por lo menos 25 mm de espesor; e
incubar 5 das a 37C.
La produccin de cido anaerobicamente se ve por un cambio de color amarillo en el agar, indicando la
presencia de S. aureus (figura 15).

5.7

Utilizacin anaerobia de manitol

Repetir el paso 2 usando manitol como fuente de carbono en el medio. S. aureus generalmente de una reaccin
positiva, aunque en ocasiones pueden presentarse variedades que dan la prueba negativa.

5.8

Produccin de nucleasa termoestable

Esta prueba pretende ser especfica como la prueba de coagulasa pero menos subjetiva porque involucra un
cambio de color azul a rosa brillante. Esta no es un sustituto para la prueba de coagulasa, ms bien es como una
prueba de apoyo para la reaccin de coagulasa.

56

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1.- Prepare en un portaobjetos extendiendo 3 mL. de agar azul de tolouidina-DNA en la superficie.
2.- Cuando el agar ha solidificado, perfore el agar haciendo pozos de 2mm de dimetro (10-12 por placa).
3.- Adicionar alrededor de 0.01 mL. de los cultivos crecidos en el caldo BHI (calentados 15 minutos en un bao
de agua hirviendo).
4.- Incubar la placa en una cmara por 4 horas a 35C.
El desarrollo de un halo rosa brillante extendido por lo menos 1.0mm de periferia indica una reaccin positiva.

5.9

Algunas caractersticas bioqumicas tpicas de 2 especies de Staphylococcus y Micrococcus son


mostrados en la tabla 16.

Caractersticas

S. aureu

S. epidermidis S. micrococcii

Actividad de la catalasa

Produccion de coagulasa

Produccion de nucieasa termoestable

Utilizacion anaerobia de glucosa

Utilizacion anaerobia de manitol

Fuente : FDA bacteriological analytical manual 7th edition/ 1992


5.10 Normas APLICADAs para Staphylococcus aureus.
Alimentos

Limite maximo permisible UFC/mL. o g

Productos carnicol maduros, crudos, cocinados

<100

Productos carnicol curados, emulsionados (salchichas,


mortadelas etc.)
Pescados frescos-refrigerados y congelados

100 en al palnta y/0 frontera


1000 en venta
1000

Leche pasteurizada en 25mL.

Ausente

Queso fresco

1000

Quesos madurados

100

Quesos procesados

<100

Huevo fresco-refrigerado

<100

Huevo liquido refrigerado o congelado

<100

Huevo, yema y clara congelados

<100

Huevo, yema y clara deshidratados

<100

Huevo, yema
aspticamente.

clara

pasteurizadas

envasadas

<100

Fuente: diario oficial de la federacin mexicana. NOM-115-SSA1-94

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Observaciones y conclusiones:
Cuestionario
1.- Que caractersticas de Staphylococcus aureus hace que este microorganismo se considere como
enteropatgeno?
2.- Cul es la enzima involucrada en la actividad sobre el H2O2
3.- Qu funcin tiene el telurito de potasio adicionado al agar Bair- Parker
4.- Cul es la principal fuente de contaminacin por S. aureus en una planta de productos lcteos
Bibliografa
-Board R.G. 1989. Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos. Edit Acrabia. Espaa.
-Carl, Vanderzant, Phd,. Don F. Splittstoesser, Phd. 1992. Compendium of methods for the mocrobiological
examination of toods. 3th edition.
-David, A. Power, and. Peggy, J. McCuen. 1988. Products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.
United States of America.
-Diario Oficial de la Federacin Mexicana. NOM-115.SSA1-94.

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA APLICADA
NOMBRE

FECHA

VI.- Practica N 5
determinacin de mohos y levaduras
6.0 introduccin.
Los hongos de inters en la industria alimenticia son aquellos que estn involucrados tanto en el deterioro de los
alimentos como en la produccin de mico toxinas dainas para la salud humana. Se desarrollo vegetativo mas
comn en una forma levaduriforme a las que se les conoce con el nombre de levaduras o bien formado
estructuras ramificadas o micelios conocindose como mohos. Estos microorganismos quimiorganotrofos tienen
la caracterstica de reproducirse en forma mas lenta que las bacterias, es necesario acondicionar el medio de
cultivo para inhibir inicialmente el crecimiento de estas y propiciar el crecimiento de los hongos.
6.1 Material
Cajas de Petri estriles.
Frascos con 90 mL. de solucin diluyente estril.
Pipetas de 10 y 1.0 mL. estriles

Contador de colonias
Microscopio.

6.2 Medios de cultivo y reactivos.


Agar papa y dextrosa
cido tartrico al 10% estril.
6.3

procedimiento.

1.- preparar y diluir la muestra


2.- aadir el cido tartarico estril al medio de cultivo (por cada litro de medio adicionar 14mL. de cido)
3.- colocar 1.0 mL. de muestra diluida en una caja Petri, y adicionar 25 mL. de agar
4.- incubar las placas invertidas de 3-5 das a 22-25C
5.- contar el nmero total de mohos o levaduras y multiplicar por el factor de dilucin.
6.- se reporta numero de colonias/ g o mL. de alimento.
6.4

Especificacin APLICADA de mohos y levaduras en alimentos.

alimentos

Limite mximo permisible


levaduras UFC/g o mL.

Queso fresco

500

Quesos maduros

500

Quesos procesados

100

Salchichas, pasteles mortadelas, salchichones, pates, etc.

<10

Mermeladas, purs, jaleas y ates

<10

Jugos y nctares pasteurizados

25

Harina de trigo

300

60

mohos

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Harina de maz

1000

Harina de maz nixtamalizada

1000

Harina de centeno

200

Harina de avena

100

Harina de cednada

200

Harinas integrales

500

Harina de arroz

200

Pan blanco, pan de narinas integrales y productos de bollera,


galletas.

20

Pan dulce

50

Pasteles, pays, panques, galletas con relleno.

50

Fuente: diario oficial de la federacin mexicana. NOM-11-SSA1-94


Dibujos y observaciones:
Cuestionario.
1.-Cul es la funcin del cido tartarico al 10%, cuando se adiciona al agar de papa y dextrosa?
2.- Cul es la principal fuente de contaminacin por mohos y levaduras en al produccin de pasteles?
3.- En la sanitizacion de pisos y paredes se deben considerar los mohos y las levaduras? Por qu?

Bibliografa.
-carl, vanderzant, phd,. Don F splittstoesser, phd. 1992. compendium of methods for the microbiological
examination of foods. 3th edition.
-david, A. Power., and peggy, j. Mccuen. 1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6th edition.
United states on america.
-diario oficial de la federacin mexicana. NOM-111-SSA1-94

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PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE

FECHA

VII.- Practica N6
Determinacin de microorganismos proteoliticos y lipoliticos
7.1 Determinacin de la presencia de microorganismos proteoliticos.
7.1.1 introduccin.
Los microorganismos proteoliticos son aquellos que son capaces de utilizar las protenas como una fuente de
nitrgeno y carbono, debido a que sintetizan enzimas que van a hidrolizar los enlaces peptodicos presente. Los
productos finales de esta hidrlisis van hacer los aminocidos, los cuales van hacer aprovechados como tales
para la biosntesis de sus protenas o bien pueden ser desaminados para obtener los esqueletos de carbono
necesarios para la biosntesis de otros compuestos como los lpidos y carbohidratos.
El estudio de las bacterias proteoliticas en los alimentos es importante debido a la degradacin que puedan sufrir
estos (carnes rojas, pollos y pescado) bajando la calidad nutricional y organolptica de los alimentos.
Los organismos proteoliticos constituyen un grupo muy heterogneo, en el cual se pueden encontrar bacterias de
los gneros: clostridium, bacillus, proteus, pseudomonas, como proteoliticos activos. LOS
MICROORGANISMOS que efectan hidrlisis de protenas y fermentacin se les conoce como cidoproteoliticos, por ejemplo: streptococcus faecalis, var licuefaciens y micrococcus casseolvticus.
En los hongos encontramos proteoliticos activos entre ellos aspergillus, penicilium, mucor etc., que en algunos
casos se utilizan por su capacidad de formar proteasas en al industria.
7.1.2 material.
Pipetas estriles de 1.0 mL.
Homogenizador de alimentos estriles
Frasco con 90mL. de diluyente estril
Esptula estril
Cajas de Petri estriles

Contador de colonias Qubec


Varilla de vidrio estril
Incubadora a 32+ 1C

7.1.3 medios de cultivo y reactivos.


Agar cuenta estndar adicionada de leche descremada en polvo (despus de esterilizar). Colocar 1g de leche en
polvo por cada 100mL. de medio solucin de cloruro mercrico.
7.1.1 procedimiento para detectar microorganismos proteoliticos
1.-PESAR 10G DE LA MUESTRA.
2.- efectuar las siguientes diluciones decimales 10-1,10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
3.- inocular 0.1 mL. de cada dilucin por duplicado en cajas de Petri conteniendo agar cuenta estndar adicionado
de leche descremada en polvo.
4.- sembrar por extensin en superficie utilizando varilla de vidrio.
5.- incubar una serie de placas en refrigeracin a 4-8C por 10 das y la otra serie a 30C por 24-72 hrs.
6.- incubar las placas durante 1 min. de la solucin de cloruro de mercurio y escurrir.
7.- contar las colonias tpicas con halo transparente que corresponde a los microorganismos
Proteoliticos.
8.- multiplicar el recuento obtenido por 10 y por la inversa de la dilucin correspondiente. Reportar como
proteoliticos psicrotroficos en el primer caso y de mesofilicos en el segundo caso por g 0 mL. demuestra.

62

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7.2 Determinacin de la presencia de microorganismos lipoliticos.
7.2.1 Introduccin.
Los alimentos que son ricos en grasas, estn sujetos a un deterioro cuando estas sufren una alteracin. Los
cambios mas comunes son la oxidacin qumica y enzimatica de los cidos grasos que estn presentes, lo cual
viene a dar como resultado el llamado enranciamiento del alimento, con sus consecuencias de cambios
organolpticos ya conocidos.
La degradacin microbiana de las grasas la realizan una serie de microorganismos tanto bacterias como mohos y
levaduras, entre las que se encuentran especies de: pseudomonas, achromobacter, staphylococcus, rhizopus,
geotrichum, aspergillus, penicillium, cndida, Rhodotorula y Hansenula entre otros. Estos gneros son capaces
de biosintetizar una serie de enzimas lipoliticas o lipasas, causantes de la degradacin de las grasas.
Una de las caractersticas comunes de estas enzimas lipoliticas es su estabilidad a temperatura de refrigeracin,
por lo que son las causales junto con ezimas proteoliticas de los microorganismos del deterioro de los alimentos
almacenados en refrigeracin.
7.2.2 material.
Pipetas estriles de10.0 mL. y 1.0 mL.
Homogenizador de alimentos estril.
Frasco con 90 mL. de diluyente estril.
Esptula estril.
7.2.3 medios de cultivo y reactivos

Cajas de Petri estriles


Contador de colonias
Varilla de vidrio estril.
Incubadora a 30C

Medio base
Tampn fosfato
Sulfato de cobre a 0.2%

Solucin amortiguadora.
Mantequilla

7.2.4 procedimiento para microorganismos lipoliticos.


(Mtodo del sulfato de cobre)
1.- pesar 10g de muestra proveniente de un alimento que contenga grasa en abundancia, por ejemplo aderezo,
mayonesa, mantequilla.
2.- adicionar 90mL. de diluyente estril.
3.- licuar aproximadamente durante 30s a alta velocidad.
4.- efectuar las diluciones siguientes: 10-1,10-2, 10-3, 10-4 y 10-5
5.- mezclar a partes iguales el medio base y el tampn fosfato. Aadir 20g de mantequilla agitando fuertemente; y
distribuir la mezcla en cajas de Petri colocadas sobre un bloque de hielo.
6.- sembrar 0.1mL. de las distintas diluciones por extensin en superficie.
7.- incubar durante 3 das a 30C
8.- recubrir el medio con una solucin saturada de sulfato de cobre.
(20g de SO4 CU 5 H2O por litro de agua). Dejar 15min, retirar esta solucin, y comprobar si en el agar han
aparecido o no manchas azules que son los precipitados de las sales de cobre de los asidos grasos libres formados
en la liplisis microbiana.
9.- contar las colonias con halo azul y multiplicar el recuento obtenido por 10 y por la inversa de la dilucin
correspondiente.
10.- reportar el numero de UFC lipoliticas por gramo de alimento.
Dibujos y observaciones:
Cuestionario.

63

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1.-Cul es la actividad de enzimtica detectada en las bacterias lipoliticas?
2.- Qu otros sustratos aparte de la mantequilla pueden utilizarse para al identificacin de las bacterias lipoliticas?
3.- Qu tipo de alimentos son ms susceptibles al ataque de las bacterias lipoliticas?
4.- escriba el gnero y especie de cuatro bacterias proteoliticas?
Biografa.
- Eduardo Fernndez escartin. Agua y alimentos. Microbiologa Sanitaria. Vol1.
- peclar M.J. JR., reid R.D. y chan E.C.S. 1996. Microbiologa. Edit. Mc graw Hill.

71

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA APLICADA
NOMBRE

FECHA

VIII.- Practicas N7
Determinacin de Salmonella sp
8.0 introduccin.
El genero Salmonella pertenece a la familia etobacteriaceae. Es un bacilo Gram. negativo. Anaerobio facultativo,
la mayora de las especies son mviles mediante flagelos peritricos. Es un microorganismos quimiorganotrofico
que puede llevar un metabolismo respiratorio y fermentativo, es oxidasa negativo y catalasa positivo, puede
crecer con citrato como fuente de carbono, descarboxila la alisina y la ornitina, no hidroliza la urea y
generalmente produce cido sulfhdrico. Produce cido y gas a partir de glucosa en agar fierro triple azcar (TSI),
xilosa lisina desoxicolato (XLD), SALMONELLA-SHIGELLA (SS), hektoen y aquellos en los que tengan verde
brillante.
En los ltimos aos se ha detectado una gran variedad y gentica en Salmonella lo que ha hecho que este
microorganismo se este adaptando a condiciones extremas del medio ambiente as sepas mutantes pueden crecer
en rangos de temperaturas de 4C hasta 50C y a PH de 4.5 A 9.5.
Las infecciones por especies de salmonera, producen en el humano las enfermedades conocidas como fiebre
tifoidea y paratifoidea. La presencia de estos microorganismos en los alimentos se debe a la contaminacin de
estos cuando son manipulados por personas con malos hbitos higinicos. La contaminacin puede ser directa o
indirecta por medio del polvo y utensilios contaminados previamente. Su distribucin en los alimentos es amplia
ya que se han reportado en productos lcteos, derivados de carne, alimentos a base de huevo, hortalizas crudas y
cosidas y bebidas preparadas.
8.1 material.
Cajas de Petri estriles.
Matraces erelenmeyer 500mL.
Frascos de dilucin con 90mL. de lquido de
solucin estril.
Balaza
Esptula estril.

Tubos con tapn de baquelita estril 15x100


Papel aluminio estril (15x15 cm.) o contenedor
estril para pesar la muestra.
Incubadora a 35C
Pipetas de 10.0 y 1.0mL.

8.2 medios e cultivo y reactivos.


Agar sulfito de bismuto (BS)
Agar xilosa lisina desoxilato (XLD)
Agar triple azcar (TSI)
Agar lisina hierro (LIA)
Caldo tetrationato.
Caldo selenito sextina
Caldo soya tripticasa.

Caldo lactosado (CL)


Solucin de yodo-yoduro
Reactivo de kovac.
Solucin rojo de metilo.
NaOH 1N o HCl 1N
K2SO3
Tergitol 7 o triton x -100

8.3 preparacin de las muestras.


a)

huevo en polvo, leche y harinas preparadas, harinas de soya y casena:

1.- pesar aspticamente 25gr de muestra y adicionarla aun recipiente de 500mL. conteniendo 225mL. de caldo
lactosado esteril.
2.- mezclar bien y dejar reposar por 60min a temperatura ambiente.
3.- ajustar el PH a6.8 con NaOH 1N o HCl 1N esteriles. Incubar a 35C durante 24hrs

65

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b)

leche en polvo:

1.- preparar en un recipiente de 500mL., 225mL. de una solucion acuosa de verde brillante (2mL. de una solucion
al 1% de verde brillante en 1lt de agua destilada esteril)
2.- adicionar 25g de lamuestra. Incubar 24hrs a 25C
c)

pimienta blanca y negra, chile en polvo, ajonjol, pprika, vegetales deshidratados:

1.- pesar aspticamente 25g d emuestra y depositarlos en 225mL. de caldo soya triplicasa esteril.
2.- mezclar perfectamente y ajustra el PH 6.8
3.- incubar a 35C durante 24hrs.
d)

ajo y cebolla deshidratados.

1.- pesar aspticamente 25g de muestra y mezclarla con 225mL. de caldo soya tripticasa conteniendo 0.5%
K2SO3
2.- incubar a 35C durante 24hrs.
e)

carnes y derivados:

1.- pesar aspticamente 25g de muestra y homogeneizarla con 225mL. de caldo lactosado estril.
2.- ajustar el PH a 6.8
3.- adicionar 2.25mL. de tergitol 7 aniomico o triton x-100 esterilizados con vapor.
4.- incubar 24horas a 35C
8.3.1 aislamiento
1.- despus de la incubacin anterior transferir 1mL. a un tubo con tapn conteniendo 10mL. de caldo selenito
cistina y otro mL. a 10mL. de caldo tretationato
2.- incubar los tubos 24hrs a 35C
3.- mezclar y resembrar del caldo tretrationato en placas de agar sulfito de bismuto (BS), agar xilosa desoxilato
(XLD). Repetir el mismo resembrado con la muestra del tubo con caldo selenito cistina.
4.- incubar en placas 24hrs a 35C (ver diagrama)
8.3.2 interpretacin: las colonias tpicas o sospechosas de ser Salmonella son de un color gris oscuro o negras en
agar sulfito bismuto, puede tambin presentar un brillo metlico.
En el agar XLD las colonias de Salmonella se presentan de un color rosa-rojo con o son centro negro (figura 17)

8.3.2 confirmacin bioqumica.

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a)

resembrar 2-4 colonias tpicas de las placas de BS y XLD en tubos con agar triple azcar (TSI) y agar de
hierro (LIA) inoculando la superficie y el fondo del tubo.
b) Incubar los tubos con TSI 254hrs a 35C y los LIA a 35C durante 48hrs.
c) Interpretacin: caractersticamente salmonellla forma un medio alcalino en la superficie (rojo) y cido
en el fondo del tubo (amarillo) en TSI con o sin produccin de H 2S (figura 18)

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Aadir 1mL. de inoculo
.

10mL.
Caldo selenito

10mL.

Incubar a 35C x 24hrs

caldo tetrationato

BS

XLD

LIA
Incubar a 35C x 48hrs

8.4 Diferenciacin de las colonias de Salmonella sp.

TSI
1.-Incubar
agar verde
brillante:
este medio contiene lactosa y sacarosa, un indicador el rojo de fenol, el inhibidor es el
a 35C
x 24hrs.
verde brillante. Los microorganismos lactosa negativos como Salmonella y ocasionalmente proteus, forman
colonias de color rosa plido transparente y rodeadas de un halo rojo brillante. Las bacterias fermentadoras de la
lactosa, producen colonias verde amarillentas, opacas y rodeadas de un halo amarillento.
2.- agar sulfito y bismuto: este medio contiene sulfito de bismuto como agente selectivo. La mayora de las
cepas de sallmonella son capaces de reducir sulfato y el sulfito a sulfuro, produciendo colonias negras con un
brillo metlico, rodeadas de un halo caf, que posteriormente se torna negro. En ocasiones las colonias pueden ser
de color caf o pardo.
3.- agar para Salmonella y shigelia (S.S): las colonias son traslucidas transparentes u opacas algunas veces con
centro negro.
4.- agar de Mc conkey: las colonias son transparentes e incoloras o ambas.
5.- agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD): las colonias de Salmonella son rojas transparentes y bordes amarillos
con centro negro si producen H2S, sin centro negro si no son productoras de H2S.
Dibujos y observaciones:

Cuestionario
1.- Por qu se debe hacer un enriquecimiento previo al aislamiento e identificacin de Salmonella sp?
2.- Cul seria un foco de contaminacin por Salmonella sp en una planta deshidratadora de productos vegetales?
3.- Cul es la cantidad mxima de Salmonella sp. Permitida en un alimento?
4.- Por qu no se debe esterilizar en autoclave el caldo tetrationato?

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Bibliografa
-

david, A. powen, and pegy, J. M. 1998. products and laboratory procededures. Manual of BBL. 6 th
edition. United states of america.
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed acribia, Zaragoza, Espaa.
James, T. Peeler., and larry, J. Maturin. 1992. Aerobic Plate count. FDA, bacteriologica analitical
manual. 7th edition.
Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de Mxico, S.A de C.V
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed. Acribia, Zaragoza, Espaa.

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PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE

FECHA

IX.- Practica N8
Determinacin de la presencia de vibrio cholerae
9.0 Introduccin.
El genero vibrio son bacilos Gram. Negativas que miden de 0.5 micras a 0.8 micras
De dimetro por 1.4-2.6 micras de largo, las formas involucionadas usualmente se presentan en cultivos viejos
( en fase estacionarias) o bajo condiciones adversas de cultivo, no forman endoesporas, ni micro quistes, en
medio liquido son mviles por flagelos polares, son anaerobias facultativos, poseen ambos metabolismos,
respiratorio y fermentativo, no fijan ni desnitrifican el nitrgeno, todos son quimiorganotrofos, muchos son
capaces de crecer en medio mineral contenido D-glucosa y NH4Cl, solo unas cuantas capas necesitan factores
orgnicos de crecimiento. Los iones sodio estimulan el crecimiento de todas las especies y son un requerimiento
para la mayora, la mnima concentracin necesaria para un ptimo crecimiento es del orden de 5-700 mM;
muchas especies crecen bien en medio contenido una base de agua de mar.
Fermentan la D-glucosa dando como resultado produccin de cido pero no de gas. Todos utilizan D-glucosa,
D_fluctuosa, maltosa y gliserol. La mayoris de las especies son oxidasa positiva y todas crecen a 20C y muchas
a 30C
El clera es una infeccin intestinal aguda, grave que se caracteriza por al aparicin brusca de diarrea acuosa y
abundante vmitos, deshidratacin rpida, acidosis, colapso circulatorio y el los casos no tratados se produce la
muestre dentro de las 24hrs de su aparicin. Hoy se sabe que la infeccin tambin puede ser asintomtico o solo
provoca una leve asintomatologia. La letalidad en los casos graves no tratados puede exceder el 50%, pero si se
aplica l debido tratamiento, se reducen a menos del 1%
9.1 material.
Homogenizador de alimentos estriles.
Balanza.
Frasco de dilucin con 90mL. de solucin diligente
estril.

Cuchillo estril.
Caja de Petri estril.

9.2 medios de cultivo y reactivos.


Agua peptonada alcalina.
Agar de to sulfat citrato bilis sacarosa (TCBS)
9.3 procedimiento.
1.- las muestras de alimentos sospechosos se recolectan al azar y se trituran en agua paptonada alcalina en
proporcin de 1:10 utilizando un homogeneizador de alimentos estriles. Tambin se pueden pesar 50grv del
alimento que se desmenuza finamente con un cuchillo estril en 500mL. de agua peptonada alcalina.
2.- se recomienda el mtodo de doble enriquecimiento en agua peptonada alcalina PH 9.0; con 1% de NaCl con
resiembra a medio TCBS despus de 6 horas de incubacin a 37C
3.-despus de homogeneizar la muestra en el agua peptonada se incuba durante 6-8hrs. A 37C para despus
sembrar por estra el medio selectivo de agar TCBS.
4.- incubar las placas a 37C durante 18-24 hrs. Las colonias son planas de 2-3mm de dimetro y de color
amarillas.

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9.1 pruebas diferenciales de vibrio.
Prueba
Fermentacin de glucosa
Fermentacin de sacarosa
Rojo de metilo 37C
TSI: superficie
TSI: fondo
TSI: H2S
Crecimiento a 43C
Caldo nutritivo sin NaCl
Caldo nutritivo con 10% NaCl
+: Positivo

-: negativo

V. cholerae V. parahemolyticus Vibrio no cholerea


+, no gas
+, no gas
+, no gas
+, (raro-)
-, (raro-)
+, (raro -)
+, (raro-)
+ (requiere NaCl)
-, (raro -)
A, (raro r)
R
RoA
A
A
A
+
Crece
no crece
crece
No crece
crece
no crece
A: cido

R: alcalino

Dibujos y observaciones:

Cuestionario.
1.- Cules son los habitantes naturales de Vibrio cholerae?
2.- Qu caracterstica le da la propiedad de ser toxico a Vibrio cholerae?
3.- Qu funcin tiene la incubacin en agua peptonada alcalina previa a el aislamiento de Vibrio cholerae?
Bibliografa
- Carl, vanderzant, phd,. Don F. splittstoesser, phd. 1992. compedium of methods for the microbiological
examination of foods. 3th edition.
- Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de Mxico, S.A de C.V

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PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE

FECHA

X.- Practica N9
Determinacin de la presencia de Listeria monocytogenes
10.0 Introduccin.
El genero Listeria lo constituyen bacilos cortos Gram., positivos, mviles, no formadores de esporas, anaerobios
facultativos, catalasa positivos. Existen especies patgenas y no patgenas para el hombre, la mas importante
desde el punto de vista de salud publica y relacionada con infecciones por alimentos contaminados es Listeria
monocytogenes. las incidencias de listeriosis han ocurrido principalmente en el verano. Existen portadores sanos
que son individuos que estn en contacto rutinario con animales en la granja o en rastros de sacrificios. En
general se ha observado que los vegetales, principalmente hortalizas que son regadas con aguas negras presentan
una alta incidencia de especies de Listeria. Entre los alimentos procesados se han reportado los quesos fabricados
con leche no pasteurizada. La diferencinciacin bioqumica de las diferentes especies de Listeria se muestra en la
tabla 19.
especies

Listeria
monocytogenes
L. ivanovil
L. innocua
L. welshimeri
L. seeligeri
L. grayli
L. murrayi

(beta)
hemoliticos
+

reduccin
de
nitrato
-

+
+
-

manitol

ramnosa

xilosa

virulencia
(ratn)

+
+

variable
variable
variable

+
+
+
-

+
-

Fuente: FDA bacteriological analytical manual 7th edition/1992


10.1 Material
Matraz erlenmeyer de 500mL.
Pipetas de 1.0 y 5.0 mL. estriles
Cajas de Petri estriles.
Contenedor estril para pesado de muestra
Balanza
Lmpara de luz blanca
10.2 Medios de cultivo y reactivos.

Triple
Espejo
Autoclave
Homogenizador de alimentos.
Esptula
Incubadora calibrada a 30 y 35C

cido sulfanilico
Agar Oxford (OXA)
Agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM)
Agar soya tripticasa con 0.6% de extracto de
levadura (ASTEL)
Caldo carbohidratado.

Caldo de enriquecimiento para Listeria (CEL)


Esculina
Solucin buffer
Solucin salina estril al 0.85%
N-(1-naftil) etilendiamina

10.3 Procedimiento para determinacin de Listeria monocytogenes.

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1.- adicionar 25g o mL. de la muestra a un matraz erlenmeyer de 500 mL. conteniendo 225mL. de caldo de
enriquecimiento (CEL) estril. Agitar fuertemente para homogeneizar la mezcla, e incubar durante 2 das a 30C.
2.- a partir del matraz con caldo de enriquecimiento, resembrar a las 24 y 48 hrs en placas con agar Oxford
m(OXA) y agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM). Incubar las placas a temperatura de 30 a 35C
durante 24-48 hrs respectivamente.
3.- despus del tiempo de incubacin, se observan las placas d agar LPM, habiendo incidir un haz de luz blanca
con un Angulo de incidencia de 45 de acuerdo a la figura 20. De esta forma, las colonias de Listeria presentan
un color blanco azulado brillante, dando la impresin de un cristal estrellado.
4.- cuando no es posible utilizar el dispositivo de luz para la observacin de las colonias de acuerdo a la figura 20,
al medio de agar LPM s ele puede adicionar 1.0g de esculina y 0.5g de citrato ferrico de amonio.
5.- las colonias caractersticas que Listeria forma tanto en agar OXA y LPM con sales de fierro y esculina, son
de un color negro, presentando tambin un halo oscuro.

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Observar perpendicularmente
Al plano de la caja
Fuente de luz blanca

Caja

Tripie

Espejo
Figura 20: observacin de las placas por iluminacin indirecta de colonias de Listeria.
10.4 Confirmacin de la presencia de Listeria.
1.- de las colonias aisladas en las placas de OXA y LPM, resembrar al menos 5 de cada una de ellas a placas con
agar soya tipticasa con 0.6% de extracto de levadura (ASTEL).
2.- incubar las placas de ASTEL a 30C por 24-48hrs.
3.- utilizando el dispositivo de la figura 9, las colonias tpicas de Listeria se observan de un color azul o azulgrisaseo.
4.- hacer frotis de varias colonias y teirlas con el medio de gram para confirmar que son bacilos cortos gram
positivos.
5.- realizar la prueba de catalasa, para confirmar su positividad.
6.- resembrar en placas de agar-sangre. Las colonias formadas por las especies de Listeria monocytogenes y L.
ivanovil presentan una zona de hemolisis.
7.- las especies patgenas para el hombre no reducen los nitratos. para confirmar esto, se incuban tubos con 3-5
mL. de caldo nitrato, incubndose a 35C durante 5 das. Depuse de este tiempo se adiciona 0.2mL. del reactivo
de cido sulfanilico y 0.2mL. de reactivo de N-(1-naftil) etilendiamina. El desarrollo de un color rojo nos indica
una prueba positiva.
8.- pueden tambin realizarse pruebas de fermentacin, inoculando tubos con 3-5mL. de caldo para fermentacin
conteniendo 0.5% de cada una de los carbohidratos probados. La produccin de cido se interpreta como una
prueba positiva.
Comparar los resultados en al tabla 19, para identificar la especie presente.
Dibujos y observaciones

Cuestionario
1.- Cules son las caractersticas morfolgicas de Listeria sp?
2.- Por qu es importante la deteccin de Listeria monocytogenes en una planta congeladora de vegetales?
3.- cuales serian las fuentes de contaminacin por lsiteria monocytogenes en una planta de productos lcteos?
4.- Cul es le ingrediente selectivo para Listeria en el medio de cultivo agar LPM?

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Bibliografa
-

James, T. peeler., and Larry, J. M. 1992. aerobic plate count. FDA, bacteriological analitical manual. 7 th
edition.
David, A. Power., and peggy, J. Mccuen.1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th
edition. United states of america.
Warburton, D.W., J. M. Farber. A. Armostrong, R. Caderia, NP. Tiwari, T. Babiuk, P. Lacasse & S.
Read 1991. A canadian comparative study of modified version of the EDA & USDA methods for
the detection of Listeria monocytogenes. J. Food Prot.

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PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE

FECHA

XI.- Practica No 10
Determinacin de bacterias anaerobias
11.0 Introduccin.
Las bacterias anaerobias de importancia en al Microbiologa Sanitaria, son las especies del genero clostridiu. Este
genero se caracteriza por ser bacilos gram positivos, formadores de esporas que varan de tamao desde 0.5-1
micras de dimetro por 3.0-10.0 micras de largo, al mayora de sus especies son niveles, reducen los nitratos a
nitritos, licuan la gelatina, producen cido y gas. El hbitat natural de estos microorganismos es el suelo y los
productos vegetales, de ah que los alimentos contaminados con polvo y agua contaminada, pueden contener
esporas las cuales posteriormente germinan para producir clulas vegetativas. Las dos especies ms importantes
en Microbiologa Sanitaria, por sus capacidades de producir intoxicaciones son: clostridium perfringens y
clostridium botulinum. Las caractersticas principales de estas dos especies es la formacin de esporas termo
resistentes y la sntesis de enteroroxinas y neorotoxinas.
11.1 Determinacin de la presencia de clortridium perfringens.
11.1.1 Material.
Asa de platino
Bolsas o frascos de boca ancha estriles
Baos Maria a 46C
Cajas de Petri 100 x 15 mm estriles
Contador de colonias Qubec
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Pipetas bacteriolgicas de 1.0mL. 10.0mL. y 0.1mL.


estriles
Tubos de ensaye 15 x 100 mm
Incubadora regular a 35C
Jarra para anaerobiosis

11.1.2 Medios de cultivo y reactivos


Agar TSC.
Caldo tioglicolato.
Medio de lactosa de gelatina.
Medio de hierro-leche
11.1.3 aislamiento (prueba presuntiva).

Agua peptonada estril.


Emulsin de yema de huevo al 50% estril.
Polvo de zinc.
Solucin reguladora-glicerina estril.

1.- Aspticamente colocado 25 g. de muestra en un frasco estril.


2.- Adicionar 225 mL. de agua peptonada (dilucin 1:10).
3.- Homogenizar lentamente de 1 a 2 minutos.
4.- preparar una serie de diluciones de 10-1 hasta 10-6, mezclando cada dilucin
5.- colocar 6-7 mL. de agar TSC sin emulsin de huevo dentro de cada caja de Petri y
Extenderlo rpidamente.
6.- cuando el agar solidifique etiquetas, y aspticamente transferir 1 mL..
De cada dilucin al centro de las placas con el agar y adicionar otros 10-15 mL..
De agar TSC sin emulsin de huevo, homogenizado bien el medio con el inculo y

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Esperar a que se solidifique.
7.- colocar las placas verticalmente en una jarra para naerobiosis, incubarlas a 35C durante
20-24 horas.
11.1.4 mtodo alternativo:
1.- preparar placas con 8-10 mL. de agar TSC con emulsin de yema de huevo al 50% estril, dejar que
solidifique el agar. Depositar 0.1 mL. de cada una de las diluciones de la muestra en cada placa y extender el
inculo en toda su superficie con una varilla de vidrio estril
2.- despus que el inoculo es adsorbido (alrededor de 5 minutos), adicionar a las placas 10 mL. de agar TSC sin
emulsin de yema de huevo.
3.- cuando el agar se solidifique colocar las placas verticalmente en una jarra para enerobiosis e incubarlas a 35C
por 24 horas.
4.- despus de la incubacin seleccionar las placas que contengan 20-200 colonias tpicas. Las colonias de C.
perfringens en medio con yema de huevo son negras con dimetros de
2-4 mm y una zona clara alrededor de ella como resultado de la actividad de la actividad de lecitinaza.
5.- usando un contador de colonias Qubec, contar las colonias negras y calcular
Las UFC/ g de alimento.
11.1.5 confirmacin de la prueba presuntiva
1.- seleccionar 10 colonias tpicas de C. perfringens de agar TSC con y sin emulsin de yemas de huevo.
2.- inocular las colonias seleccionadas en tubos con caldo tioglicolato, e incubarlos a 35C durante 10-24 horas.
11.1.5.1 prueba presuntiva en medio de hierro-leche:
1.- Inocular tubos conteniendo 11 mL. del medio de hierro y leche modificado con
1mL. del cultivo desarrollado en caldo tioglicolato e incubarlo en un bao de agua a 46C.
2.- revisar los tubos caga dos horas, una prueba positiva es cuando se observa una fermentacin intensa, que es el
resultado de una rpida coagulacin de la leche seguida de una cuajada en al superficie, agitar levemente los
tubos positivos para prevenir un derrame en el bao de agua.
11.1.6 Prueba complementaria
1.- de los cultivos desarrollados en las placas con agar TSC y los tubos con caldo tioglicolato, inocular por
picadura tubos con medio de nitrato para observar la movilidad y tubos con gelatina-lactosa.
2.-incubar los tubos a 35C durante 24hrs.
3.- observar si existe movilidad en los tubos con el medio de nitrato. Determinar tambin si hubo la reduccin de
nitratos a nitritos, para esto se adicionan 0.5mL. del reactivo cido sulfanilico y 0.2mL. de N (-1-naftil)
etilendiamina, el desarrollo de un color violeta en los siguientes 5min nos indica que la prueba es positiva.
4.- observar si en los tubos con gelatina lactosa hay produccin de gas y de cido. El vire de un color rojo a
amarillo nos indica la produccin de cido.
5.- estos mismos tubos se enfra a 5C durante 1hora, y se observa si hay licuefaccin de la gelatina.
11.1.7 Calculo del nmero de clostridium perfringens:
Ejemplo: si el conteo en placa de la dilucin 10 -4 es de 85 y de 8 a 10 colonias de esta prueba se confirman C.
perfringens el numero de clulas de C. perfringens/g de alimento es:
85 x (8/10) x 10 000 = 680,000
11.2 Determinacin de clostridium botulinum en alimentos.
11.2.1 Material.

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Asa de platino
Balaza
Cajas de Petri estriles
Incubadoras a 26 y a 35C

Jarras para sistema de anaerobiosis


Mechero bunsen
Microscopio
Tubos de ensayo de 13 x 100mm

11.2.2 Medios de cultivo y reactivos.


Agar hgado de ternera yema de huevo
Caldo tripticasa peptona glucosa extracto de
levadura (TPGY)

Medio de carne cocida (MCC)


Etanol al 50% o absoluto estril.
Solucin reguladora de fosfatos con gelatina estril.

11.2.3 Enriquecimiento.
1.- al medio de enriquecimiento se le remueve previamente el oxigeno disuelto, poniendo el medio en una
corriente de vapor durante 10-15min, enfriando rpidamente, procurando no agitarlo.
2.- inocular 2 tubos conteniendo 15mL. del caldo de enriquecimiento (MCC) con 1-2g o mL. de muestra. Incubar
a 35C.
3.- inocular 2 tubos de caldo tripticasa peptona glucosa extracto de levadura (TPGY) como en el paso 2. Incubar
a 26C
4.- despus de 7 das de incubacin examinar los tubos y observar si hay turbidez, produccin de gas y digestin
de las partculas de carne.
5.- hacer una tincion de gram de cada cultivo y examinar los frotis al microscopio.
6.- observe la morfologa de los microorganismos. Las clulas tpicas de clostridium botulinum, tienen una
estructura semejante a una raqueta de tenis.
11.2.4 Aislamiento de cultivo puro.
11.2.4.1 pretratamiento de las muestras.
1.- en un tubo con tapn de baquelita estril, mezclar 1 o 2mL. del cultivo enriquecido o de la muestra original
con igual volumen de alcohol absoluto estril. Mezclar bien e incubarlo a temperatura ambiente durante 1 hora.
2.- alternativamente, el cultivo enriquecido se calienta a 80C durante 10-15min para destruir las clulas
vegetativas. Este tratamiento no se recomienda para tipos de C. botulinum no proteo lticos.
3.- de los tubos con el tratamiento con alcohol y de los tratados trmicamente resembrar para obtener colonias
aisladas, en placas con agar hgado de ternera yema de huevo o agar yema de huevo para anaerobiosis. Incubarlas
a 35C durante 48 horas en condiciones de anaerobiosis.
4.- las colonias tpicas de C. botulinum tienden a extenderse con bordes irregulares rodeadas de una zona de
precipitado amarillo.

Dibujos y observaciones:

Cuestionario.
1.- Por qu la bacteria anaerobia no se reproduce en medio aerbico?
2.- en que productos alimenticios procesados es probable el desarrollo de anaerobios?
3.- Qu caractersticas de clostridium perfringens le da el carcter de ser patgeno para el hombre?
4.- Qu previsin APLICADA deben tener las personas de una planta de alimentos que pudieran infectarse con
clostridium taten?
Bibliografa.
- David, A. Power., and peggy, J. Mccuen.1988. products and laboratory procedures. Manual of BBL. 6 th
edition. United states of america.

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-

Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed. Acribia zaragoza, Espaa.
James, T. Peeler., and larry, J. Maturin. 1992. Aerobic Plate Count. FDA, bacteriological Analitical
Manual. 7th edition.
- Medios de cultivo y reactivos de diagnostico. Manual bioxon de Mxico, S.A de C.V
Forrest, J. Etal, 1978. fundamentos de ciencia de la carne. Ed. Acribia zaragoza, Espaa.

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PRACTICAS DE MICROBIOLOGIA APLICADA

NOMBRE

FECHA

XII.- Practica No 12
Efecto de los agentes desinfectantes sobre los microorganismos
12.0 Introduccin.
Desde el inicio de la conservacin de los alimentos por el hombre, se han empleado una serie de agentes fsicos y
qumicos para destruir y/o inhibir el crecimiento de los microorganismos sobre los alimentos y de esta manera
poder conservarlos por tiempos mas prolongados. Los agentes fsicos mas ampliamente utilizados en la
actualidad es la deshidratacin y las radiaciones. Dentro de los agentes qumicos se encuentran toda la amplia
gama de conservadores utilizados hoy en da.
Sin embargo no es nicamente el hecho de aplicar agentes fsicos o qumicos sobre los alimentos para el control
de los microorganismos; tambin hay que tener presente el medio ambiente en el que se estn procesando los
alimentos y que esta formado por la maquinaria, utensilios, superficies, aire y operadores de un sistema de
transformacin de alimentos.
Actualmente es de primordial importancia la implantacin en la industria alimentara de programas de
sanitizacion del equipo y materiales utilizados, as como programas de buenas practicas de manufactura y de
higiene dentro del personal involucrado en su manipulacin.
En la presente practica se observara el efecto de algunos desinfectantes comnmente utilizados en programas de
sanitizacion en plantas procesadoras de alimentos, sobre microorganismos que con mas frecuencia determinan el
deterioro de los alimentos y aquellos causantes de infecciones e intoxicaciones alimenticias.
12.1 Soluciones
Solucin de hipoclorito de calcio (200ppm de cloro activo)
Solucin de cido dodecilbensulfonico (200ppm)
Solucin de yodo (25ppm de yodo libre titulable)
12.2 Medios de cultivo y microorganismos.
Agar de papa y dextrosa acidificado.
Agar violeta rojo bilis
Agar de baird-parker
Agar para mtodos estndar
12.3 Procedimiento.

Inoculo de saccharomyces cereviceae.


Inoculo de escherichia coli
Inoculo de staphylococcus aureus.

1.- en 100mL. de agua peptonada al 1%, ajustar los inculos de los microorganismos hasta obtener una concentracin de
clulas aproximadas de 10-3/mL..
2.- con un hisopo estril, impregnar la superficie de tres mesas de acero inoxidable, cada una con uno de los
microorganismos.
3.- despus de 30min. Realizar un muestreo en un rea de 20x20 cm. para determinar la cuenta estndar de microorganismos
mesoflicos arerbicos, cuenta de coliformes totales y cuenta total de staphylococcus, para el caso de las mesas donde se
inoculo E. coli y S. aureus y cuenta total de levaduras para la mesa que fue inoculada con S. cereviceae.
4.- una vez realizado el muestreo, aplicar a cada una de las terceras partes de cada mesa cada uno de los sanitizantes en
concentracin y tiempo de accin de acuerdo a las indicaciones del proveedor. Cada mesa representara la actividad de tres
diferentes sanitizantes sobre un solo microorganismo.
5.- retirar de la mesa el sanitizante siguiendo las instrucciones del proveedor.
6.- realizar nuevamente un muestreo en un rea de 20x20cm para cada uno de los sanitizantes en las tres mesas, haciendo las
determinaciones como en el punto 3

80

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7.- despus de un periodo de incubacin de 24-48 horas a 35C para las bacterias y de 3-5 das a 28C para las levaduras,
comparar la UFC/20 cm2 antes y despus de aplicar los sanitizantes.
8.- hacer el reporte de la actividad de cada sanitizante en funcin de la diferencia de UFC obtenidas en el segundo muestreo.
Dibujos y observaciones

Cuestionario
1.- que es un agente bacteriosttico?
2.- Cul es el mecanismo de accin de un detergente en un proceso de sanitizacion?
3.- Cmo se define una sanitizacion IN SITU?
4.- Cmo determina la actividad de un sanitizante sobre el piso de un a rea de embutidos?
5.- Por qu se debe hacer un muestreo de superficie del equipo antes y despus de sanitizar?

Bibliografa
-

Zargo, G. 1993: manual de aplicacin del anlisis de riesgos, identificacin y control de puntos crticos. Secretaria
de la salud, Mxico, D.F.

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PRACTICAS DE MICRO BIOLOGIO APLICADA

NOMBRE

FECHA

XII.- Practica No 12
DESARROLLO DE UN ECOSISTEMA. COLUMNA DE WINOGRADSKY
http://faca.uncoma.edu.ar/academica/materias/microbiologia_agricola/Guia_Microbiologia_Agricola_2007.pdf
Objetivo: Observar el desarrollo de un ecosistema utilizando como modelo diferentes columnas de Winogradsky.
Una columna ideal de Winogradsky se podra representar con el siguiente esquema.

LUZ

O2

PROCESO
PRINCIPAL
Fotosntesis
oxignica
Fotosntesis
anoxigenica

Quimiolitotrofis
mo

SH2,
CO2

Esta columna permite el desarrollo de bacterias


del tipo fotosinttico. La columna provee un
gradiente de oxgeno desde la superficie al fondo
de la misma que junto a una fuente de luz, crea
un ambiente adecuado para organismos aerobios
y bacterias fotosintticas (anaerbicas). El tipo
de suelo y los nutrientes determinan las
variedades de organismos que aparecen en la
columna luego de un cierto tiempo. La capa
acuosa de la parte superior soporta el desarrollo
den una mezcla de protozoos, hongos y algas.
Todos estos microorganismos son aerobios,
teniendo estilos de vida y requerimientos
nutritivos diferentes. En el fango anaerbico se
encuentran las bacterias fotosintticas (Brock y
Madigan, 1991).

Los alumnos construirn una columna de Winogradski. En ella podrn comprender la importancia de los distintos tipos de
metabolismos que caracterizan a los microorganismos del suelo (autotrfico, litotrfico, organotrfico y heterotrfico) y que
permiten, entre otras actividades microbianas, la transformacin de la materia orgnica. La columna de Winogradsky es un
medio muy simple que le permitir observar el desarrollo de distintos tipos de microbios del suelo.
La columna de Winogradsky es en esencia un pequeo estanque artificial donde se facilita la eutrofizacin. La capa de lodo
est formada por una fuente de carbono, que puede ser de distinto origen (papel, material vegetal, etc), una fuente de azufre y
carbonato de calcio como fuente de dixido de carbono. Las bacterias que reducen el sulfato, a travs de una respiracin
anaerbica, producen sulfuro el cual en su momento sirve como donante de electrones para las bacterias prpura y verdes del
azufre. Simultneamente, otras bacterias descomponen la celulosa, en forma fermentativa, liberando cidos que reaccionan
con el carbonato de calcio produciendo dixido de carbono. Los otros productos de descomposicin que se producen, tales
como acetato, piruvato, citrato, etc., son utilizados por algunos microorganismos fottrofos que desarrollan en la columna.
En la interfase aerbica-anaerbica, aparecen al cabo de los das manchas de distintos colores, que tienen su origen en
bacterias no sulfurosas. La capa acuosa aerobia permite el desarrollo de algas verdes y verde-azuladas (cianobacterias),
hongos, bacterias aerobias y protozoos. En la naturaleza, bacterias fotosintticas viven en el fondo de un estanque junto a
restos orgnicos y sulfuros de distinto tipo. Aunque tenemos oscuridad en ese lugar, cierta cantidad de luz perteneciente al
infrarrojo cercano puede penetrar y ser utilizada por las bacterias prpura y verdes del azufre o sea por miembros de las
familias Chromatiaceae y Chlorobiaceae, respectivamente. Estos organismos captan luz que no es absorbida por las
cianobacterias que viven en las capas superiores de los estanques. Las bacterias usan donadores de electrones tales como
sulfuro de hidrgeno y construyen carbohidratos a partir del CO2 y no utilizan O2. Una vez que el nivel de sulfuro disminuy,

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el tercer grupo de bacterias fotesintticas pueden aparecer en el ambiente o sea las Rhodospirillaceae o bacterias prpuras no
sulfurosas.
En el fondo de la columna es posible encontrar fijadores libres de N2 (Ej. Clostridium pasteurianum), bacterias sulfato
reductoras y productoras de metano, entre otras.
1. PREPARACIN DE LA COLUMNA (Ctedra)
Metodologa de Trabajo
Mezclar 1 g de CaSO4 con 2 g de CaCO3 y 0,5 g de papel pulverizado por 2 mm. Se puede utilizar suelo de distinto origen
(jardn, campo, fondo de estanque, etc). Colocar la mezcla preparada en un cilindro de vidrio (Pj. Una probeta) y mezclar
suavemente con el objeto de remover los poros de aire de mayor tamao. Agregar agua para humedecer la mezcla de suelo y
con una varilla remover las burbujas de aire. Agregar suelo adicional, sin aditamentos, y volver a agregar agua hasta que la
columna este llena n un 80% de su capacidad. Cubrir el cilindro con un plstico (se evita prdida de agua) e incubar frente a
una ventana o utilizando una luz incandescente de baja intensidad (60 wats; longitud de onda: 720-1000 nm). Es til cubrir la
columna con papel de aluminio los primeros 7- 8 das, para protegerla de la luz. Durante ese perodo comienzan a desarrollar
organismos heterotrficos con respiracin anaerbica, facilitando la formacin de un flujo de H2S y CO2 y la creacin de un
gradiente de oxgeno hacia la superficie de la columna. Finalmente, se debe realizar una descripcin completa de la actividad
microbiana observada luego de incubar la columna durante 50-60 das.
2. DESCRIPCION DE LOS MICROORGANISMOS PRESENTES EN LA COLUMNA
Metodologa de trabajo
- Se realizarn preparaciones en fresco de las columnas de Winogradsky de distintas edades provistas por la ctedra.
- Se anotar la edad de las columnas y se realizarn esquemas de los distintos microorganismos detectados a diferentes alturas.
Relacione la presencia de los microorganismos con su metabolismo y la localizacin en la columna. La observacin tiene que
ser hecha desde la parte superior a la inferior de la misma.

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Apndices

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Apndice I
formulacin y preparacin de medios de cultivo para Microbiologa Sanitaria
Agar de baird-parker
Formulacin y preparacin.
Formula aproximada en gramos por litro
Peptona de caseina10.0
Extracto de carne...5.0
Extracto de levadura..1.0
Cloruro de litio..5.0
Agar..17.0
Glicina..12.0
Piruvato de sodio..10.0
pH final 6.8 + 0.2
Suspender 60g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 5 a 10min calentar agitando frecuentemente
y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C durante 15min.
Enfriar a 45-50C y agregar 10mL. de solucin de telrico de potasio al 1% y 50mL. de emulsin de yema de huevo.
Homogenizar suavemente y vaciar en cajas de Petri. Refrigerar en recipientes sellados, o en frascos o tubos con tapones de
rosca cerrados. La base puede conservarse por periodos largos de tiempo. Puede fundirse y emplearse a medida que se
necesite.
Agar de bilis y rojo violeta
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro
Extracto de levadura3.0
Peptona de gelatina. 7.0
Mezcla de sales biliares.. 1.5
Lactosa10.0
Cloruro de sodio..5.0
Agar15.0
Rojo neutro.0.03
Cristal violeta.0.002
pH final 7.4 + 0.2
Suspender 41.5g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15min. Calentar agitando
frecuentemente y hervir durante un minuto. Enfriar a 44-46C, usar de inmediato, o esterilizar a 121C (15lb presin) durante
15min. Una vez esterilizado enfriar a unos 40-45C y vaciar en cajas de Petri.
Agar de bilis verde brillante
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro
Peptona de gelatina.8.250 g
Lactosa. 1.900 g
Agar especial.10.150 g
Sulfito de sodio. 0.205 g
Fascina bsica77.6 mg
Erioglaucina.. 64.9 mg
Cloruro ferrico... 29.5 mg
Fosfato monopotasico... 15.3 mg

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bilis de buey..2.95 mg
Verde brillante. 29.5 mg
pH final 6.9 + 0.2
Suspender 20.6g de polvo deshidratado en un litro de agua destilada de buena calidad. Dejar en reposo de 5 a 10 min para
que el agar se hidrate correctamente. Calentar agitando frecuentemente y hervir durante un minuto esterilizar en autoclave a
15lb de presin durante 15min. Dejar enfriar entre 45-50C y distribuir en cajas Petri.
Agar cloruro de litio-feniletil-moxalactama (LPM)
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro
Agar feniletanol (DIFCO).35.5 g
Anhdrido glicina...10 g
Cloruro de liyio.. 5g
Solucion de fosfatos 1% con pH 6.0 2 mL.
Solucion de moxalactam
Agua destilada
Esterilizar el medio (sin moxalactam) a 121C por 15min. Enfriar a 48-50C y adicionar filtrada y esterilizada la solucin de
moxalactam.
Solucin de moxalactam: consiste en 1g de sales de moxalactam (amonio o sodio) en 100mL. y 0.1M de solucin de fosfato
de potasio. Filtrar y esterilizar, guardar la solucin de moxalactam en refrigeracin en alcuotas de 2mL..
Agar de dextrosa y papa (DPA)
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro.
Infusion de papa200.0
Dextrosa..20.0
Agar. 15.0
pH final 5.6 + 0.2
SUSPENDER 39G Del medio deshidratdo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15min. Calentar agitando
frecuentemente y hervir un minuto. Esterilizar a 121C (15lb de presin) durante 15min.una vez esterilizado enfriar a unos
40-45C y vaciar en cajas de Petri.
Agar de eosina y azul de metileno.
Formulacin aproximada en gramos por litro.
Peptona de gelatina10.000
Lactosa...5.000
Sacarosa.5.000
Fosfato dipotasico.2.000
Eosina y 0.400
Azul de metileno0.065
Agar13.5
pH final 7.2 + 0.2
Suspender 36g de polvo en un litro de agua destilada de buena calidad. Mezclar y remojar unos 10min para que se hidrate
correctamente al agar. Calentar agitando con frecuencia. Hervir un minuto. Esterilizar en autoclave a 15lb de presin durante
15min. Dejar que se enfri la solucin a unos 50C. Agitar suavemente, enviando la formacin de burbujas, para que la

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composicin del medio se uniformice y vaciar en cajas de Petri estriles. Dejar que el medio se solidifique y luego invertir las
placas para que no se deposite demasiada humedad sobre la superficie del mismo.
Agar hierro tres azucares (TSI)
Formulacin y preparacin:
Composisicion gramos/litros.
Peptona de casena.15
Peptona de carne5
Extracto de carne.. 3
Extracto de levadura..3
Cloruro sodio 5
Sacarosa10
D(+) glucosa.1
Amonio de hierro (III) citrato...0.5
To sulfato sodico..0.3
Rojo de fenol.0.024
Agar-agar.. 12
pH 7.4 + 0.1
Disolver 65 g/lt, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15min a 121C. dejar solidificar en posicin inclinada. El medio
de cultivo es claro y de color rojo anaranjado.
Agar hgado de ternera yema de huevo.
Formulacin y preparacin:
Infusin de hgado..50g
Infusin de temera..500g
Proteosa peptona20g
Neopeptona1.3g
Tristona. 1.3g
Dextrosa.5g
Almidon soluble.10g
Caseina isoelectrica2g
Cloruro de sodio.5g
Nitrato de sodio..2g
Gelatina...20g
Agar.15g
Agua destilada.1000mL.
Calentar con agitacin constante hasta dilucin completa. Esterilizar en autoclave por 15min a 121C, pH final 7.3 + 0.2.
Agregar por cada 500mL. del medio base fundido de 40mL. de la suspensin salina de yema de huevo, mezclar y vaciar a
cajas de Petri estriles de 15 x 100mm (aproximadamente 15-20mL.). Secar las placas a temperatura ambiente por 2 das o a
35C por 24horas. Almacenar en refrigeracin.
EMULSION AL 50% de yema de huevo:
LAVAR LOS HUEVOS CON UN CEPILLO suave y dejar escurrir. Sumergirlos por 1 hora en solucin de cloruro mercrico
al 0.1%, escurrir, ABRIR los huevos en condiciones aspticas y descartar las claras. Colocar las yemas en un recipiente
estril y mezclar con igual volumen de solucin salina estril al 85%. Guardar en refrigeracin hasta su uso.

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Agar lisina hierro
Formulacin y preparacin:
Composicin gramos/litro
Peptona de carne....5
Extracto de levadura..3
D (+) glucosa.1
L-lisina monoclorhidrato...10
Tiosulfato sodico.. 0.04
Citrato de amonio y hiero (III)..0.5
Prpura de promocresol0.02
Agar-agar.12.5
Ph 6.7 + 0.1
Disolver 32 g/lt, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave (15min a 12C). dejar solidificar en posicin inclinada deforma
que, al solidificar, se produzca una columna de unos 3 cm. de altura, sobre ella, una superficie inclinada de, por lo menos, la
misma longitud. El medio de cultivo es claro y de color gris violeta.
Agar para mtodos estndar
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litros.
Peptona de casena..5.0
Extracto de levadura2.5
Dextrosa..1.0
Abr..15.0
Suspender 23.5g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar y mezclar bien de 5 a 10min. Calentar
agitando frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir en tubos de ensayo con tapn de rosca, o en un matraz si el
medio va a usarse poco despus de esterilizarlo. Esterilizar a 121C (15lb de presin) durante 15minutos. Puede volverse a
fundir, una sola vez cuando se necesite.
Agar Oxford (OXA)
Formulacin y preparacin:
Composicin en g/litro.
Peptona23
Almidn1
Cloruro de sodio.. 5
Agar-agar.13
Esculina1
Citrato de amonio y hierro (III)0.5
Cloruro de litio.15
pH 7.0 + 0.2
Disolver 29, 25 en 500mL. de agua desmineralizada, someter al autoclave durante 15minutos a 121C disolver el contenido
de un frasco de suplemento selectivo para Listeria Oxford, con 5mL. de etanol/agua estril (1:1) y aadir al medio de cultivo
estril enfriado a 50C. Mediante agitacin cuidadosa por balanceo el suplemento selectivo se debe mezclar en forma
homognea en la solucin del medio de cultivo. Verter el medio de cultivo estril enfriado a 50C. Mediante agitacin
cuidadosa por balanceo el suplemento selectivo se debe mezclar en forma homognea en la solucin del medio de cultivo.
Verter el medio de cultivo en placas y dejar solidificar. Listeria monocytogenes crece en colonias coloreadas de gris azulado
con una mancha negra (disgregacin de esculina).

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Agar para Salmonella y shigella (agar SS)
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro
extracto de carne5.0
Mezcla de peptonas...5.0
Lactosa10.0
Mezcla de sales biliares..8.5
Citratos de sodio.8.5
Agar13.5
Tiosulfato de sodio.8.5
Citrato ferrico.1.0
Rojo neutro.0.025
Verde brillante0.330mg
pH final 7.0 + 0.2
Suspender 60g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar unos 15min. Agitar para obtener una
suspensin homognea, calentar con agitacin frecuente y hervir durante un minuto. No deber esterilizarse en autoclave.
Verter en placas. Evtese la congelacin.
Agar de soya tripticasa
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en g/litro.
Peptona de casena..15
Peptona de soya..5
Cloruro de sodio..5
Agar.15
pH final 7.3 + 0.2
Suspender y remojar de 10 a 15min 40g del medio deshidratado en 1 litro de agua destilada. Calentar agitando
frecuentemente durante un minuto para que se disuelva. Esterilizar en autoclave entre 118 y 121C y a una presin no mayor
de 15lb por 15min.
Agar sulfito-bismuto
Formulacin y preparacin:
Composicin gramos/litros
Extracto de carne..5
Peptona de carne..10
D (+) glucosa5
Hidrogenofosfato disodico....4
Sulfato ferroso..0.3
Verde brillante.0.025
Indicador bismuto sulfito.8
Agar-agar.15
pH 7.6 + 0.2
Disolver 47.5 g/litro. Verter en placas, en capa gruesa, el precipitado obtenido despus de haberlo distribuido
homogneamente.

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No esterilizar en autoclave!
Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS)
Formulacin y preparacin:
Composicin gramos/litros
Peptona de casena.5
Peptona de carne5
Extracto de levadura..5
Citrato sodico3
Sacarosa.20
Tiosulfato sodico...10
Bilis de buey, desecada..5
Cloruro sodico...10
Citrato de hierro (III).1
Azul de timol.0.04
Agar-agar...14
pH 8.6 + 0.2
Disolver 88g/litro y verter en placas. no esterilizar en autoclave!. Las placas con meido son claras y de color azul verdoso.
Agar tripotas-sulfito-cicloseina (TSC)
Formulacin y preparacin:
Composicin gramos/litro.
Triptosa..15
Peptona de harina de soya..5
Extracto de levadura...5
Bisulfito sodico..1
Citrato de amonio y hiero (III)...1
Agar-agar15
Cicloserina..0.5
Disolver 42 g/litro en lo posible en recipientes pequeos, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15min a 121C.
Incorporar la cicloderina, verter en placas.
Agar verde brillante
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro
Extracto de levadura..3.0
Mezcla de peptonas..10.0
Cloruro de sodio5.0
Lactosa...10.0
Sacarosa.10.0
Rojo de fenol..0.08
Agar20.0
Verde brillante12.5 mg
pH final 6.9 + 0.2

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Suspender 58g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar remojar unos 15min. Calentar agitando
frecuentemente y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15lb de presin) durante 15min y distribuir en
cajas de Petri.

Agar de vogel Jonson


Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro
Peptona de casena.10
Extracto de levadura5
Manitol10
Fosfato di potsico5
cloruro de litio.5
Glicina.10
Agar.16
Rojo de fenol25 mg

PH final 7.2 + 0.2


Suspender 61g del medio deshidratado en in litro de agua destilada. Mezclar bien. Remojar de 5 a 10min. Calentar agitando
frecuentemente y hervir durante un minuto. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C (15lb de presin) durante 15 min.
Enfriar a 45 50C y agregar 20mL. de una solucin de telurito de potasio al 1%. Agitar vigorosamente y vaciar en cajas de
Petri.
Agar XLD
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro.
Xilosa3.50
L-lisina..5.0
Lactosa...7.50
Sacarosa.7.50
Cloruro de sodio.5.0
Extracto de levadura..3.0
Rojo de fenol.0.08
Agar...13.50
Desoxicolato de sodio2.50
Tiosulfato de sodio.6.80
Citrato de hierro y amonio.0.80
PH final 7.4 + 0.2
109
Suspender 55g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar que se remoje durante 10 a 15min. Calentar con
todo cuidado y agitando con frecuencia justamente hasta que el medio hierva. No sobrecalentar. Dejar de calentar en cuanto
se obtenga la dilucin completa del polvo. Una vez disuelto, enfriar rpidamente en agua o en bao Maria a 50C y verter en
cajas de Petri. El medio debe ser transparente o casi transparente y tener un color rojo rub anaranjado.
El calentamiento excesivo o el mantener el medio demasiado tiempo en bao Maria a 50C puede ocasionar que se formen
precipitados. En este caso se corre el riesgo de que las colonias sean de menor tamao y presenten reacciones menos ntidas.
Sin embargo, el precipitado no perjudica el desarrollo bacteriano y puede eliminarse por filtracin con papel filtro.

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Caldo de cerebro-corazn (BHI)
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada g/litro
Substrato alimenticio (extracto de cerebro,
Extracto de corazn y peptona).27.5
D (+) glucosa..2.0
Cloruro Sdico5.0
Hidrgeno fosfato disdico..2.5
Agar-agar15.0
PH 7.4 + 0.2
Disolver 52 g/litro (agar cerebro de corazn) y esterilizar en autoclave 15min a 21C
Caldo citrato de koser
Formulacin y preparacin:
NaNH4HPO44H2O.1.5 g.
K2HPO4..1.0 g.
Citrato de sodio. 2H2O...3.0 g.
MgSO47H2O...0.2 g.
Agua destilada....1000 mL..
Distribuir en tubos con tapn de baquelita. Esterilizar en auto clave 15 minutos a 121 C.
Caldo de enriquecimiento para Listeria (cel)
Formulacin preparacin:
Formula aproximada en g/litro.
Peptona.23.0
Extracto de levadura...5.0
Cloruro de ltio......10.0
Esculina...8.0
Citrato de amonio y hierro (111)0.5
D (-)-manita.5.0
Rojo de ferol..0.08
Lecitina de soya. 1.0
PH 7.4+0.1
Disolver 23.7 g en 500 mL. de agua desmineralizada, someter al autoclave (15 minutos a 121C).
Disolver el contenido de un frasco de suplemento selectivo para Listeria PALCAM. Con 1 mL. de agua destilada estril y
aadir al caldo base enfriando por debajo de 50C mediante agitacin cuidadosa por balanceo debe mezclarse
homogneamente al suplemento selectivo en el caldo nutritivo.
Caldo de Escherichia coli
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litros.
Digestivo pancretico de casena.20.0 g
Lactosa...5.0
Mezcla de sales biliares..1.5
Fosfato hidrogeno dipotacio...4.0
Fosfato dihidrogeno de potasio..1.5

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Cloruro de sodio.....5.0
PH final 6.9+ 0.2
Suspender 37 g de polvo en 1 litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo con campanas de Dirham en porciones de
10 mL.. Para muestra de 1 mL.. O menos.
Esterilizar en autoclave a 121 C durante 12-15 minutos. Enfriar rpidamente el caldo como sea posible.
Caldo lactosado
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litros:
Peptona de gelatina5.0
Extracto de carne de res.3.0
Lactosa...5.0
PH final 6.9+ 0.1
Suspender 13 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, o si es necesario preparar
Mas concentrado el medio. Disolver y distribuir en tubos de ensayo con campanas de dirham. Esterilizar a 121C durante 15
minutos, y enfriar lo mas rpidamente posible.
Caldo lauril sulfato de sodio
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada por litros.
Laurilsulfato de sodio..0.10
Peptona de casena.20.00
Lactosa...5.0
Fosfato di potsico....2.75
Fosfato monopotasico......2.75
Cloruro de sodio...5.00
PH final 6.8+.0.2
Disolver 35.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Distribuir en tubos de ensayo con tubo invertido o
campana de dirham en porciones de 10 mL.. Para muestra de un mL.. O menos. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15
minutos. Es preferible almacenar el caldo a temperatura ambiente y utilizar frascos con tapn de rosca.
Caldo laurel sulfato + mug
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro.
Triptosa... 20.0
Lactosa ..5.0
Cloruro sdico5.0
Laurel sulfato, sal sdica....0.1
Hidrogeno fosfato di potsico..2.75
Dihidrogeno fosfato potasico...2.75
L triptfano.1.0
4 metilumbeliferil B D glucoronido...0.1
PH 6.8+ 0.1
Disolver 36.5 g/litro y distribuir en tubos provistos eventualmente de campanas de dirham.
Esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C.
La florescencia se provoca mediante una lmpara UV. Las colonias que muestran fluorescencia
Azul claro corresponden a las de E. coli.

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Caldo lauril triptosa + mug (lst mug)
Formulacin y preparacin:
Triptosa............................................................................20g.
Lactosa..............................................................................5g.
K2HPO4 ............................................................................2.75 g.
K2HPO4 ............................................................................2.75 g.
Lauril sulfato de sodio.......................................................0.1 g.
NaCI......5 g.
4 metilumbeliferil B D glucoronido..50 mg.
Agua destilada...1000 mL..
PH 6.8+ 0.2
Preparar el caldo laurel sulfato y adicionar el MUG. Disolver calentando si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos.
113
Caldo - m HD endo.
Formulacin y preparacin:
Extracto de levadura...3g.
Casi tona....10g.
Thiopeptona......10g.
Lactosa......20 g.
Desoxicolato de sodio...0.2 g.
Cloruro de sodio5g.
Fosfato di potsico.6 g.
Fucsina bsica....0.84 g.
Sulfito de sodio......2.1 g.
Agua destilada...1000 mL..
PH final 7.5 + 0.2
Pasar los ingredientes, suspenderlos en agua destilada y calentar a ebullicin, no esterilizar en autoclave. Enfriar el medio a
35 50 C para depositarlo en el cojinete de la caja de Petri en cantidades de 2.0 mL.. Se recomienda preparar pequeos
volmenes de medio.

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Caldo rojo de metilo voges y proskauer (mr vp)
Formulacin y preparacin:
Peptona.7.0 g.
Glucosa.....5.0 g.
K2HPO4 ...5.0 g.
Agua destilada ....1000 mL..
PH 6.9 + 0.2
C alentar hasta disolver los ingredientes en 800 mL.. De agua., filtrar. Esterilizar en auto clave 12 15 minutos a 121 C.
Enfriar a 20 C.
Caldo selenito y cistins
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada g/litro.
Mezcla de peptonas..5
Lactosa..4
Fosfato de sodio10
Selenito cido de sodio..4
L Cistina..0.01
PH final 7.3 + 0.2
Suspender 23g. De polvo en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Mezclar bien y ligeramente hasta que
el medio se disuelva. Envasar en tubos de ensaye,
Preferiblemente con tapa de rosca, volmenes entre 10 15 mL.. Por tubo. Esterilizar a vapor
Fluente durante 15 minutos.
Caldo tetrationato
Formulacin y preparacin:
Composicin gramos/litros
Peptona de casena..2.5
Peptona de carne.....2.5
Mezcla de sales biliares..1
Carbonato calcico...10
To sulfato sdico...30
Aditivo: yoduro potasico 5.0, yodo 6.0, eventualmente verde brillante 0.01.
PH 7.0 + 0.1
Disolver 46 g/litro y en caso necesario, calentar brevemente y enfriar rpidamente. Queda un sedimento de carbonato calcio.
No esterilizar en autoclave!.
Antes de su uso, aadir 20 mL. / litros de solucin yodo yoduro potsico, adems eventualmente 10 mL. / litros de solucin
al0.1% de verde brillante y en caso necesario. 0.04 g/litro de Novobiociona. Evitar todo calentamiento posterior. Al distribuir
el medio de cultivo, repartir homogneamente el precipitado que eventualmente hubiera podido formase.
Preparacin de la solucin yodo yoduro: yodo 6.0 g. yoduro de potasio 5g. Agua destilada 20mL..
El caldo preparado y listo para el uso, debe ser preparado el mismo da de su preparacin.
Caldo tioglicolato
Formulacin y preparacin:

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Composicin gramos / litro
Peptona de casena.15
Extracto de levadura.5
D (+) glucosa 5.5
L (+) cisterna..0.5
Cloruro sodico......2.5
Tioglicolato sdico0.5
PH 7.1 + 0.2
Disolver 29 g/litros, distribuir en tubos y esterilizar en autoclave 15 minutos a 121C:
Caldo tripticasa peptona extracto de levadura (tpgy)
Formulacin y preparacin:
Tripticasa..50 g.
Peptona...5 g.
Glucosa...4 g.
Extracto de levadura...20 g.
Tioglicolato de sodio...1 g.
Agua destilada..1000 mL..
Disolver los ingredientes en agua caliente, enfriar y ajustar a Ph 7.2. Distribuir en volmenes de 21 mL.. En tubo de 20 x 150
Mm. con tapn de rosca. Esterilizar por vapor fluente, enfriar a la temperatura y almacenar a 4 C Hasta 6 semanas. Si se
almacena ms de 12 horas tratarlos mediante calentamiento en bao de agua a ebullicin por 10 minutos y enfriar antes de
usarlo.
Caldo triptosa
Formulacin y preparacin:
Formula aproximada g/litro.
Triptosa.20.0
D (+) glucosa.1.0
Cloruro sodico...5.0
Tiamina bicloruro..0.005
Agar-agar...13.0
pH 7.3 + 1
Disolver 26 g/litro y esterilizar en autoclave 15min a 121C

Caldo verde brillante bilis al 2% (caldo brila)


Formulacin y preparacin:
Formula aproximada en gramos por litro.
Bilis de buey deshidratada20.0
Lactosa..10.0
Peptona de gelatina10.0
Verde brillante0.0133
pH final 7.2 + 0.2
Suspender 40g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Agitando frecuentemente para disolver el producto.
Distribuir volmenes de 10mL. de tubos de ensayo con campanas de dirham e incubarlos por porciones de un mL. del

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producto en estudio. para analizar porciones de 10mL. de producto, disolver 60g del medio deshidratado en un litro de agua
destilada y envasar en volmenes de 20mL.. Esterilizar a 121C durante 15min.
Medio base
Formulacin y preparacin:
Peptona de casena..10.0g
Extracto de levadura5.0g
Glucosa2.0g
Agar..25.0g
Agua destilada..1000mL.
117
Disolver los ingredientes y esterilizar en autoclave 15min a 120C.
Medio de carne cocida (CMM)
Formulacin y preparacin:
Corazn de res.454g
Proteosa peptona.20g
Bactodextrosa...2g
Cloruro de sodio...5g
Extracto de corazn de res...1000mL.
Picar el corazn de res, sumergir en agua y calentar hasta ebullicin durante 1 hora. Enfriar, ajustar el pH a 7.0 y hervir 10
minutos. Filtrar a travs de muselina y presionar para drenar el exceso de lquido de la carne. Guardar la carne cocida.
Agregar los ingredientes al filtrado y ajustar a pH 7.0
Agregar agua hasta hacer 1000mL. . Filtrar a travs de un papel filtro poroso. Se puede conservar el caldo y la carne en
congelacin por separado. Agregar el corazn cocido y picado a tubos de ensaye de 18 x 150 mm o 20 x 150 mm a una altura
de 1.2 a 2.5 cm. del tubo y adicionar de 10 a 12 mL. de caldo. Esterilizar en autoclave 15min a 121C. Si este medio se
almacena por ms de 12 horas despus de su preparacin debe calentarse a ebullicin por 10 min. Y enfriar antes de su uso.
Medio lactosa gelatina.
Formulacin y preparacin:
Triptosa.15g
Extracto de levadura..10g
Lactosa...10g
Rojo fenol...0.05g
Gelatina..120g
Agua destilada1000mL.
Calentar hasta disolver la triptosa, extracto de levadura y lactosa en 400mL. de agua. Suspender la gelatina en 600mL. de
agua y calentar a 50-60 C agitando para disolver. Mezclar las 2 soluciones. Ajustar a pH 7.5 + 0.2. Adicionar rojo fenol y
mezclar. Transferir porciones de 10mL. dentro de tubos de 16 x 150 mm con un tapn de baquelita. Esterilizar en autoclave
10min a 121C
Medio nitrato-movilidad
Formulacin y preparacin:
extracto de carne3g
Peptona (DIFCO)...5g
KNO3.....1g
Na2HPO42.5g
Agar3g

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Galactosa............5g
Glicerina.5mL.
Agua destilada1000mL.
Disolver todos los ingredientes excepto el agar. Ajustar el pH a 7.3 + 0.1. Adicionar el agar hasta disolver. Suspender
porciones de 11mL. dentro de tubos de 16 x 150mm. Esterilizar en autoclave 15min. A 121C. si no se usa dentro de 4 horas,
calentar 10min a ebullicin y enfriar en agua antes de su uso.

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Apndice II
preparacin de reactivos y soluciones para Microbiologa Sanitaria
cido sulfanilico
cido sulfanilico
cido actico 5N

1g
125mL.

cido tartarico (para hongos)


cido tartarico
10.0g
Agua destilada
100.0mL.
Disolver y esterilizar a 121C durante 15 minutos.

Alfa naftol (prueba de voges proskauer)


Alfa naftol
Alcohol etilico absoluto

5.0g
100.0mL.

Cloruro mercrico (prueba de proteolisis)


Cloruro mercrico
cido clorhdrico concentrado
Agua destilada

12.0g
16.0g
80,0 mL.

Hidrxido de potasio (reaccin de voges proskauer)


Hidrxido de potasio
Agua destilada

40.0g
100.0mL.

120
Hidrxido de sodio 1.0N
Hidrxido de sodio
Agua destilada

4g
100mL.

Kovac (prueba del indol)


p-dimetilamino benzaldehido
Alcohol amilico
cido clorhdrico concentrado

5.0g
75.0mL.
25.0mL.

Disolver el aldehdo en el alcohol y adicionar lentamente el HCl


N (1-naftjil) entilendiamina
N (1-naftjil) entilendiamina dihidroclorida 0.25g
cido actico 5N
-200mL.

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Rojo de metilo
Rojo de metilo
Alcohol etilico
Agua destilada

0.1g
300.0mL.
500.0mL.

Disolver el indicador en el alcohol y adicionar el agua.


Solucin sal-glicerina
Glicerina
K2 HPO4
KH2PO4
NaCl
Agua destilada

100mL.
12.4g
4g
4.2g
900mL.

Mezclar el cloruro de sodio y el agua destilada. Adicionar la glicerina y los fosfatos. Ajustar en pH a 7.2. Esterilizar en
autoclave 15minutos a 121C. Para una doble concentracin utilizar 200mL. de glicerina y 800mL. de agua destilada.

121
Buffer oTampn fosfato
Fosfato monopostasico
Fosfato dipotasico
Agua destilada

6.0g
16.0g
1000mL.

Tripsina (1:250)
a) solucin al 1%
b) disolver 200mg en 20mL. de agua destilada. No almacenar

Soluciones diluyentes
Agua destilada
Agua peptonada
Peptona
Cloruro de sodio
Agua destilada

1g
8.5g
1000mL.

Preparacin:
1.- disolver los componentes en 1 litro de agua
2.- ajustar el pH a 7 con hidrxido de sodio 1.0N
3.- distribuir en porciones de 99,90 y 9 mL. segn se requiera
4.- esterilizar a 121C durante 15min.
5.- despus de la esterilizacin. El pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales.
Si este diluyente no es usado inmediatamente, almacenar en lugar obscuro a una temperatura entre 0 a 5C por un tiempo no
mayor de un mes, en condiciones tales que no alteren su volumen o composicin.

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122
Solucin reguladora de fosfatos (solucin concentrada)
KH2PO4
Agua destilada

34g
1000mL.

Preparacin:
1.- disolver el fosfato en 500mL. de agua y ajustar el pH a 7.2 con solucin de hidrxido de sodio 1.0N
2.- aforar con agua en 1lt.
3.- esterilizar durante 15min a 121C.
4.- conservar en refrigeracin (solucin concentrada)
5.-tomar 1.25mL. de solucin concentrada y llevar a 1lt con agua (solucin de trabajo)
6.- esterilizar a 121C durante 15min.
7.- despus de la esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser iguales a los iniciales.

Solucin amortiguadora de fosfatos con gelatina


Gelatina
Na2HPO4
Agua destilada

2g
4g
1000mL.

1.- ajustar a pH 6.2 con solucin de cido clorhdrico 4N


2.- distribuir en frascos con tapn de rosca esterilizar por vapor, enfriar a temperatura ambiente.
3.- almacenar a 4C

Solucin salina.
Cloruro de sodio
Agua destilada

8.5g
1000mL.

Preparacin:
1.- disolver y distribuir en tubos o frascos.
2.- esterilizar a 121C durante 20min.

123
ndice de tablas y figuras
pg
fig 1.- etiqueta de identicacion para muestras....8
fig 2.- plantilla estril para muestreo de superficies.15
fig 3.- fotografas de muestreo de la superficie de manos....17
fig 4.- fotografa donde se indica la manera de pesar una muestra...24
fig 5.- diagrama del mtodo de las diluciones ..25
normas APLICADAs de mesofilos aerobios...33
Fig 6.- diagrama de la prueba presuntiva de la tcnica del NNP de coliformes.
en agua purificada y hielo.39
fig 7.- confirmacin de burbujas de gas en campanas de deurham39

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Tabla 8.- combinacin de los tubos positivos en el anlisis de aguas
Y bebidas...40
Fig 9.- caractersticas E. coli en agar EMB41
Interpretacin de de la prueba bioqumica de E. coli43
Fig 10.- diagrama de la prueba presuntiva de la tcnica del NMP
De coliformes fecales en alimentos..45
Tabla 11.- combinacin de los tubos positivos del anlisis de alimentos.47
normas APLICADAs de coliformes..52
Fig 12.- inoculacin por extensin de superficie..60
fig 13.- prueba de la cuagulasa.60
Fig 15.- utilizacin anaerobia de glucosa..60
Tabla 16.- caractersticas bioqumicas ripicas de 2 especies S. aureus
Y micrococcus59
normas APLICADAs para shapylococcus aureus...59
Fig 17.- caractersticas de Salmonella en agar XLD.74
Fig 18.- confirmacin bioqumica de Salmonella..75
Pruebas diferenciales de Vibrio cholerae..80
Fig 19.- diferenciacin bioqumica de los diversos tipos de Listeria...83
Fig 20.- observaciones de las placas por iluminacin indirecta de
Las colonias de Listeria..85

ndice de medios de cultivo, reactivos y soluciones


cido sulfanilico................................................119
cido tartrico.....119
Agarbairb-parker.. 98
Agar bilis y rojo violeta.99
Agar bilis verde brillante...99
Agar cloruro enil moxalactama (LPM)..100
Agar dextrosa y papa...100
Agar EMB...101
Agar hierro tres azucares (TSI)...101
Agar hgado de ternera yema de huevo...102
Agar lisina hierro (LIA)..103
Agar mtodos estndar103
Agar Oxford (OXA)104
Agar Salmonella y shigella (SS)......105
Agar soya triplica....105
Agar sulfito bismuto (BS)...106
Agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS).....106
Agar triptosa cicloserina (TSC)..107
Agar verde brillante.....107
Agar vogel-Johnson....108
Agar XLD108

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Agua peptonada...121
Alfa naftol...119
Caldo infusin cerebro de corazn (BHI)...119
Caldo citrato de koser (CK)....119
Caldo de enriquecimiento para Listeria......110
Caldo E. coli110
Caldo lactosa (CL)......111
Caldo laurel sulfato de sodio...111
Caldo laurel triptosa + MUG...112
Caldom- HD ENDO......113
Caldo rojo de metilo voges proskauer (MR-VP)113
Caldo seenito cistina (SC)...114
Caldo TPGY115
Caldo triptosa......116
Caldo verde brillante bilis al 2% (caldo brila)....116
Cloruro mercrico...119
Hidrxido de potasio...119
Hidrxido de sodio 1N120
Kovac......120
125
Medio base..116
Medio de carne cocida (CMM)...117
Medio lactosa gelatina.....117
Medio nitrato-movilidad.....118
N-(1 nafthil) etilendiamina...120
Rojo de metilo.120
Solucin amortiguadora de fosfatos122
Solucin amortiguadora de fosfato con gelatina.....122
Solucin sal-glicerina..123
Solucin salina....122
Tampn fosfato...121
Tripsina...121

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ANEXO II. DIFERENTES TIPOS DE OPERACIN CON CULTIVOS MICROBIANOS
1. Toma de una muestra de un tubo con lquido.

Se esteriliza el asa, se toma el tubo con la mano izquierda, con el dedo meique y la palma de la mano
derecha se sostiene firmemente el tapn y se retira rotando el tubo suavemente y con firmeza.

Se flamea la boca del tubo. Con el tubo inclinado aproximadamente 30, nunca en posicin
horizontal, se introduce el asa, tocando la pared del tubo hasta entrar en el lquido A 1/3 de
profundidad, cuidadosamente se retira el asa con un movimiento que permita la adhesin de una gotita
en el circulo de alambre. No basta con que se forme una pelcula.

Se saca el asa sin tocar la pared del tubo, seflamea la boca del tubo y se tapa.

2. Descarga de la gota acarreada en el asa.

La gota que se ha tornado aspticamente puede tener diferentes destinos:

a) El ms simple es que se deposite en el centro de un portaobjetos limpio para hacer alguna


preparacin. Inmediatamente despus se debe esterilizar el asa.

b) A menudo, el destino de una gota tomada con el asa es servir de inculo, para lo cual se deben
seguir los pasos siguientes:

Inculo a otro medio liquido en tubo o matraz. La operacin es similar a la toma


de la muestra, se sostiene firmemente el recipiente con la mano izquierda y el tapn
se retira con el dedo meique de la mano derecha, se flamea la boca del recipiente y
se introduce el asa cuidadosamente sin tocar las paredes hasta romper la superficie
del liquido, ah se hace un ligero movimiento de rotacin y se retira el asa, se flamea
la boca del recipiente, se coloca su tapn y se esteriliza el asa.

Si es a un medio slido, se hace una estra con el asa, observando que parte del
material tornado quede extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se
debe romper la superficie del medio slido.

3. Toma de una muestra de un medio slido.


Las operaciones son las mismas descritas anteriormente, excepto que con el asa se debe tocar y separar un
fragmento del material de inters, ya sea una colonia bacteriana, o parte de una pasta o material viscoso. El
destino de la muestra puede ser el mismo que en el prrafo anterior.

Si se va a hacer una preparacin para observar al microscopio, el material se suspende en una pequea
gota de agua destilada colocada previamente en el centro de un portaobjetos.

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Si va a ser un inoculo, se trata igual como se describi si es a un medio liquido.

Si es a un medio slido, se hace una estra con el asa, observando que parte del material tornado queda
extendido a lo largo del trazo. A menos que se indique, no se debe romper la superficie del medio
slido.

4. Manipulacin de cajas de Petri.


Estos recipientes generalmente contienen un medio de cultivo solidificado con agar, cuya firmeza depende
de la concentracin del mismo, la cual regularmente es del 1.5 a 2.5 %. En la mayora de los casos esta
sustancia es inerte y no interfiere con el desarrollo de los microorganismos. A menos que se indique lo
contrario, las cajas de Petri se mantienen como posicin normal, con la tapa abajo y la base arriba,
con lo cual el agua de condensacin que se forma en la tapa no cae sobre el medio de cultivo y la tapa
permite levantar la caja sin destaparla accidentalmente.
Con la mano izquierda se toma la caja y con un giro de la mueca se tiene la caja en posicin invertida, la
base abajo y la tapa arriba, se deja caer la base en la palma de la mano y se sostiene la tapa can la yema de
los dedos, se invierte el giro de la mueca y se deja la tapa de la caja sobre la mesa junto al mechero.
Sosteniendo la base entre los dedos se vuelve a girar la mueca y la superficie del medio de cultivo queda
expuesta al operador. En estas condiciones se puede observar la superficie del medio, tomar una muestra,
inocular con el asa, etc.
Cualquiera que sea la operacin debe hacerse en un tiempo mnimo, ya que aunque se trabaje en la zona de
seguridad del mechero, la probabilidad de que los contaminantes lleguen aumenta al prolongar el tiempo de
exposicin. En caso de tener que transferir un volumen de lquido con una pipeta, se recomienda un
procedimiento diferente:
Se coloca la caja sobre la mesa, junto al mechero, con la tapa arriba y la base abajo, se destapa suavemente
con la mano izquierda al tiempo que se introduce la punta de una pipeta y se descarga el volumen deseado.
Inmediatamente despus se retira la pipeta y se coloca la tapa.
Otra forma de manipular las cajas de Petri, que se recomienda slo despus de tener cierta habilidad y
confianza en el trabajo es el de tomar la caja de Petri con la mano izquierda, en posicin invertida, la base
abajo y la tapa arriba, la base se apoya sobre los dedos meique y anular, mientras que la tapa se sostiene
con los dedos ndice y pulgar y haciendo un movimiento de tijeras se abre una rendija por la cual se hace la
operacin deseada. Con cierta prctica se puede abrir la caja casi por completo.
5. Aislamiento de colonias.
Una vez que se ha depositado en la superficie del medio, en la caja de Petri, el material que en general sirve
de inculo, debe extenderse ste, para lo cual se siguen diferentes procedimientos.

106

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Para aislar colonias, se extiende el inculo con el asa haciendo varios trazos en forma de secante cada vez
mayor de la orilla hacia el centro, pero solamente una distancia de 1 a 2 cm de la orilla. Se esteriliza el asa,
se deja enfriar o se introduce en el medio en un lugar que no interfiera con las siguientes estras.
Se gira la caja de Petri un quinto de vuelta y con el asa esterilizada se hace una nueva serie de estras que
deben extender una pequea porcin de la primera serie en forma similar con trazos que vayan de la orilla
hacia el centro. La operacin se repite dos veces ms y en la quinta se hace una serie de estras abiertas.
6. Crecimiento uniforme o masivo en la superficie
En caso de requerir que ocurra un crecimiento uniforme del inculo, ste se debe extender ya sea con el asa
o con un hisopo, haciendo numerosas estras en todas direcciones o bien, con la ayuda de una varilla de
vidrio acodada, la cual se esteriliza flamendola despus de introducirla en alcohol, se deja enfriar y se hace
un movimiento de vaivn sobre la superficie del medio al tiempo que se hace girar varias veces la caja de
Petri sobre la mesa, extendiendo el inculo hasta cubrir toda la superficie.
7. Toma de muestras con pipeta.
Se rompe el papel de envoltura cerca de la boquilla. Se siguen los pasos correspondientes a la manipulacin
de tubos y matraces, introduciendo en el liquido la punta de la pipeta, succionando el volumen deseado,
aforando a la marca correspondiente, se retira sin tocar las paredes, se flamea y tapa el recipiente,
manteniendo la punta de la pipeta dentro de la zona de seguridad del mechero.
Se toma el recipiente al que se va a transferir el lquido manipulndolo como se describi antes y se
descarga el volumen deseado del contenido de la pipeta en el recipiente.
Esta operacin debe ser muy rpida, pues el calor del mechero hace que el aire dentro de la pipeta se
dilate y expulse el lquido, lo que causa derrames indeseables sobre la mesa, la bata u otros recipientes.
La pipeta se debe desechar introducindola en un recipiente con una solucin desinfectante, despus de lo
cual se puede lavar o si se quiere se puede esterilizar con todo el material sucio en el autoclave.
Alternativamente, se puede colocar nuevamente en la envoltura de papel en la que se esteriliz,
mientras se termina el trabajo y se dispone la esterilizacin de todo el material sucio.
8. Toma de muestras e inoculacin con hisopo
Un hisopo consiste de un palillo de madera de unos 15 cm de largo, con un poco de algodn enredado en un
extremo. Estos instrumentos se esterilizan en tubos gruesos o envuelto en papel.
Se saca un hisopo cuidadosamente de su contenedor con la mano derecha sin tocar el extremo con algodn,
que servir para impregnarse del material que interesa., se introduce el extremo con algodn y se deja
humedecer o empapar, se retira el hisopo sin tocar las paredes y se lleva a su destino.

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Si es un medio lquido basta con un movimiento de inmersin o extraccin. Si es a un medio slido se
descarga humedeciendo la superficie con un movimiento suave.
Si se quiere conservar la muestra tomada en el hisopo se introduce ste en un tubo estril ya sea seco o con
un lquido conservador para su transporte y se sujeta con el propio tapn del tubo, dejando fuera la parte
que ha sido tocada con los dedos. Una vez que se ha utilizado el hisopo, para desecharlo hay varios caminos:
se le sumerge en una solucin desinfectante o se le pone en un recipiente para su posterior esterilizacin o
se incinera.
9. Preparacin de medios de cultivo.
En la mayora de las ocasiones, los medios de cultivo se adquieren comercialmente de diversos proveedores
y marcas, son preparados deshidratados en polvo, cuya composicin vara de acuerdo con las necesidades.
En general, el fabricante seala la cantidad de polvo que debe usarse por cada litro de medio de cultivo. En
un recipiente del doble del volumen que se desea preparar, se pone el polvo y agua destilada para
disolverlo.
Si el medio contiene agar se requiere primero dejar reposar en fro para que el agar se hidrate, despus
requiere del calentamiento hasta ebullicin para lograr la disolucin del mismo, en el caso en que este
medio deba ser utilizado para preparar tubos inclinados. Cuando este agar se prepara para vaciar en cajas,
esta disolucin no es necesaria, puesto que se alcanzar sin problemas durante la esterilizacin. Hay que
tener mucha precaucin, ya que los medios con agar tienden a hervir abrupta y violentamente, lo cual
podra causar quemaduras graves del operador.

Por lo anterior, se recomienda que al realizar la ebullicin del mismo, la boca del matraz nunca apunte en
direccin del operador o de otras personas o equipo, y que ste utilice guantes de asbesto para su proteccin
y est atento en todo momento del matraz.
El paso siguiente consiste en envasar los volmenes convenientes en los tubos de cultivo y esterilizarlos en
autoclave. Si el medio se va a utilizar en cajas de Petri, se tapa con algodn el recipiente en que se disolvi,
se cubre con papel y se esteriliza en autoclave.
10. Despus de esterilizar.
a) Medios de cultivo lquidos
Los tubos y otros recipientes con medio de cultivo lquido se sacan del autoclave y se dejan enfriar a
temperatura ambiente.
b) Medios de cultivo slidos

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Los recipientes con medio slido se sacan del autoclave y se hace lo siguiente:

Si son tubos, se dejan enfriar en posicin inclinada de tal modo que se forme el pico de flauta, una
superficie plana larga y que no alcance el lmite del tapn de baquelita. Al enfriarse se solidifica el
medio de cultivo cuando alcanza una temperatura entre 40 y 45C.

Si son recipientes cuyo contenido se va a utilizar en cajas Petri, se dejan enfriar hasta alcanzar una
temperatura de 45 a 50C, y se procede a verter el medio todava lquido en las cajas estriles, en
una operacin asptica cerca de la llama del mechero, evitando la formacin de burbujas. En caso
de que se formen burbujas, se pueden romper flameando ligeramente la superficie con el mechero.
Cada caja puede contener de 12 a 15 mL. Se dejan enfriar sobre la mesa hasta que el medio
solidifique. Se invierten para que la tapa quede abajo y la base arriba. Si no se utilizan en ese
momento, las cajas pueden mantenerse en refrigeracin, debidamente etiquetadas y selladas con
papel parafilm, con la tapa hacia abajo y la base de la caja en la parte superior.

11. Rotulado.
En todos los casos, se debe rotular cada portaobjetos, tubo, matraz, caja de Petri o cualquier otro recipiente
en el que se haga un cultivo, reactivo o prueba, con el fin de conocer sin lugar a dudas lo que se tiene entre
manos.
Nunca se debe depositar toda la confianza en la memoria. En caso de que no hubiera espacio suficiente para
poner todos los datos necesarios, se debe utilizar una clave simple y confiable, que contenga la iniciales del
operador, material, cultivo, cepa, muestra o prueba y fecha. Esto mismo debe registrarse en la bitcora de
trabajo en donde estarn explcitos todos los datos.

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Bibliografa
1.- Board R.G. 1989 Introduccin a la microbiologa moderna de los alimentos.
Edit. Acribia. Espaa.
2.- carl, vanderzant, phd, Don F. Splittstoesser, Phd. 1992. compendium of
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4.- diario oficial de la federacin mejicana (DOF). Mxico DF
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