Recoleccin y Obtencin del frijol Garbancillo.

Se busca el frijol garbancillo, cuidadosamente se excavaban las races y se

colocan en bolsas de polietileno para transportarlas al laboratorio de
Microbiologa. Al final de la recoleccin de las races se obtuvieron los ndulos.

Los ndulos seleccionados pasan por un lavado para su limpieza y esterilizacin

con: agua destilada hasta eliminar la tierra y lodo proveniente del cultivo, una
gota de leja diluida en 1 litro de agua para lavarla y dejarla en reposo durante 3
minutos, lavarla con alcohol de 70 durante 1 minuto para su esterilizacin y
por ultimo enjuagar con agua destilada 3 veces.
Una vez lavados, se muelen los ndulos esterilizados en un mortero hasta formar
una pasta para luego ser sembradas en las placas Petri.

Identificacin y aislamiento de la bacteria Rhizobium Sp.

Para poder identificar la bacteria Rhizobium Sp. se prepara el medio de cultivo
ELMARC, ste medio de cultivo contiene los nutrientes especficos para el crecimiento
y la reproduccin de la bacteria; para la preparacin del medio de cultivo se necesita: D
manitol (10 gr/L), K2HPO4 (0.5 gr/L), MgSO4.7H2O (0.2 gr/L), NaCl (0.1 gr/L),
CaCO3 (3 gr/L), Extracto de Levadura (0.4 gr/L), Agar (15 gr/L), Rojo de congo (10 ml)
y Agua Destilada (1000 ml).
Despus de pesar los nutrientes del medio, se calienta hasta disolverlo para luego ser
autclavado por un tiempo de 1.5 horas

y a una temperatura de 120 C para

posteriormente servirlo en placas Petri esterilizadas y dejarlo enfriar por un tiempo de

15 minutos.
El sembrado se realiza empleando una aza bacteriolgica estril haciendo un
estriado en

placas Petri esterilizadas; dichas placas fueron llevadas a la

incubadora para el crecimiento de la bacteria, las condiciones de operacin para

la incubacin fueron de 25C y por un tiempo de 48 horas; observando cada 12
horas si haba un crecimiento bacteriolgico para su posterior identificacin de
la bacteria Rhizobium Sp.

Una vez observado el crecimiento bacteriolgico se escogan las colonias ms

puras para la identificacin de la Rhizobium Sp. y se colocaron en unas
laminillas porta objetos para realizar la coloracin o tincin de Gram. La tincin
de Gram es una tcnica de laboratorio que se utiliza para diferenciar diferentes
grupos de bacterias para as poder estudiarlas y clasificarlas, la cual se aplica
para bacterias del tipo gran negativas como es la bacteria Rhizobium Sp.

Se coloca en el portaobjetos una gota de agua estril y se extrajo una colonia con
la aza bacteriolgica, luego se procedi a secar la muestra en la llama (flama) del
mechero sin que se haya efectuado un calentamiento excesivo. Posteriormente se
cubri el rea del frotis con violeta de genciana por un minuto, transcurrido el
minuto se lav con agua destilada y se escurri. Seguidamente se agreg lugol
por un minuto y se lav con agua destilada. Se agreg alcohol etlico por 30
segundos y por ltimo se cubri con safranina durante cinco minutos y se lav
con agua destilada y se dej secar. Se observ al microscopio agregndole una
gota de aceite de inmersin.
.

Fig. 3.6.- Tincin de Gram para la identificacin de Rhizobium Sp.

Fig. 3.7. Identidicacin de la bacteria Rhizobium Sp. en el microscopio para su

aislamiento.

PREPARACIN DEL INCULO

La reproduccin de la bacteria Rhizobium Sp. en el medio ELMARC se
encuentra en pH 6 - 7 ligeramente cido y neutro; las condiciones de operacin
para las pruebas de biodegradacin se realizaron a pH 11 (bsica), para ello se
acondiciono la bacteria aumentando peridicamente hasta llegar a 11.5.
Inicialmente se aument el pH de 7 a 8 agregndole 0.1 ml de hidrxido de
sodio al 10 % al medio de cultivo, se cultiv la bacteria en frascos esterilizados y
se llev a incubar por 48 horas a 25 C; transcurrido el tiempo se observ el
crecimiento microbiano, observando as la adaptacin y reproduccin de la
bacteria a las nuevas condiciones.

Posteriormente se aumenta el pH de 8 9 y de 9 -10 agregndole 0.2 y 0.3 ml de

hidrxido de sodio al 10 % al medio de cultivo, se cultiv la bacteria en frascos
esterilizados y se llev a incubar por 48 horas a 25 C; transcurrido el tiempo se
observ el crecimiento microbiano a pH 9 - 10, observando as la adaptacin y
reproduccin de la bacteria a las nuevas condiciones.

Continuando con la adaptacin de la bacteria, al aumentar el pH de 10 11.5 se

observ que al trmino de 48 horas de incubacin a 25 C, la reproduccin de la
bacteria fue lenta o nula. Esto se puede dar a mltiples factores, donde nos llev
a una serie de interrogantes del porque no creca la bacteria al pH que se
necesitaba; una de las posibles respuestas se dedujo despus de hacer una prueba
en donde se volvi a preparar el medio de cultivo a pH 11.5, pero esta vez las
condiciones de incubacin fueron distintas: 3 placas Petri fueron puestas en la
incubadora a 25 C por un tiempo de 48 horas y 3 placas Petri se pusieron a

temperatura ambiente durante 48 horas. Al trmino de las 48 horas se pudo

observar que en las placas que se coloc en la incubadora no haba una
reproduccin microbiana; mientras que en las placas que se encontraban a
temperatura ambiente s se observ una reproduccin de la bacteria. Para
corroborar el crecimiento de la bacteria y que no est contaminada se realiz una
tincin de Gram, donde efectivamente se pudo observar que el crecimiento de la
bacteria era uniforme y pura.

Una vez obtenida la bacteria a las condiciones requeridas, se procedi a la

reproduccin de la biomasa. Para ello se prepar 1 litro del medio de cultivo en
frascos de prex esterilizados y se realiz el sembrado de la bacteria en dichos
frascos. Despus de realizar el sembrado se dej a temperatura ambiente (25 C)
por un tiempo de 3 semanas para su reproduccin, paralelamente para la
reproduccin de la bacteria se iba controlando cada 24 horas para ver que se
encuentre en un ambiente limpio y libre de una posible contaminacin.

Una vez transcurrido las 3 semanas se observ una notable reproduccin de la

bacteria que se encontraba pura y libre de una contaminacin, para verificar que
la bacteria estaba pura se realiz una tincin de Gram, despus de realizar dicha
tincin se comprob efectivamente que las condiciones de la biomasa de la
bacteria eran adecuadas.

Conteo celular para la prueba de biodegradacin de cianuro libre

Una vez obtenida la biomasa se procedi a preparar 100 ml de solucin salina, se
agreg 3 ml de la solucin en 9 tubos de ensayo de 10 x 150 mm y se introdujo
azadas de la bacteria en los tubos de ensayo para realizar el conteo celular; ste
procedimiento se realiz 3 veces ya que se necesitaba 9 tubos de ensayo con una
concentracin bacteriana de 2 x 108 cel/ml para 24 horas, 9 tubos de ensayo de 4
x 108 cel/ml para 48 horas y 9 tubos de ensayo de 6 x 10 8 cel/ml para 72 horas.
Para realizar el conteo celular se llevaron las muestras de tubos de ensayo al
laboratorio escalabs, aqu se us el equipo Densimat Biomerieux:

Preparacin de la muestra y Agitacin en el shaking incubator

Para la prueba de biodegradacin de cianuro libre se cont con una solucin
cianurada que tena una concentracin de 150 ppm de cianuro libre (CN-) y se
acondicion a pH 11; para la primera prueba de biodegradacin se usaron 9
matraces de 300 ml, en ellos se agreg 200 ml de solucin cianurada,
posteriormente se agreg a 3 matraces una concentracin de 2 x 108 cel/ml del
inculo de la bacteria, a otros 3 matraces una concentracin de 4 x 108 cel/ml y
por ultimo a 3 matraces una concentracin de 6 x 108 cel/ml para colocarlos en
agitacin en el shaking incubator por un tiempo de 24 horas y a temperatura de
25 C y a 100 rpm , Este procedimiento se repiti para la agitacin de 9 matraces
en un tiempo de 48 horas y 72 horas.

Para cada prueba se hizo un monitoreo del pH, cada 4 horas durante las primeras
12 horas, y despus cada 12 horas. Para ver si disminua el pH y evitar la

formacin del gas cianhdrico (HCN) el cual se forma a partir de pH 9.5 a

menos, el cual es muy txico.

Muestras para el anlisis volumtrico y espectrofotomtrico

Las muestras que se sacaron para el anlisis volumtrico (titulacin de la

solucin cianurada) fueron cada 8 horas; se sacaban los matraces que se
encontraban en el shaking incubator y se ponan en reposo por 5 minutos y se
extraan 10 ml de solucin de cada uno y se regresaban a poner en agitacin, de
la muestra que se obtena se monitoreaba el pH y se filtraba con los filtros para
viales de 0.2 m para obtener una solucin libre de bacterias y evitar que sea un
interferente a la hora de la titulacin debido a que se usa nitrato de plata para la
titulacin; se agregaba 3 gotas de yoduro de potasio (indicador) y se titulaba con
nitrato de plata (N= 0,00147) hasta obtener un color verde limn; este
procedimiento se realiz para las 24, 48 y 72 horas a una concentracin de 2 x
108 cel/ml, 4 x 108 cel/ml y 6 x 108 cel/ml.

Una vez obtenido los datos de los gastos de la titulacin se procedi a calcular
los ppm de cianuro libre para cada muestra; a continuacin se muestran los
resultados obtenidos por el mtodo volumtrico para la biodegradacin de
cianuro libre.