La electroforesis es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una
corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomolculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. Fue empleado por primera vez por en el ao 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los aos cincuenta Durrum y Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asign a la separacin de materiales en un campo elctrico en presencia de algn tipo de soporte; aunque este trmino se limit originalmente al anlisis de coloides y partculas submicroscopicas , se ha convertido en estos ltimos aos en una metodologa aplicada a sustancias de bajo peso molecular. La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte slido, como por ejemplo la electroforesis realizada en acetato de celulosa, a travs de una matriz porosa como lo son la electroforesis realizada en gel de agarosa o poliacrilamida, o bien en disolucin conocido como electroforesis libre. Una aplicacin muy importante para la electroforesis en gel es en la tecnologa del ADN. Esta tcnica es una de las ms importantes herramientas en biologa molecular y es de valor crtico en muchos aspectos de la manipulacin y estudio gentico. El principal uso es la separacin y purificacin de fragmentos individuales conteniendo genes interesantes, los cuales pueden ser recuperados del gel con actividad biolgica completa. La electroforesis en gel hace posible determinar la diferencia gentica y la relacin evolutiva entre especies y plantas y animales. Usando esta tecnologa es posible separara e identificar las protenas que difieren en por lo menos en un solo aminocido. Electroforesis del ADN (pato) Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de arn y adn en funcin de su tamao, visuaizandolos mediante una sencilla tincin, y de esta forma determinar el contenido de los ac. Nucleicos de una muestra, teniendo una estimacin de su concentracion y el grado de entereza. Podemos adems extraer del gel los fragmentos de adn que sean de inters, para asi, posteriormente, utilizarlos en diferentes aplicaciones. La electroforesis de adn fue y sigue siendo una herramienta de primordial importancia en desarrollo de tcnicas del adn recombinante o ing. genetica
La electroforesis el gel de agarosa y poliacrilamida son unas de las
metodologas mas utilizadas hoy en dia en los laboratorios bioqcos. Y en todo lo relacionado con trabajos de ac. Nucleicos Electroforesis en gel de agarosa (pato) La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agaragar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse. Este gel esta constituido por una matriz o trama tridimensional de fibras polimricas embebida en gran cantidad de medio lquido, que retarda el paso de las molculas, se usa usualmente para separar molculas grandes de alrededor 20.000 nucletidos. Esta electroforesis es la mas utilizada y se aplica en la separacin de fragmentos que se transfieran a una membrana gelosa, y la separacin de fragmentos que resultan de la digestin con diferentes enzimas de restriccin. La utilizacin de este gel es un mtodo estndar para separar y purificar fragmentos de adn cuando no se requiere un alto poder de resolucin Electroforesis en gel de poliacrilamida.(anais) Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros, se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad. Esta membrana permite la obtencin de adn de alta pureza que puede utilizarse para aplicaciones que requieran un adn totalmente libre de impurezas. Mtodo (pato) el anailisis de los geles de agarosa y poliacrilamida se realizan preferentemente en un equipo documentador de geles, los cuales tienen incorporado un software que permite guardar fotografas del gel en formatos TIFF,JPG, etc. Adems de llevar a cabo anlisis densitometricos cuando se necesite realizar una cuantigficacion precisa de la intensidad de las bandas en el gel. Esta cuantificacin puede tener distintas aplicaciones, por ejemplo, la estimacin de la concentracion del adn en una muestra mediante comparacin con otra muestra de concentracion conocida, y la comparacin de cantidad del adn en un experimento RT-PCR.
Los programas de anlisis pueden realizar una estimacin del tamao de los fragmentos por comparacin con los marcadores de peso molecular utilizado.
Ventajas y desventajas de los mtodos en matriz gelosa.(yicel)
El principal problema que afecta la estabilidad y la resolucin en todos los medios de electroforesis es la absorcin y desorcin. Las caractersticas de tamizaje del gel estn fundamentalmente dirigidas por el tamao del poro y cuando el medio absorbe agua, el tamao medio del poro se incrementa, esto hace que las molculas puedan migrar ms rpido a lo largo del gel y disminuye la resolucin. Pero como la absorcin de agua no es uniforme en cada porcin del gel, casi siempre es mayor en la regin central que en los extremos, por lo que las molculas localizadas en esta migran a travs del gel ms rapido que las que estn en los extremos, lo que deforma y afecta la reproducibilidad de la electroforesis. Ventajas y desventajas de la electroforesis en gel de agarosa (yicel) Las ventajas son que el gel es fcilmente vertido, no desnaturalizas las muestras y las muestras pueden ser tambin recuperadas. Por otra parte, las desventajas son que los geles puede fundirse durante la electroforesis, el buffer puede agotarse, y diferentes formas de material gentico pueden tratarse cuando su forma no es predecible. Ventajas y desventajas de la electroforesis en gel de poliacrilamida (yicel). Todos los geles de poliacrilamida absorben agua durante el proceso de polimerizacin y durante la conservacin, pero la tendencia se incrementa con el aumento del porcentaje de acrilamida. En el sistema de electroforesis con tampn y gel heterogneos, la diferencia de concentracin entre los geles concentrador y separador crea un potencial osmtico entre los 2 geles, lo que provoca que el agua pase del gel concentrador (regin de bajo % acrilamida) hacia el separador (regin de alto % de acrilamida). Este proceso es muy
rpido y contina hasta que se establezca un equilibrio entre ambos geles
como resultado de la difusin del agua al gel separador, por lo que el porcentaje de acrilamida no es estable en el gel separador y es necesario emplear los geles en el da de su preparacin. Cuando se mantiene en tampn, el gel absorbe rpidamente agua de este hasta llegar al equilibrio, lo que provoca inestabilidad en este y dificulta su comercializacin. Un gel no tiene una calidad aceptable si presenta poros no uniformes como resultado de la difusin de agua entre el gel de alto porcentaje y la atmsfera.16 Por todo lo anterior se ha planteado la utilizacin de compuestos que restringen la difusin, los que pueden ser polioles, polisacridos, alcoholes polimricos, etc. Estos compuestos se adicionan en la parte del medio de electroforesis en que se quiere inmovilizar el agua, en el caso de la electroforesis en poliacrilamida cuando est sintetizando el gel concentrador, lo que no afecta 38 el proceso electrofortico que se puede seguir segn el mtodo convencional. Si se desea prevenir la difusin de agua desde el tampn hasta el gel, es necesario aadir estos compuestos al tampn.
Factores que afectan a la electroforesis (pozo)
La electroforesis es una tcnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como la temperatura durante la polimerizacin y la corrida del gel, velocidad de la polimerizacin, niveles de catalizador, pureza del reactivo, tiempo de corrida y preparacin de las muestras. Conclusiones (pozo) Las tcnicas de electrforesis de adn son bsicas e insustituibles para el desempeo de cualquier trabajo en biologa molecular, bioqca y biotecnologa, referente a ensayos con acidos nucleicos, por lo que seguirn utilizndose previamente durante mucho tiempo. Con el pasar de los aos se han ido desarrollando grandes avances en este tipo de tcnica, como la PFGE, y aplicaciones nuevas, tales como la ENSA. El continuo desarrollo de las tcnicas bioqumicas y biotecnolgicas, hace prever que se desarrollaran aun mas aplicaciones para los diversos mtodos de elctroforesis des acidos nucleicos en gel. Lamentablemente la electroforesis es una tcnica demasiado sensible, por lo que es necesario tener bajo control cada uno de los factores asociados a errores en el mtodo, adems de la debida preparacin del personal.