Relatório Análises Clínicas

Mariana do Rosrio Ramos
Relatrio de Estgio
Mestrado em Anlises Clnicas
Relatrio de Estgio Curricular no mbito do Mestrado em Anlises Clnicas, orientado pelo Doutor Frederico
Valido e apresentado Faculdade de Farmcia da Universidade de Coimbra
Setembro, 2012
(Para efeitos de paginao)

Folha de Ros
Mariana do Rosrio Ramos

Relatrio de Estgio - Mestrado em Anlises Clnicas
Faculdade de Farmcia da Universidade de Coimbra
Relatrio de Estgio do Mestrado em Anlises

Clnicas,
decorrido
no
Servio
de
Patologia
Clnica do Instituto Portugus de Oncologia de
Coimbra Francisco Gentil E.P.E. sob orientao da
Dr. Frederico Valido, com um total de 600 horas,
compreendidas entre Novembro e Maio de 2012 nas
reas de Imunologia e Hematologia.
Setembro
Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra
ii

ndice
ndice de Figuras ........................................................................................................................................ vii
Indice de Tabelas ........................................................................................................................................ ix
Abreviaturas ................................................................................................................................................. xi
Resumo ....................................................................................................................................................... xiii
Introduo ..................................................................................................................................................... 1
Caracterizao do Laboratrio de Estgio ............................................................................................ 2
Controlo de Qualidade .............................................................................................................................. 3
A Fase Pr-Analtica .............................................................................................................................. 3
A Fase Analtica....................................................................................................................................... 4
A Fase Ps Analtica .............................................................................................................................. 4
Controlo de Qualidade Interno e Externo ....................................................................................... 4
Escolha dos anticoagulantes ...................................................................................................................... 5
Microbiologia ............................................................................................................................................... 7
Anlise de urinas .................................................................................................................................... 7
Bioqumica ..................................................................................................................................................... 9
Imunologia/Hormonologia ......................................................................................................................10
Princpios dos imunoensaios ...............................................................................................................11
Imunoensaio competitivo ................................................................................................................11
Imunoensaio sandwich/ no competitivo .....................................................................................12
Tcnicas manuais ...................................................................................................................................13
Sistemas automticos de Imunologia ................................................................................................14
Electroquimioluminescncia..........................................................................................................14
Quimioluminescncia .....................................................................................................................16
TRACE................................................................................................................................................18
Imunoturbidimetria ........................................................................................................................19
Marcadores Tumorais...........................................................................................................................20
Antignio Carbohidrato 125 .........................................................................................................20
Antignio Carbohidrato 15.3 ........................................................................................................21
Antignio Carbohidrato 19.9........................................................................................................21
Antignio Carbohidrato 72.4 .......................................................................................................21
CYFRA 21.1 ......................................................................................................................................21
iii

Enolase Neuro Especfica ............................................................................................................... 22

Antignio do Carcinoma de Clulas Escamosas ........................................................... 22
Antignio Carcinoembrionrio......................................................................................... 22
Alfa-fetoprotena .................................................................................................................. 22
Subunidade Beta da Gonadotrofina Corinica Humana .............................................. 22
2-microglobulina ................................................................................................................. 23
Cromogranina A .................................................................................................................... 23
Antignio Especifico da Prstata ....................................................................................... 23
Calcitonina .............................................................................................................................. 24
Electroforese no sistema Hydrasis................................................................................................ 25
Electroforese de protenas sricas ................................................................................. 25
Intrepertao do proteinograma .................................................................................... 26
Albumina............................................................................................................................ 26
-I Globulinas ................................................................................................................ 26
-2 Globulinas............................................................................................................... 26
Globulinas ................................................................................................................ 27
Gama Globulinas ........................................................................................................ 27
Gamapatias policlonais ......................................................................................................... 28
Gamapatias monoclonais ..................................................................................................... 28
Imunofixao .......................................................................................................................... 29
Alguns exemplos prticos de Gamapatias ........................................................................ 30
Hematologia ................................................................................................................................................ 33
Procedimentos de rotina no Sector de Hematologia ................................................................. 34
Hemograma e Esfregao Sanguneo ................................................................................................ 34
Eritrograma ...................................................................................................................................... 35
Eritrcitos ............................................................................................................................... 35
Quantificao da Hemoglobina ........................................................................................... 37
Hematcrito .......................................................................................................................... 37
Hemoglobina Corpuscular Mdia ...................................................................................... 37
Concentrao da Hemoglobina Corpuscular Mdia ...................................................... 38
Volume Corpuscular Mdio ................................................................................................. 38
Variao do tamanho dos eritrcitos ................................................................................ 38
Reticulcitos ........................................................................................................................................ 38
iv

Plaquetas ...............................................................................................................................................39
Leucograma ..........................................................................................................................................40
Neutrfilos .................................................................................................................................40
Basfilos ......................................................................................................................................41
Eosinfilos ...................................................................................................................................41
Moncitos ...................................................................................................................................41
Linfcitos .....................................................................................................................................42
Velocidade de Sedimentao .......................................................................................................42
Hemostase...............................................................................................................................................44
Coagulao Sangunea ......................................................................................................................44
Estudos Coagulativos.....................................................................................................................46
Tempo de protrombina..........................................................................................................46
Tempo de Tromboplastina Parcial activada .......................................................................47
Tempo de Trombina ...............................................................................................................48
Fibrinognio ..............................................................................................................................48
D-dmeros ................................................................................................................................48
Patologias mais comuns associadas coagulao ...........................................................................49
Hemofilia A .........................................................................................................................................49
Hemofilia B .........................................................................................................................................49
Doena de Von Willebrand ............................................................................................................49
Deficincia de vitamina K ................................................................................................................49
Concluses ..................................................................................................................................................50
Bibliografia ...................................................................................................................................................51
vi

ndice de Figuras
Figura I Ilustrao de ensaio competitivo ............................................................................... 11
Figura 2 Relao entre a concentrao do antignio do doente e a intensidade do sinal, no
ensaio competitivo ........................................................................................................................ 12
Figura 3 Ilustrao de ensaio no competitivo .................................................................... 12
Figura 4 Relao entre a concentrao do antignio do doente e a intensidade do sinal no
ensaio no competitivo ................................................................................................................. 13
Figura 5 Esquema ilustrativo do mtodo electroquimioluminescente sandwich .......... 15
Figura 6 Cobas e 411, da Roche (www.roche.pt ) ............................................................ 16
Figura 7 Sistema Automtico Immulite 2000, da Siemens ....................................................... 18
Figura 8 Equipamento Kryptor ........................................................................................................ 19
Figura 9 Equipamento Konelab 60i ................................................................................................... 20
Figura 10 Proteinograma em gel de agarose, utilizando o Hydrasys (19) ............................ 25
Figura 11 Grfico de corrida electrofortica normal (18) ...................................................... 25
Figura 12 Principais protenas encontradas em cada fraco electrofortica (com destaque
para as Igs) (18) ............................................................................................................................................. 27
Figura 13 Imunofixao srica de pacientes com gamapatias monoclonais IgG kappa e IgA
lambda (22)....................................................................................................................................................... 29
Figura 14 Electroforese de Protenas do Caso 1 ........................................................................ 30
Figura 15 Imunofixao de proteinas sricas realizado no Caso 1 ...................................... 30
Figura 20 Pesquisa de Bence Jones no Caso 3 ............................................................................. 32
Figura 21 Esquema de Focagem Hidrodinmica utilizado na tecnologia VC .................... 35
Figura 22 Alifax Test 1 BCL ................................................................................................................ 42
vii

Figura 23 Exemplo de Hemograma e VS executado no sector de Hematologia do Servio

de Patologia Clnica do IPO ................................................................................................................... 43
Figura 24 ACL TOP 500, Instrumentarion Laboratory............................................................ 44
Figura 25 Esquema representativo do modelo da cascata da coagulao......................... 45
viii

ndice de Tabelas
Tabela 1 Nmero de doentes atendidos no servio nos ltimos 3 anos ......................... 2
Tabela 2 Nmero de parmetros quantificados em cada sector, nos ltimos 3 anos ... 2
Tabela 3 Tabela indicativa de parmetros feitos por tcnicas manuais no sector de
Imunologia/Hormonologia ......................................................................................................... 14
Tabela 4 Analitos doseados no Sistema Cobas e 411 ........................................................ 16
Tabela 5 Analitos doseados no Sistema Automtico Immulite 2000 ............................... 18
ix

Abreviaturas
AFP Alfa-fetoprotena
aPTT Tempo de Tromboplastina Parcial activada
BMG 2- Microglobulina
CA 125 Antignio Carbohidrato 125
CA 15.3 Antignio Carbohidrato 15.3
CAL Calcitonina
CEA Antignio Carcinoembrionrio
CGA Cromogranina A
CHCM Concentrao da Hemoglobina Corpuscular Mdia
DNA cido desoxirribonucleico
ECLIA Electroquimioluminescncia
EDTA-K3 -cido etilenodiaminotetractico tripotssico
EGTM European Group on Tumor Markers
FT Factor Tecidular
FVW Factor de Von Willebrand
GMSI Gamapatia Monoclonal de Significado Indeterminado
Hg- Hemoglobina
HBP Hiperplasia Benigna da Prstata
HCM Hemoglobina Corpuscular Mdia
HCT Hematcrito
Ig Imunoglobulina
IGF-I Factor de Crescimento Insuline-like
INR Internacional Normalized Ratio
IPOCFG Instituto Portugus de Oncologia de Coimbra, Francisco Gentil
IRMA Immunoradiometric assay Ensaio imunoradiomtrico
ISI Index de Sensibilidade Internacional
LDH Lactato Desidrogenase
LCR Liquido Cefalorraqudeo
NSCLC Non Small Cells Loung Cancer
NSE Enolase Neuro Especfica
PCR Protena C Reactiva
PSA Antignio Especfico da Prstata
xi

PT Tempo de Protrombina
RDW Variao do tamanho dos eritrcitos
RIA Radio Immunoassay Radio Imunoensaio
RIQAS Randox International Quality Assessment Scheme
RNA Acido ribonucleico
rpm rotaes por minuto
SCC Antignio do carcinoma de clulas escamosas
TAC Tcnico de Anlises Clnicas
TG Tireoglobulina
TRACE Time-Resolved Amplified Cryptate Emission
TSAC Tcnico Superior de Anlises Clnicas
TT Tempo de Trombina
VCM Volume Corpuscular Mdio
VCS Velocidade, Condutividade e Disperso
VS Velocidade de Sedimentao
-HCG Subunidade Beta da Gonadotrofina Corinica Humana
xii

Resumo
O presente relatrio refere-se ao estgio realizado no Instituto Portugus de
Oncologia de Coimbra Francisco Gentil E.P.E (IPOCFG E.P.E), no mbito das anlises
clnicas.
O estgio teve como principal objectivo a minha integrao no Servio de Patologia
Clnica do IPOCFG E.P.E, proporcionando-me a aquisio de habilidades prticas na
execuo das tcnicas laboratoriais, sempre associadas a um conhecimento terico que me
permita fazer a interpretao dos resultados.
As reas aprofundadas neste relatrio so a Imunologia e a Hematologia, sendo feita
apenas uma referncia genrica Bioqumica e Microbiologia.
Abstract
The following report refers to the internship done at Instituto Portugus de
Oncologia de Coimbra Francisco Gentil E.P.E (IPOCFG E.P.E), in the context of clinical
analysis.
The main goal of my internship was an integration in the clinical pathology service of
IPO, which provided me the opportunity to acquire practical skills in the performance of
laboratory techniques, always associated with a theoretical knowledge which allowed me to
interpret the results.
In this report, the emphasized areas are Immunology and Hematology, and theres
only a generic reference about Biochemistry and Microbiology.
xiii

Introduo

O estgio curricular realizado teve como principal objectivo a minha integrao na

rotina do Servio de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E, sob a orientao do Doutor
Frederico Valido. Esta integrao na prtica laboratorial foi fundamental para percepo de
todas as responsabilidades que tem um Tcnico Superior de Anlises Clnicas (TSAC). Deste
modo, foi til para a aplicao prtica dos conhecimentos cientficos adquiridos ao longo do
curso.
A rea das Anlises Clnicas est em constante expanso e desenvolvimento e
constitui umas das reas fundamentais dentro das cincias da sade. As tcnicas utilizadas
tm cada vez mais tendncia para a eficcia, garantindo assim a qualidade dos resultados.
Este estgio foi realizado durante 7 meses e perfez um tempo de 600 horas. O tempo
foi repartido pelas valncias de Qumica Clinica, Microbiologia, Hematologia e
Imunologia/Hormonologia, permanecendo um ms em cada sector. Selecionei Hematologia e
Imunologia para maior aprofundamento, sendo que estive mais um ms nestes sectores.
So referidos os procedimentos de Controlo de Qualidade que se tm em conta, de
modo a minimizar os erros a que o processo analtico est sujeito. No final desta parte
realizada uma apreciao global de como os conhecimentos adquiridos durante a fase
curricular do Mestrado de Anlises Clnicas auxiliaram na aprendizagem prtica.

Caracterizao do Laboratrio de Estgio

O Servio de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E, situado no edifcio da Oncologia

Mdica e Laboratrios (Piso 0), constitudo por quatro sectores distintos, sendo o director
do servio o Doutor Frederico Valido. O sector da Bioqumica est sob a orientao do
Doutor Lus Nina, o sector da Microbiologia pela Doutora Elvira Malta, o sector de
Hematologia pela Doutora Joana Diamantino e o sector de Imunologia/Hormonologia pelo
Doutor Nuno Cunha. O servio conta tambm com a colaborao do pessoal
administrativo, Tcnicos de Anlises Clnicas (TAC), TSACs e clnicos. O servio conta com
uma sala de espera, duas salas de colheitas, a recepo, a sala de lavagem do material, o
gabinete do chefe do servio e os espaos pertencentes aos diferentes sectores.
Diariamente o servio recebe aproximadamente 300 amostras para serem analisadas,
dentre as quais a grande maioria dos pedidos so dirigidos bioqumica, hematologia e
imunologia.
A seguinte tabela (Tab. 1) mostra o nmero de doentes atendidos no servio nos
ltimos 3 anos.
Tabela 1 - Nmero de doentes atendidos no servio nos ltimos 3 anos
N doentes
2009
2010
2011
64.503
65.440
67.351
Na tabela abaixo (Tab. 2) visvel o nmero de parmetros quantificados em cada

sector, nos ltimos 3 anos.
Tabela 2 - Nmero de parmetros quantificados em cada sector, nos ltimos 3 anos
Sectores
2009
2010
2011
Bioqumica
759.099
792.496
790.891
Hematologia
132.269
133.062
123.675
Imunologia
65.655
71.300
69.771
Microbiologia
9.871
11.971
10.893
Hormonologia
36.935
38.980
37.501
Total
1.003.829
1.047.809
1.032.731
Apesar de haver um crescente nmero de doentes atendidos no servio verifica-se

um decrscimo do nmero de pedidos no ltimo ano. Isto provavelmente est relacionado
com os condicionantes de ordem econmica a que os prprios clnicos esto sujeitos.
2

Controlo de Qualidade

A principal preocupao do laboratrio deve estar relacionada com a qualidade dos

resultados dados ao clnico.
Esta qualidade depende dos procedimentos que se fazem desde a colheita at
obteno do resultado ao longo de trs fases: a Fase Pr-Analtica, Analtica e PsAnaltica(1).
Durante muito tempo os laboratrios focaram-se no controlo dos erros da fase
analtica
(2)
, no entanto actualmente sabido que a maioria dos erros provm da fase pr-
analtica, erros devidos por exemplo colheita, manuseamento e transporte da amostra (1).
A Fase Pr-Analtica

Um erro da fase pr-analtica influencia decisivamente o erro total, e

consequentemente o resultado analtico que o laboratrio d ao clnico. Assim, um
adequado tratamento na fase pr-analtica pode evitar a repetio de provas, colheitas e um
diagnstico incorrecto que conduza a um tratamento inadequado (3).
Os erros da fase pr-analtica so os mais comuns atingindo cerca de 46%-68% dos
erros totais de um laboratrio (4). O preenchimento inadequado do pedido, uma inadequada
preparao do paciente, uso excessivo do garrote, extraco lenta ou difcil ou por via
heparinizada, m identificao da amostra ou um anticoagulante errado, enchimento do tubo
com volume de sangue inadequado, tempo prolongado do transporte, conservao da
amostra a temperaturas inadequadas ou centrifugao incorrecta so alguns exemplos de
erros que podem ser cometidos nesta fase (1).
A fim de reduzir os erros totais, a fase pr analtica deve ter prioridade. Devem ser
desenvolvidos procedimentos prprios, o pessoal deve ser treinado especificamente e deve
haver uma cooperao inter-sectores. A associao de robtica de maneira a inovar o
laboratrio com tecnologia recente tambm uma boa ferramenta para reduzir os erros nas
colheitas e manipulao das amostras (4).

3

A Fase Analtica
A fase analtica corresponde fase da realizao da anlise propriamente dita, sendo

que a manuteno dos equipamentos, a calibrao, o controlo de qualidade e a preparao
das amostras esto compreendidas nesta fase.
Um aspecto relevante a ter em conta nesta fase a hidratao dos reagentes,
controlos e calibradores. Um mau procedimento implica erros fatais no processo analtico
das amostras, na calibrao e nos controlos. ento importante proceder de maneira
correcta e ter todos os cuidados necessrios sua preparao. Um mau funcionamento do
equipamento e falhas no detectadas no controle de qualidade so tambm uma importante
fonte de erros nesta fase (4).
Com o aparecimento da automatizao, os erros da fase analtica tm vindo a
diminuir de forma radical. Esta automatizao ento vantajosa tambm deste ponto de
vista, uma vez que a diminuio de erros leva consequentemente a uma reduo dos custos
j que as repeties so bastante menos acentuadas. Temos como exemplo de outras
vantagens da automatizao o tempo reduzido na anlise dos parmetros, o aumento da
preciso e exactido dos resultados. O laboratrio procura sempre dar o resultado ao
clnico com o mximo de confiana possvel (3).

A Fase Ps Analtica

Esta fase consiste na avaliao final de todos os resultados, que culmina com a
validao biopatolgica, emisso e entrega do boletim analtico. Os erros que resultam desta
fase podem ter origem quando acontece uma falha na comunicao, uma validao errada
dos dados analticos ou uma entrada de dados errada proveniente do sistema (5).

Controlo de Qualidade Interno e Externo

O controlo de qualidade um conjunto de procedimentos postos em prtica no

laboratrio com vista a obter fiabilidade nos resultados das anlises medida que elas vo
sendo executadas (6).
Neste laboratrio existem procedimentos de controlo da qualidade para monitorizar

a validao dos ensaios. Os dados resultantes destes procedimentos so registados de
maneira a que se possam detectar tendncias.
Em todos os sectores feito o controlo de qualidade interno e externo. O controlo
de qualidade interno permite reduzir a impreciso e feito diariamente em todos os
equipamentos utilizando 2 ou 3 nveis de controlo diferentes (Controlo normal, patolgico
nvel 1 e patolgico nvel 2). Utiliza-se tambm sempre que um novo kit ou lote utilizado
bem como quando se verifica alguma tendncia dos resultados. Implica a anlise de materiais
de controlo o mais similares possvel s amostras dos pacientes, assegurando assim a
qualidade dos resultados obtidos, pois efectuado em paralelo com as amostras e em
condies semelhantes, permitindo a validao analtica dos resultados dos pacientes. O
resultado dos controlos expressa-se numericamente e graficamente.
Os valores alvo tericos de cada nvel de controlo encontram-se nas bulas do
respectivo controlo. O laboratrio define os critrios de aceitao e de um modo geral usase a mdia +/- 2 desvios padro. De acordo com clculos estatsticos, este intervalo
representa o intervalo de confiana para o qual existe 95,5% de probabilidade do valor do
controlo estar dentro do intervalo.
No controlo de qualidade externo o laboratrio analisa amostras com valores
desconhecidos provenientes de uma entidade externa acreditada (no caso especfico deste
laboratrio o RIQAS (Randox International Quality Assessment Scheme) e o Instituto
Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge). Este programa permite ao laboratrio medir a sua
capacidade de obter um resultado exacto e comparar os seus resultados com outros
laboratrios equipados com a mesma tecnologia e reagentes, valorizando assim a exactido
do laboratrio.

Escolha dos anticoagulantes

Os anticoagulantes so usados para fazer anlise em sangue total ou plasma. Em geral,

os anticoagulantes tm como principal papel a interrupo da activao da cascata de
coagulao, inibindo a formao da protrombina, impossibilitando a formao do cogulo. A
anlise pode ser realizada em sangue total (ex.: Hemograma), plasma (ex.: Provas de
coagulao) e soro (ex.: Parmetros Bioqumicos e Serolgicos). Quando a anlise
5

realizada em soro, a colheita feita em tubo sem anticoagulante, para que ocorra o
processo de coagulao. Quando se pretende fazer a anlise em plasma ou em sangue total,
a amostra deve ser colhida para tubo com anticoagulante especfico.
As amostras para hemogramas so colhidas em tubos com EDTA-K3 (cido
etilenodiaminotetractico tripotssico) que permite uma estabilidade morfolgica dos
eritrcitos, leuccitos e plaquetas at 24 horas. Este liga-se ao clcio, impedindo a
coagulao. A sua concentrao na amostra de sangue importante, uma vez que se for
baixa h a formao de micro-cogulos, e se for alta provoca variaes morfolgicas nas
clulas sanguneas. Assim a sua concentrao ideal de 1-2 mg/ml de sangue.
Para estudos de coagulao utilizado o Citrato de sdio por preservar os factores
V e VIII. Tambm previne a coagulao por formar um complexo solvel com o clcio,
bloqueando a cascata de coagulao. o anticoagulante mais indicado para os testes de
monitorizao teraputico da heparina e o mais adequado para estudos de agregao
plaquetria. A concentrao tambm importante, sendo a ideal de 1 parte de citrato de
sdio para 9 partes de sangue, pois se se colher menos sangue a proporo de citrato
aumenta. Este aumento pode no ter efeito sobre provas de coagulao em pacientes
normais, mas prolonga os tempos de coagulao em pacientes anticoagulados. Quando se
utilizam vrios tubos de colheita de sangue venoso, o tubo destinado coagulao deve ser
o segundo ou o terceiro para minimizar o efeito do Factor tecidular (FT) libertado com a
puno venosa. essencial verificar a mistura correcta do sangue com o anticoagulante e
inclinar suavemente o tubo, evitando a formao de espuma. A agitao excessiva pode
provocar hemlise. O tubo de sangue citratado pode ser conservado a temperatura
ambiente durante um mximo de 2 horas aps a extraco. As amostras que no cumpram a
proporo de sangue/anticoagulante devem ser rejeitadas bem como as amostras
hemolisadas, j que a hemlise activa a coagulao. O mesmo se deve fazer com amostras
em que o sangue esteja coagulado. Os resultados destas amostras no so, de todo, fiveis(7).

Microbiologia

A este sector chegam vrios tipos de amostras biolgicas, como sejam urina, pus,
hemocultura, expectorao, lquido cefalorraqudeo (LCR), fezes, entre outros, para fazer as
anlises devidas.
Este sector encontra-se subdividido em duas partes. Numa das partes da sala do sector faz-se
a anlise da urina no cobas u 411 da Roche, enquanto que na outra parte feita a pesquisa de
microrganismos e a sua identificao atravs do antibiograma, feito no VITEK 2 Compact 15, da
Biomerieux. O BACTEC 9050 da Becton Dickinson utilizado para as hemoculturas. Conta

tambm com uma cmara de fluxo laminar da Forma Scientific e uma incubadora da mesma
marca. Numa outra sala encontram-se os microscpios onde so feitas as observaes
microscpicas.
Os TACS tm como responsabilidade a recepo das amostras, fazer as listas de
trabalho, verificar os produtos em falta, executar as sementeiras e tratar das urinas,
efectuando os procedimentos necessrios anlise da urina tipo II. J a TSAC que tambm
a chefe do sector, coordena todo o sector, avalia as caixas semeadas nos dias anteriores e
os resultados das identificaes e antibiogramas e faz a respectiva validao biopatolgica.
Tem tambm a responsabilidade de observar microscopicamente os exames a fresco e os
exames corados.
Neste sector foi-me explicada a rotina laboratorial, sendo a minha principal funo
acompanhar a TSAC na observao das placas, observaes microscpicas e validao
biopatolgica dos resultados.

Anlise de urinas
A urina tipo II, tambm chamada de sumria uma anlise feita urina onde so
analisadas as caractersticas fsicas e qumicas desta e o exame microscpico do sedimento
urinrio. Estas amostras de urina devem ser analisadas o mais rpido possvel nunca
passando mais de duas horas entre o tempo de colheita e o tempo da anlise para no
falsear alguns resultados. No Servio de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E. este tempo
bastante reduzido uma vez que as amostras provenientes da sala de colheitas vo quase
imediatamente para o sector de Microbiologia, e as amostras que vm das enfermarias, em
malas trmicas, tambm no tardam a chegar ao sector. De entre as possveis maneiras de
fazer a colheita de urina, a mais usual a colheita do jacto intermdio. importante dar a
conhecer ao doente a forma mais adequada de fazer esta colheita, explicando e dando
7

folhetos com ilustraes. Deve-se desperdiar a primeira mico, e fazer a recolha do jacto
intermdio para um recipiente estril, depois de uma boa higiene. A primeira urina da manh
a amostra ideal pois h maior concentrao de compostos, e no h outras interferncias
provocadas por outros factores. Uma boa higiene tambm factor preponderante,
principalmente no que respeita urocultura, para evitar o aparecimento de contaminao
com flora normal da entrada da uretra.
A urina uma das principais vias de excreo do organismo e a sua anlise pode
oferecer informaes importantes sobre o estado fisiolgico do organismo, sobre a presena
e a evoluo de muitas doenas sistmicas, sobre a avaliao de certos tratamentos e sobre
o estado funcional dos rins.
As fitas usadas para fazer a sumria de urina so lidas no Cobas u 411. Esta leitura
revela-nos informao acerca da densidade, pH, cor e aspecto da urina. D tambm uma
apreciao qualitativa de leuccitos, nitritos, protenas, glucose, cetonas, urobilinognio,
bilirrubina, eritrcitos, classificando como negativo, normal, ou positiva a presena destes
compostos. A densidade deve estar compreendida entre 1,005 e 1,035, o pH entre 4,8 e 8,
pode apresentar vestgios de urobilinognio e bilirrubina, e deve ter um aspecto lmpido,
odor caracterstico e cor amarela. Alteraes nestes parmetros podem indicar leses prrenais, renais ou ps-renais. De seguida a urina centrifugada e a visualizao microscpica
do sedimento urinrio realizada por um TAC, onde realizada a pesquisa de eritrcitos,
leuccitos, bactrias, leveduras, clulas epiteliais, cilindros hialinos e cristais. A presena
destes compostos em grande nmero pode estar associada a diferentes patologias.
Quando um sedimento de urina apresenta alteraes feito um esfregao com esse
sedimento e uma colorao de Gram, para se observar ao microscpio ptico (8).

Bioqumica

Este sector encontra-se dividido em trs partes. Na primeira, as amostras so

recebidas e centrifugadas 10 minutos a 3000 rpm para se obter o soro (o sector conta com
duas centrfugas uma Centra CL3 e uma Centra CL4, ambas da IEC). Ainda nesta zona do
sector existe o que se chama altar de soros onde as amostras esto organizadas j com
etiquetas de cdigos de barras com o nmero correspondente ao nmero do dia. Esta parte
da sala conta tambm um espectrofotmetro Shimadzu UV-120-02.
Numa outra parte da sala, encontra-se a secretria do chefe do sector onde se d a
validao biopatolgica. Nessa sala existe tambm um gasmetro Ciba Corning 855 da
Siemens, RapidChem 744 da Siemens para confirmao de resultados dos ies Na+, K+ e Cl- e
um Reflotron da Roche que utiliza a qumica seca para determinao de vrios parmetros,
de uma forma rpida.
Para determinao da grande maioria dos parmetros bioqumicos existem dois
Cobas c501 que esto ligados em cadeia e um Cobas c311, da Roche. Nesta parte do sector
existem ainda dois gasmetros ABL 555 da Radiometer.
No sector da Bioqumica estudam-se os parmetros bioqumicos que esclarecem o
estado funcional de vrios rgos e vias metablicas.
Foi-me dada a oportunidade de realizar algumas determinaes atravs de tcnicas
manuais. Apesar de j no estarem em uso, permitiu-me adquirir os fundamentos tericos
necessrios compreenso do funcionamento dos equipamentos. Fiz o doseamento de
vrios ies como o cloro, cobre, clcio total, clcio ionizado, ferro, fsforo e magnsio; A
determinao da capacidade total de fixao do ferro; O doseamento de lpidos como o
colesterol, triglicerdeos e fosfolpidos; E ainda outras determinaes como protenas totais,
cido rico e hemoglobina glicada.

Imunologia/Hormonologia
Este sector encontra-se dividido fisicamente em trs salas. A sala principal conta com
vrios equipamentos para a determinao de diversos parmetros. O Immulite 2000 Xpi e o
Immulite 2000 (ambos da Siemens) funcionam agregados a um brao robtico (Versa Cell)
que distribui as amostras pelos dois aparelhos, de modo a rentabilizar o tempo para a
anlise. Existem tambm o Kyrptor da Brahams e o cobas e 411 da Roche. No Konelab
fazem-se a Protena C Reactiva (PCR) e o doseamento de imunoglobolinas. No Liaison da
DiaSorin fazem-se os marcadores cardacos e o Viva E da Siemens utilizado para
doseamento de drogas. Na sala B do sector encontra-se para anlise das protenas sricas o
Hydrasys da Sebia, para a auto-imunidade o Unicap e o contador gama 1272 CliniGamma
CKB Wallac Automatic Gamma Counter, que faz as leituras das amostras tratadas, atravs
de tcnicas manuais, com iodo marcado radioactivamente. Para leitura dos resultados do
iodo urinrio usado um leitor de absorvancias ABE-2 Plus. Nesta sala existe ainda uma
centrfuga refrigerada de modelo Juan BR4i- Multifunction Thermo Electron Corporation, e
uma ultra-centrifuga TL100, da Beckman. Existe ainda uma sala onde se encontram os
frigorficos, uma sala comum onde esto os vestirios e um gabinete do chefe do sector.
Neste sector so efetuados os doseamentos de marcadores tumorais, hormonas e

algumas protenas. Estuda-se tambm o perfil electrofortico e imunolgico das protenas do
soro e realizada a pesquisa de autoanticorpos na seco de auto-imunidade.
As amostras que chegam ao sector com o nmero do dia proveniente da sala de
colheitas, so registadas num programa interno (Omega 3000, da Roche) onde recebem um
nmero associado a um cdigo de barras. As amostras chegam ao sector em tubos
apropriados que permitem a coagulao do sangue e so centrifugadas a 3000 rpm durante
10 minutos. Neste sector existem protocolos internos ( ex: MAM, TI4, etc) onde j esto
inseridos diversos conjuntos de parmetros a dosear, de modo a facilitar o seu registo.
Assim quando se colocam os tubos nos autoanalisadores, e por estes estarem ligados em
rede, os aparelhos iniciam os testes pedidos anteriormente enviando depois o resultado para
o computador central, ao qual o chefe do sector tem acesso para proceder validao
biopatolgica. As amostras seguem um circuito que respeita a seguinte ordem: Immulite
2000, Kryptor, Cobas e 411, Konelab e Liaison.
H que ter em ateno o estado das amostras. No caso de aparecerem amostras
lipmicas os soros tm de ser ultracentrifugados e as amostras hemolisadas podem indicar
10

um tratamento incorrecto da amostra antes do envio para o laboratrio, portanto os

resultados devem ser interpretados com cuidado.
Os parmetros relacionados com a endocrinologia ilucidam acerca da aco, sntese
e regulao de vrias hormonas no organismo. Os parmetros toxicolgicos fazem a
pesquisa de drogas no organismo. Estes parmetros no so abordados neste relatrio,
dando-se apenas enfase aos marcadores tumorais.
Existem determinados parmetros cujos resultados so obtidos a partir de tcnicas
manuais. Enquanto os resultados do iodo urinrio so obtidos atravs da leitura de
absorvncias, todas as outras tcnicas manuais feitas neste sector tm como base a leitura
num contador gama.
Todos os imunoensaios realizados envolvem o uso de anticorpos especficos dirigidos
contra os marcadores tumorais plasmticos. No entanto, estas tcnicas de determinao dos
parmetros analticos podem diferir no princpio do imunoensaio (ensaio competitivo ou
no-competitivo/sandwich) e no mtodo de deteco do complexo antignio-anticorpo
(mtodos radioactivos, fluorescentes, quimioluminescentes, electroquimioluminescentes,
Time-Resolved Amplified Cryptate Emission (TRACE) e imunoturbidimetria).

Princpios dos imunoensaios

Imunoensaio competitivo
Neste tipo de ensaio, o antignio presente na amostra do doente e um antignio
idntico, mas marcado com um radioistopo, um fluorocromo ou outro agente de deteco,
competem pela ligao a um anticorpo especfico.
O antignio marcado misturado com o anticorpo a uma concentrao em que h
saturao dos locais de ligao antignio anticorpo.
De seguida a amostra adicionada, e como o anticorpo no distingue antignios
marcados de no marcados, os dois tipos de antignios vo competir pela ligao ao
anticorpo (se existir antignio na amostra do doente) (Fig. 1).
Figura 1 - Ilustrao de ensaio competitivo
11

Assim, quanto maior for a concentrao de antignio no marcado na amostra,

menor ser a quantidade de antignio marcado que se liga ao anticorpo. H uma correlao
inversa entre a quantidade de antignio marcado ligado ao anticorpo e a concentrao de
antignio presente na amostra. Ou seja, o sinal originado pelo antignio marcado
inversamente proporcional quantidade de antignio presente na amostra biolgica, seja
plasma, soro ou urina (Fig. 2). O ensaio competitivo utiliza-se sobretudo, para pequenos
analitos de baixo peso molecular (9).
Figura 2 Relao entre a concentrao do antignio do

doente e a intensidade do sinal, no ensaio competitivo
Imunoensaio sandwich/ no competitivo

O anticorpo usualmente marcado em vez do antignio. O ensaio decorre em duas etapas.
Na primeira, o antignio presente na amostra reage com um anticorpo especfico (anticorpo
primrio) imobilizado numa matriz insolvel de fase slida, como por exemplo
micropartculas, esferas de latex ou as paredes dos tubos de polipropileno. Em seguida,
adicionado um outro anticorpo (anticorpo secundrio) que reconhece uma regio do
antignio distinta daquela que se liga ao anticorpo primrio (Fig. 3).
Figura 3 Ilustrao de ensaio no competitivo
A intensidade do sinal emitido pelo complexo anticorpo primrio antignio

anticorpo secundrio directamente proporcional quantidade de antignio presente na
amostra do doente (Fig. 4).
12

Figura 4 Relao entre a concentrao do antignio do

doente e a intensidade do sinal no ensaio no competitivo
Este mtodo particularmente til para antignios que no podem ser facilmente
marcados. Utiliza-se vulgarmente para antignios com elevado peso molecular, desde que
possuam duas ou mais regies moleculares que possam funcionar como determinantes
antignicos (antignios divalentes ou polivalentes).

Tcnicas manuais
Radio Imunoensaio e Ensaio Imunoradiomtrico
Nas tcnicas manuais o antignio marcado radioactivamente com um istopo I125,
detectado e quantificado depois num contador gama Automatic Gamma Counter. A
intensidade do sinal medido inversamente proporcional concentrao de antignio na
amostra testada no mtodo RIA. Na tcnica IRMA o anticorpo secundrio que marcado
radioactivamente e detectado pelo mesmo mtodo. A intensidade da radiao ento
directamente proporcional quantidade de antignio presente na amostra do doente (9).
As concentraes nas amostras dos pacientes so calculadas a partir de curvas de
calibrao, elaboradas com padres de concentraes conhecidas.
Estas tcnicas manuais tm cado em desuso nos ltimos anos. Para alm de se
querer evitar o contacto com produtos radioactivos, esta metodologia requer mais trabalho
por parte dos tcnicos, o que pode induzir mais facilmente em erros da fase analtica. No
sector de imunologia do IPOCFG actualmente ainda se usa para uma quantidade significativa
de parmetros (Tab. 3) mas o nmero de amostras no muito elevado, pelo que
normalmente se congelam os soros durante alguns dias at que haja um nmero suficiente
para realizar os ensaios, no desperdiando assim reagentes para as curvas de calibrao. O
facto dos marcadores radioactivos terem uma semi-vida relativamente curta tambm um
inconveniente que vai de encontro ao facto do nmero de amostras no ser elevado,
desperdiando-se assim dinheiro em reagentes. Outro inconveniente o tempo despendido
nestas determinaes. So ensaios demorados que requerem incubaes de algumas horas e
tcnicos com experincia.
13

Todos estes inconvenientes levam cada vez mais ao abandono dos mtodos que
utilizam radioistopos e ao uso mais frequente de mtodos automticos que usam por
exemplo quimiluminescncia e fluorescncia.
Tabela 3 - Tabela indicativa de parmetros feitos por tcnicas manuais no sector de Imunologia/Hormonologia
Produto Biolgico
Parmetro
Aldosterona, Cromogranina A (CGA),
Cromogranina
B,
Metanefrinas,
Normetanefrinas, Testosterona Livre,
Dehidroepiandrostenediona,
Androstenediona, Factor de Crescimento
Insulina-like
Metanefrinas, cido Vanilmandlico, cido
5-Hidroxil-Indol-Actico, Iodo, Cortisol
Soro
Urina
Sistemas automticos de Imunologia

Tal como foi dito anteriormente neste relatrio, a seco de imunologia agrupa uma
srie de auto-analisadores. Os vrios parmetros doseados esto distribudos pelos
diferentes equipamentos que tm diferentes mtodos de deteco dos complexos antignioanticorpo. O mtodo escolhido para dosear os diversos parmetros baseado numa
questo de opo interna com base no rcio qualidade/preo.

Electroquimioluminescncia
Dependendo do analito a dosear, assim o princpio bsico do ensaio: competitivo
ou sandwich.
Tcnica de sandwich/no competitiva
Este mtodo utiliza dois anticorpos, sendo que o primeiro anticorpo est biotinilado
(tem uma molcula de biotina a ele ligado).
Assim, existe uma primeira incubao com a amostra, um anticorpo monoclonal
biotinilado especifico do antignio e um segundo anticorpo monoclonal especfico do
antignio marcado com complexo de rutnio (Ru(bpy)2+3). Estes compostos reagem entre si
e formam um complexo sandwich.
Numa segunda incubao h a adio de microsferas, o anticorpo biotinilado liga-se a
esta fase slida pois as microesferas tm superfcie uma molcula de estreptavidina qual
se vai ligar a biotina que est no anticorpo devido grande afinidade entre a biotina e a
14

estreptavidina. Aqui temos a fase slida: molcula de estreptavidina ligada ao complexo

anticorpo-antignio-anticorpo (10).
Tcnica competitiva
Este mtodo usa apenas um anticorpo e dois antignios. Na primeira incubao a
amostra reage com o anticorpo monoclonal marcado com um complexo de rutnio e
especfico do antignio a dosear. Numa segunda incubao adicionado o anlogo do
antignio, conjugado com biotina e microesferas revestidas com estreptavidina. O anticorpo
marcado com rutnio que no se ligou ao antignio da amostra vai ser capturado pelo
antignio ligado ao complexo biotina-estreptavidina (10).
Nos dois ensaios a mistura de reao aspirada para a clula de leitura, onde as
micropartculas so fixadas magneticamente superfcie do elctrodo, pois o equipamento
tem uma zona magntica que faz com que a microesfera carregada (negativamente) se ligue a
essa zona magntica. Os elementos que no esto ligados so removidos com ProCell. A
aplicao de uma corrente elctrica vai fazer com que haja excitao e transferncia de
electres, induzindo ento a uma emisso quimioluminescente, que medida por um
fotomultiplicador.
H uma reacao redox que acaba por excitar a molcula que emite luminescncia
(Fig. 5) (11).
Figura 5 Esquema ilustrativo do mtodo electroquimioluminescente sandwich
Os resultados so determinados com base numa curva de calibrao gerada

especificamente pelo analisador, atravs de uma calibrao de 2 pontos, e numa curva
principal includa no cdigo de barras dos reagentes.
Esta tcnica tem sido amplamente utilizada devido sua elevada sensibilidade, ao
pequeno volume de amostra necessrio, e aos custos dos testes que so relativamente
15

baixos. No entanto a utilidade da mesma ainda pode ser muito explorada noutras reas.
Desenvolvimentos com o intuito de minimizar o tamanho do equipamento tambm esto a
ser amplamente alargados para que futuramente se possam fazer, por exemplo, deteces
cabeceira do doente (12).
Esta tcnica usada pelo equipamento cobas e 411, da Roche (Fig. 6) que doseia
os parmetros assinalados na Tabela 4.

Figura 6 Cobas e 411, da Roche (www.roche.pt )
Tabela 4 - Analitos doseados

no Sistema Cobas e 411

Parmetro Analtico
Marcadores Tumorais
Antignio Carbohidrato 125 (CA 125),

Antignio Carbohidrato 19.9 (CA 19.9),
Antignio Carbohidrato 72.4 (CA 72.4),
CYFRA 21
Hormonas
FT3, FT4, Paratormona, Insulina, Cortisol Salivar
Outros Parmetros
Vitamina B12, cido flico, peptdeo C,

25- OH- Vitamina D3,
e TRABs (Anticorpos anti-receptores da TSH).
Quimioluminescncia
Nos ltimos anos o imunoensaio quimioluminescente tem ganho cada vez mais
ateno em diferentes campos das cincias da vida, incluindo no diagnstico clnico, devido
sua alta sensibilidade, boa especificidade e a uma ampla gama de aplicaes. Este sistema de
anlise apresenta rendimentos elevados, tempos curtos, baixos consumos de reagentes e
amostras e um custo significativamente baixo (13).
Este mtodo utiliza tambm as tcnicas bsicas sandwich e competitiva. Quando a
tcnica competitiva, o anlogo do antignio a dosear marcado com fosfatase alcalina. No
16

caso de a tcnica ser sandwich o anticorpo secundrio que marcado com o referido
enzima (9).
O sistema Immulite 2000 um analisador que permite a realizao de ensaios
imunomtricos de vrios tipos, por quimioluminescncia. O reagente constitudo por uma
fase slida (prola de poliestireno coberta por anticorpos) e uma fase lquida. A prola
funciona como reservatrio para a reaco imunolgica, incubao, lavagem e
desenvolvimento do sinal de leitura.
Aps incubao com a esfera, a amostra sofre uma segunda incubao com a
fosfatase alcalina. Entre incubaes, o tubo de reaco passa por lavagens sucessivas num
espao de segundos que ocorrem por um sistema de centrifugao, que permite remover
excessos de reagentes. No final deste processo, a esfera encontra-se totalmente desprovida
de molculas no ligadas.
A camada ligada esfera quantificada usando um substrato quimioluminescente
prprio. A reaco quimioluminescente consiste assim na reaco do fosfato de adamantil
dioxetano (o substrato) com a enzima fosfatase alcalina. Esta enzima, que se encontra
associada ao complexo formado na esfera, desfosforila o dioxetano num intermedirio
aninico instvel que emite um foto aquando da sua decomposio. A quantidade de luz
emitida ser detectada pelo fotomultiplicador e quantificada.
A quantidade de luz emitida ser directamente proporcional quantidade de fosfatase
alcalina ligada, nos imunoensaios do tipo sandwish, ou inversamente proporcional no caso
dos ensaios competitivos (14).
A diferena entre competitivo e sandwich no s no nmero de anticorpos. Traduzse tambm porque a empresa que comercializa o teste fez o estudo de sensibilidade e
especificidade. Sandwich mais sensvel mas implica que existam vrios eptopos
imunognicos, ou seja, tem de existir uma molcula suficientemente grande e com eptopos
imunognicos suficientemente bons para que se possa ter anticorpos contra esses locais da
cadeia polipeptdica o que muitas vezes no acontece porque nem todas as protenas so
macromolculas. Nos ensaios competitivos s usado um anticorpo. h competio entre a
protena que se quer dosear e um anlogo que est marcado, podendo usar-se esta tcnica
para protenas mais pequenas que s tenham um local imunognico. Assim, o tamanho da
protena tem importncia na escolha do teste. Muitas vezes a empresa vai preterir o facto da
sandwich ser mais sensvel porque a protena mais pequena por definio tem de seguir para
17

a RIA e a tcnica competitiva perde sensibilidade, na sandwich h dois anticorpos e um

monoclonal, havendo aumento da sensibilidade.
Neste autoanalisador (Fig. 7) so doseados os analitos referenciados na tabela 5.
Figura 7 Sistema Automtico Immulite 2000, da Siemens
Tabela 5 - Analitos doseados no Sistema Automtico Immulite 2000
Parmetro Analtico
Marcadores Tumorais
Antignio Carcinoembrionrio (CEA),

Alfa-fetoprotena (AF), 2-Microglobulina (BMG),
Antignio especfico da Prstata (PSA) Total e Livre
Hormonas
Hormona Tireotrfica, T3 Livre, T4 Livre, T3 Total,

T4 Total, Tiroglobulina (TG), Calcitonina, Paratormona,
Hormona Adrenocortical, Hormona de Crescimento,
Hormona Fulculoestimulante, Hormona Lutenica,
Prolactina, Progesterona, Estradiol, Hormona
Gonadotrfica Corinica, Cortisol,
SO4 dihidro epiandrostenediona, Eritropoietina e
Gastrina
Outros Parmetros
Anticorpos anti - TG, Anticorpos anti-peroxidase,

Factor de Crescimento Insulina-Like (IGF I), IGF 1Binding
Protein (BP3)
TRACE

Trace a tecnologia utilizada pelo equipamento BRAHMS KRYPTOR (Fig. 8).

A base da tecnologia TRACE a transferncia de energia no radioactiva que ocorre
entre dois marcadores fluorescentes.
O dador (criptato) e o receptor, (XL 665 um fluorocromo) tm uma proximidade
fsica necessria para este tipo de interaco. Quando o imunocomplexo se forma, tendo
18

como ponte o antignio, o fluorocromo aceitador eficazmente excitado. A formao do

complexo antignio-anticorpo e a consequente transferncia de energia do criptato para o
XL665 permite o prolongamento temporal e a intensificao do sinal de fluorescncia do
XL665.
A intensidade do sinal obtido proporcional concentrao do antignio. Os sinais
de fluorescncia do aceitador e do dador so medidos simultaneamente a 665nm e 620nm.
Dessa forma pode ser calculada a razo das intensidades da luz emitida em ambos os
comprimentos de onda (665/620), o que permite uma correco directa das diferenas na
transmisso ptica do meio.
Devido a uma anlise cintica das primeiras medies, amostras altamente
concentradas j so reconhecidas pouco depois do inicio da incubao, sendo
automaticamente diludas e depois analisadas novamente.
O antignio a dosear est ligado entre ambos os anticorpos de acordo com o
mtodo sandwich (15;16).
O Kryptor doseia os marcadores tumorais: Antignio Carbohidrato 15.3 (CA 15.3),
Enolase Neuroespecfica (NSE), Antignio do Carcinoma de clulas escamosas (SCC) , CGA
e PSA Total.
Figura 8 Equipamento Kryptor
Imunoturbidimetria
O Konelab (Fig. 9) utiliza a imunoturbidimetria como tcnica para fazer a
determinao de uma grande variedade de parmetros.
Um antisoro especfico adicionado em excesso s amostras. O aumento da
absorvncia causado pela formao de imunocomplexos entre o analitico medido e o
anticorpo especfico, sendo medida at a reaco atingir o seu ponto final. A diferena de
absorvncias tanto maior quanto maior for a quantidade de antignio na soluo (17).
19

No sector de Imunologia este equipmaneto utilizado para a quantificao de
imunoglobulinas e determinao da PCR.
Figura 9 Equipamento Konelab 60i
Marcadores Tumorais
Um marcador tumoral pode ser definido como um amplo espectro de molculas de
caractersticas muitos variveis, produzidas ou induzidas pela clula neoplsica que reflectem
o seu crescimento e a sua actividade (18).
A maioria dos marcadores tumorais no so usados na deteco precoce da
malignidade. Contudo, em pacientes j diagnosticados com doena maligna os marcadores
tumorais so teis na determinao do prognstico prevendo a resposta teraputica e
mantendo a vigilncia aps uma cirurgia. Tm tambm grande utilidade na monitorizao da
teraputica na doena avanada (19).
De acordo com esta definio so muitos os parmetros que podem ser
considerados marcadores tumorais, como sejam enzimas, hormonas, antignios de funo
desconhecida, oncoproteinas, etc. (18).
Seguem-se algumas especificaes acerca dos principais marcadores tumorais
utilizados.

Antignio Carbohidrato 125

uma glicoprotena de elevado peso molecular
(18)
, encontrada em grande
concentrao nas clulas cancergenas do ovrio. Pode ser encontrada em concentraes

elevadas no soro de 80% de mulheres com estdio avanado de tumor no ovrio (20).
Nveis muito elevados de CA 125 podem encontrar-se em patologias associadas a
retenes de lquidos como derrames pleurais e pericrdicos ou sndrome nefrtico.
Aumentos moderados detectam-se em algumas situaes como alguns miomas uterinos,
20

quistos ovricos, peritonites e insuficincia renal. Ainda, pequenos aumentos podem ser
encontrados em mulheres durante a menstruao (18).
O CA125 pode ser usado para diferenciar massas plvicas benignas e malignas numa
mulher ps-menopausica, tendo sido recomendado recentemente pela European Group on
Tumor Markers (EGTM). De acordo com estudos feitos, casos com nveis elevados (> 35
U/mL) de CA 125 devem ser encaminhados para o clnico fazer avaliao peridica (19).
Antignio Carbohidrato 15.3
A molcula detectada no ensaio de CA 15.3 a forma solvel da protena MUC-1 (21).
A sua principal utilidade clinica na monitorizao dos carcinomas mamrios, mas
tambm podem existir nveis elevados em outras neoplasias epiteliais, principalmente em
carcinomas ovricos, tumores do endomtrio e carcinomas do pulmo de clulas pequenas.
Pequenos aumentos podem detectar-se em algumas situaes benignas principalmente
hepticas e renais (18).
O CA 19.9 o principal marcador do carcinoma do pncreas e do carcinoma das vias
biliares, tornando-se tambm o padro para prever uma recidiva do tumor pancretico
durante o follow-up
(22)
. No entanto este marcador tem limitaes importantes. No um
marcador especfico do cancro do pncreas e os nveis de CA 19.9 podem estar elevados

noutras condies benignas como a colestase. Alm disso, h tambm pacientes com cancro
pancretico que tm nveis indetectveis de CA 19.9 (23).


O CA 72.4, em associao com o CEA, o marcador de primeira escolha para o
carcinoma do estmago. Aparece aumentado no carcinoma do ovrio, juntamente com o
CA 125 (24).
Este marcador tem uma especificidade muito elevada, detectando-se poucos falsos
positivos (18).
CYFRA 21.1
O CYFRA 21.1 um marcador tumoral sensvel no cancro do pulmo nomicroctico ou seja no Non-Small Cell Loung Cancer (NSCLC). til na clnica para fazer a
monitorizao da terapia e acompanhamento de doentes que padecem deste cancro
(25)
Pode apresentar um aumento no especfico em situaes de hepatopatias e insuficincia

renal (26).
21

Enolase Neuro Especfica

A NSE uma enzima glicoltica normalmente presente nos neurnios, tecidos
nervosos
perifricos
tecidos
neuroendcrinos.
Tem
utilidade
para
fazer
acompanhamento e controlo da terapia no cancro do pulmo de pequenas clulas. Tambm

tem funo de marcador tumoral em alguns tumores de origem neuroendcrina podendo
ser assim usada para acompanhamento e controle da terapia em neuroblastomas (26).

Antignio do Carcinoma de Clulas Escamosas

O SCC no um marcador tumoral muito especfico, podendo ser detectado em
tecidos escamosos normais como sejam o crvix, a vagina, a vulva, o esfago, etc. No
entanto o SCC til na detecao de recidiva do cancro do colo do tero, do esfago e do
pulmo (aplica-se ao carcinoma que no afecta as pequenas clulas do pulmo, NSCLC) (18).

Antignio Carcinoembrionrio
O CEA utilizado na vigilncia de pacientes diagnosticados com cancro colorrectal.
tambm um marcador complementar, quando associado a outros marcadores tumorais, dos
carcinomas da mama, pulmo, ovrio, estomgo, pncreas, tiride e fgado (19).
Pequenos aumentos deste marcador tumoral podem ser encontrados em indivduos
fumadores e em situaes benignas como a cirrose heptica, insuficincia renal, colite
ulcerosa e quistos ovricos (18).
Este marcador til para ajudar a definir o estadiamento da doena maligna. Permite
efectuar o controlo da evoluo da doena e a avaliao da eficcia teraputica.

Alfa-fetoprotena
A AFP uma glicoprotena com uma composio proteica muito similar albumina.
o marcador de carcinomas hepatocelulares, e em associao com a -hCG o marcador dos
tumores germinais. Usa-se no seguimento da terapia e monitorizao do curso dos referidos
tumores. Aumenta inespecificamente em muitas patologias hepticas no neoplsicas como a
cirrose heptica, hepatites agudas e crnicas, e tambm em neoplasias gastrointestinais (18).

Subunidade Beta da Gonadotrofina Corinica Humana

A -hCG a fraco beta da hormona gonadotrofina corinica humana, juntamente
com a AFP o marcador de tumores trofoblsticos e neoplasias germinais do testculo e
ovrio.
22

Faz diagnstico diferencial em tumores germinais: no coriocarcinoma puro e em tumores do

saco vitelino. Permite avaliar a eficcia do tratamento. Existem falsos positivos numa situao
de gestao (27).
2-microglobulina
Marcador tumoral do mieloma mltiplo, do linfoma de clulas B e da leucemia
linfoctica crnica. Pode ser utilizada para fazer o prognstico da progresso da doena e a
monitorizao do tratamento. Para interpretao dos resultados a funo renal deve ser
sempre considerada pois em situaes de insuficincia renal existe um aumento deste
marcador (28).
Cromogranina A
A CGA uma protena presente em vrios tecidos neuroendcrinos. um marcador
tumoral com utilidade em neoplasias endcrinas, tipo feocromocitoma, sndrome carcinide,
carcinoma medular da tiride, adenoma hipofisrio, carcinoma de clulas dos ilhus do
pncreas e na neoplasia endcrina mltipla.
Os nveis de CGA srica esto elevados em 56 a 100% dos pacientes com tumores
carcinides, e estes nveis correlacionam-se com o tamanho do tumor. Os nveis plasmticos
de NSE tambm so usados como marcadores para os tumores carcinides, mas so menos
especficos que a CGA, estando elevados somente em 17 a 47% dos pacientes (29).

Antignio Especifico da Prstata

O PSA o marcador tumoral do carcinoma da prstata, e dos poucos marcadores
tumorais que podem ser utilizados como elemento de diagnstico, e usado no rastreio (30). O
PSA circula ligado a protenas inibidoras das proteases sricas, permanecendo uma pequena
fracco no estado livre (PSA livre). A percentagem de PSA livre varia em funo da patologia
prosttica, sendo menor em pacientes com cancro da prstata do que indivduos normais ou
com patologia benigna (18).
A percentagem de PSA livre, calculada pela frmula
[!"# !"#$%]
[!"# !"!#$]
! 100, permite
distinguir duas situaes clnicas. O rcio menor em doentes com cancro, comparado com
aqueles portadores de hiperplasia benigna da prstata (HBP). Este conceito assume especial
importncia nos valores de PSA total entre 2,6 e 4 ng/ml, permitindo aumentar a
especificidade em 20 a 40%, com perda moderada de sensibilidade (5-10%). Utilizando este
teste evita-se a realizao de bipsias desnecessrias. Na prtica, em cada cinco bipsias
23

negativas efectuadas, uma ou mais podero ser evitadas pela sua utilizao. O uso combinado
do PSA livre com o PSA total revela-se muito til na deteco de carcinomas da prstata
clinicamente significativos, sobretudo usando um cut-off de PSA total mais baixo (30).

Calcitonina
A Calcitonina o marcador tumoral das clulas C da tiride, sendo que altos nveis
podem sugerir carcinoma medular da tiride. Os nveis de calcitonina podem relacionar-se
com a extenso da doena, nomeadamente com o volume do tumor e a presena de
metstases. til como auxiliar de diagnstico, para monitorizao do tratamento e
prognstico. Pode apresentar uma concentrao elevada em casos de insuficincia renal,
doenas pulmonares, pancreatite, hiperparatiroidismo, anemia perniciosa, e doena de
Pagets (31).

Os valores de referncia dos marcadores tumorais variam consoante o equipamento

utilizado. H que ter ento em conta, na validao dos resultados, qual o sistema automtico
em uso. Daqui tambm se revela a importncia que tem um paciente que est em follow up,
fazer os testes sempre no mesmo laboratrio, para que se possa monitorizar o doente.

Electroforese no sistema Hydrasis

Para fazer a electroforese de protenas sricas utilizado no laboratrio o aparelho
semi-automtico HYDRASYS. O sistema HYDRASYS destina-se separao electrofortica
em gis de agarose e permite realizar todas as sequncias at obteno do gel para
interpretao qualitativa, comeando na aplicao das amostras, passando pela migrao
electrofortica, secagem, aplicao de corante, remoo de corante e secagem final.
Seguidamente, as bandas obtidas so quantificadas por um sistema de digitalizao, atravs de
densitometria. Ao utilizar gel de agarose obtem-se uma resoluo das bandas muito melhor
do que com acetato de celulose (32).
Neste laboratrio existem kits para realizar proteinogramas, imunofixaes, pesquisa
de protena de Bence Jones, separao de hemoglobinas, identificao e quantificao de
diferentes isoenzimas da fosfatase alcalina, e a separao das 5 isoenzimas da lactato
desidrogenase (LDH). No entanto aqui vou especificar apenas o que se usa mais na rotina
laboratorial.
24

O produto biolgico usado o soro que se obtm atravs da centrifugao do

sangue total, colhido sem anticoagulante, durante 10 minutos a 3000 rpm.

Electroforese de protenas sricas

A electroforese de protenas sricas um mtodo que permite separar protenas do
plasma humano em fraces, com vista deteco de anomalias no perfil proteco. A
interpretao que daqui resulta til para a investigao e diagnstico de diversas doenas
(33)
. tambm uma ferramenta til na monitorizao de alteraes malignas, indica processos
inflamatrios agudos e crnicos, doenas hepticas, deficincias de anticorpos, diferencia

gamapatias monoclonais e policlonais, para alm de permitir monitorizar respostas terapia
(34)
.
Esta tcnica baseia-se nos princpios da electroforese de zona executada num suporte
adequado. A agarose tem sido utilizada por ser um meio de suporte verstil e eficaz. Para
determinao na rotina as protenas so separadas apenas em cinco fraces de mobilidade
diferente, de acordo com a sua carga a um determinado pH
(35)
. As protenas separadas so
coradas com negro de amido e o excesso de corante eliminado em meio cido.

As protenas apresentam mobilidade electrofortica diferente, e assim a separao
das protenas permite a formao de bandas denominadas de: albumina, alfa-1-globulina, alfa2-globulina, betaglobulina e gamaglobulina, como se pode ver na figura 10. Da quantificao
resulta um grfico que, em situaes normais semelhante ao da figura 11
(32)
. O
conhecimento dos principais componentes de cada banda electrofortica facilita o raciocnio

clnico e auxilia na identificao de padres electroforticos, caractersticos de algumas
doenas (33).
Figura 11 Grfico de corrida electrofortica normal (33)

Figura 10 Proteinograma em gel de agarose, utilizando o
Hydrasys (32)
25

Intrepertao do proteinograma
Albumina
a protena mais abundante no plasma e corresponde a cerca de 60% da
concentrao total de protenas (36).

A diminuio da concentrao de albumina uma condio altamente inespecfica e
acompanha inmeras doenas. Esta hipoalbuminmia acontece em situaes que promovam
a sua perda (por meio dos glomrulos renais e intestinos), baixa ingesto proteca, em
situaes de elevado catabolismo (infeco bacteriana grave, neoplasias malignas, insuficincia
cardaca congestiva, doenas inflamatrias e infecciosas crnicas), ou em situaes de sntese
prejudicada como sejam a cirrose heptica e hepatite viral. O aumento desta protena
acontece em casos de desidratao devido a uma perda consecutiva de gua (sudorese
excessiva, diarreia, vmito) (32).

-I Globulinas
Este grupo constitudo por um conjunto de vrias protenas, de entre as quais a 1antitripsina que corresponde a 90% do pico normal da 1-globulina.
Em geral h um aumento desta fraco em processos inflamatrios, infecciosos e
imunes de forma inespecfica (so protenas de fase aguda) (33).
Esta protena codificada por dois alelos denominados M e Z. Pacientes com
homozigotia Z geram um decrscimo nos nveis sricos de 1- antitripsina o que leva a um
elevado risco de desenvolver doena pulmonar, e est tambm relacionado com uma forma
progressiva de cirrose (37).
Assim diante da ausncia ou diminuio deste pico so necessrios testes mais
especficos.
-2 Globulinas
A banda alfa-2 constituda por um grupo variado de protenas, entre elas a haptoglobina, a
alfa-2-macroglobulina, a ceruloplasmina, a eritropoetina e a colinesterase. Estas protenas so
tambm protenas de fase aguda, podendo aparecer aumentadas em presena de infeco,
processos inflamatrios e imunes.
A -2-macroglobulina e a haptoglobina correspondem maior parte desta banda.
A haptoglobina migra mais lentamente que a -2-macroglobulina e tem funo de se
ligar hemoglobina circulante, permitindo que o complexo haptoglobina-hemoglobina seja
26

rapidamente removido. Num quadro de hemlise intravascular, onde h um importante

gasto desta protena, os nveis esto diminudos.
A -2-macroglobulina uma das maiores protenas globulnicas presentes no plasma
e a sua concentrao pode elevar-se 10 vezes ou mais na sndrome nefrtica, quando so
perdidas as outras protenas de peso molecular mais baixo (33).

Globulinas
Esta banda composta por um grupo heterogneo de protenas, de onde se
destacam as beta-lipoprotenas, a transferrina e o componente C3 do complemento.
Pode acontecer diminuio desta banda devido a insuficincia hepatocelular ou
desnutrio, mas normalmente raro. O aumento pode estar relacionado com anemia
ferropriva (1 aumento da sntese de transferrina com padro electrofortico mais
rpido)(33), pode tambm haver uma hiperglobulinmia 2 devido a por aumento do
componente C3 do complemento de origem inflamatria ou secundria a uma obstruo
biliar intra ou extra heptica. A presena de protena de Bence-Jones, a qual tambm pode
migrar na zona, tambm pode fazer aumentar a banda (38).

Gama Globulinas
Esta fraco constituda por imunoglobulinas que so os anticorpos produzidos
pelos plasmcitos, quando estimulados por antignios ou devido desordem clonal maligna
dessas clulas
(33)
. H diferentes classes, todas elas formadas por duas cadeias pesadas (IgG,
IgA, IgM, IgD ou IgE, correspondendo a IgG a 80% das gamaglobulinas
(34)
) e duas cadeias
leves (kappa ou lambda) (33) (Fig. 12).
Figura 12 Principais protenas encontradas em cada fraco

electrofortica (com destaque para as Igs) (33)
27

Apenas a IgG apresenta migrao por toda a banda da fraco de gamaglobulinas.
Assim, as alteraes nessa banda reflectem o que ocorre com esta imunoglobulina. A IgA
encontra-se na rea de juno com a fraco betaglobulina. A IgM, por sua vez, migra na
regio localizada entre a IgA e a IgG e detectada quando estimulada (infeces agudas) (32).
Gamapatias policlonais
O aparecimento de um pico policlonal representa uma resposta imunolgica de
diversos clones plasmocitrios a determinado estmulo antignico. Este padro aparece
como aumento difuso da fraco gama, representado pela presena de uma curva de base
larga, demonstrando assim a produo de todas as classes de imunoglobulinas. Os estmulos
podem ser inflamatrios, imunes ou infecciosos.

Gamapatias monoclonais
As gamapatias monoclonais, constituem um grupo de patologias caracterizado pela
proliferao de um clone de clulas plasmticas que produz uma protena monoclonal
(protena M)
(39)
. Produzem e secretam imunoglobulina (Ig) ou fragmentos de Ig, que resulta
num aumento homogneo da fraco gama, levando produo de uma curva de base
estreita conhecida como pico monoclonal. A identificao do componente monoclonal
essencial para o diagnstico, o prognstico, o tratamento e a avaliao da eficcia do
tratamento das gamapatias monoclonais (40).
Podem ento existir hipergamaglobulinmias monoclonais, presentes em doenas
linfoproliferaticas, tais como a gamapatia monoclonal de significado indeterminado, mieloma
mltiplo, amiloidose e macroglobulinmia de Waldenstrom
(41)
. Hipergamaglobulinmias
policlonais todas as vezes que se verificar uma reaco inflamatria, imune ou infecciosa. A
hipogamaglobulinmia verificada em anomalias congnitas, em processos patognicos que
trazem destruio do sector linfide, numa variao de cadeia leve do mieloma mltiplo
(existncia de protenuria de Bence Jones), e pode ser secundria a corticides,
imunossupressores, quimioterapia ou radioterapia. Em situaes de cirrose alcolica pode
ser observada uma ponte beta-gama (38).
De acordo com estudos realizados a mdia de idades onde so diagnosticadas
gamapatias monoclonais de 65 anos, em que apenas 2 a 4% dos casos totais se apresentam
em pessoas com idade inferior a 40 anos. A proporo Homem/Mulher de 2:1 (42).
28

Apesar do mieloma mltiplo ser o prottipo da gamapatia monoclonal, a desordem

mais comum das clulas plasmticas a Gamapatia Monoclonal de Significado Indeterminado
(GMSI), onde encontrada uma imunoglobulina monoclonal no soro com uma concentrao
inferior a 3 g por decilitro, com ausncia de leses sseas, anemia, hipercalcmia e
insuficincia renal relacionada com a proliferao monoclonal das clulas plasmticas. Um
paciente com GMSI requer um follow-up ilimitado, pois existem factores de risco para que
evolua para uma condio maligna (43).

Imunofixao
Aps a deteco de um pico ou banda monoclonal numa electroforese de protenas,
dever ser realizada uma imunofixao para confirmar a presena de protena M e identificar
o tipo de cadeias presentes (41).
As protenas so separadas por electroforese em meio alcalino (pH 9,1) e depois
imunoprecipitadas com antisoros de especificidades diferentes: anti-cadeias pesadas gama (Ig
G), alfa (Ig A) e mu (Ig M), e anti-cadeias leves kappa e lambda (livres e ligadas). Aps
imunofixao, as protenas imunoprecipitadas so coradas com negro de amido ou violeta
cido. O excesso de corante eliminado em meio cido (44).
Na presena de componente monoclonal identificada uma banda bem definida
associada a uma classe de cadeia pesada (IgM, IgG e IgA) e uma banda com o mesmo padro
de migrao em relao s cadeias leves (kappa e lambda), como possvel observar na
figura 13 (38).

Figura 13 Imunofixao srica de pacientes com

gamapatias monoclonais IgG kappa e IgA lambda (38)
Em alguns casos, as clulas produzem apenas cadeias leves livres, geralmente

detectadas na urina e conhecidas como protenas de Bence-Jones (42).
29

Segundo vrios estudos, as cadeias pesadas com mais prevalncia so a IgG (em mais
de metade dos casos), seguindo-se a IgM e a IgA. Em relao s cadeias leves, as cadeias
kappa ocupam o lugar de maior prevalncia com aproximadamente 60% dos casos, contra as
cadeias lambda com aproximadamente 40% (42; 43).

Alguns exemplos prticos de Gamapatias

Estes exemplos so casos que foram estudados no sector de Imunologia do Servio
de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E. durante o meu perodo de estgio.
Caso 1
No proteinograma (Fig. 14) verifica-se
a presena de uma banda monoclonal na zona
gama, que corresponde a um pico que se
pode encontrar no grfico. Apesar das
percentagens
protenas
das
estarem
diferentes
dentro
classes
dos
de
valores
normais, bem como o valor absoluto das

mesmas, a presena desta banda monoclonal
necessita que se faa uma imunofixao srica
(Fig. 15).
Figura 14 Electroforese de Protenas do Caso 1
O resultado da imunofixao revelou a

presena de uma banda monoclonal IgA Lambda.
Figura 15 Imunofixao de proteinas sricas

realizado no Caso 1
30

Caso 2
O traado electrofortico (Fig.
16), revelou a presena de duas bandas
monoclonais. Como visvel no grfico
h uma biclonalidade da zona gama. Podese
verificar
decrscimo
tambm
no
valor
que
de
um
albumina,
compensado pelo aumento dos valores

da alfa-1, mas estas diferenas no so
significativas. As duas bandas monoclonais
foram posteriormente caracterizadas por
imunofixao (Fig. 17).
A imunofixao revelou a presena de um

banda IgG Lambda e uma IgG Kappa.
Figura 17 Imunofixao de proteinas sricas
realizado no Caso 2
31

Caso 3
Nesta anlise de protenas sricas
(Fig.18), pode-se ver um aumento das
fraces alfa-2 e beta e uma diminuio na
fraco gama. Apesar de no se ver
alterao na banda gama, a alterao dos
valores implica que se faa imunofixao de
protenas sricas para averiguar (Fig. 19).
Figura 19 Imunofixao de proteinas

sricas realizado no Caso 3
Verifica-se a presena de uma banda monoclonal IgA Kappa associada e uma cadeia
Kappa sem correspondncia. Quando no existe correspondncia de cadeias leves o
procedimento que se segue fazer a pesquisa de protena de Bence Jones e tambm da IgD
e IgE (Fig. 20).
Figura 20 Pesquisa de Bence Jones no Caso 3
No so encontradas IgE e IgD, mas consegue-se ver a correspondncia de cadeias

leves livres Kappa.

32

Hematologia
Este sector encontra-se dividido em duas salas. Na sala principal so feitos os
hemogramas no LH 750 da Beckman Coulter, a velocidade de sedimentao (VS) no Alifax
Test 1 BCL, bem como os esfregaos que so necessrios e as respectivas coloraes. Numa
segunda sala pertencente ao sector, so feitas as provas de coagulao no TOP500 da
Instrumentation Laboratory, e a citometria de fluxo no citmetro FC500 da Beckman
Coulter. Existe ainda um termociclador, Gene Xpert, para pesquisa do gene de fuso BcrAbl e factor V de Leiden. Para a realizao dos hemogramas, velocidade de sedimentao e
provas de coagulao existem dois equipamentos de cada, alternando-se diariamente o uso
destes.
Durante o perodo que permaneci neste sector integrei a rotina do mesmo
manuseando os diferentes equipamentos que equipam o Sector de Hematologia, tanto ao
nvel do processamento de amostras como na sua manuteno. Da rotina do sector fazem
tambm parte a execuo e observao de esfregaos de sangue perifrico, onde participei
activamente. Para alm das tcnicas de rotina pude tambm contribuir para a execuo de
amostras por citometria de fluxo, nomeadamente na sua marcao atravs de anticorpos
monoclonais.
A Hematologia uma rea com extrema relevncia para os clnicos, pois aborda o
estudo de clulas sanguneas e sua produo. Para alm de estudar o estado de normalidade
dos elementos sanguneos e dos rgos hematopoiticos, estuda tambm as doenas com
eles relacionados
(7)
. Neste Servio a rea de Hematologia reveste-se de uma acentuada
importncia, pois estando o Servio integrado num Hospital Oncolgico existe a necessidade
de avaliao de doentes previamente aos tratamentos, para que assegure as condies de
suporte por modo a evitar reaces adversas nefastas.
O sangue composto por clulas sanguneas em suspenso no plasma. Estas clulas
tm um tempo de vida limitado estando continuamente a ser substitudas por novas clulas
produzidas num processo conhecido por hematopoiese, que ocorre no estroma da medula
ssea. A clula estaminal hematopoitica pluripotente est na base de todas as clulas
sanguneas e quando se multiplica origina clulas com as mesmas propriedades e clulas
diferenciadas em duas linhagens: clula estaminal linfide (linfcitos T e B) e clula estaminal
mieloide. A clula estaminal mielide diferencia-se, originando neutrfilos, eosinfilos e
basfilos que so granulcitos, moncitos, eritrcitos e plaquetas. Citocinas e factores de
33

crescimento suportam a sobrevivncia, proliferao e diferenciao de cada tipo de

clula(45;46).

Procedimentos de rotina no Sector de Hematologia

Hemograma e Esfregao Sanguneo
Das normas do Servio fazem parte a identificao das amostras colhidas em tubo de
EDTA-K3 com recurso a um nmero dirio, usando etiqueta de cdigo de barras, para fcil
leitura nos equipamentos automatizados. no equipamento automtico LH 750 da Beckman
Coulter que se faz a contagem das clulas sanguneas: eritrcitos, leuccitos e plaquetas,
assim como o doseamento da hemoglobina.
Sempre que necessrio efectuado esfregao de sangue perifrico e a observao ao
microscpio ptico com contagem manual do diferencial leuccitrio e observao da
morfologia celular.
O hemograma o exame laboratorial mais requisitado e mais completo em
hematologia. Este exame abrange a contagem de clulas brancas, vermelhas, plaquetas e
reticulcitos (quando pedido especificamente pelo clnico), dando assim informaes acerca
do nmero e morfologia das clulas (47).
O aparecimento de sistemas automatizados trouxe vantagens nomeadamente em
relao rapidez de obteno de resultados assim como na reprodutibilidade dos memos.
Assim com o recurso a estes equipamentos possvel uma anlise de um fluxo de amostras
muito maior num curto espao de tempo bem como uma drstica diminuio dos erros da
fase analtica, pois reduz a interveno dos tcnicos durante o processo. A contagem de
clulas por impedncia foi primeiramente descrita por Wallace Coulter em 1956 (48).
O LH 750 da Beckman Coulter utiliza o Princpio de Coulter, que se baseia na
tecnologia VSC (acrnimo de Volume, Condutividade e Disperso), a ferramenta mais
eficaz disponvel para a anlise de clulas sanguneas. Esta tecnologia oferece grande
sensibilidade, especificidade e eficincia.
Para a execuo do Hemograma o equipamento utiliza reagentes como o

Erythrolyse e o Stabilyse que so misturados com a amostra de sangue numa cmara de
mistura orbital para remover as clulas vermelhas, enquanto que os glbulos brancos
permanecem inalterados. O Erythrolyse utilizado para lisar os glbulos vermelhos e o
34

Stabilyse posteriormente adicionado para parar a reaco ltica, deixando os leuccitos

prontos para a anlise.
Esta tecnologia utiliza um citmetro de fluxo modificado para proporcionar mais
informao sobre as clulas no coradas do que possvel usando apenas a disperso de luz.
O sistema contm uma clula de fluxo de cristais de quartzo que permite que os leuccitos
passem um de cada vez no sistema de deteco usando focagem hidrodinmica (Fig. 21).
Figura 21 Esquema de Focagem hidrodinmica utilizado na tecnologia VCS (47)
A tecnologia VCS usa um nico canal que utiliza trs fontes de energia independentes
para detectar at 8192 clulas sanguneas na clula de fluxo. Esta combinao do volume,
condutividade e disperso permite avaliar directamente as 5 classes de leuccitos (49; 50).
O recurso observao de esfregao de sangue perifrico ocorre quando h
caractersticas clnicas que deixam algumas dvidas em relao aos resultados (por exemplo
quando no vai de encontro ao histrico do doente) ou quando h uma anormalidade na
contagem automtica sendo que nestas situaes o equipamento emite alarmes prprogramados
(51)
. O esfregao pode ser feito por um TAC, mas poltica do servio que a
observao microscpica seja feita por um TSAC especialista.

Eritrograma
Eritrcitos
A principal funo dos eritrcitos maduros a oxigenao dos tecidos, realizada
atravs da molcula da hemoglobina. A sua maturao ocorre na medula ssea passando
pelas diferentes fases, desde o proeritroblasto, eritroblasto basfilico, eritroblasto
policromtico, normoblasto, reticulcito e eritrcito. A produo de eritrcitos
eritropoiese estimulada pela eritropoietina que secretada pelos rins.
35

Existem patologias que interferem com a normal eritropoiese provocando variaes
na forma, contedo em hemoglobina e no tamanho dos eritrcitos.

Variao na forma (poiquilocitose): Os eritrcitos normalmente tm forma de disco
bicncavo, contudo podem apresentar outras formas, sendo que se houver uma prevalncia
de algumas destas formas indicativo de algumas patologias. Esta anlise feita atravs da
observao do esfregao de sangue perifrico.
Contedo em Hemoglobina: O contedo em Hb pode variar em situaes
patolgicas. Assim os eritrcitos com nveis normais de Hb designam-se normocrmicos,
sendo hipocrmicos os que apresentam nveis baixos de Hb e por analogia hipercrmicos os
eritrcitos que apresentam nveis elevados de Hb.
Tamanho dos eritrcitos (anisocitose): Normalmente os eritrcitos apresentam um
tamanho uniforme. Contudo podem aparecer eritrcitos mais pequenos (micrcitos) ou
maiores (macrcitos) que o normal. Esta variao no tamanho est, em regra, associada a
patologias. Os micrcitos podem surgir por exemplo em anemias por deficincia de ferro ou
anemias hemolticas. Os macrcitos aparecem associados a patologias hepticas, anemias por
deficincia de vitamina B12 ou cido flico e anemias megaloblsticas, entre outras. A
interpretao da variao do tamanho dos eritrcitos deve ter em conta a idade e etnia do
individuo j que os eritrcitos das crianas so menores do que os dos adultos, enquanto
que no recm-nascido apresentam tamanho superior. J os negros tm eritrcitos menores
que os caucasianos (7).
Particularidades dos eritrcitos
Apesar dos eritrcitos poderem apresentar diversas particularidades, vou apresentar
apenas aquelas que tive oportunidade de observar no decorrer do estgio.
Corpos de Howell-Jolly so fragmentos nucleares redondos de cor azul escura
(colorao de Wright), resultantes de DNA condensado, normalmente removidos pelo
bao. Frequentes em anemias hemolticas severas, pacientes com disfuno do bao ou aps
esplenectomia.
Ponteado Basfilo So agregados de RNA sob a forma de grnulos (prpura)
distribudos pela clula. Podem resultar de exposio a algumas drogas, septicmia, algumas
anemias ou queimaduras graves.
36

Formao de Rouleaux Ocorre quando os eritrcitos ficam empilhados. Pode

ocorrer pela presena de altas concentraes de globulinas ou fibrinognio no plasma. Estas
formaes de eritrcitos so encontradas em casos de mieloma mltiplo, macroglobulinemia
e podem tambm ser encontradas na gravidez onde h aumento do fibrinognio. H que ter
ateno para no confundir com artefactos que aparecem nos bordos dos esfregaos.
Aglutinao dos eritrcitos a formao de aglomerados irregulares de clulas.
Pode ocorrer devido formao de cogulos aquando da recolha do sangue. Pode estar
tambm relacionado com anemia hemoltica autoimune em que os eritrcitos esto
revestidos por anticorpos contra eles prprios (7).

Quantificao da Hemoglobina
A hemoglobina, constituinte do eritrcito, responsvel pelo transporte do oxignio
para os pulmes e do dixido de carbono na direco inversa. uma protena tetramrica
composta por 4 cadeias ligadas a um grupo heme. Nos eritrcitos de adultos normais a HgA
constitui cerca de 97% da hemoglobina total, sendo que existe tambm HgA2 e HgF (52).
Como foi referido atrs, quando a amostra de sangue chega ao equipamento
adicionado um reagente de lise dos eritrcitos, permitindo assim a libertao da
hemoglobina e a sua estabilizao, sendo quantificada depois espectrofotometricamente a
525nm. A Hg expressa em grama por decilitro (g/dL) e os valores de referncia variam
com o sexo e idade, sendo mais elevados no sexo masculino.
Hematcrito (HCT)
Corresponde fraco de eritrcitos numa coluna de sangue centrifugada, expresso
em percentagem relativamente coluna total. calculado pelo equipamento segundo a
frmula: !"# =
!"# !"#$
!"
Hemoglobina Corpuscular Mdia (HCM)

Este parmetro representa a quantidade mdia que cada eritrcito possui de
hemoglobina. calculado atravs da hemoglobina e do nmero de eritrcitos segundo a
!" !/!" ! !"
seguinte frmula: !"# !" = !"# (!"#!!"/!")

Valores diminudos de HCM podem encontrar-se em anemias microcticas, e valores
aumentados em anemias macrocticas ou em casos de esferocitose.
37

Concentrao da Hemoglobina Corpuscular Mdia (CHCM)

A CHCM (g/dL) corresponde razo entre a concentrao de Hb e o HCT.
[CHCM= (Hb/HCT) x 100]. Relaciona o nmero e volume dos eritrcitos com o
seu contedo. Este parmetro til para avaliar a cromia dos eritrcitos.

Volume Corpuscular Mdio (VCM)

Este parmetro avalia o tamanho dos eritrcitos, podendo estes apresentar tamanho
superior ou inferior aos valores de referncia, consoante se tratem de eritrcitos
macrocticos ou microcticos, respectivamente. O VCM expresso em fentolitros (fL).

Variao do tamanho dos eritrcitos (RDW)

uma medida de heterogeneidade da populao eritrocitria, onde normalmente
existe uma variao que pode ir at aos 15%. expresso em percentagem e quanto maior o
RDW, maior a anisocitose (7).

Reticulcitos
Os reticulcitos so eritrcitos imaturos no nucleados que conservam ainda restos
de RNA, ribossomas e mitocndrias no seu citoplasma, presentes em grandes quantidades
no citoplasma de percursores nucleados de onde derivam.
Os reticulcitos maturam ao fim de 2-3 dias, e passam para a circulao por
diapedese, a maioria j como eritrcito. Pode acontecer, em certos casos patolgicos, que
os reticulcitos entrem em circulao em maior nmero que o normal, constituindo um
ndice para avaliar o grau de regenerao dos eritrcitos na medula ssea (7).
A contagem de reticulcitos combina a metodologia do Novo Azul de Metileno com
a anlise de grande preciso da citometria de fluxo utilizando a tecnologia VCS. Assim,
fornece uma alta qualidade dos resultados sem a necessidade de utilizar corantes
fluorescentes e sistemas de laser dispendiosos.
Uma pequena poro de sangue incuba em cmara aquecida com soluo de Novo
Azul de Metileno, precipitando o RNA residual que existe nos eritrcitos. Uma poro da
amostra corada transferida para outra cmara juntamente com uma soluo de lavagem
hipotnica de forma a remover a hemoglobina do eritrcito mas preservando a colorao
do RNA dentro da clula. De seguida a amostra processada atravessando a clula de fluxo
38

sendo assim analisada da mesma forma que as restantes clulas, utilizando as trs diferentes
sondas (49).
A percentagem de reticulcitos aumenta na corrente sangunea em vrios tipos de
patologias como anemias hemolticas e sideroblsticas e tambm no caso de hemorragias
crnicas ou agudas. A percentagem de reticulcitos pode diminuir em casos de anemia
aplsica, que representa uma disfuno medular (51).

Plaquetas
As plaquetas so fragmentos de megacaricitos, caractersticos da medula ssea no
sendo usual a sua observao no sangue perifrico. Aps a migrao da medula ssea para o
sangue perifrico, as plaquetas apresentam um tempo de vida de cerca de 10 dias. A sua
principal funo prende-se com a situao hemorragia aps um trauma tecidual, leso
vascular e reparao do endotlio
(50)
. As plaquetas tm grnulos azurfilos que contm
factores de coagulao necessrios ao processo de hemostase. Assim, plaquetas agranulares

no so funcionais (53).
Uma situao de trombocitose (aumento do nmero de plaquetas) pode surgir de
uma situao reactiva, ou estar relacionada com situao de inflamao crnica, hemorragia,
neoplasia ou patologia de plaquetas nomeadamente trombocitmia essencial. A
trombocitopenia (diminuio do nmero de plaquetas) pode ser devida a neoplasias
medulares, infeces virais, alcoolismo crnico, mas tambm aparece como consequncia de
tratamentos de quimioterapia e radioterapia (54), o que se observa com frequncia no Servio
de Patologia Clnica do IPOCFG. Nos casos de trombocitopenia que no so concordantes
com o histrico deve-se verificar a possvel presena de cogulos e observar esfregao de
sangue perifrico para pesquisar a presena de agregados plaquetrios.
Agregados Plaquetrios A activao das plaquetas leva libertao dos grnulos
e consequente agregao plaquetar, o que leva a contagens falsamente diminudas devendo
sempre que se suspeita desta situao observar microscopicamente esfregao de sangue
perifrico. Certos indivduos apresentam imunoglobulinas, que aps colheita provocam a
agregao plaquetar. Nestes casos a colheita deve ser executada a quente, para impedir a
aco destas imunoglobulinas a frio.
Satelitismo Plaquetrio Este fenmeno pode ocorrer devido a alteraes nas
imunoglobulinas de superfcie dos neutrfilos provocadas pelo EDTA-K3. ento, uma
condio in vitro, cuja magnitude se relaciona com o tempo de exposio ao anticoagulante e
39

que se associa exclusivamente ao EDTA-K3. O satelitismo induzido por um factor

plasmtico que leva adeso plaquetar superfcie dos neutrfilos. No apresenta
significado clnico mas pode originar uma contagem de plaquetas incorrectamente diminuda
(7)
.
Leucograma
O diferencial leucocitrio efectuado no equipamento automtico LH 750 da Beckman
Coulter, inclui o nmero absoluto e relativo de neutrfilos, moncitos, eosinfilos, basfilos

e clulas linfoides.
Como j foi referido anteriormente o diferencial leucocitrio gerado atravs da
anlise de eventos que passam numa clula de fluxo, utilizando 3 tecnologias distintas. Uma
que est relacionada com o tamanho das clulas ou volume (impedncia volumtrica), outra
que se relaciona com a complexidade da clula (condutividade que utiliza energia
electromagntica) e uma terceira que relaciona o tamanho da clula com a estrutura
(disperso de luz laser).
O resultado destes dados exposto num grfico histograma a trs dimenses
(VCS), e os clusters so identificados como populaes especficas de clulas, de acordo com
o seu tamanho e complexidade (49).
Nalguns estados patolgicos pode ocorrer um aumento do nmero total de
leuccitos (leucocitose) ou uma diminuio (leucopenia). A frmula leucocitria pois muito
til para a deteco do leuccito que apresenta variabilidade na contagem. Sempre que
existam dvidas em relao ao diferencial feito pelo equipamento efectuado esfregao de
sangue perifrico e observao microscpica com contagem do diferencial leucocitrio e
observao das caractersticas morfolgicas dos leuccitos, recorrendo a um contador
manual, obtendo-se assim o resultado da frmula em termos de percentagem.
Neutrfilos
Os neutrfilos so os leuccitos que existem em maior nmero no adulto. Tm um
ncleo de cromatina densa e segmentada que se divide em lbulos (3 a 5) unidos por pontes
de cromatina. Uma das suas caractersticas o facto de terem grnulos citoplasmticos que
permitem ao neutrfilo exercer as suas funes, de onde se destaca a funo fagoctica
durante o processo de inflamao (55).
Uma diminuio do nmero de neutrfilos (neutropenia) pode ser devida ao uso de
drogas, leucemia, anemia aplsica e a sndromes mielodisplsicos. J um aumento (neutrofilia)
40

pode ter como causa doenas infecciosas e inflamatrias, stress, tabagismo, infeces
bacterianas e patologias da srie mieloide (52).
Basfilos
So as clulas menos numerosas no sangue perifrico normal, representando apenas
1% do total dos leuccitos. O ncleo tem normalmente 2 lbulos cobertos pelas abundantes
granulaes que caracterizam os basfilos (7; 55).
Um aumento de basfilos pode ser um sinal precoce de doena mieloproliferativa.
Est tambm relacionado com leucemias de basfilos e reaces de hipersensibilidade. Da
sua funo faz parte a libertao de histamina no local da inflamao, originando
vasodilatao, o que facilita a migrao dos restantes leuccitos. Nos tecidos diferenciam-se
em mastcitos que se ligam s IgE, quando os alergnios se ligam a este complexo ocorre
desgranulao dos mastcitos conduzindo a reaces de hipersensibilidade imediata (52).

Eosinfilos
O eosinfilo tem um ncleo bi ou trilobulado com cromatina densa e sem nuclolos.
O citoplasma apresenta grnulos que aps colorao pelo mtodo de Wright adquirem cor
alaranjada e assim so facilmente identificados por microscopia ptica. Os eosinfilos
participam dos mecanismos de defesa contra corpos estranhos e parasitas. A maior parte
dos eosinfilos est presente nos tecidos, aparecendo em pouca quantidade no sangue
perifrico
(7; 55)
. As causas mais comuns de eosinofilia so infeces parasitrias e reaces
alrgicas (52).

Moncitos
a maior clula madura do sangue perifrico. Apresenta um ncleo irregular,
citoplasma cinza com grnulos azurfilos finos. O seu destino os tecidos onde se vo
diferenciar em vrios tipos de macrfagos. As principais funes do moncito e do
macrfago so: a defesa contra microrganismos e clulas tumorais; remoo de clulas
velhas e danificadas bem como de protenas plasmticas; participao no metabolismo do
ferro e processamento de antignios para apresentar aos linfcitos (7; 55).
O aumento do nmero de moncitos (monocitose) pode ser devido a vrias
patologias ou estados clnicos como infeces, doenas granulomatosas ou distrbios
41

mieloproliferativos. A monocitopenia pode ocorrer devido a anemia aplsica, algumas

leucemias ou administrao de glucocorticoides (52).
Linfcitos
Os linfcitos so clulas mononucleares, com um ncleo regular e um citoplasma
sem grnulos especficos (7). Existem duas populaes de linfcitos: B e T. Actuam no sistema
imunitrio na resposta s invases por agentes estranhos. Os linfcitos T completam a sua
maturao no timo, onde adquirem a capacidade de reconhecer os diferentes antignios e
controlar a produo de anticorpos. Ao reconhecer um antignio, os linfcitos T estimulam
os linfcitos B a produzir anticorpos especficos para aquele antignio (56).
Velocidade de Sedimentao
A VS considerada um teste no especfico. No entanto, um importante indicador
indirecto da resposta inflamatria aguda, aumentando na presena de infeces e processos
inflamatrios crnicos e agudos
(57)
. Neste laboratrio, usado um mtodo automatizado
para medio da velocidade de sedimentao: Alifax Test 1 BCL (Fig. 22).
Figura 22 Alifax Test 1 BCL
Este equipamento automtico analisa a velocidade de sedimentao globular dos

eritrcitos, no tubo primrio de K3-EDTA. Este parmetro a velocidade em mm/h, a que
sedimentam os eritrcitos no plasma, e depende da sua maior ou menor capacidade para a
agregao, que por sua vez depende da presena de certas protenas que neutralizam as
cargas negativas dos eritrcitos e o efeito de repulso entre si. Esta tcnica realiza-se por
fotometria cintica. Mede ento a velocidade de formao dos agregados de eritrcitos e o
seu tamanho na fase de agregao, nesta fase inicial realizam-se medies da densidade
ptica da amostra num sistema capilar. Um algortmo matemtico transforma a leitura da
densidade ptica da fase de agragao em mm/hora.
42

O controlo de qualidade feito diariamente, bem como a limpeza do equipamento.

Apenas aps estes procedimentos estarem concludos se incia o processamento das
amostras. O controlo de qualidade interno, baseia-se no processamento de trs amostras
com valores conhecidos de turvao, submetidas ao mesmo procedimento de valorizao
das amostras, cujos resultados se devem ajustar a intervalos esperados, de modo que se
verifique a calibrao do equipamento. O kit de controlo tem trs nveis.
Na figura abaixo (Fig. 23) encontra-se um exemplo de um resultado de hemograma e

VS executado no Servio de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E.
Figura 23 Exemplo de Hemograma e VS executado no sector de Hematologia do Servio de Patologia Clnica do

IPO
Tomando esta figura como exemplo possvel observar-se que o hemograma

engloba os diferentes tipos de leuccitos, os glbulos vermelhos e todos os parmetros com
eles relacionados bem como as plaquetas. Estes encontram-se dentro dos valores de
referncia. um exemplo de uma situao no patolgica. O mesmo acontece para a VS.

43

Hemostase
No Servio de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E. o equipamento utilizado para as
provas de coagulao o ACL TOP 500, Instrumentation Laboratory (Fig. 23).
Figura 24 ACL TOP 500, Instrumentation Laboratory
Este equipamento apresenta um menu completo de ensaios para a monitorizao,

avaliao e diagnstico de riscos trombticos e de hemorragia. um sistema de carga
contnua com leitor de cdigos de barras com um tempo de resposta bastante rpido. A sua
tecnologia permite minimizar interferncias de amostras lipmicas e ictricas e est
integrado no laboratrio atravs de uma rede que transmite os resultados para os
computadores centrais do sector onde se procede validao biopatolgica.
A hemostase pode ser definida como o processo pelo qual o sangue se mantm sob a
forma lquida dentro do sistema vascular. um mecanismo de defesa do organismo contra
qualquer forma de hemorragia, que culmina com a formao fisiolgica do cogulo da fibrina.
regulada por factores extravasculares que envolvem os tecidos localizados na periferia dos
vasos e que estam ligados estrutura vascular lesada, onde ocorre um processo de
vasoconstrio reflexa e formao de um cogulo primrio; e intravasculares onde
participam factores plaquetares, protenas plasmticas, fosfolpidos e ies clcio que esto
envolvidos na coagulao sangunea.

Coagulao Sangunea
O processo de coagulao envolve as plaquetas e os factores de coagulao, os quais
aps a leso so activados sequencialmente dando origem quilo a que se designa de
cascata de coagulao". Os inibidores da coagulao, por sua vez, constituem um sistema de
controlo ligando o excesso de factores em circulao prevenindo a formao de trombos.
A reaco central do mecanismo da coagulao consiste na converso da
Protrombina em Trombina (PT). O estudo da coagulao plasmtica in vitro permitiu definir
44

os mecanismos da via extrnseca e da via intrnseca, ambos implicados na formao de

trombina, responsvel pela converso do fibrinognio em fibrina.
A cascata da coagulao pode ser dividida em duas vias: A via intrnseca, em que os
factores necessrios a que a coagulao ocorra esto presentens no sangue, sendo
necessria a sua activao, e a via extrnseca onde substncias (Factor tecidular (FT),
libertado pelos tecidos danificados) normalmente ausentes no sangue so necessrias para
desencadear o incio da cascata. Estas duas vias convergem numa via comum a partir da
activao do factor X.
Na via extrnseca, o factor VII plasmtico (na presena do seu cofactor, o FT ou
tromboplastina) activa diretamente o factor X. Na via intrnseca, a activao do factor XII
ocorre quando o sangue entra em contato com uma superfcie, contendo cargas eltricas
negativas (por exemplo, a parede de um tubo de vidro). Tal processo denominado
activao por contacto e requer ainda a presena de outros componentes do plasma: prcalicrena (uma serinoprotease) e cininognio de alto peso molecular (um cofactor no
enzimtico). O factor XIIa activa o fator XI, que, por sua vez, ativa o fator IX. O fator IXa,
na presena de fator VIII, ativa o fator X da coagulao, desencadeando a formao de
trombina e subsequente formao de fibrina
(58)
. Esta explicao est esquemetaizada na
figura 25.
Figura 25 Esquema representativo do modelo da cascata da coagulao
45

Estudos Coagulativos
So estudos realizados sobre plasma pobre em plaquetas.
Aps colheita de sangue para tubo com citrato de Na+, este deve ser agitado
convenientemente por forma a prevenir a activao da cascata da coagulao com
consequente consumo de factores, o que poderia falsear os resultados obtidos. As amostras
so ento centrifugadas 10 minutos a 3000 rpm, por forma a obter plasma pobre em
plaquetas, com o qual se iro executar os diferentes testes. Este plasma contm todos os
factores de coagulao necessrios formao da rede de fibrina, excepto o Ca2+.
O estudo da coagulao tem utilidade prtica no diagnstico de sndromes
hemorrgicas apesar de no ser totalmente fiel coagulao fisiolgica. No entanto, provas
como o PT e o tempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) permitem detectar a maior
parte das sndromes hemorrgicas devidas a defeitos na coagulao. Apenas o factor XIII no
explorado por estas duas provas (58; 59).

Tempo de protrombina
A determinao do PT permite avaliar alteraes da via extrnseca da coagulao alm de ser
til na monitorizao de doentes com teraputica anticoagulante, nomeadamente
anticoagulantes orais (varfin).
Este teste mede o tempo que uma amostra de plasma pobre em plaquetas e
anticoagulada com citrato de Na+, demora a formar a rede de fibrina, colocando a amostra
em contacto com uma suspenso de tromboplastina tecidular e fosfolpidos exgenos, sendo
o processo iniciado pela adio de Ca2+. O tempo que o plasma demora a formar um
cogulo de fibrina define o tempo de protrombina.
Assim sendo, com este mtodo possvel avaliar funcionalmente, e como um todo
os factores II, V, VII, X e fibrinognio. O TP apresentar-se- prolongado na deficincia de
qualquer um destes factores, bem como na presena de inibidores, como seja o varfin
farmacologico. O TP adequado para:
Controlo da terapia anticoagulante oral;
Diagnstico de deficincias congnitas e adquiridas de factores de coagulao;
Controlo da actividade de sntese heptica, pois estes factores so produzidos

nos hepatcitos.
46

Os valores de referncia para o PT variam de laboratrio para laboratrio pois esto

dependentes dos reagentes, dos lotes dos mesmos e do mtodo de leitura.
Os resultados so expressos em segundos, percentagem e ainda como I.N.R.
(Internacional Normalized Ratio), que compara o reagente utilizado em cada laboratrio
com um internacional possibilitando assim a comparao de resultados de diferentes
laboratrios
(60)
. O valor de INR deve aproximar-se de 1 em situaes normais pois a

!" !"#!"
frmula que permite calcular o I.N.R a seguinte !"# = ( !" !""# !"#$%& )
ISI
, sendo o ISI o
Index de Sensibilidade Internacional, que varia de reagente para reagente e de lote para
lote, estando indicado em cada bula de reagente. O INR teraputico deve variar entre 2 e 3,
sendo sempre estabelecido pelo clnico. Para valores de INR elevados os pacientes incorrem
risco de hemorragia, assim como valores de INR abaixo do estabelecido pelo clnico pode
aumentar o risco de AVC.

Tempo de Tromboplastina Parcial activada

O aPTT, tambm chamado de Tempo de Cefalina Caulino, um processo de
screening na avaliao das alteraes da via intrnseca da coagulao e monitorizao de
doentes com teraputica anticoagulante, nomeadamente anticoagulante endovenoso
(heparina).
Esta determinao consiste em adicionar ao plasma citratado activadores de
contacto, fosfolpidos e ies clcio em excesso promovendo o incio da cascata de
coagulao e culminando com a formao do cogulo de fibrina. O tempo que o plasma
demorar a formar o cogulo de fibrina ser o tempo de activao parcial da tromboplastina.
O aPTT encontra-se prolongado na presena de deficincias nos factores da via
intrnseca (XII, XI, IX e VIII). tambm sensvel, se bem que em menor grau, ao dfice de
factores da via comum (X, V, II e fibrinognio).
O aPTT encontra-se alargado quando existem frmacos com actividade inibitria do
factor IIa, de tal forma que o teste de eleio para o controlo do tratamento com estes
frmacos. Encontra-se tambm alargado na presena de anticorpos antifosfolipdicos,
nomeadamente anticoagulante lpico. Assim um aPTT alargado associa-se a um aumento do
risco hemorrgico (hemofilias por dfice de factores VIII, IX, e XI) e a um aumento do risco
trombtico (anticoagulante lpico) (58; 60).

47

Tempo de Trombina
Mede o tempo em segundos que demora a converso do fibrinognio solvel em
fibrina. Tempos de trombina prolongados ocorrem quando o nvel de fibrinognio se

encontra abaixo dos 75-100mg/dL ou quando estamos em presena de fibrinognio no
funcional. um estudo extremamente sensvel presena de heparina ou produtos de
degradao de fibrina, onde se prolonga marcadamente.

Fibrinognio
O fibrinognio (ou factor I) sintetizado no fgado, para alm de apresentar actividade
essencial formao do cogulo, tambm uma protena de fase aguda que se encontra
aumentada em situaes de inflamao, infeces agudas e neoplsicas.
Nveis baixos de fibrinognio podem encontrar-se em desordens hereditrias tais
como hipofibrinogenemia, afibrinogenemia, disfibrinogenemia e tambm em outras formas
como doenas hepticas, coagulao intravascular disseminada, sndromes fibrinolticos, etc.
O doseamento do fibrinognio no equipamento automtico ACL TOP 500 ,
primeiramente efectuado por avaliao da taxa de aumento da turbidez obtida com o PT da
amostra. Esta directamente relacionvel com a concentrao de fibrinognio no plasma.
Sempre que os valores se encontram fora do intervalo de referncia, as amostras so
automaticamente processadas com recurso ao mtodo de referncia - mtodo de Clauss.
No mtodo de Clauss, quando um excesso de trombina adicionado a plasma, o tempo de
coagulao inversamente proporcional concentrao de fibrinognio plasmtico. O
tempo de coagulao obtido comparado posteriormente com uma preparao de
fibrinognio padronizada.
Os valores de referncia para este mtodo apresentam, para um indivduo normal,
uma concentrao de fibrinognio entre 150-400 mg/dl.

D-dmeros
Do processo de fibrinlise resultam produtos de degradao da fibrina, sendo o
dmero-D um fragmento especfico da rede de fibrina que circula na corrente sangunea
durante alguns dias, aps um acidente trombtico. Os D-dmeros so um marcador de
grande valor para excluir o diagnstico de trombose venosa profunda e embolia pulmonar.

48

Patologias mais comuns associadas coagulao

Hemofilia A
Na hemofilia A existe uma deficiente produo de factor VIII, a nvel heptico
compromentendo-se a normal formao do cogulo de fibrina. Os pacientes portadores de
Hemofilia A apresentam habitualmente alargamento do aPTT. Nestas situaes a anlise
actividade do factor VIII essencial para o diagnstico de Hemofilia A.

Hemofilia B
Como a hemofilia A, a B tambm devida deficincia de um factor de coagulao,
neste caso o factor IX. Clinicamente indistinguvel da hemofilia A e o seu tratamento passa
pela administrao sistmica de factor IX.
Os hemoflicos requerem ateno especial em alguns procedimentos a fim de evitar
hemorragias severas. Certos medicamentos como a aspirina ou outros anti-inflamatrios
com aco antiplaquetria so contraindicados.

Doena de Von Willebrand

A causa mais comum da disfuno plaquetria hereditria a Doena de Von
Willebrand. uma coagulopatia congnita que se manifesta por uma adeso das plaquetas
deficiente e uma deficincia no factor VIII que leva a um alargamento do aPTT. O estudo do
FVW (factor de von Willebrand) essencial na distino entra a Doena de Von Willebrand
e a Hemofilia A (61).

Deficincia de vitamina K
Os factores VII, IX, X, II e a protena S e C dependem da vitamina K para a sua
sntese. A deficincia em vitamina K leva diminuio destes factores e consequente
aumento do PT e aPTT, incorrendo-se risco hemorrgico. A administrao de vitamina K
necessria para corrigir este tipo de desordens (62).

49

Concluses
Foi muito vantajoso para mim realizar o estgio no Servio de Patologia Clnica do
IPOCFG E.P.E. Adquiri conhecimentos no s de cariz prtico mas tambm terico que me
ajudaram a complementar os conhecimentos adquiridos durante a fase curricular do
Mestrado de Anlises Clnicas.
Estar em contacto directo com um servio deste nvel permitiu-me ter a noo de
como se trabalha sempre primando pela qualidade, apesar das condicionantes,
principalmente econmicas a que o servio est sujeito. Mesmo assim, em praticamente
todos os sectores existem dois equipamentos com a mesma funo. Normalmente so
alternados diariamente, para que se tenha a certeza que esto a funcionar de maneira
correcta, assim quando por algum motivo existe uma avaria ou a necessidade de parar um
equipamento o servio continua a trabalhar com a certeza de estar a dar resultados fiveis.
Durante o meu estgio no servio de patologia clnica vrios equipamentos foram
testados, pois o servio prima por excelncia na qualidade dos resultados e por isso
encontram-se habitualmente equipamentos experincia de maneira a avaliar a relao
qualidade/custo e tentar minimizar os tempos de espera.
Este estgio sensibilizou-me principalmente para a responsabilidade que o TSAC tem em
assegurar a qualidade de todo o processo analtico at validao biopatolgica, tendo
sempre um esprito crtico.

50

Bibliografia
1.
Vivek Bhat, Manikchandra Tiwari, et al. Analysis of laboratory sample rejections in
the pre-analytical stage at an oncology center. Clinica Chimica Acta, 2012;413: 12031206
2.
Goswami B, Singh B, et al. Evaluation of errors in a clinical laboratory: a one-year
experience. Clin Chem Lab Med, 2010;48(1):636

3.
Ashakiran S., M.E. Sumati, et al. A study of pre-analytical variables in clinical
biochemistry laboratory. Clinical Biochemistry, 2011;44: 944-945

4.
Giorgio Da Rin. Pre-analytical workstations: A tool for reducing laboratory errors.
Clinica Chimica Acta, 2009;404: 6874

5.
Mario Plebani.
Exploring the iceberg of errors in laboratory medicine. Clinica
Chimica Acta, 2009; 404: 16-23

6.
Xiaofei Lai, M.D., Ping Yang, M.D., et al.
Analysis of Factors Influencing the
Generation of Unqualified Clinical Samples and Measures to Prevent this Generation. Annals
of Laboratory Medicine, 2012; 32:216-219
7.
Bain, Barbara J., Blood Cells, 4th, London, Artmed, 2007
8.
Caleffi, A., Manoni F., et al, Quality in extra-analytical phases of urianalysis, Biochemia
Medica, 2010; 20: 179-183

9.
Kindt T., Osborne B., Goldsby R., Kuby Immunology, 6th edition, W.H. Freeman &
Company, 2006; 147, 148

10.
Roche Diagnostics Corporation: Cobas e411 analyser; 2011; 1-4
11.
Sennikov S., Krysov S., et al., Quantitative analysis of human immunoregulatory
cytokines by electrochemiluminescence method, Journal of Immunological Methods; 2003;

275: 81 88
12.
Wei H., Wang E., Electrochemiluminescence of tris(2,2-bipyridyl)ruthenium and its
applications in bioanalysis: a review; The Journal of Biological and Chemical Luminescence;

2011; 26: 7785
13.
Chen W., ZONG J., Chemiluminescent Immunoassay and Its Applications; Chin J
Anal Chem; 2012, 40: 310

51

14.
Colombier A., Duflo-Leroy A., et al., Analytical evaluation of assays in vitamine B12
and folates on Immulite 2000 Analyzer; Immuno-analyse & Biologie spcialise; 2002; 1:40
47
15.
Moutereau S., , Rymer JC., Kryptor - Evaluation finale en situation de routine; Immunoanal
Biol Spc; 1998; 13: 307-316

16.
Kryptor: Instructions for Use CA 125; BRAHMS ; Version R26; 2011; 1-6
17.
Bogard C., Bouizegarne T., et al., Evaluation de Lanalyseur multiparamtrique
Konelab 60i; Revue Franaise de Laboratoires; 1999; 312: 157-163

18.
Molina R., Filella X., Marcadores tumorales. Estado actual y perspectivas de futuro II.
Hospital Clinico de Barcelona. Roche Diagnostics S.I. 2003

19.
Duffy M. J., Role of tumor markers in patients with solid cancers: A critical review.
European Journal of Internal Medicine 2007; 18: 175184

20.
Daniel L., Clarke-Pearson, M.D., Screening for Ovarian Cancer. The new england
journal o f medicine. 2009;361:170-7

21.
Michael J. D., Evoy D., CA 15-3: Uses and limitation as a biomarker for breast cancer.
Clinica Chimica Acta. 2010; 411: 18691874

22.
Ventrucci M., Pozzato P., Persistent elevation of serum CA 19-9 with no evidence of
malignant disease. Digestive and Liver Disease. 2009; 411: 357363

23.
Hidalgo M., Pancreatic Cancer. The new england journal o f medicine 2010; 362:1605-
17.
24.
Gadducci A., Cosio S., et al., Serum tumor markers in the management of ovarian,
endometrial and cervical cancer. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2004. 58: 2438
25.
Patel J.L., Erickson J.A., Performance characteristics of an automated assay for the
quantitation of CYFRA 21-1 in human srum. Clinical Biochemistry. 2010; 43: 14491452
26.
Holdenrieder S., Pawel J., Nucleossomes, ProGPR, NSE, CYFRA 21-1, and CEA in
Monitoring First-Line Chemotherapy of Small Cell Lung Cancer. Clinical Cancer Research.
2008; 14:7813-7821
52

27.
Caquet, R., Guia Prtico das Anlises Clnicas, 2 Edio, Lisboa, Climepsi Editores,
2004
28.
Palumbo A., Anderson K., Multiple Myeloma, The new england journal of medicine,
2011; 364: 1046-60

29.
Korse C., Taal B., et al., Choice of tumour markers in patients with neuroendocrine
tumours is dependent on the histological grade. A marker study of Chromogranin A,

Neuron specific enolase, Progastrin-releasing peptide and cytokeratin fragments, European
Journal of Cancer,2012; 48: 662 671
30.
Grilo M., Oliveira M.,
Papel do antignio especfico da prstata no rastreio do
carcinoma da prstata, Acta Urolgica 2004; 21; 2: 27-33

31.
Elise R., Routine serum calcitonin measurement in the evaluation of thyroid nodules,
Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, 2008; 6: 941953
32.
Bossuyt X., Bogaerts A., Serum protein electrophoresis and immunofixation by a
semiautomated electrophoresis system. Clinical Chemistry 1998; 44: 944949

33.
Silva R., Lopes A., et al., Seric proteins electrophoresis: clinical interpretation ans
correlation, Revista Mdica de Minas Gerais. 2008; 18: 116-122

34.
Silva D., Teodoro G., Electrophoretic profile of plasmatic proteins: study in children
assisted at the Pediatric Hospital Hosped/ufrn in natal city, RBAC; 2005; 37: 239-242
35.
Wicher J.T., Spence C.E. Serum protein electrophoresis - An out moded test. Ann.
Clin. Biochem., 1987, 24, p. 133 139

36.
Fanali G., Masi A., Human serum albumin: From bench to bedside, Molecular Aspects
of Medicine; 2012; 33: 209290

37.
Snyder M., and Fantz C.R.,
Cirrhosis Originally Diagnosed as Nonalcoholic
Steatohepatitis, Clinical Chemistry; 2008; 54: 13951399

38.
Carrer
D.,
Electrophoresis
immunofixation
of
serum
protein,
illustrated
interpretations. 2rd ed. Laboratoires Sebia 1994;13-99

39.
Kyle R. A.., S. Rajkumar V., Monoclonal gammopathies of undetermined significance.
Best Practice & Research Clinical Haematology; 2005; 18: 689707

53

40.
The International Myeloma Working Group. Criteria for the classification of
monoclonal gammopathies, multiple myeloma and related disorders: a report of the

International Myeloma Working Group. Br J Haematol 2003;121:749-57
41.
Alexanian R, Weber D, Liu F. Differential Diagnosis of Monoclonal Gammopathies.
Arch Pathol Lab Med; 1999;123(2):108-13

42.
Tamimi W., Alaskar A., et al., Monoclonal gammopathy in a tertiary referral hospital.
Clinical Biochemistry; 2010; 43: 709713

43.
Kyle A., Therneau T., Prevalence of Monoclonal Gammopathy of Undetermined
Significance; The new England Journal of Medicine; 2006; 354:1362-9

44.
Keren D. F., "High Resolution Electrophoresis and Immunofixation Techniques and
Interpretation", Butterworth-Heinemann, Woburn, Ma, USA, 2nd ed., 1994, 397 pp

45.
Peixoto D., Dingli D., Modelling hematopoiesis in health and disease, Mathematical
and Computer Modelling, 2011; 53: 15461557

46.
Kaushansky K., Lineage-Specific Hematopoietic Growth Factors, The New England
Journal of Medicine, 2006, 354: 2034 2045

47.
Buttarello M., Quality specification in haematology: the automated blood cell count,
Clinica Chimica Acta, 2004; 346: 45 54

48.
Bacall N., Automated hematology analyzer and the importance of validation of new
equipment in the clinical laboratory, Rev. Bras. Hematol. Hemoter, 2009;3: 218-220
49.
COULTER GENS Clinical Case Studies; Beckman Coulter; USA; 2000
50.
Aulesa C., Pastor I., Validation of the Coulter LH 750 in a Hospital Reference
Laboratory, 2002, Laboratory Hematology 9:15-28

51.
Bain B., et al., Diagnosis from the Blood Smear, The New England Journal of
Medicine, 2005; 353: 498-507

52.
Lichtman M., Kipps T., et al., Williams Hematology, 8th Edition, McGraw-Hill
Professional, 2010
53.
Dav G., et al., Platelet Activation and Atherothrombosis, The New England Journal of
Medicine, 2007; 357: 2482-94

54

54.
Sulai N., Tefferi A., Why Does My Patient Have Thrombocytosis?, Hematology/
Oncology Clinics of North America, 2012; 26: 285301

55.
Greer J., Foerster J., et al., Wintrobe's Clinical Hematology, Vol 2, Twelfth Edition,
Lippincott Williams & Wilkins, 2008; 1896

56.
Bishop G., Hostage B., B lymphocyte activation by contact-mediated interactions with
T lymphocytes, Current Opinion in Immunology, 2001; 13: 278285

57.
Calderon A., Wener M., Erythrocyte Sedimentation Rate and C-Reactive Protein,
Hospital Medicine Clinics, Volume 1, 2012; 3: 313-337

58.
Santasusana P., Bases fisiolgicas y studio de la hemostasia y la thrombosis. Barcelona.
9-86
59.
Franco R., Overview of coagulation, anticoagulation and fibrinolysis, Hemostasia e
trombose, 2001; 34: 229-237

60.
Valerie N.,
Prothrombin Time and Partial Thromboplastin Time Assay
considerations, Hemostasis and Coagulation, 2009, 2: 253263

61.
PeyvandI F., Klamroth R., Management of bleeding disorders in adults, Haemophilia,
2012; 18: 2436

62.
Napolitano M., Mariani G., et al, Hereditary combined deficiency of the vitamin K-
dependent clotting factors, Orphanet Journal of Rare Diseases, 2010; 5:21
55

Relatório Análises Clínicas

Transféré par

Informations du document

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Relatório Análises Clínicas

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Mariana do Rosrio Ramos

(Para efeitos de paginao)

Mariana do Rosrio Ramos

Faculdade de Farmcia da Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio do Mestrado em Anlises

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Enolase Neuro Especfica ............................................................................................................... 22

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Figura 23 Exemplo de Hemograma e VS executado no sector de Hematologia do Servio

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

O estgio curricular realizado teve como principal objectivo a minha integrao na

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Caracterizao do Laboratrio de Estgio

O Servio de Patologia Clnica do IPOCFG E.P.E, situado no edifcio da Oncologia

Na tabela abaixo (Tab. 2) visvel o nmero de parmetros quantificados em cada

Apesar de haver um crescente nmero de doentes atendidos no servio verifica-se

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

A principal preocupao do laboratrio deve estar relacionada com a qualidade dos

Um erro da fase pr-analtica influencia decisivamente o erro total, e

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

A fase analtica corresponde fase da realizao da anlise propriamente dita, sendo

Controlo de Qualidade Interno e Externo

O controlo de qualidade um conjunto de procedimentos postos em prtica no

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Neste laboratrio existem procedimentos de controlo da qualidade para monitorizar

Escolha dos anticoagulantes

Os anticoagulantes so usados para fazer anlise em sangue total ou plasma. Em geral,

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Biomerieux. O BACTEC 9050 da Becton Dickinson utilizado para as hemoculturas. Conta

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Este sector encontra-se dividido em trs partes. Na primeira, as amostras so

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Neste sector so efetuados os doseamentos de marcadores tumorais, hormonas e

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

um tratamento incorrecto da amostra antes do envio para o laboratrio, portanto os

Princpios dos imunoensaios

Figura 1 - Ilustrao de ensaio competitivo

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Assim, quanto maior for a concentrao de antignio no marcado na amostra,

Figura 2 Relao entre a concentrao do antignio do

Imunoensaio sandwich/ no competitivo

Figura 3 Ilustrao de ensaio no competitivo

A intensidade do sinal emitido pelo complexo anticorpo primrio antignio

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Figura 4 Relao entre a concentrao do antignio do

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

Sistemas automticos de Imunologia

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra

estreptavidina. Aqui temos a fase slida: molcula de estreptavidina ligada ao complexo

Figura 5 Esquema ilustrativo do mtodo electroquimioluminescente sandwich

Os resultados so determinados com base numa curva de calibrao gerada

Relatrio de Estgio Mestrado Anlises Clnicas - Faculdade de Farmcia Universidade de Coimbra