UNIVERSIDAD DE

COLIMA
Facultad de Ciencias Qumicas
Qumico Farmacutico Bilogo

Bioqumica ll
Identificacin de catalasa heptica en tejidos animales y
vegetales; aislamiento y medicin de la actividad enzimtica
en eritrocito humanos
Practica No.2
Quinto Semestre

Doctora Nlida Araceli Medina Pineda

Integrantes:
Jonathan Eduardo Gonzlez Anguiano
Juan Manuel Herrera Zamora

Fernando Osuna Lpez

Coquimatln, Colima 10 de Septiembre del 2015

Introduccin
Las especies de oxgeno reactivas como el radical superxido, el radical hidroxilo
y el perxido de hidrgeno (H2O2) se forman durante la reduccin del dioxgeno
en agua. Estas especies pueden daar las protenas, los lpidos y los cidos
nucleicos, por lo que se requieren sistemas antioxidantes eficientes, entre los que
se incluyen ciertas enzimas. El perxido de hidrgeno se forma por la dismutacin
del radical superxido y tambin en la reaccin de algunas oxidasas. Hay varias
enzimas capaces de degradar el perxido de hidrgeno: las catalasas, las
peroxidasas y las peroxirredoxinas (1, 2). Las peroxidasas eliminan el H2O2
usndolo para oxidar otros sustratos. A diferencia de las otras enzimas, que
requieren de un sustrato reducido, las catalasas dismutan el perxido de
hidrgeno. Se han identificado tres grupos de catalasas:
i)
ii)

iii)

Las catalasas mono funcionales, que contienen hemo y estn presentes

tanto en los organismos procariotas como en los eucariotas.
Las Mn-catalasas, que son enzimas hexamricas que no tienen hemo,
tienen Mn en el sitio activo y slo estn presentes en algunos
organismos procariontes aerobios.
Las catalasas-peroxidasas, que tienen actividad de catalasa y de
peroxidasa, contienen hemo y slo estn presentes en las bacterias y
los hongos.

La mayora de los organismos aerobios tienen catalasas mono funcionales. Las

catalasas catalizan la dismutacin del perxido de hidrgeno en agua y dioxgeno
evitando as que se forme el radical hidroxilo y el oxgeno singulete, especies de
oxgeno que son muy reactivas. En el hombre, la catalasa protege la hemoglobina
del perxido de hidrgeno que se genera en los eritrocitos. Tambin tiene un papel
de proteccin en la inflamacin, en la prevencin de mutaciones, evita el
envejecimiento y cierto tipo de cncer. Las mutaciones en el gen de la catalasa
pueden resultar en la enfermedad hereditaria denominada acatalasemia que entre
otros sntomas se reconoce por un incremento en la incidencia de ulceraciones
bucales.
El mecanismo de reaccin

En la reaccin de la catalasa ocurre la transferencia de dos electrones entre dos

molculas de perxido de hidrgeno en la cual una funciona como donador y otra
como aceptor de electrones. El mecanismo de reaccin se lleva a cabo en dos
pasos. En el primero la catalasa se oxida por una molcula de perxido formando
un intermediario llamado compuesto I. El compuesto I se caracteriza por tener un
grupo ferroxilo con Fe IV y un radical catinico de porfirina. En esta reaccin se
produce una molcula de agua (Reaccin 1). En el segundo paso de la reaccin,
el compuesto I es reducido por otra molcula de perxido regresando la catalasa a
su estado inicial y produciendo agua y dioxgeno (Reaccin 2). En ciertas
condiciones el compuesto I puede captar un electrn originando el compuesto II.
El compuesto II tiene un estado de oxidacin intermedio a los observados en el
compuesto I y la catalasa en reposo. Al reaccionar con una molcula de H2O2
forma el compuesto III, que tiene un estado de oxidacin Fe IV. El compuesto II y
el compuesto III son inactivos catalticamente. La catalasa tambin puede catalizar
ciertas reacciones como peroxidasa. En la reaccin de peroxidasa de la catalasa,
el compuesto I puede oxidar el metanol, el etanol, el formato o el nitrato utilizando
una molcula de H2O2 como oxidante. En el cerebro, la reaccin de la catalasa
con el etanol forma acetaldehdo (Reaccin 3), que explica algunos de los efectos
neurolgicos del alcohol en humanos.

Enz (Por-FeIII) + H2O2 Compuesto I (Por+-FeIV-O) + H2O

Compuesto I (Por+-FeIV-O) + H2O2 Enz (Por-FeIII) + H2O + O2
Compuesto I (Por+-FeIV-O) + CH3CH2OH Enz (Por-FeIII) + CH3CHO + H2O

Antecedentes
Las catalasas mono funcionales son de dos tipos: las catalasas con subunidades
pequeas (masa molecular 60 kDa) y las catalasas con subunidades grandes
(masa molecular > 80 kDa). Las primeras (Fig. 1A) se encuentran en los
mamferos, las plantas, los hongos y la mayora de las bacterias y tienen la
caracterstica de unir NADPH y de ser inhibidas e inactivadas por sustrato. La
unin del NADPH es para prevenir la acumulacin del compuesto II y III.
Las catalasas grandes slo estn presentes en los hongos y en las bacterias, no
unen NADPH, tienen un dominio en el C-terminal semejante a la flavodoxina y son
resistentes al H2O2.

Un estudio cintico muestra que la catalasa de hgado de bovino (BLC: bovine

liver catalase), que es una catalasa pequea, se inhibe reversiblemente y se
inactiva irreversiblemente a partir de 200 mM de H2O2, mientras que la catalasa R
de Aspergillus niger, que es una catalasa grande, no muestra inhibicin reversible
e inactivacin irreversible con 2 M de sustrato. La inhibicin reversible de la BLC
se debe a la acumulacin del compuesto III (5). Otra catalasa grande que no se
inhibe reversiblemente y no se inactiva irreversiblemente con altas
concentraciones de H2O2 (3 M) es la Catalasa-1 de Neurospora crassa (CAT-1).
Adems de su resistencia al H2O2, la CAT-1 presenta cooperatividad en altas
concentraciones de sustrato (> 200 mM) (Daz A, Muoz-Clares R A y Hansberg
W. Manuscrito en preparacin).
Para poder entender estas diferencias funcionales es importante conocer la
estructura tridimensional de las distintas catalasas. Estableciendo correlaciones
estructura-funcin se podr desentraar el mecanismo ntimo de la reaccin.
DESCRIPCIN DE LA ORGANIZACIN DE LAS CATALASAS
Las catalasas mono funcionales estn formadas por los siguientes dominios: 1) el
amino terminal, 2) un barril con ocho hebras antiparalelas, 3) el asa envolvente,
4) un dominio de hlices (Fig. 1A) (4) y, en el caso de las catalasas grandes, el
dominio tipo flavodoxina del carboxilo terminal.
El amino terminal comprende desde el primer aminocido hasta el residuo de
histidina esencial cataltico. Esta regin de aproximadamente 60 aminocidos

tiene poca similitud entre las secuencias de las catalasas y se observa como un
brazo torcido que se entierra en las subunidades vecinas. Contiene a la hlice 2
que es el primer elemento de estructura secundaria comn en las catalasas. La
HPII tiene el amino terminal ms largo, con 90 aminocidos. En tres estructuras de
catalasa los primeros aminocidos del amino terminal estn desordenados, en la
SCCA son los primeros 14 aminocidos, en la HPII de E. coli son los primeros 26
aminocidos y en la CAT-1 de N. crassa son los primeros 17 aminocidos (Daz A,
Rudio-Piera E, Arreola R, Horjales E y Hansberg W. Manuscrito en preparacin),
por lo que no se observan en los mapas de densidad electrnica y no se incluyen
en los modelos moleculares.
El barril con ocho hebras antiparalelas es el dominio ms conservado de las
catalasas; se clasifica como estructura + y abarca aproximadamente 260
aminocidos. Las primeras cuatro hebras (1-4) son consecutivas y estn
separadas por tres hlices (3-5) del segundo grupo de cuatro hebras (5-8). La
primera mitad del barril contiene la histidina y la asparagina esenciales del sitio
activo. La continuidad de los puentes de hidrgeno entre las hebras del barril se
pierde entre las hebras 4 y 5 dnde hay slo dos puentes de hidrgeno con la
asparagina esencial. La hebra 5 es irregular porque tiene tres aminocidos
(Ser196, His197 y Thr198 en PMC) que no participan en la hoja . Lo anterior
permite que el amino terminal de la hebra 5 se una a las hebras 4 y 6 para
cerrar el barril . Entre las hebras 6 y 7 hay dos hlices (6 y 7). La segunda
mitad del barril funciona para unir el NADPH en las catalasas BLC, PMC, MLC,
SCCA y HEC. La ltima hlice (8) es una hlice tipo en BLC, PVC, CAT-1 y
posiblemente en todas las otras estructuras de catalasa.
La principal diferencia estructural entre las catalasas pequeas y las grandes es la
presencia, en estas ltimas de un dominio extra en el carboxilo terminal de
aproximadamente 150 aminocidos. ste es un dominio del tipo / formado por
cuatro hlices alfa (15-18) y ocho hebras (9-16) cuya topologa es semejante
a la flavodoxina.

EL GRUPO HEMO Y SU FUNCIN

La localizacin del hemo y su ambiente estn muy conservados en las catalasas.
El hemo no est unido covalentemente y se encuentra enterrado entre el barril y
dos hlices (4 y 12). La distancia del hemo a la superficie del tetrmero es de
aproximadamente 20 . Los grupos propionato del hemo estn enterrados y
estabilizados por puentes salinos con tres argininas conservadas. ( Departamento
de Bioqumica, Instituto de Fisiologa Celular, UNAM. Mxico, D. F. C. P. 04510.
Telfono: 5622 5655, Fax: 5622 5630. Correo E: adiaz@ifisiol.unam.mx. :
http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/20032_LA
%20ESTRUC_.pdf)
(1. Mat MJ, Zamocky M, Nyquir LM, Herzog C, Alzari PM, Betzel C, Koller F y Fita I
(1999) Structure of catalase-A from Saccharomyces cerevisiae. J Mol Biol 286:135149).
(2. Lledas F, Rangel P y Hansberg W (1998) Oxidation of catalase by singlet oxygen.
J Biol Chem 273:10630-10637).

OBJETIVO GENERAL:
Aislar e identificar la presencia de la enzima catalasa y comprobar algunas de
sus propiedades especficas.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
1.- Aislar y comprobar experimentalmente la presencia de la catalasa en diversos
tejidos animales y vegetales.
2.- Demostrar la desnaturalizacin proteica de la enzima catalasa por medio de
calor
3.- Realizar la medicin de la actividad enzimtica de la catalasa en eritrocitos
humanos.
MATERIAL:

8Tubos de ensayo de 13 x 150

1 Gradilla para tubos de ensayo
3 Pinza para tubos de ensayo
1 Mechero Bunsen
1 Mortero con pistilo
2 Vasos de precipitado de 100 ml
1 Vaso de precipitado de 250 ml
5 Matraces Erlenmeyer de 50 ml.
1 Matraz aforado de 100 ml.

1 Pipetas serolgicas de 0.1 ml

2 Pipetas serolgicas de 1 ml
2 Pipeta graduada de 5ml
1 Pipeta graduada de 10 ml.
1 Bureta de 50 ml
1 Soporte universal
1 Pinzas para bureta.
1 Tubos de ensayo de13 x 100 con tapn esmerilado
1 Bao de temperatura constante (100 C) o incubadora (para todo el
grupo)
1 Recipiente para bao de hielo (por equipo)

REACTIVOS:

Agua oxigenada comercial (traer un frasco pequeo el alumno)

AGUA DESTILADA FRA

Acido sulfrico 6 N (250 (ml)
Amortiguador de fosfatos 0.02 M (pH= 7.0) (500 ml)
Permanganato de potasio, 0.005M (500 ml)
Perxido de Hidrgeno 0.05M (250 ml)
Sal di sdica de EDTA al 1% (50 ml) o en su caso tubo Vacutainer con
heparina

MATERIAL BIOLGICO Y ADICIONAL

- Fuentes animales: Hgado (res, cerdo),
- Vegetales: papa, cebolla, col, zanahoria, pepinos.
- Frutas: manzana, pia, pltanos.
- Sangre humana completa obtenida en el momento de realizar la prctica
- Hielo

Desarrollo Experimental:
Para comenzar cada equipo se encargo de hacer un macerado de su fruta o
verdura que les toc (pltano, zanahoria, papa, cebolla, col, pepinos, pia,
manzana) con agua destilada, utilizando un mortero con pistilo y se depositaron
los macerados en vasos de precipitados. De igual manera se hizo con el hgado

de res, para obtener su macerado. Y tambin se realizo la extraccin de sangre

con vacutainer, la cual se coloco con en un tubo con heparina y este se coloco en
hielo inmediatamente.
Para la primera prueba se colocaron 2.5 ml. de macerado de cada fruta, cada
verdura, del hgado y de sangre en un tubo de ensayo diferente cada uno, se
rotularon y despus a cada uno se le agregaron 10 gotas de agua oxigenada y se
observ lo que sucedi al colocar las gotas (generacin de espuma).
Para la siguiente prueba se realiz de igual manera el primer paso, (colocar 2.5
ml. de cada macerado en un tubo de ensayo diferente), luego de tener los
macerados en los tubos estos se rotularon y despus se procedi a tomar un tubo
de ensayo y colocarlo al mechero hasta ebullicin y despus de alcanzar el punto
de ebullicin se colocaron 10 gotas de agua oxigenada y se observo lo que
sucedi (espuma), se hizo el mismo procedimiento con cada uno de los tubos con
macerado.
En la siguiente prueba en un matraz aforado de 100 ml se colocaron 25 ml de
agua destilada fra, se pipeteo exactamente 0.1 ml de la sangre extrada y se
coloco en el matraz aforado con agua destilada fra y se pipeteo varias veces
hasta corroborar que toda la sangre quedo en el matraz, se procedi a agitar el
matraz durante 1 minuto para homogeneizar la mezcla y una vez homogeneizada
la mezcla se aforo a 100 ml con agua destilada fra. Despus de esto se procedi
a colocarla en agua fra para evitar desnaturalizacin de la enzima.
Despus se procedi a preparar cinco matraces de 50 ml segn indica la siguiente
tabla. Todos los matraces deben estar en agua fra pues la reaccin se lleva a
cabo a esa temperatura. Despus de aadir cada reactivo mezclar con
movimientos de rotacin.

Una vez que se tiene todo listo se procedi a titular el H2O2 restante en cada uno de los
matraces con KMNO4 0.005.

Observaciones:
En la primera prueba que realizamos sobre presencia de catalasa en tejidos
logramos observar como dio positiva esta prueba para: papa, zanahoria, pepino,
pltano, manzana, hgado, sangre. Dio positiva debido a que la prueba positiva
consista en observar la creacin de espuma al agregar agua oxigenada.
De igual manera observamos como en cebolla, pia, y col no creo espuma lo que
nos indic que no hay presencia de catalasa en estas pruebas.
Para la siguiente parte de la primera prueba la cual consisti en el mismo mtodo
que la primera parte a excepcin de que antes de agregar el agua oxigenada se
calent cada uno de los tubos de ensayo a punto de ebullicin logramos observar
que todas las pruebas dieron negativo ya que no creo espumar al agregar el agua
oxigenada, esto se debi a que al calentar el tubo el tejido que contena la enzima
se desnaturalizo y perdi la actividad cataltica.
Para la segunda y ltima prueba al momento de titular logramos observar que el
primer matraz necesito 2 ml para virar a color rosa, en cambio los matraces 3 y 4
solo necesitaron 3 gotas para virar a rosa, mientras que el segundo matraz
necesito solo 2 gotas para virar a rosa y el ultimo matraz necesito 4 gotas para
virar a color rosa. Observamos como todos cambiaron a color rosa, y tambin
como al primer matraz se le tuvo que agregar ms gotas para que virara a color
rosa esto debido a que antes de aadir la enzima y titular se aadieron 2ml de
H2S04.

Resultados:
tejidos

pap
a

Ceboll
a

zanahori
a

pepin
o

pltan
o

manzan
a

pi
a

hgad
o

Tejidos
mas
H2O2 a
T
ambient
e
Tejido
mas
calor,
mas
H2O2

Si

no

si

si

si

si

no

si

Sangre
complet
a
si

no

no

no

no

no

no

no

no

no

reactivos
Amortiguador de
fosfatos 0.02 M
(pH)
H202 0.005M
(S)
catalasa
0
centgrados
(inactiva)
catalasa
desnaturalizada
por calor
H2SO4 6N

1(ml)
10

2(ml)
10

3(ml)
10

4(ml)
10

5(ml)
10

.5

.5

.5

.5

.5

2 ml antes
de aadir la
enzima

2
6 minutos

2
despus de

2
aadir la

2
catalasa

Discusiones:
Al analizar los resultados discutimos que la enzima catalasa se encuentra tanto en
tejidos animal como vegetal, ya que ambos producen a causa del metabolismo
perxido que es toxico, y como ya lo aviamos mencionado esta enzima lo
descompone en agua y oxigeno, pero al realizar la practica nos dimos cuenta que
la catalasa esta presente principalmente en los tejidos animales, en este caso fue
el hgado y la sangre ya que al agregar el agua oxigenada comercial mostraba

mayor efervescencia que todos los tejidos vegetales que utilizamos, en los cuales
algunos de estos no presentaron actividad a simple vista tal es el caso de la
cebolla y la pia.
En la prueba de medicin de la actividad enzimtica en el tubo numero uno o
blanco se necesitaron dos mililitros, el cual tericamente nos muestra que es la
actividad mxima de la enzima, en el matraz dos se necesitaron 2 gotas (cada
gota equivale de 0.0648524 ml), en el matraz 3 que tambin lo utilizamos como
blanco para la determinacin de otras sustancias externas a la reaccin utilizamos
tres gotas, en el matraz numero 4 utilizamos tres gotas y finalmente en el matraz
numero 5 utilizamos 4 gotas. Todos los matraces viraron a un color rosa, lo cual
nos dice que es positivo a la prueba.

Clculos:
Fomula.
mol de H2O2 = ml de KMNO4 x 2.5 x 1000

mol de H2O2 iniciales =

ml matraz 1 x 2.5 x 1000 =
2ml x 2.5 x 1000 = 5000

mol de H2O2 restantes =

ml matraz 2 x 2.5 x 1000 =
(.06 x 2) =0.12 x 2.5 x 1000 = 300
ml matraz 3 x 2.5 x 1000 =
(.06 x 3) = 0.18 x 2.5 x 1000 = 450
ml en el matraz 4 x 2.5 x 1000 =
(.06 x 3) = 0.18 x 2.5 x 1000 = 450
ml en el matraz 5 x 2.5 x 1000 =
(.06 x 4) = .24 x 2.5 x 1000 = 600
-sumatoria (300+450+450+600)=1800

mol de H2O2 descompuesto = mol de H2O2 iniciales - mol de

H2O2 restantes. = 5000 1800 = 3200
Actividad enzimtico =mol de H2O2 descompuesto/4x102 =
3200/4x102 = 1280000

Conclusiones:
Con respecto a la tabla uno (superior), concluimos que la actividad cataltica de los
tejidos que presentaron la enzima catalasa al agregar el H2O2 a temperatura
ambiente, ya no mostraban o se perda la actividad cataltica al someter a calor la
enzima por que ocurra un proceso de desnaturalizacin permanente (al enfriar no
regresaban a su actividad enzimtica) y por ende no reaccionaba con el H2O2.
En la tabla dos (inferior) concluimos que la catalasa no cambiaba o no variaba a
pesar que la sometimos o la utilizamos, tanto desnaturalizada por calor, como
inactiva a cero grados centgrados y esto se debe a que a pesar de los cambios
fsicos primarios en ambos casos se dejo agitando la enzima durante unos
segundos lo cual permite que la enzima que no estuviera activa se active y la q
estaba desnaturalizada se re naturalice, y as produce su actividad cataltica.
Bibliografa:
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/enzima-catalasa
http://www.uacj.mx/ICB/redcib/Documents/REB_DOC/2003/06/20032_LA
%20ESTRUC_.pdf
https://es.wikipedia.org/wiki/Catalasa
http://tesisdeinvestigadores.blogspot.mx/2011/05/la-catalasa-enzima.html
Cuestionario:
1.- De acuerdo al tipo de reaccin que cataliza A que grupo de enzimas
pertenece la catalasa?
Peroxidasas
2.- Por qu burbujeaba el hgado al agregarse el agua oxigenada?
Presencia de niveles altos de catalasa
3.- Por qu se usaba (o se usa) el agua oxigenada como desinfectante?

La existencia de catalasa en los tejidos animales, se aprovecha para utilizar el

agua oxigenada como desinfectante cuando se echa sobre una herida. Como
muchas de las bacterias patgenas son anaerobias (no pueden vivir con oxgeno),
mueren con el desprendimiento de oxgeno que se produce cuando la catalasa de
los tejidos acta sobre el agua oxigenada.
4.- Qu tipo de organismos producen la enzima catalasa?
La mayora de los organismos vivos.
5.- Qu podra suceder si el agua oxigenada se le agrega a una colonia de
bacterias?
Las bacterias anaerobias, mueren al estar en contacto con oxgeno, es por esta
razn que el oxgeno producido por esta enzima tiene efecto bactericida sobre
estos microorganismos. Al agregar agua oxigenada a la colonia estas moriran.
6.- Por qu se obtuvieron resultados diferentes en el ensayo 1.1 y 1.2?
Esto se debe a que en el ensayo 1.2 se desnaturalizo la enzima, esto hizo que los
resultados fueran todos negativos en este punto y ninguno diera espuma como
presencia de catalasa.
7.- Investigar en bibliografa las caractersticas qumicas, el nombre
sistemtico y el nmero asignado por la comisin de enzimas para la
catalasa.
Catalasa (perxido de hidrogeno peroxidasa). La catalasa es una enzima
perteneciente a la categora de las oxidorreductasas que cataliza la
descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua. Esta
enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso.
8.- Escribir dos reacciones donde haya formacin de perxido de hidrgeno.
H2O2 + Fe(III)-E H2O + O=Fe(IV)-E
H2O2 + O=Fe(IV)-E H2O + Fe(III)-E + O2

9.- Escriba la reaccin catalizada por la catalasa.

2 H2O2 2 H2O + O2

10.- Escribir en la siguiente tabla los datos y resultados que se indican.

MATRAZ NMERO
1

ml de KMNO4 0.005 M
utilizado
mol
de
iniciales

H2SO4

mol
de
H2O2
descompuestos (en 5
min./5x10-4
ml
de
sangre)
Actividad Enzimtica

11.- Investigue en bibliografa la actividad enzimtica de la catalasa

El perxido de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular de muchos
organismos vivos y tiene como funcin protectora contra microorganismos
patgenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse
rpidamente en compuestos menos peligrosos. Esta funcin la efecta esta
enzima que cataliza su descomposicin en agua y oxgeno.