ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGA E INGENIERA

201504 - Microbiologa

GUAS DE COMPONENTE PRCTICO

CURSO: MICROBIOLOGA 201504

MERY LILIANA LPEZ MARTNEZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD

ESCUELA DE CIENCIAS BSICAS TECNOLOGA E INGENIERA
CEAD PASTO
DICIEMBRE DE 2014

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A continuacin encuentran las guas de laboratorios que van a desarrollar de forma presencial en
cada uno de los CEAD. Los laboratorios son de carcter obligatorio.
Esta gua se puede ser modificada por los docentes que van a orientar los laboratorios, de acuerdo
a la necesidad y disponibilidad de equipos en cada uno de los centros.

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PRACTICA 1. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD

1. Objetivos:
Establecer normas y principios bsicos de comportamiento en el laboratorio.
2. Introduccin
La bioseguridad es un conjunto de medidas preventivas encaminadas a reducir el riesgo de
transmisin de enfermedades infecciosas, las plagas de cuarentena, las especies exticas
invasoras, organismos vivos modificados.
Cuando se trabaja en laboratorio con microorganismos se deben poner en prctica varias normas
de bioseguridad para evitar accidentes y adquirir enfermedades.
3. Procedimiento
A continuacin encuentra las normas de bioseguridad bsicas de cualquier laboratorio y los
cuidados que se deben tener al lavar material del vidrio. Por favor realice una buena lectura pero
principalmente ponga en prctica todas las recomendaciones.
Normas generales de bioseguridad.
Mantener una actitud responsable, no se permite hacer bromas, jugar, correr o gritar.
No se permite el ingreso de personas ajenas al laboratorio y/o que no porten sus
implementos de bioseguridad adecuados.
No se permitir el ingreso de personas bajo efectos de bebidas alcohlicas o sustancias
psicoactivas.
Para el ingreso a los laboratorios, prstamo de material o equipo se debe presentar el
carnet vigente.
Todas las superficies de trabajos se limpiaran y desinfectaran diariamente y siempre que
se produzca un derrame.
Usar bata de manga larga con puos, la cual debe estar completamente cerrada.

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Usar guantes de nitrilo, tapabocas, gorro, gafas de seguridad y todos los elementos de
seguridad solicitados dependiendo del riesgo.
Evitar tocar sus ojos o piel con las manos enguantadas.
Usar cabello recogido, calzado cerrado y bajo, no usar falda, joyas, manillas, reloj o
elementos que puedan entorpecer la manipulacin de los materiales o equipos.
Bajo ninguna circunstancia se permitir comer, beber o fumar en el laboratorio.
Bajo ninguna circunstancia, se debe tocar, oler o probar las sustancias qumicas o
biolgicas utilizadas en el desarrollo de las prcticas.
No trabajar nunca solo en el laboratorio.
No pipetear sustancias con la boca.
Cuando en el desarrollo de las prcticas se utilice cido y agua en diluciones, agregue el
cido sobre el agua.
No devolver reactivos a los frascos, as no hayan sido utilizados.
Siga fielmente todas las recomendaciones dadas por el docente responsable
laboratorio.

del

Al calentar los tubos de ensayo en el mechero dirija la boca donde nadie corra peligro de
quemarse.
Los residuos y muestras de procedimientos de microbiologa que van a ser incinerados
fuera del laboratorio deber ser sometidos a desactivacin en autoclave.
Como norma general no se podr verter ninguna sustancia peligrosa para el medio
ambiente por el desage.
Al culminar el trabajo, dejar limpio y ordenado el mesn, devolver los elementos y
materiales perfectamente limpios, asegrese de dejar cerrado el gas, agua y lavarse las
manos.
Para la eliminacin de los residuos se deben utilizar los recipientes destinados para este
fin siguiendo las indicaciones del docente responsable del laboratorio.

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Cualquier accidente por pequeo que sea debe comunicarse al docente responsable del
laboratorio.

Trabajo con material de vidrio

No se debe calentar recipientes de vidrio comn.
No calentar directamente al mechero de gas ni colocar recipientes de vidrio vacos o
hmedos por fuera en la parrilla elctrica.
Cuando utilice cubreobjetos, se deben revisar los mesones y evitar que queden sobre ellos.
Comprobar la temperatura del material de vidrio.
No forzar el cierre del material.
Comprobar cuidadosamente la temperatura de los recipientes que hayan estado sometidos
a calor antes de tomarlos directamente con las manos.
No lavar los elementos de vidrio de laboratorio con medios abrasivos que al rayar la
superficie debilitan el vidrio.
Al lavar el material utilice guantes y gafas de seguridad y no deje residuos.
Al lavar la vidriera de laboratorios no se debe someter a cambios brusco de temperatura.
4. Cuestionario
Qu es bioseguridad?
Cules son las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio de microbiologa?

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PRACTICA 2. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Objetivos
Aprender la preparacin y manipulacin de los medios de cultivo.
2. Introduccin
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los
microorganismos. La composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, porque
las necesidades nutricionales varan considerablemente. Hay microorganismos muy poco
exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes
que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
3. Procedimiento
Revise las etiquetas de los recipientes de diferentes medios de cultivo, anote el nombre, la
composicin y forma de preparacin.
En las instrucciones de forma de preparacin le dicen la cantidad en gramos de medio
deshidratado que se necesitan para disolver en un litro de agua. En muchas ocasiones no es
necesario preparar un litro de medio, por lo tanto mediante un clculo matemtico sencillo
ustedes pueden preparar una cantidad menor.
Supongamos que desean preparar 325 mililitros de medio de cultivo, al leer las instrucciones de
preparacin en la etiqueta dice que para preparar 1 litro (1000 ml) de medio se necesitan 20
gramos medio deshidratado.
Para hacer el clculo se realiza un regla de tres simple:
20 gr.......

1000 ml

X gr.........

325ml

X= (20 gr.x 325ml)/1000= 6.5 gr.

Esto quiere decir que se necesitan 6,5 gramos de medio deshidratado para preparar 325 ml de
medio de cultivo. Para preparar el medio se hace el siguiente procedimiento:

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Pese 6.5 gramos del agar deshidratado. Mida 325 mililitros de agua destilada con una probeta. De
esos 325 mililitros de agua destilada coloque la mitad en un erlenmeyer previamente lavado con
agua destilada, para eliminar residuos de otras sustancias. El erlenmeyer debe ser de volumen
superior a la cantidad que se va a preparar. Agregue los 6.5 gramos de agar deshidratado al agua
contenida en el erlenmeyer y posteriormente adicione el resto del agua destilada. Mezcle con el
agitador.
A continuacin lleve la preparacin a disolver en la plancha de calentamiento, agite
constantemente con ayuda de la varilla de vidrio hasta que ebulla para lograr la disolucin total
del Agar.
Tape la boca del erlenmeyer papel aluminio. Si las normas de preparacin no indican otra cosa, la
esterilizacin se lleva a cabo en autoclave, a 121 grados centgrados, durante 15 minutos.
Esterilizado el medio deje enfriar aproximadamente a 45C.
Proceda a servir el medio en presencia del mechero y en cajas de Petri, previamente esterilizadas.
Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente la
superficie con la llama no luminosa de un mechero Bunsen. Deje enfriar hasta que solidifique.
Los medios de cultivo lquidos se preparan de la misma forma y se sirven en tubos con tapa
rosca. Posteriormente lleve los tubos con caldo a esterilizar en autoclave. No olvide que cuando
se va a esterilizar medios directamente en los tubos estos no deben tener la tapa ajustada.
Finalmente tenga en cuenta que para preparar Agar inclinado en tubo, solo cambia el momento en
que se pone a solidificar ya que los tubos deben colocarse sobre una pipeta para lograr que se
forme el pico de agar inclinado.
Tome un medio de cultivo al azar y realice los clculos para preparar volmenes de 356 ml, 1567
ml, 131 ml y 24 ml.
Experimentalmente prepare 70 ml de medio de cultivo slidos y srvalos en 2 cajas de Petri, 2
tubos con agar y 2 tubos con agar inclinado. Prepare 20 ml. de cualquier caldo de cultivo y
srvalos en 2 tubos de ensayo con tapa.
4. Cuestionario
1. Qu es un medio de cultivo; de qu estn compuestos principalmente; cmo se clasifican
segn su proporcin de Agar y segn su suministro de nutrientes?
2. Cul es la utilidad de los medios de cultivo y qu diferencia un caldo de un medio slido?

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3. En qu momento se esteriliza un medio de cultivo y por qu?

PRACTICA 3. MICROORGANISMOS DEL AMBIENTE

1. Objetivos
Explicar cmo se puede demostrar la presencia de microorganismos en diferentes sitios.
Describir las caractersticas macroscpicas de las colonias bacterianas.
2. Introduccin
En esta prctica se va a demostrar la presencia de microorganismos en el ambiente que nos rodea.
Con este fin se toman muestras de diferentes sitios y se las siembra en un medio de cultivo que
contiene las sustancias nutritivas que las bacterias necesitan para desarrollarse, se las lleva a
incubar a la temperatura apropiada y se las deja el tiempo necesario para que crezcan y se puedan
observar las colonias a simple vista y as determinar las caractersticas macroscpicas de esas
colonias.
3. Procedimiento
Marcar cada caja de Petri que se va a utilizar con los siguientes datos: Nombre, Sitio del cual se
tom la muestra, Fecha de la prctica.
Tome cajas de Petri que contengan agar nutritivo y tome muestras de los diferentes sitios que se
relacionan a continuacin:
Deje una caja de Petri abierta durante 30 minutos en el sitio del laboratorio que desee.
Pase un copito sobre la superficie del mesn en el cual est trabajando y siembre en una
caja de Petri.
Pase sus dedos por el cabello y rasque suavemente para que el producto que salga caiga
sobre la caja de Petri.
Toque con sus dedos la superficie de una caja de Petri.
Tosa o estornude sobre una caja de Petri.
Introduzca un copito en su odo y siembre en una caja de Petri.

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Siembre una muestra tomndola del sitio que desee.

Todas las cajas llvelas a incubar durante 24-48 horas a 37 Grados.

Para sembrar hongos tome cajas de Petri que contengan Agar PDA, destpelas y djelas al aire
libre durante 30 minutos en el sitio que desee y luego tpelas. Djelas a temperatura ambiente y
en las oscuridad durante 48- 72 horas.
4. Resultados
Observe las colonias y basndose en la figura 1, llene los datos de la tabla describiendo las
caractersticas de las colonias y la cantidad de crecimiento (mucho, abundante, regular, poco).
Describa 2 colonias de cada caja teniendo en cuenta las siguientes caractersticas:
Tamao
Forma: circular, irregular, extendida
Color: pigmentada, incolora
Textura: Granular, friable, hmeda, seca, membranosa.
Superficie: suave, spera, rugosa, opaca, resbalosa.
Elevacin: Plana, convexa, Umblicada.
Borde: irregular, aserrado, discreto, regular, entero ondulado,
Olor: inodora, aromtica desagradable.

TABLA 1. CARACTERSTICAS DE LAS COLONIAS

SITIO DE TOMA DE LAS
MUESTRAS

CANTIDAD DE
CRECIMIENTO

Superficie del mesn

Cabello

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CARACTERSTICAS DE LAS
COLONIAS

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Figura 1. Forma, elevacin y borde de las colonias microbianas

Fuente: Valencia (2004) Manual de prcticas de microbiologa bsica. Coleccin Notas de Clase. Editorial
UNIBIBLIOS. Universidad Nacional de Colombia.

5. Cuestionario
Consulte la composicin de los medios de cultivo empleados y regstrelos en su informe
Qu es un medio de cultivo selectivo y un medio de cultivo no selectivo?

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En ciertos procesos industriales se requiere de reas blancas. Qu significa el trmino anterior?

PRCTICA 4. SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

1. Objetivos
Determinar las condiciones necesarias para realizar la siembra de microorganismos
Reconocer los distintos sistemas de siembra y su utilidad.
2. Introduccin
Sembrar es colocar una muestra de inculo, en un medio de cultivo para obtener el crecimiento
de los microorganismos. Para ello se extiende la muestra sobre caja de Petri, que contiene un
medio compuesto por las sustancias que necesitan los microorganismos para crecer. A veces se
aaden otras clases de sustancias; por ejemplo, para impedir el crecimiento de otras bacterias que
podran contaminar el cultivo. La siembra se puede hacer en otros tipos de medios de cultivo,
como tubos de vidrio con gel, frascos con lquidos nutritivos para los microorganismos.
Si el cultivo bacteriano tiene xito, crecern "colonias" de bacterias en el medio de cultivo. Estas
colonias tienen caractersticas de color, forma, tamao etc. propias de cada bacteria y esto nos
ayuda a identificarlas. Tambin se puede someter a las bacterias de las colonias a pruebas
bioqumicas o de otro tipo para lograr su identificacin. Algunas bacterias son muy difciles de
cultivar, otras tardan mucho tiempo en crecer y algunas, finalmente, no se han conseguido
cultivar.
3. Procedimiento
3.1 Siembra de medio slido a medio lquido
Marque correctamente los tubos con el nmero del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha.
Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de l.
Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y djela enfriar.
Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo.
Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee
nuevamente la boca del tubo, tpelo y djelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo

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estril en el cual va a colocar la muestra, destpelo, flameando la boca el tubo con el mechero e
introduzca el asa con la muestra obtenida.
Realice movimientos de rotacin con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo.
Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape.
Esterilice el asa en el mechero despus de usarla.
Incube los tubos a 37C por 24 horas.
Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente
3.2 Siembra de medio lquido a slido
Proceda en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es
en tubo recuerde hacer puncin y estra. Si es en caja puede utilizar diferentes sistemas como
estra, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.
Siembra de medio slido a slido
Proceda de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta.
Los medios slidos contienen agar en proporcin de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener
colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios mtodos: como estras,
agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro.
3.3 Siembra por agotamiento
Tome una placa de agar, marque la base de la caja de Petri con los nmeros 1, 2 y 3. Coloque la
muestra a sembrar en el nmero 1, realice estras hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire
la caja hasta el nmero 2, tome las dos ltimas estras y siga estriando hasta el nmero 3. Gire la
caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estras ya hechas.
3.4 Siembra por estras
Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto nmero uno, realice estras hasta el
nmero 2. Esterilice el asa, tome las dos ltimas estras y extindalas hasta el nmero 3, tome las
dos ltimas estras y extindalas hasta el nmero 4 y as sucesivamente hasta llegar al nmero 6.
3.5 Siembra en agar inclinado
Esta se realiza por puncin y por estra. Por puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta
el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de

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entrada que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando
suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag.
No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra.
Evalu la presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el
crecimiento de colonias en la superficie.
3.6 Siembra en profundidad
Marque la caja de Petri estril con el nmero de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra
ligeramente la caja de Petri cerca del mechero.
Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plstica, transfiera 1
ml de ste cultivo a la base de la caja de Petri estril. Descarte la pipeta en el frasco de boca
ancha con clorox.
Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos
suaves sobre el mesn, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L
invertida, y por ltimo en forma de 8. Esto garantiza una distribucin homognea de las bacterias
en todo el agar para facilitar su posterior recuento.
Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, mrquelos con el nmero de
grupo, la fecha. Luego incube 37 c por 48 horas.

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PRACTICA 5. TCNICAS DE TINCIN

1. Objetivos
Preparar frotis de bacterias para observaciones microscpicas
Observar las bacterias teidas al microscopio y clasificarlas por su forma y su reaccin a la
coloracin de Gram.
2. Introduccin
La observacin microscpica de las bacterias se facilita cuando han sido coloreadas.
acostumbra fijar las bacterias en la lmina portaobjetos para poder teirlas con facilidad.

Se

La fijacin puede hacerse con solventes o con calor. En cualquier caso se trata e deshidratar la
clula y coagularla con protenas.
Las coloraciones pueden ser simples cuando se utiliza un solo colorante o compuestas cuando se
utilizan 2 ms colorantes. Tambin se puede hacer una coloracin negativa en la cual se tie el
fondo, adems de la bacteria, para poder observar la cpsula.
3. Procedimiento
3.1 Coloracin Simple
Para la coloracin simple se utiliza azul de metileno y se trabaja con Staphylococcus aureus. Se
toma una pequea muestra del microorganismo y se fija con calor, posteriormente se aade una
gota pequea de azul de metileno, se coloca la laminilla o cubre objetos y se observa al
microscopio en un aumento de 100x.
3.2 Tincin de Gram
La tincin de Gram se realiza en cultivos de Staphylococcus aureus, y Escherichia coli.

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La tincin de Gram. Es una coloracin compuesta porque en ella se utilizan 2 colorantes, uno
primario: cristal violeta o violeta de genciana y uno de contraste, safranina o fucsina de Gram. Es
una tincin diferencial porque segn la composicin qumica de la pared celular las bacterias
quedan teidas con el cristal violeta o la safranina, como mordiente o sustancia fijadora del color
se utiliza lugol.

El agente diferenciador, es decir, el que acta de modo diferente sobre la pared celular de las
Gram. Positivas y las Gram negativas es la solucin alcohol cetona alcohol- cido.
Los pasos de la tincin de gran son los siguientes:
Fijar la muestra al calor
Aadir el violeta de genciana o cristal violeta y dejarlo actuar durante 1minuto
Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
Aadir lugol y dejarlo actuar durante 1 minuto
Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
Aadir alcohol- cido y dejarlo actuar durante 15 segundos y lavar rpidamente con agua
Aadir fucsina y dejar actuar durante 5 minutos
Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante
Secar al aire libre o con una toalla absorbente segn las indicaciones del profesor
Observar en el microscopio a un aumento de 100x.

Observe todas las bacterias con las diferentes coloraciones, determine su morfologa y trate de
identificar sus partes, determine si son bacterias Gram. Positivas bacterias gran negativas.
Dibuje lo observado.
4. Cuestionario
Establezca las diferencias entre una coloracin simple y una coloracin de gram

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Investigue que coloracin se debe utilizar para observar las endoporas o esporas bacterianas, y
para observar la cpsula

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