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AH y tmb el metodo AOAC
YO lo tengo
es justo para vit A en formulas infantiles

Qu es la Cromatografa?
La cromatografa agrupa un conjunto importante y diverso de mtodos que
facilitan la separacin, identificacin y determinacin de componentes
estrechamente relacionados en mezclas complejas; muchas de dichas
separaciones son imposibles por otros medios.1 En todas las separaciones
cromatograficas la muestra se disuelve con una fase mvilque puede ser un
gas, un lquido o un fluido supercrtico la cual se hace pasar a travs de una
fase estacionaria inmiscible fija en una columna o en una superficie slida. Las
dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyen en grados distintos entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria
se mueven con mucha lentitud con el flujo de la fase mvil. En cambio, los
componentes unidos dbilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez.
Como consecuencia de las distintas velocidades de migracin, los
componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se
pueden analizar en forma cualitativa y cuantitativa.
Clasificacin de la cromatografa
Una clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatograficos se basa en
los tipos de fases mviles y estacionarias, y en la clase de equilibrios
involucrados en la transferencia de los solutos entre las fases.
Tabla 1: Clasificacin de los mtodos cromatgrafos en columna.

Cromatografa HPLC (Cromatografa liquida de alta


resolucin)
La cromatografa de lquidos es la tcnica analtica de separacin ms
ampliamente utilizada. Las razones de su popularidad son su sensibilidad, su
fcil adaptacin a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para
automatizarla, su capacidad para separar especies no voltiles o termolbiles,
pero sobre todo, su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la
industria, muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos
ejemplos de estos materiales son aminocidos, protenas, cidos nucleicos,
hidrocarburos, carbohidratos, frmacos, terpenoides, plaguicidas, antibiticos,
esteroides, especies organometalicas y una variedad de sustancias
inorgnicas.
Figura 1: Seleccin del sistema comatografico en funcin del tipo de
muestra

Clasificacin de la cromatografa liquida


Los diferentes tipos de cromatografa liquida se pueden clasificar de diferentes
maneras, pero la forma ms habitual de clasificacin es la realizada en base a
la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es esta la que impone
fundamentalmente el mecanismo de separacin; de este modo, se pueden
enumerar cuatro tipos de tcnicas.

Cromatografa de adsorcin (liquido-solido)

La fase estacionaria es un adsorbente y la separacin se basa en repetidas


etapas de adsorcin-desorcin
Cromatografa de reparto/adsorcin (fases ligadas qumicamente)
La separacin en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil
y la fase estacionaria.

Cromatografa de intercambio inico.

Este tipo de cromatografa se da cuando la fase estacionaria presenta en su


superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signo
contrario que circulan en la fase mvil.

Cromatografa de exclusin molecular.

La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamao de poro


controlado, que permite la entrada de ciertas molculas de manera selectiva,
dejando fuera otras de mayor tamao.

El mecanismo de retencin en los dos primeros casos es similar, variando


nicamente el tipo de interacciones que se producen y cul de ellas es la
predominante; por esta razn, en la prctica se realiza otra divisin de los dos
primeros tipos de cromatografa atendiendo a la polaridad de la fase
estacionaria:

Cromatografa de fase normal:

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las


interacciones que se producen con el soluto son especficas del grupo activo.
La fase estacionaria puede ser un slido adsorbente (slice o almina), o bien,
un soporte al que se unen qumicamente molculas orgnicas que presentan
grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc.)

Cromatografa de fase reversa (inversa):

La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas,


grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecficas (efecto
solvofobo)

Instrumentacin de la cromatografa liquida.


Para realizar una cromatografa liquida tan solo es necesario disponer de las
dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografa

de lquidos de alta eficacia , debido al pequeo dimetro de las partculas de


fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilizacin de unos dispositivos
que contribuyen el cromatgrafo.
Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquidos son:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado


de eluyentes)
Dispositivos de inyeccin
Conducciones y conexiones.
Detector y registrador.
Columna.

Figura 2: Esquema bsico de un cromatgrafo de lquidos

Instrumentos para HPLC (cromatografa e lquidos de alta


eficiencia)

Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento del


solvente:

Un aparato moderno para cromatografa de lquidos est equipado con uno o


ms recipientes de vidrio, cada uno de los cuales contiene 500 mL o ms de un
solvente. A menudo estn equipados con un sistema para eliminar los gases
disueltos y el polvo de los lquidos Los gases disueltos ocasionan flujos
inestables y ensanchamiento de bandas; adems, las burbujas y el polvo
interfieren con el funcionamiento de la mayora de los detectores. Con
frecuencia, los sistemas tambin contienen un dispositivo para filtrar los
solventes y eliminar el polvo y las partculas slidas que estn en suspensin
para evitar que daen la bomba o los sistemas de inyeccin u obturen la
columna.
Una elucin que utiliza un solo solvente o una mezcla de solventes de
composicin constante se denomina elucin isocratica. En la elucin con
gradiente se usan dos sistemas de solventes y algunas veces ms, que difieren
de manera notable en cuanto a polaridad y varan en composicin durante la
separacin.
Figura 3: Diagrama que muestra una separacin de mezclas y el
ensanchamiento de las bandas

Sistemas de bombeo

La misin de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de


pulsos de la fase mvil a travs de la columna, sin que el flujo sea influido por
la presin en cabeza de columna. Entre los requisitos para las bombas en
cromatografa de lquidos esta 1) la generacin de presiones de hasta 6000 psi
(lb/in.2) o 414 bares, 2) salida libre de pulsos, ya que las pulsaciones pueden
contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad
3) tasas de flujo de 0.1 a 10mL/min, 4) reproducibilidad del flujo de caudal
debe ser constante , ya que de l depende la reproductibilidad del tiempo de

retencin (0.5% relativo o mejor) y 5) componentes resistentes a la corrosin a


causa de la diversidad de solventes.

Sistemas de inyeccin de muestras:


Es de importancia capital, pues un mal sistema de inyeccin puede dar
lugar a ensanchamientos de la banda cromatografa que deterioren la
eficacia del sistema cromatgrafo.

Un inyector ideal debe tener las siguientes caractersticas:


Introducir la muestra en la columna como una banda lo ms
estrecha posible.
Ser de fcil manejo.
Dar lugar a resultados reproductibles, tanto en la cantidad de
muestra inyectada como en el ensanchamiento que origina en la
banda cromatografa.
Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

La mayor parte de los cromatgrafos actuales se venden con


autoinyectores. Dichas unidades tienen la capacidad de inyectar
muestras en el cromatgrafo de lquidos a partir de frascos que estn en
un carrusel o desde placas microtituladoras. Por lo regular, contienen
rizos de muestreo y una bomba de jeringa para inyectar volmenes
desde menos de 1 L hasta ms de 1 mL .Algunos poseen medios
controlados por temperatura que facilitan el almacenamiento de la
muestra y efectan reacciones de derivacin antes inyectarla. La mayor
parte de los equipos se puede programar para facilitar las inyecciones
automticas en el sistema de cromatografa de lquidos.

Figura 4: Rizo de muestreo para


cromatografa de lquidos. Con la
vlvula en la posicin que se
muestra a la izquierda, la jeringa
llena el rizo y la fase mvil pasa
de la bomba a la columna. Cuando
la vlvula se coloca en la posicin
que se muestra a la derecha, el
rizo queda insertado entre la
bomba y la columna, de tal modo
que la fase mvil arrastra la
muestra hacia la columna.

Columnas para
cromatografa de lquidos
de alta resolucin
Las columnas para esta tcnica se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de dimetro interno uniforme. Algunas ocasiones las columnas para
cromatografa de lquidos de alta resolucin se fabrican con tubos de vidrio de
paredes resistentes o con polmeros como el polieteretercetona. La columna es
el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto que es en ella
donde tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta fundamental una correcta
eleccin de la columna adecuada para cada separacin; por lo tanto, resulta
fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada para cada
separacin, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad nunca se
obtendrn buenos resultados aunque se disponga del mejor instrumental.
Las columnas ms utilizadas en cromatografa de lquidos son las de relleno;
estas columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de fase
estacionaria adecuada al tipo de separacin que se pretende llevar acabo. La
mayora de las columnas para cromatografa de lquidos miden de 5 a 25 cm de
largo. Invariablemente se usan columnas rectas. A veces se pueden alargar
acoplando dos o ms de ellas. El dimetro interior de las columnas analticas es
a menudo de 3 a 5 mm; los tamaos de las partculas de los rellenos ms
comunes son 3 o 5 m. Las columnas que ms se utilizan miden de 10 a 15 cm
de longitud y 4.6 mm de dimetro interior y estn rellenas con partculas de 5
m.

Las caractersticas de la columna que


influyen sobre su capacidad de
separacin son:
de
Dimetro
interno
Relleno
la columna.

Longitud
Todas las
separaciones
Conexiones cromatograficas tienen
lugar sobre
la fase estacionaria .Las fases
Relleno
estacionarias en cromatografa de lquidos,
Tamao de partculas de relleno
estn constituidas generalmente por partculas
de materiales rgidos o semirrgidos, y en la
gran mayora de los rellenos se suele utilizar
con este fin, aunque tambin es posible
Figura rellenos
5: Componentes
de la
encontrar
basados en polmeros
columna
sintticos.

slice

En la
realiza

mayora de rellenos de columnas de


cromatografa liquida, la slice utilizada
una de las tres funciones siguientes:

Superficie adsorbente: En este caso los


propios grupos activos de la superficie de la
slice son los responsables de la separacin.
Soporte de la fase estacionaria: Est
impregnada a la superficie de la slice o bien
se encuentra ligada qumicamente a ella.
Actuacin como substrato microporoso: En este caso, la slice permite la
seleccin de molculas en funcin de su tamao.

Tipos de detectores.
Los detectores para cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los
detectores basados en una propiedad de la solucin son sensibles a una
propiedad de la fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante
dielctrica o la densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En
cambio, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a
alguna de las propiedades de este ltimo, como la absorbancia en el UV,
fluorescencia o corriente de difusin, que no son inherentes a la fase mvil.
Detectores de ultravioleta/visible.
Cuando se hace pasar una radiacin electromagntica a travs de compuestos
que presentan determinados grupos funcionales, estos experimentan una
excitacin electrnica a causa de la absorcin de energa, a una longitud de
onda que ser especfica para cada grupo funcional .Esta energa, provoca el
paso de un electrn desde el estado fundamental hasta un nivel de energa
superior. La absorcin de energa, se traduce en una disminucin de la
intensidad del haz luminoso que se ha hecho pasar a travs de la muestra,

pudindose medir esta disminucin de intensidad haciendo incidir el haz sobre


una fotoclula.
La utilizacin de la absorcin de luz ultravioleta o visible para el control de una
corriente liquida y analizar los distintos componentes que lleva en disolucin,
es una extensin natural de la espectrofotometra. Al contrario de lo que ocurre
con el ndice de refraccin , la absorcin UV o visible es un parmetro
especfico para cada compuesto , ya que este debe presentar una absorcin
adecuada en alguna regin del espectro o , en su caso, debe combinarse con
un reactivo adecuado para formar un derivado que presente absorcin.
Cuando la muestra no absorbe la radiacin por s misma, el hallar un reactivo
adecuado que d lugar a un derivado coloreado para poder medir la absorcin
en visible.
Detectores de longitud de onda variable:
Los detectores de longitud de onda variable son particularmente tiles en tres
casos:
En el caso de que pueda obtenerse una mejor sensibilidad a una longitud de
onda distinta de 254nm o de otras longitudes de onda para las que existen
filtros.
En el caso de que los distintos componentes de la muestra presentan gran
absorcin a diferentes longitudes de onda y, por tanto, el trabajo a una nica
longitud de onda reduzca la sensibilidad e incluso pueda resultar imposible la
deteccin de algunos de los componentes de la muestra.
En el caso de que se desee una operacin con paro del flujo combinado con un
registro del espectro completo de picos.
Detectores de absorcin con capacidad de barrido
Los detectores espectrofotomtricos de ultravioleta ms potentes son los
instrumentos de arreglos de diodos. Varios fabricantes ofrecen este tipo de
instrumentos, los cuales permiten recoger los datos de un espectro completo
en aproximadamente un segundo. Por consiguiente, los datos espectrales de
cada pico cromatografico se pueden recoger y almacenar a medida que
aparecen al final de la columna.
La base de funcionamiento de los espectrofotmetros con arreglo de diodos es
simple; el haz de radiacin que ha atravesado una cubeta de flujo continuo, a
travs de la que circula la fase mvil procedente de la columna cromatografica,
es dispersado por medio de una red de difraccin fija, siendo recogidas
simultneamente todas las longitudes de onda dispersas mediante una matriz
de fotodiodos.
La configuracin del equipo permite trabajar en modo isocrtico, gradiente
binario o de pasos, hasta una presin de 20 Atmsferas. El gradiente puede ser
de composicin de solventes, presin o flujo. La medicin en la zona UV-Visible
con el detector de diodos permite la lectura simultnea de 16 seales o
canales (lambdas) entre 190-800 nm con la obtencin del espectro total o
parcial, diagrama de isocontorno (ploteo de contorno), vista tridimensional y
pureza de pico para el desarrollo de mtodos. Con el detector de fluorescencia
se puede trabajar en el rango de 220-900 nm tanto en la excitacin como en la

emisin, pudiendo variar ambas en el tiempo, o sea, hacer mediciones con


programacin. Finalmente las mediciones con ambos detectores pueden ser
independientes o simultneas.
Figura6: Detector UV de arreglo de diodos.

ESTUDIO DE VALIDACIN DE LA METODOLOGA PARA LA DETERMINACIN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTNEOS


POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)

Resumen
Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneos se
efectu la validacin de la metodologa para la determinacin de la vitamina A
por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisin del
sistema se evaluaron tres parmetros: tiempo de retencin, rea y altura,
hallndose una desviacin estndar relativa (RSD) mxima de 1,78%. En la
linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin r=0,99 y una precisin con
un RSD de 2,70%. La exactitud del mtodo se evalu en trminos de
recuperacin mediante la adicin de vitamina A al alimento obtenindose un
porcentaje de recuperacin de 97,98%; y para la sensibilidad del mtodo se
obtuvo un lmite de deteccin (LOD) de 0,06 g/g y un lmite de cuantificacin
(LOQ) de 0,58 g/g. Con los resultados obtenidos se demuestra que el mtodo
en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en
el control de calidad de alimentos infantiles instantneos para la determinacin
de vitamina A.

Introduccin
Vitamina A es el nombre genrico utilizado para describir al retinol, sus steres
y los correspondientes ismeros. Slo est presente, como tal, en los alimentos
de origen animal, aunque en los vegetales se encuentra como provitamina A
en forma de carotenos. Los diferentes carotenos se transforman en vitamina A
en el cuerpo humano, se almacenan en el hgado en grandes cantidades y
tambin en el tejido graso de la piel (palmas de las manos y pies,
principalmente), por lo que pueden subsistir largos perodos sin su aporte.
La principal funcin de la vitamina A es la proteccin de la piel y su
intervencin en el proceso de visin de la retina. Tambin participa en la
elaboracin de enzimas en el hgado y de hormonas sexuales y suprarrenales.
El dficit de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en los ojos
(membrana conjuntiva) y en la piel, y afecciones diversas de las mucosas. En
cambio, el exceso de esta vitamina produce trastornos como alteraciones
seas, e incluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.
La vitamina A se encuentra principalmente en productos animales tales como
leche, crema, mantequilla, queso, huevos, carne, hgado, rin y aceite de
hgado de bacalao. Por lo general, se encuentra como steres de cidos grasos
de cadena larga pero tambin se encuentra como retinol. Se destruye muy
fcilmente con la luz, con la temperatura elevada y con los utensilios de cocina
de hierro o cobre. Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora,
son fortificados normalmente utilizando formulaciones especiales que mejoran

su estabilidad y valor nutritivo, siendo la ingesta diaria recomendada (RDA) de


400 -700 g de vitamina A, para nios de 1 -10 aos de edad.
En el Per, los programas de complementacin alimentara distribuyen
alimentos instantneos a la poblacin con alto riesgo de desnutricin; en ese
sentido, el desarrollo de tecnologas adecuadas para la evaluacin de
micronutrientes como la vitamina A, son necesarias para el control de calidad
de los productos designados a los beneficiarios de estos programas.
El anlisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafo para los
analistas dado que se asocia con problemas significativos. Muchos de estos
problemas han sido eliminados gracias a los recientes avances en la tecnologa
y el desarrollo de nuevos enfoques analticos. A pesar de ello, no es una tarea
fcil analizar vitaminas y se necesita experiencia y los conocimientos
adecuados para producir resultados reproducibles, que sean exactos y vlidos.
El primer mtodo vlido para la determinacin de Vitamina A fue un
bioensayo4; luego, se establecieron los mtodos espectrofotomtrico y
fotomtrico5, sin embargo, ambos mtodos estn expuestos a interferencias,
desde algunas sustancias como carotenos, derivados y productos de
descomposicin de la vitamina A que podran absorber luz en la misma regin
ultravioleta o dar colores similares con los reactivos utilizados en la
determinacin fotomtrica. Es as, que estos mtodos no son lo
suficientemente especficos para determinar esta vitamina, adems que la
confiabilidad de sus resultados depende del xito en los pasos de purificacin y
los procedimientos de trabajo.
Como vemos, el problema realmente no son los mtodos de determinacin,
sino ms bien los procedimientos de extraccin, ya que debido a su
inestabilidad, algunos autores prefieren extraer separadamente cada vitamina
liposoluble6.
En ese sentido, y buscando una ptima metodologa de anlisis, en el presente
estudio se realiz la validacin de la metodologa por HPLC para la
determinacin de vitamina A contenida en alimentos infantiles instantneos.

Material y mtodos
EQUIPOS
Se utiliz un equipo de cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC), marca
Shimadzu, modelo LC10A, con inyector automtico, bomba con sistema de
gasificacin, con integrador o sistema de registro, software para el procesado
de datos cromatogrficos, detector de arreglo de diodos (longitud de onda
variable). La columna cromatogrfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase
reversa, de 25 cm x 4,6 mm de dimetro interno, 5 m de dimetro de
partcula, y guarda columna con cartucho C18, Supelco. Las condiciones tpicas
de operacin fueron: sistema isocrtico, flujo 1,2 mL/min, volumen de inyeccin

20 l, deteccin UV 242 nm, temperatura de horno, ambiente, y tiempo de


corrida 7 min. La fase mvil fue metanol al 100% grado HPLC.
REACTIVOS
Metanol grado HPLC ( Merk), estndar all-trans Retinol: Vitamina A (Sigma),
hexano p.a. (Merck), etanol absoluto p.a. (Merk), solucin de hidrxido de
potasio al 50%, BHT cido Ascrbico (antioxidantes), y agua tridestilada o
grado HPLC. Solucin stock estndar de vitamina A: Se disolvieron 100 mg del
estndar en 100 mL de etanol absoluto, con aproximadamente 0,002g de BHT,
y se guard la solucin en congelacin (-20C), se verific la pureza del
estndar mediante la medicin de su espectro de absorcin (la vitamina A y los
correspondientes steres muestran un espectro de absorcin caracterstico,
donde la posicin del pico mximo depende del solvente): en etanol, el retinol
a 325 nm, tiene un coeficiente de extincin (E 1 % - 1 cm.) de 1843).
PROCEDIMIENTOS
Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil (papilla) en un baln de
base plana, se coloc un magneto y se adicion 70 mL de etanol absoluto. Se
colocaron los tubos de reflujo y se agit la mezcla hasta su ebullicin con
corriente de nitrgeno. Luego, se adicion 20 mL de solucin de KOH al 50% y
se saponific la mezcla por 30 minutos con agitacin moderada. Antes de
finalizar esta etapa se enjuag el contenido con 50 mL de agua en 3 porciones.
La solucin se enfri a temperatura ambiente y luego se filtr al vaco. Se
coloc inmediatamente el contenido en una pera de separacin de 250 mL y se
adicion 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extraccin. Se agit la
mezcla por 20 segundos y al separarse las fases se coloc la capa superior
(fase orgnica) en un baln de 250 mL de base redonda que contena
aproximadamente 0,5 g de BHT cido ascrbico. Se efectu dos veces ms la
extraccin y se juntaron los extractos en el baln de 250 mL. Se evapor a
sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor con bao de agua a 40C,
se diluy inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se llev a
volumen en un matraz volumtrico de 10 mL. Finalmente, se pas la solucin
final por un filtro de 0,2 m, llenndolos en viales mbar de 2 mL para
colocados en el inyector del cromatgrafo.

CLCULOS

Dnde: Am (rea del pico de vitamina A en la muestra), As (rea del pico de


vitamina A en el estndar), Cs (Concentracin de vitamina A en el estndar,
mg/ml), D (Factor de dilucin), Wm (Peso de la muestra, g).
DISEO EXPERIMENTAL
Se analizaron muestras de papilla realizndose los ensayos en las muestras
previamente homogenizadas con 2 analistas en 2 das diferentes para
cuantificar la vitamina A expresada en g/g. Cada analista realiz 08 ensayos
por da, bajo condiciones de repetibilidad y reproducibilidad. La temperatura en
el rea de cromatografa lquida fue 23C 2C. La precisin del mtodo
analtico se estudi sobre el sistema, evaluando la dispersin de 4 inyecciones
por cada uno de los 5 niveles de concentracin de la solucin estndar de
vitamina A; y sobre el mtodo, evaluando la dispersin de la preparacin de la
muestra. La evaluacin correspondi a todo el procedimiento, desde la
preparacin de la muestra hasta la medicin del analito por parte del
instrumento.
La exactitud del mtodo se evalu en trminos de recuperacin. El analito se
adicion a la matriz, disuelto en el mismo solvente usado para la extraccin, y
se dej en contacto con sta por muchas horas antes de la extraccin, para
permitir su interaccin. Para tal efecto, se trabaj con 3 niveles de
concentracin diferentes adicionados a la muestra. Las concentraciones de
trabajo adicionadas fueron las siguientes: Nivel 1 = 3 ppm; Nivel 2 = 5 ppm;
Nivel 3 = 7 ppm. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y 1,78 mL de una solucin
estndar de 100 ppm de vitamina A y se adicionaron a 6 muestras de papilla
por nivel. Se dej en contacto la solucin estndar con las muestras durante
toda la noche bajo refrigeracin y, al da siguiente, se realiz el tratamiento y
se hicieron las lecturas de los resultados de las 18 muestras.
La especificidad del mtodo se represent mediante los espectros y el reporte
de su correspondiente pureza con las muestras empleadas para la evaluacin
de la precisin y con la solucin estndar. La evaluacin de la especificidad del
sistema se realiz mediante el software del equipo, trabajndose con la
solucin estndar y la evaluacin. La determinacin de los lmites de deteccin
y cuantificacin se evalu sobre las muestras empleadas para la prueba de
precisin. Estos parmetros tambin fueron determinados por el software del
equipo.
Resultados

En la Figura 1 se muestran los cromatogramas representativos de dos


concentraciones (mayor y menor) de vitamina A para la curva de calibracin. El
tiempo de retencin de la vitamina A fue 3,91 0,5 min, siendo el tiempo total
de anlisis para una muestra de 7 min. La respuesta de deteccin fue lineal en
el rango de concentraciones de 5 - 15 g/g (Figura 2), obtenindose un
coeficiente de correlacin r=0,99. El lmite de deteccin del mtodo en base a

la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 g/g y el lmite de cuantificacin de 0,58 g/g.
El perfil de la precisin que se obtuvo en 16 determinaciones por analista en
dos das diferentes, fue: CV de repetibilidad de 3,09% para el analista A, y
2,25% para el analista B vs. en tanto, el mtodo oficial de la AOAC (CV de
3,62%); el CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por el mtodo
oficial (de 9,72%).
Los resultados de la precisin del sistema, basados en la variacin del tiempo
de retencin, rea y altura; se muestran en la Tabla 1. La recuperacin
obtenida fue de 97,98% vs. la obtenida por el mtodo oficial de la AOAC (de
98,8%).
Figura 1: Cromatograma de la curva de calibracin correspondiente a
5ppm y 15ppm de Vit. A.

Figura 2: Curva de calibracin de Vit. A.

La especificidad del mtodo se muestra en la Figura 3, donde se observa la


ausencia de interferencias debido a la adecuada extraccin del analito, y
adems se muestra la comparacin del espectro del estndar puro vs el
espectro del analito en la muestra
Figura 3: Cromatograma de muestra con espectro de analito.

Discusin
Varias tcnicas han sido propuestas para la medicin de la vitamina A en
alimentos infantiles 6 frmulas infantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas
y limitaciones, pero, comparado con otros mtodos por HPLC, nuestra
metodologa propuesta tiene la ventaja de que el tratamiento de la muestra se
realiza en menos tiempo, en relacin al mtodo oficial de la AOAC 992.06
Vitamina A (Retinol) in Miik-Based Infant Formula. Adems, la columna que se
utiliza en el mtodo propuesto (C18) es ms comercial que la columna del
mtodo de la AOAC (ciano), ya que esta ltima trabaja en fase normal siendo,
por tanto, ms difcil de controlar y por la naturaleza no polar del extracto, se
debe usar cromatografa en fase reversa. El tiempo de corrida por muestra es
tambin ms corto en nuestra metodologa (7 minutos), comparado con el
mtodo oficial que es de 10 minutos. Estas caractersticas contribuyen al
menor costo del anlisis.
Es necesario tener presente que tanto la saponificacin, la isomerizacin y la
ruptura de la vitamina A son retardados por la adicin del antioxidante (cido
ascrbico) y el uso de nitrgeno, el cual interfiere con los agentes de oxidacin
presentes. Asimismo, el retinol y sus steres son rpidamente destruidos por la
luz, el oxgeno y los cidos, por lo que deben almacenarse en frascos mbar o
cubiertos con papel platino o su equivalente.
La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la
oxidacin, evitndose la luz solar directa y la luz brillante. La iluminacin
artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados
equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento
deberan realizarse en material de vidrio mbar para prevenir la degradacin.

Dado que el calor tambin contribuye a la isomerizacin o a una posterior


alteracin de las vitaminas, debera evitarse el calor innecesario. Por lo tanto,
debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la evaporacin de los solventes se
realice lo ms suave posible utilizando un evaporador rotatorio, con un buen
control de la temperatura, un enfriamiento adecuado de los condensadores y
un vaco ptimo. Adems, se debe hacer un control espectrofotomtrico de la
pureza del estndar.
De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos concluir que el Mtodo de
ensayo CENAN-DQ.ME.16: Mtodo para la Determinacin de Vitamina A
(retinol) en alimentos infantiles instantneos por HPLC es preciso, exacto,
especfico y sensible para los parmetros evaluados en este estudio, ya que se
encuentran dentro de los rangos establecidos.

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