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cuado de clasificacion
cromatografia Hplc
que tipo..
instrumentacion
resumen
introducciona
asi como el que esta en una de las primeras diapos de kevin
materiales y metods (equipo reactivo procedimiento)
calculos
diseo experimental
resultados
discusion
AH y tmb el metodo AOAC
YO lo tengo
es justo para vit A en formulas infantiles
Qu es la Cromatografa?
La cromatografa agrupa un conjunto importante y diverso de mtodos que
facilitan la separacin, identificacin y determinacin de componentes
estrechamente relacionados en mezclas complejas; muchas de dichas
separaciones son imposibles por otros medios.1 En todas las separaciones
cromatograficas la muestra se disuelve con una fase mvilque puede ser un
gas, un lquido o un fluido supercrtico la cual se hace pasar a travs de una
fase estacionaria inmiscible fija en una columna o en una superficie slida. Las
dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se
distribuyen en grados distintos entre la fase mvil y la fase estacionaria.
Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria
se mueven con mucha lentitud con el flujo de la fase mvil. En cambio, los
componentes unidos dbilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez.
Como consecuencia de las distintas velocidades de migracin, los
componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se
pueden analizar en forma cualitativa y cuantitativa.
Clasificacin de la cromatografa
Una clasificacin ms fundamental de los mtodos cromatograficos se basa en
los tipos de fases mviles y estacionarias, y en la clase de equilibrios
involucrados en la transferencia de los solutos entre las fases.
Tabla 1: Clasificacin de los mtodos cromatgrafos en columna.
Sistemas de bombeo
Columnas para
cromatografa de lquidos
de alta resolucin
Las columnas para esta tcnica se construyen de ordinario con tubo de acero
inoxidable de dimetro interno uniforme. Algunas ocasiones las columnas para
cromatografa de lquidos de alta resolucin se fabrican con tubos de vidrio de
paredes resistentes o con polmeros como el polieteretercetona. La columna es
el elemento fundamental de un cromatgrafo de lquidos, puesto que es en ella
donde tiene lugar la separacin; por lo tanto, resulta fundamental una correcta
eleccin de la columna adecuada para cada separacin; por lo tanto, resulta
fundamental una correcta eleccin de la columna adecuada para cada
separacin, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad nunca se
obtendrn buenos resultados aunque se disponga del mejor instrumental.
Las columnas ms utilizadas en cromatografa de lquidos son las de relleno;
estas columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de fase
estacionaria adecuada al tipo de separacin que se pretende llevar acabo. La
mayora de las columnas para cromatografa de lquidos miden de 5 a 25 cm de
largo. Invariablemente se usan columnas rectas. A veces se pueden alargar
acoplando dos o ms de ellas. El dimetro interior de las columnas analticas es
a menudo de 3 a 5 mm; los tamaos de las partculas de los rellenos ms
comunes son 3 o 5 m. Las columnas que ms se utilizan miden de 10 a 15 cm
de longitud y 4.6 mm de dimetro interior y estn rellenas con partculas de 5
m.
Longitud
Todas las
separaciones
Conexiones cromatograficas tienen
lugar sobre
la fase estacionaria .Las fases
Relleno
estacionarias en cromatografa de lquidos,
Tamao de partculas de relleno
estn constituidas generalmente por partculas
de materiales rgidos o semirrgidos, y en la
gran mayora de los rellenos se suele utilizar
con este fin, aunque tambin es posible
Figura rellenos
5: Componentes
de la
encontrar
basados en polmeros
columna
sintticos.
slice
En la
realiza
Tipos de detectores.
Los detectores para cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los
detectores basados en una propiedad de la solucin son sensibles a una
propiedad de la fase mvil, como el ndice de refraccin, la constante
dielctrica o la densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En
cambio, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a
alguna de las propiedades de este ltimo, como la absorbancia en el UV,
fluorescencia o corriente de difusin, que no son inherentes a la fase mvil.
Detectores de ultravioleta/visible.
Cuando se hace pasar una radiacin electromagntica a travs de compuestos
que presentan determinados grupos funcionales, estos experimentan una
excitacin electrnica a causa de la absorcin de energa, a una longitud de
onda que ser especfica para cada grupo funcional .Esta energa, provoca el
paso de un electrn desde el estado fundamental hasta un nivel de energa
superior. La absorcin de energa, se traduce en una disminucin de la
intensidad del haz luminoso que se ha hecho pasar a travs de la muestra,
Resumen
Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantneos se
efectu la validacin de la metodologa para la determinacin de la vitamina A
por cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisin del
sistema se evaluaron tres parmetros: tiempo de retencin, rea y altura,
hallndose una desviacin estndar relativa (RSD) mxima de 1,78%. En la
linealidad se obtuvo un coeficiente de correlacin r=0,99 y una precisin con
un RSD de 2,70%. La exactitud del mtodo se evalu en trminos de
recuperacin mediante la adicin de vitamina A al alimento obtenindose un
porcentaje de recuperacin de 97,98%; y para la sensibilidad del mtodo se
obtuvo un lmite de deteccin (LOD) de 0,06 g/g y un lmite de cuantificacin
(LOQ) de 0,58 g/g. Con los resultados obtenidos se demuestra que el mtodo
en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en
el control de calidad de alimentos infantiles instantneos para la determinacin
de vitamina A.
Introduccin
Vitamina A es el nombre genrico utilizado para describir al retinol, sus steres
y los correspondientes ismeros. Slo est presente, como tal, en los alimentos
de origen animal, aunque en los vegetales se encuentra como provitamina A
en forma de carotenos. Los diferentes carotenos se transforman en vitamina A
en el cuerpo humano, se almacenan en el hgado en grandes cantidades y
tambin en el tejido graso de la piel (palmas de las manos y pies,
principalmente), por lo que pueden subsistir largos perodos sin su aporte.
La principal funcin de la vitamina A es la proteccin de la piel y su
intervencin en el proceso de visin de la retina. Tambin participa en la
elaboracin de enzimas en el hgado y de hormonas sexuales y suprarrenales.
El dficit de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en los ojos
(membrana conjuntiva) y en la piel, y afecciones diversas de las mucosas. En
cambio, el exceso de esta vitamina produce trastornos como alteraciones
seas, e incluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.
La vitamina A se encuentra principalmente en productos animales tales como
leche, crema, mantequilla, queso, huevos, carne, hgado, rin y aceite de
hgado de bacalao. Por lo general, se encuentra como steres de cidos grasos
de cadena larga pero tambin se encuentra como retinol. Se destruye muy
fcilmente con la luz, con la temperatura elevada y con los utensilios de cocina
de hierro o cobre. Los alimentos infantiles instantneos, en su gran mayora,
son fortificados normalmente utilizando formulaciones especiales que mejoran
Material y mtodos
EQUIPOS
Se utiliz un equipo de cromatografa lquida de alto rendimiento (HPLC), marca
Shimadzu, modelo LC10A, con inyector automtico, bomba con sistema de
gasificacin, con integrador o sistema de registro, software para el procesado
de datos cromatogrficos, detector de arreglo de diodos (longitud de onda
variable). La columna cromatogrfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase
reversa, de 25 cm x 4,6 mm de dimetro interno, 5 m de dimetro de
partcula, y guarda columna con cartucho C18, Supelco. Las condiciones tpicas
de operacin fueron: sistema isocrtico, flujo 1,2 mL/min, volumen de inyeccin
CLCULOS
la seal / ruido (S/N) fue de 0,06 g/g y el lmite de cuantificacin de 0,58 g/g.
El perfil de la precisin que se obtuvo en 16 determinaciones por analista en
dos das diferentes, fue: CV de repetibilidad de 3,09% para el analista A, y
2,25% para el analista B vs. en tanto, el mtodo oficial de la AOAC (CV de
3,62%); el CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por el mtodo
oficial (de 9,72%).
Los resultados de la precisin del sistema, basados en la variacin del tiempo
de retencin, rea y altura; se muestran en la Tabla 1. La recuperacin
obtenida fue de 97,98% vs. la obtenida por el mtodo oficial de la AOAC (de
98,8%).
Figura 1: Cromatograma de la curva de calibracin correspondiente a
5ppm y 15ppm de Vit. A.
Discusin
Varias tcnicas han sido propuestas para la medicin de la vitamina A en
alimentos infantiles 6 frmulas infantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas
y limitaciones, pero, comparado con otros mtodos por HPLC, nuestra
metodologa propuesta tiene la ventaja de que el tratamiento de la muestra se
realiza en menos tiempo, en relacin al mtodo oficial de la AOAC 992.06
Vitamina A (Retinol) in Miik-Based Infant Formula. Adems, la columna que se
utiliza en el mtodo propuesto (C18) es ms comercial que la columna del
mtodo de la AOAC (ciano), ya que esta ltima trabaja en fase normal siendo,
por tanto, ms difcil de controlar y por la naturaleza no polar del extracto, se
debe usar cromatografa en fase reversa. El tiempo de corrida por muestra es
tambin ms corto en nuestra metodologa (7 minutos), comparado con el
mtodo oficial que es de 10 minutos. Estas caractersticas contribuyen al
menor costo del anlisis.
Es necesario tener presente que tanto la saponificacin, la isomerizacin y la
ruptura de la vitamina A son retardados por la adicin del antioxidante (cido
ascrbico) y el uso de nitrgeno, el cual interfiere con los agentes de oxidacin
presentes. Asimismo, el retinol y sus steres son rpidamente destruidos por la
luz, el oxgeno y los cidos, por lo que deben almacenarse en frascos mbar o
cubiertos con papel platino o su equivalente.
La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la
oxidacin, evitndose la luz solar directa y la luz brillante. La iluminacin
artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados
equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento
deberan realizarse en material de vidrio mbar para prevenir la degradacin.