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Prctica # 1 Elaboracin de Penicilina

mediante la fermentacin del Hongo


Penicillium Chrysogenum.

Ingeniera de Fermentaciones

INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INSTERDISCIPLINARIA DE
INGENIERAS CAMPUS GUANAJUATO

INGENIERA FARMACUTICA

INGENIERIA DE FERMENTACIONES
Elaboracin de la penicilina mediante la fermentacin
del Hongo Penicillium Chrysogenum

6FV1

PROFESOR: DIANA RAMIREZ SAENZ


ALUMNO: OSCAR EFRAIN FERNANDEZ DELGADO
BOLETA: 2012660037

FECHA DE ENTREGA
03/12/2013

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato


Profesora: Diana Ramrez Senz

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Prctica # 1 Elaboracin de Penicilina


mediante la fermentacin del Hongo
Penicillium Chrysogenum.

Ingeniera de Fermentaciones

Objetivo: Producir un antibitico grado farmacutico de mayor uso en el mercado,


mediante la fermentacin del hongo Penicillium Chrysogenum, aprovechando sus
propiedades bioqumicas y funciones microbiolgicas, utilizando como fuente un medio de
cultivo enriquecido con nutrientes necesarios para su desarrollo, y con la ayuda de un
biorreactor de tanque agitado Lambda especializado para su produccin.
Objetivos especficos

Produccin del antibitico bencilpenicilina mediante la fermentacin del hongo


Penicillium Chrysogenum, en un biorreactor Lambda de tanque agitado.
Purificacin del caldo sobrenadante, producto de la fermentacin del hongo
mencionado, mediante una cromatografa de columna, logrando la extraccin del
antibitico puro.
Identificacin del compuesto extrado, utilizando tcnicas microbiolgicas de
cultivo in vitro, mediante varios antibiogramas que contengan diferentes cepas, en
las cuales se compruebe con halos de inhibicin bacteriana, la presencia del
antibitico obtenido.

INTRODUCCIN
Un antibitico se conoce como aquel compuesto qumico producido ya sea por hongos o
bacterias, y que posee una actividad de defensa ante diferentes microorganismos
presentes en cualquier medio ambiente, para el hongo proteger los nutrientes que
necesita, mediante la interferencia del compuesto mismo en diversos pasos del
metabolismo de los microorganismos enemigos. Por consiguiente se le considera un
metabolito secundario, porque es antimicrobiano y resulta capaz de inhibir un crecimiento
bacteriano. [3-4]
Estructura general del antibitico
El compuesto orgnico principal es el cido 6- aminopenicilnico (6 APA), su frmula
condensada es C16H18N2O4S y su esqueleto se muestra a continuacin:
Figura 1: Estructura Orgnica general de la molcula de penicilinas

Apreciamos una estructura consistente en un anillo tiazoldinico con un anillo - lactmico, y una
parte variable acilada en la posicin 6, lo que demuestra que se pueden obtener varios tipos de
penicilina gracias a las propiedades estructurales de la molcula.
Imagen extrada de: [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg]

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Prctica # 1 Elaboracin de Penicilina


mediante la fermentacin del Hongo
Penicillium Chrysogenum.

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La penicilina es un antibitico producido por un hongo de nombre penicillium, que acta


mediante el bloqueo de la actividad de la enzima transpeptidasa, generando un
cruzamiento que conecta largos polmeros de azcares formando la pared de la clula
bacteriana, bloqueando irreversiblemente la actividad de la enzima por unin covalente
con el extremo funcional de la enzima misma. La obtencin de la penicilina es un proceso
fermentativo que se realiza considerando una seleccin de los medios de comunicacin
(aquellos que proporcionan un ambiente favorable para el cultivo en cuestin, como la
regulacin del pH) adecuados para el rendimiento general de la fermentacin,
proporcionando un medio de cultivo que contenga todos los elementos necesarios para la
sntesis de materiales de la clula y la formacin del producto deseado. [1-4]
Biosntesis del Antibitico
Se rige por la siguiente secuencia metablica:
Figura 2.- Ruta metablica que describe la produccin de penicilina va Penicillium Chrysogenum

Se aprecia la ruta biosinttica del compuesto para dar como producto final penicilinas del tipo G y V
Imagen extrada de: Microbiologa General 2008

La produccin del antibitico se origina porque la penicilina tiene un precursor donde


yacen las bases de aminocidos aromticos, la penicilina es una ruta metablica diferente
al ciclo de krebs que se engancha a los aminocidos aromticos que se generaron en el
ciclo mencionado. La fuente principal para que se lleve a cabo este proceso deriva de la
glucosa (fuente de carbono) aadida al medio de cultivo, los antibiticos resultan a partir
de metabolismos secundarios y rutas alternas del sustrato que sirva a la clula del
microorganismo para deshacerse de las bacterias (mecanismo de defensa muy til para
sobrevivir bajo condiciones adversas) que pueden competir contra ellos hacia una fuente
nutritiva. Para el caso de un medio de cultivo estril y enriquecido, como representa un
hongo in vitro, es menester aadir un precursor debido a que el hongo por naturaleza
producir muy pocas cantidades del antibitico, con el precursor se activara esa ruta
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Penicillium Chrysogenum.

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metablica para que el hongo produzca mayores cantidades de penicilina demandadas.


[2,4]
Factores microbiolgicos propicios para fermentar un determinado hongo
En microbiologa un medio de cultivo adecuado para todo tipo de hongo en general,
incluyendo al penicillium, debe contener fuentes de carbono y nitrgeno principalmente.
Segn el modelo del Dr. Salomn Bartnicki (desarrollado en el ao 1962), un medio de
cultivo mnimo y esencial debe contener fuentes de carbono, nitrgeno, sulfato de amonio
y oligoelementos (donde se encuentran muchas sales con metales de transicin, como
Mn, Cr, Fe, Co), todos ellos requerimientos nutritivos necesarios para el desarrollo del
microorganismo. [2,4]
Por ltimo resta mencionar que una propiedad fundamental en los hongos, es que
contienen enzimas que son dependientes de metales como: Manganeso, Cromo, Hierro y
Cobalto, necesarios para que las enzimas cumplan su funcin, considerando que los
hongos son restrictivos en su crecimiento porque contienen muchas rutas metablicas
alternas para producir antibiticos, u otros metabolitos secundarios como pigmentos. Las
rutas metablicas en los hongos poseen enzimas muy especficas que dependen de
metales (metaloenzimas), y es importante que estn presentes en el medio de cultivo para
el crecimiento y desarrollo del hongo, el medio debe tener un pH acido entre 4.5 y 5 (a
excepcin del Penicillium, cuyo pH debe ser de 6.5 ya que influye a un mejor desarrollo
del metabolito) puesto que a un valor mayor desarrollara mayor cantidad de biomasa que
la necesaria. [1-2,4]
Purificacin
En trminos microbiolgicos y de Biorreactores, cuando se trabaja con cualquier cultivo y
se requiere la produccin de un metabolito secundario en especfico, para este caso la
Penicilina, al aadir al cultivo cofactores que propicien en el hongo la produccin de una
ruta metablica secundaria, este tendera a excretar muchos metabolitos secundarios
posibles, no solamente uno, por ende se encontraran varios compuestos qumicos
inmersos en el caldo de cultivo, productos de la ruta metablica originada. [2-4]
El compuesto de inters se encontrara inmerso junto con otros metabolitos secundarios
posibles, y al tomar una alcuota y probarla en un antibiograma, no se conocer
exactamente que compuesto fue el que inhibi el crecimiento bacteriano, por ende el
resultado esperado variara sin conocer que lo provoco. La purificacin promueve a
separar el metabolito de inters de los otros metabolitos, mediante el uso de un solvente
capaz de polarizar a los otros metabolitos y solubilizarlos para generar una separacin de
fases, en estos casos apreciaremos dos fases: Orgnica (conteniendo a los otros
metabolitos que no se necesitan) y Acuosa (contendr el metabolito de inters). [1-3]
Para solubilizar metabolitos secundarios de desinters, y propiciar la separacin de
ambas fases, generalmente se usara un solvente orgnico de carcter polar, el cual
arrastrara metabolitos no polares generando un precipitado, dejando en la fase liquida el
metabolito de inters, este compuesto se le conoce como ciclohexanona el cual atacara
en grupos aminos y carbonilicos de los metabolitos no polares propiciando una separacin
de fases y por ende un precipitado de carcter orgnico. [Wade 2012]
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Por ltimo, para la separacin del antibitico se utiliza la cromatografa en columna, esta
tcnica permite la separacin de mezclas de sustancias, sus caractersticas y los factores
que en ella intervienen. Generalmente esta tcnica se emplea en la purificacin de
compuestos qumicos, ya que existe una afinidad diferencial de los distintos compuestos
inmersos en la mezcla por la fase mvil o estacionaria, estos compuestos son arrastrados
por un eluyente que los propicia a avanzar a lo largo de la columna, pero como no todos
los compuestos avanzaran a la misma velocidad, por consiguiente terminamos obteniendo
el antibitico de inters, ya que esperamos sea el compuesto que avance con mayor
velocidad que los otros. [1,4]
Presencia de penicilina mediante cuantificacin de susceptibilidad microbiana
Existe una tcnica fundamental dentro de la microbiologa clnica llamada quimioterapia
con antimicrobianos, esta tcnica ha venido jugando un papel vital para el tratamiento de
diversas enfermedades infecciosas en seres humanos. Desde que se desarrollaron
diferentes investigaciones acerca de las colonias microbianas por parte de Alexander
Fleming en 1924, Gerhard Dogmak en 1927 y Selman Waskman en 1932, han surgido
cientos de agentes antimicrobianos, donde algunos han sido sintetizados y unos cuantos
se encuentran disponibles para usos clnicos. Gracias a la gran variedad de agentes
antimicrobianos existentes, podemos diagnosticar con un grado de certeza confiable, los
agentes ms apropiados para el tratamiento de diversos padecimientos a manera
rutinaria. [5-7]
Figura 3: Se muestra que parte del metabolismo de un microorganismo se ve afectado por los diversos
antibiticos.

Extrada de: [Delgado, A. (2010). Obtencin de penicilina y comprobacin de su actividad


antimicrobiana. Biotecnologa Farmacutica. Instituto Politcnico Nacional]

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Desde la sntesis de la penicilina, se han descubierto muchos antibiticos capaces de


combatir todo tipo de enfermedades causadas por infecciones microbianas, pero el uso
incorrecto y excesivo de los mismos, ha llevado a que las bacterias desarrollen cierta
resistencia hacia los mencionados, derivando en microorganismos multiresistentes, por tal
razn se efectan pruebas de sensibilidad, para corroborar cul es el antibitico ms
adecuado para atacar a un determinado microorganismo. Estas pruebas consisten
principalmente en dos tipos, difusin y dilucin, que nos ayudan a determinar la
sensibilidad de un determinado microorganismos, para la eleccin del antibitico
apropiado. [5-6,8]
Figura 4: Inhibicin en el crecimiento de la bacteria E. Coli por efecto del antibitico Amoxicilina

Extrada de: [Trabajos experimentales realizados en laboratorio de Microbiologa Farmacutica en


UPIIG-IPN]

La metodologa empleada para realizar el estudio de susceptibilidad, toma en


consideracin algunos de estos factores para determinar de manera eficiente cmo un
microorganismo podra responder a un determinado antibitico. [6,9]
Virulencia
Alta concentracin de organismos
Infeccin mixta
Desarrollo de resistencia durante el tratamiento
Existen factores propios del agente antimicrobiano, como son absorcin, distribucin,
metabolismo, eliminacin, unin a protenas plasmticas y otros parmetros
farmacocinticos, los cuales pueden influenciar la respuesta del paciente. Debido a que
los microorganismos tienen susceptibilidad variable a agentes antimicrobianos, es
necesario tener una herramienta que permita determinar la susceptibilidad del
microorganismo causante de la infeccin. [5-9]

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Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo que
debemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayora de los microorganismos aislados.
La indicacin primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibitico ms
apropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infeccioso. En la mayora
de los casos, cuando comienza una enfermedad se indica un antibitico de amplio
espectro (o una combinacin de antibiticos) hasta obtener resultados acerca de la
identificacin del germen causal de la infeccin. Posteriormente al obtener una respuesta,
puede indicarse un antibitico ms especfico. [2,8]
En este momento existen varios mtodos basados en la biologa molecular que pueden
ser usados para detectar resistencia especfica a varios antimicrobianos, pero su uso de
rutina no est indicado. Estos mtodos son principalmente usados con fines
epidemiolgicos, para monitorear resistencia a antibiticos. [7]

Materiales, Reactivos y Equipo


Material

Reactivos

3 matraces erlenmeyer de 500 mL


2 charolas de aluminio
1 Esptula
2 Probeta 50 mL
1 Mechero de bunsen
2 Asa para sembrar
Algodn
Gazas
Papel destraza
2 matraces erlenmeyer de 1 L
Pinzas de diseccin
Encendedor
Probeta de 5 L
5 Lmparas de alcohol
4 tubos Falcn
Embudo de separacin
Columna cromatografa anionica
Papel Filtro
1 Porta Objeto
2 Cubre Objetos
1 Caja petri de vidrio
Equipo para cromatografa de intercambio
inico
Tubos Eppendorf estriles
Micropipeta de 1000 L
Puntas para micropipeta
Celdas para espectrofotmetro de vidrio y
plstico
3 vasos de precipitado de 100 mL
Pinzas de diseccin
12 cajas petr de plstico estriles
Encendedor
Secador

Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de levadura
KCl
MgSO4
FeCl3
Etanol al 90
Caja petri con hongo de penicillium cultivado
Tubo con esporas
Ciclohexanona
Solucin acido sulfrico 1 N
Agar PDA
Agar Bacteriolgico
Peptona de Casena
Cloruro de sodio
Penicilina Comercial
Tubo eppendorf con esporas
Cepa de cultivo con Lotto
Cepa de cultivo con E. Coli
Cepa de cultivo con Salmonella
Agua destilada

Equipo
Equipo para filtracin al vacio
Bomba
Bomba peristltica
Fermentador Instrumentado
Microscopio
Autoclave
Refrigerador
Incubadora a 29C
Espectrofotmetro Uv-vis

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Diagrama de flujo metodologa


Preparacin del medio de cultivo (PDA)
Realizar los calculos
correspondientes de
cada reactivo, para
preparar 200 mL de
medio

Pesar en la balanza
la cantidad
correspondiente de
cada reactivo

Aadir 200 ml de agua


destilada al matraz
erlenmeyer de 500 mL

Aadir a la solucion
el extracto de
levadura y agitar

Agitar
vigorosamente
efectuando una
disolucion

posteriormente
aadir cada una de
las sales pesadas en
la balanza

Aadir lentamente
la glucosa a la
solucion y agitar
mientras se va
adhiriendo.

Seguir agitando
vigorosamente
nuestra solucion
hasta que todos los
componentes esten
disueltos

Envolver con una


gasa un pedazo de
algodn, y proteger
nuestro medio de
cultivo

Microcultivo

Tomar dos muestras,


una de un homgo
aislado y la otra de una
espora inoculada.

En una caja petri


colocar un portaobjeto
y PDA, todo en un
ambiente
completamente esteril

Tomar de las muestras


de interes y sembrarlas
por un lado en el
cuadro de agar, cubiri
con un cubreobjeto.

En base a lo observado,
determinar el tipo de
cepa para cada muestra
y su especie.

Observar el hongo al
microscopio utilizando
objetivos 20 x y 40 x

Colocar 2 ml de agua
destilada (no se pudo
efectuar), sellar la caja
e incubarla por 36
horas a 37 C

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Inoculacin del Hongo en el medio de cultivo

Introducir el matraz
con todo y el medio de
cultivo al autoclave
para esterilizar,
asegurando la muerte
de toda bacteria

Una vez esterilizado,


llevarlo a la campana
de flujo laminar para
inocular con ayuda del
mechero

Verificar la asepsia del


Biorreactor y considerar
todas las medidas
necesarias. .

Meter el medio de
cultivo inoculado a un
conservador durante 4
dias.

Encender el mechero y
destapar el medio de
cultivo, flameando el
boquete del matraz y el
tapon de algodon

Flamear de nueva
cuenta el Aza y todo lo
que se utilizo.

Flamear el Aza y tomar


una pequea porcion del
hongo, cuidando que se
efectue dentro de la
zona esteril.

Introducir la porcion
extraida del hongo en
el medio de cultivo,
flameando el boquete
del matraz y la tapa de
algodon, cerrando
nuestro medio.

Fermentacin del Hongo


Desmontar el
biorreactor lambda y
lavar cada uno de sus
componentes, verificar
la presencia de todos
los componentes
necesarios

Las condiciones son:


temperatura de 23 a
25 C, VVM entre 0.5 a
1 y pH de 6.5

Realizar los calculos


correspondientes de
reactivos para
preparar 800 mL de
medio de cultivo
enriquecido (YPS), y
prepararlo

Una vez preparado el


medio de cultivo (YPS),
aadirlo lentamente al
biorreactor y cubrir
todas las entradas del
mismo.

Esterilizar tanto el
biorreactor como las
fuentes de acido
(H2SO4 1N) y alcali
(NaOH 1N).

Programar el biorreactor
en base a las
condiciones del hongo
penicillium
Chrysogenum y accionar
para comenzar la
fermentacin.

Verter el inoculo al
biorreactor, realizar
este procedimiento
cuidando un ambiente
completamente esteril
para evitar
contaminacin

Ajustar pH y conectar
las fuentes de acido y
alcali a las
alimentaciones
correspondientes.

Dejar el biorreactor
fermentando una semana
y posteriormente realizar
una filtracion para separar
el producto de la biomasa.

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Purificacin del Caldo

Eliminar los residuos de


mayor tamao mediante
una filtracion de vacio

Posteriormente tratar el
caldo por centrifugacion,
colocando en tubo de 50
mL con tapa por 10 min
a 5000 rpm

Colocar el sobrenadante
en un recipiente.

Verter la susbtancia en
un embudo de
decantacion y separar la
fase acuosa de la
organica.

Dejar reposar en el
solvente organico los
primeros 7 dias en una
gabeta, y los otros 6 dias
en refrigeracion

Aadirle al mismo 200


mL de Ciclohexanona,
realizar este paso en la
campana de flujo
laminar

Desechar la fase
organica y colocar la fase
acousa en un vaso de
precipitados para
tratarla posteriomente

Preparar la columna
anionica cromatografica
de intercambio ionico

Lavar la columna
anionica con una
solucion de H2SO4 [1 N],
(realizar calculos previos
para su preparacin)

Rotular un frasco
determinado para
guardar el producto
resultante de la
cromatografia

Tratar el restante de la
fase acuosa pasando la
misma por la columna
cromatografica

Sustraer una muestra de


10 mL de la fase acuosa

Guardar el producto
final en refrigeracion por
un periodo de 2 semanas

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Curva de referencia penicilina comercial

Preparar diferentes
diluciones a distintas
concentraciones de
penicilina comercial

Preparar el equipo de
espectrofotometria Uvvis con tubo blanco a
200 nm

Calibrar el
espectrofotometro

Construir la curva de
calibracion
correspondiente a las
asbrobancias obtenidas
en el espectro

Determinar la
absorbancia para cada
tubo con su
concentracion

Introducir los
diferentes tubos con
las diluciones reaizadas
con la penicilina
comercial

Elaboracin de antibiograma
Pesar las cantidades
correspondientes de cada
reactivo para preparar
medio LB y realizar la
solucion

Esterilizar en autoclave el
material necesario tal:
matraz con agua
destilada, caja petri de
vidrio con discos y matraz
con medio LB

Determinar las
concentraciones de
peniciina presente en el
caldo de extraccion y la
fase acousa de la
decantacion

Colocar cada dilucion en un


tubo eppendorf y rotular la
concentracion de la misma y
la sustancia de penicilina
utilizada

Preparar tres diluciones a


distintas concentraciones
para cada muestra de
penicilina: Comercial,
Cromatografia y acuosa

Para determinar tal


concentracion, realizar una
espectro UV-VIS a cada
muestra de los componentes,
y comparar en base a la curva
de referencia obtenida de
penicilina comercial

Verter 15 mL de medio LB a
temperatura ambiente sobre
las 9 cajas petri esteriles,
cuidando que se tenga un
ambiente esteril

Esperar a que el medio


solidifique

Una vez que el medio


solidifico, ir inoculando cada
cepa correspondidnte por
todo el agar, para cada caja
petri

Por ultimo colocar las cajas


petri en la incubadora a
temperatura de 29 C por una
semana y observar

Posterior a la inoculacion,
colocar el sensidisco
impregnado con la dilucion
correspondiente y rotular la
localizacion del mismo en la
caja petri

Ir impregnando cada disco


con las diluciones
correspondientes a las
distntas concentraciones de
penicilinas: Comercial, acuosa
y cromatografia

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Resultados y Discusin
Preparacin de 200 mL de medio de cultivo enriquecido
Se utilizaron las siguientes cantidades de cada reactivo:
Tabla 1: Cantidades y reactivos empleados para la elaboracin del medio de cultivo enriquecido

Reactivos

Cantidad (g)

Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de levadura
KCl
MgSO4
FeCl3

8
0.6
0.4
0.1
0.1
0.1

Cada componente del medio se aadi con la finalidad de desarrollar la correcta


proliferacin del hongo que posteriormente se vaya a inocular en el mismo, brindndole
un correcto desarrollo y atendiendo a las demandas microbiolgicas y bioqumicas del
hongo en comn.
Contrastando con la literatura y algunos trabajos industriales de carcter farmacutico, el
medio de cultivo que se preparo y los ingredientes que formaron parte del mismo, resultan
indispensables para propiciar la proliferacin del hongo penicillium en el sustrato [1]. Es
importante mencionar que cada uno de los ingredientes indicados tiene su funcin
bioqumica en el medio de cultivo enriquecido, as se le aaden sales al mismo, porque
nuestro hongo es un ser vivo (microorganismo) y necesita de electrolitos para poder
desarrollarse, las sales tambin disminuyen las probabilidades de contaminacin al medio
debido a que lo purifican y no permiten que se desarrollen bacterias, si se le hubiera
aadido cloruro de sodio se rompe el equilibrio de las bombas sodio y potasio y no se
desarrolla completamente (se limita mucho su crecimiento), en cambio con el cloruro de
potasio se genera el equilibrio adecuado [3-4].
La glucosa se le aade debido a que es una fuente de carbono y es bsica para su
desarrollo, contribuye a formar los componentes estructurales y sirve como fuente de
energa para el microorganismo, considerando que cualquier organismo debe de pasar
por el ciclo de krebs, desdoblar la glucosa para producir piruvato (glucolisis) cuya nica
va de salida es el ciclo de Krebs para sintetizar todos los intermediarios y aminocidos.
La razn por la que se le aade extracto de levadura al medio de cultivo, aparte de que
sigue aportando fuentes de carbono al microorganismo en caso de que ya no cuente con
glucosa, es porque representa el proceso metablico principal para llevarse a cabo la
fermentacin, transformando los azucares en etanol por metabolismo oxidativo que
incluye la glucolisis y ciclo de krebs en hongos [2-4]. Por lo que todos los
microorganismos requieren de carbono, hidrgeno, oxgeno, azufre y nitrgeno para su
crecimiento celular, demandando pequeas cantidades de elementos traza como Cu, Mn
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y Co dependiente de la fuente de agua como la mayora de las fuentes de agua o factores


de crecimiento, tales como vitaminas o aminocidos. [1-4]
Microcultivo
Para continuar con la extraccin del antibitico, es importante la identificacin y
comprobacin del hongo que la produce, como se trabajo con dos compuestos, Hongo
aislado y esporas, era menester corroborar que ambos fueran Penicillium Chrysogeum, se
efecta un microcultivo en el cual se identifico que solo el hongo aislado era Penicillium
mientras las esporas representaban otro componente desconocido.
No se tiene una imagen disponible del la identificacin del hongo, pero a continuacin se
muestra una imagen similar a la del hongo que se identifico experimentalmente y que
cumpli con las caractersticas que debe mostrar el penicillium.
Figura 5: Identificacin del Hongo penicillium realizada en un trabajo experimental

En la presente imagen se aprecia que efectivamente este hongo es penicillium debido a la


conformacin terverticilado de una de sus ramificaciones
Extrada de:
[http://www.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/3/pexp.JPG&imgrefu
rl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html&h=654&w=640&sz=44&tbnid=5nTOG24FOgB9
aM:&tbnh=115&tbnw=113&zoom=1&usg=__cNjOr5ylM7fxFkTE378KHAwbp8Q=&docid=WTW3zN12yYH7DM&sa=X&ei=wK
FlUsa3K8SD2QXr84DoDQ&ved=0CC8Q9QEwAQ]

En el hongo que se identifico al microscopio se apreciaron las siguientes caractersticas:


formaba conidios en una estructura ramificada, algunas ramificaciones presentaron dos
tipos de estructuras: las monoverticiladas y biverticiladas, especie esponjosa con
vellosidades la cual se asemejaba mas una esponja dura y a punto de romperse debido a
que no se le agrego agua al microcultivo y por ende no se encontraba hidratado.
La hidratacin es un factor importante en microorganismos del reino Fungi, ya que sin
agua el hongo no puede sobrevivir y por ende no tendera a producir el antibitico, aparte
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Penicillium Chrysogenum.

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de ser necesaria para el cumplimiento de sus funciones fisiolgicas, representa un


inductor de sus rutas metablicas las cuales sern compatibles con el precursor que
propiciara la mxima produccin de antibitico posible. En este caso como se trato de un
microcultivo el hongo apenas se alcanzo a apreciar, aunque se corri el riesgo de
confundirse con el hongo de la estreptomicina, ya que al estar deshidratado el hongo le
dio una apariencia similar a la estreptomicina, y despreciar al mismo antes de continuar
con el trabajo experimental. [1,3-4]
Preparacin de 800 mL de medio de cultivo enriquecido, 400 mL para cada matraz
Tabla 2: Cantidades y reactivos empleados para la elaboracin del medio de cultivo enriquecido

Reactivos

Cantidad (g)

Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de levadura
KCl
MgSO4
FeCl3

16
1.2
0.8
0.2
0.2
0.2

Se preparo el medio de cultivo en dos matraces erlenmeyer de 1 L cada matraz, y se


aadieron las cantidades indicadas en la tabla para preparar 400 mL de medio en cada
uno. Una vez preparado el medio y verificando que la base del biorreactor estuviera
limpia, se procede a verter los 800 mL de medio en la base, y se mete al autoclave para
esterilizacin, protegiendo el mismo cerrando bien cada orificio.
Imagen 1.- Medio de cultivo con el hongo desarrollado.

Se aprecia la fermentacin del hongo penicillium en el Biorreactor.

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mediante la fermentacin del Hongo
Penicillium Chrysogenum.

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Despus de una semana que se dejo fermentando el hongo en el medio de cultivo, se


aprecio una cantidad considerable de biomasa, y se procedi a llevar a cabo una filtracin
de vacio para separar la biomasa del sobrenadante y posteriormente realizar una
purificacin en base al sobrenadante extrado.
En un trabajo industrial realizado en la farmacutica Shering Plaug se realizo
fermentacin de penicillium en un biorreactor ms sofisticado y con la mayora de los
ingredientes aadidos al medio que se preparo en esta prctica, segn sus resultados,
tienen comparacin con los obtenidos en la prctica debido a la explicacin tanto
bioqumica como microbiologa de las condiciones y nutrientes que demanda el hongo;
Alexander Fleming que fue el que descubri el antibitico comprob que con la glucosa y
el extracto de levadura se produca la fermentacin en el hongo para producir una
sustancia capaz de eliminar bacterias, descubrimiento que fue un gran avance al mundo
de la ciencia y sobre todo la medicina. Todo el medio preparado se hizo en base a las
necesidades que demandan el hongo penicillium para su desarrollo, considerando que
necesita una atencin especial para desarrollarse y si no se le brinda lo necesario el
hongo se contamina o simplemente no se desarrolla y expira. Por ende todas las
consideraciones anteriores al preparar el medio antes de efectuar una inoculacin. [2,4]
Realizando una investigacin ms profunda, tambin se discute que pudo haberse
utilizado sacarosa, su efecto respecto a nuestro medio de cultivo hubiese sido prspero,
pero no brinda suficientes fuentes de carbono debido a su inestabilidad como molcula
orgnica (no tiene todas sus conformaciones en posicin ecuatorial como la glucosa), por
ende bioqumicamente no se adapta completamente a las necesidades de desarrollo y
crecimiento en el hongo segn la literatura contrastada. [1-4]
Imagen 2.- Cantidad de biomasa presente en el medio de cultivo fermentado

Se aprecia una cantidad considerable de biomasa

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mediante la fermentacin del Hongo
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En otras investigaciones se encontr que el pH ptimo para que un hongo produzca


mayor cantidad de antibitico y menor cantidad de biomasa es de 4.5 a 5 a una
temperatura de 25 grados Celsius, debido a que una menor cantidad de biomasa
representa mayor accin del precursor sobre el metabolismo secundario en un hongo.
Para el caso del hongo penicillium se observo una buena proliferacin a los 3 das de
fermentacin a un pH 6.5 y una temperatura de 26 grados Celsius, pero se produjo mucha
biomasa despus de una semana en el fermentador. Segn la literatura este no es bueno
puesto que hora que se extraiga el antibitico este no ser tan efectivo como un
antibitico comercial, porque el precursor actu como inductor del metabolismo primario
en lugar del secundario. Otros trabajos industriales sealan que mientras mayor numero
de biomasa producida, mayor cantidad y efectividad del antibitico procesado, debido a
que alcanzo un estado estacionario, y una cantidad predominante de biomasa representa
un crecimiento paulatino, el hongo se adapto bien durante su etapa lag y continuo un
crecimiento logartmico exitoso. Su reproduccin fue tan prospera que el antibitico
procesado ser identificado mediante un antibiograma en la primera prueba. [1-3]
Purificacin del sobrenadante
Una vez realizada la filtracin al vacio se obtuvo un caldo impuro el cual se procedi a
purificar para obtener la penicilina. Despus de centrifugar el caldo y aadirle 200 mL de
Ciclohexanona, dejar reposar 5 das y aadir a un tubo de decantacin, se observo la
separacin de dos fases: Orgnica (tena otros metabolitos ajenos a la penicilina) de color
amarillo fuerte y Acuosa (contena a la penicilina) de color amarillo claro. Se separa la
fase acuosa y posteriormente se pasa sobre una columna cromatografa anionica, para
guardar y conservar el producto.
Es importante este proceso puesto que se tiene que extraer el antibitico de los otros
metabolitos inmersos en el caldo, para lo cual se centrifuga el sobrenadante y se le aade
ciclohexanona, cabe mencionar que la ciclohexanona es buena para solubilizar
metabolitos polares inmersos en el caldo, puesto que es un compuesto polar que ataca a
grupos aminos y carbonilicos de otro metabolitos secundarios. Comparando con otros
trabajos experimentales de obtencin de penicilina, se encuentra que anteriormente hubo
otros intentos de purificacin utilizando otros solventes polares como: ter, cloruro de
metileno y acetato de etilo, pero estos no resultaron en una separacin de fases
adecuada, aparte de que muchos metabolitos secundarios se colaban en la fase acuosa
de penicilina, por ende el solvente orgnico que ha dado mayor resultado es la
Ciclohexanona, de haberse usado ter o cualquier otro mencionado, se hubiese obtenido
una fase acuosa de un amarillo ms pronunciado. [Wade 2012]
Cuantificacin en la concentracin de penicilina obtenida
Todas las penicilinas tienen una estructura bsica (figura 1), la cual tiene una absorbancia
con una longitud de onda entre 200 y 230 nm. Se tom una longitud de onda de 285 nm,
ya que el espectrofotmetro no admita lecturas a menores longitudes de onda, aparte
285 nm todava se encuentra en el rango donde se obtiene una absorbancia relevante.

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mediante la fermentacin del Hongo
Penicillium Chrysogenum.

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Tabla 3.- Concentracin de cada una de las diluciones de Penicilina Comercial

Dilucin
0
1
2
3
4
5
6
7

Concentracin Absorbancia
500
1.218
125
1.005
62.5
1.052
31.25
0.702
7.8125
0.561
3.90625
0.483
1.953125
0.464
0.48828125
0.289

Estos resultados se obtuvieron en el espectro UV-VIS, cabe mencionar que el aparato


presento algunas fallas tcnicas y por consiguiente para la obtencin de las absorbancias
observadas, se tuvo que calibrar el espectro en la toma de cada muestra de penicilina
comercial, obteniendo unas lecturas ms adecuadas que las anteriores. Al elucidar las
absorbancias en el espectro, de principio se efectu una sola calibracin, tomando como
blanco una celda con agua destilada, y arrojando unas lecturas bastantes variables y que
mostraban datos inconsistentes, no mostraban ninguna tendencia en especfico, por ende
se tuvo que volver a realizar el espectro para presentar la tabla aqu mostrada.
Grfica 1: Curva de Calibracin de la penicilina comercial

Absorbancia de Penicilina Comercial


1.4
y = 0.1396ln(x) + 0.338
R = 0.9453

Absorbancia

1.2
1
0.8

Absorbancia

0.6
0.4

Logartmica
(Absorbancia)

0.2
0
0

100

200

300

400

500

600

Concentracin y Dilucin

Debido a la inconsistencia de la grafica, y al resultado que arrojo en el clculo de la


concentracin de la penicilina obtenida por fermentacin, que fue de 46,332.07385
mg/mL, es notable que este dato es mayor que la concentracin de la penicilina
comercial, y por tanto no es posible haber producido demasiada penicilina en un solo
proceso. Por lo tanto se procede a eliminar los dos datos que se sealan de verde, se
realiza una nueva regresin lineal, y se obtiene el siguiente grafico:

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Grfica 2: Curva de calibracin de la penicilina comercial (mejorada)

Absorbancia de Penicilina Comercial


1.2
y = 0.0103x + 0.4065
R = 0.9307

Absorbancia

1
0.8
0.6

Series1

0.4

Lineal (Series1)

0.2
0
0

20

40

60

80

Concentracin y Dilucin

Con esta grfica, se obtiene una tendencia lineal y congruente en la curva de calibracin
de la penicilina comercial, contrastando estos resultados con las lecturas de absorbancia
realizadas al producto de la cromatografa de penicilina, que fue de 1.886, el resultado
nos otorga una concentracin final de 143.64 mg/mL, y para el producto sobrenadante,
que fue de 1.795, el resultado fue una concentracin final de 134.805 mg/mL.
Un factor que puede interferir en la lectura de la absorbancia para la penicilina comercial,
son los excipientes contenidos en este medicamento, en especial la solucin inyectable
que se adjunta en la presentacin del mismo, otorgando valores no solo de la penicilina
sino tambin de los componentes mencionados. [4]
Al comparar los resultados del grafico con varios anlisis estadsticos en minitab, se
elucida que este mtodo es de los ms exactos para la determinacin de un
comportamiento grafico til para conocer concentraciones y constantes, cabe mencionar
que este tipo de datos resulto indispensable para la determinacin de la concentracin en
productos de penicilina obtenida por la fermentacin, y como las concentraciones tuvieron
un rango de nmeros aceptable, por ende se corrobora la eficiencia del mtodo de
referencia para conocer la cantidad de producto elaborado. [3]
Elaboracin de Antibiograma
Se realizaron 9 antibiogramas en total con tres cepas de diferentes hongos (Lotto, B.
Subtilus y Salmonella) y tres muestras distintas de penicilina (Comercial, sobrenadante y
producto de cromatografa), para comparar ambas y determinar la presencia de penicilina
obtenida despus de la fermentacin.
Las imgenes se aprecian a continuacin:

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Imagen 3: Halos de inhibicin de penicilina extrada a distintas concentraciones en cultivo Salmonella

Contaminacin

Inhibicin tanto del hongo


inoculado en el medio como
de los microorganismos
invasores

Imagen 4: Halos de inhibicin de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo B.


Subtilus

Imagen 5: Halos de inhibicin de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo


Salmonella

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Imagen 6: Antibiograma infectado por hongos ajenos al cultivado y halos de inhibicin penicilina
sobrenadante a distintas concentraciones en cultivo salmonella

Contaminacin

Inhibicin tanto del hongo


inoculado en el medio como
de los microorganismos
invasores

Imagen 7: Halos de inhibicin de muestra sobrenadante de penicilina a distintas concentraciones en


cultivo B. Subtilus

Imagen 8: Halos de inhibicin de producto cromatografa de penicilina a distintas concentraciones en


cultivo B. Subtilus

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Imagen 9: Halos de inhibicin de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo Lotto

Imagen 10: Halos de inhibicin de producto cromatografa de penicilina a distintas concentraciones en


cultivo Lotto

Considerando que cada antibitico tiene un mecanismo de accin diferente, y cuenta con
diferentes regiones moleculares activas, que pueden reaccionar con una bacteria, se
usaron tres muestras distintas del mismo antibitico, penicilina, aproximando las
concentraciones de las mismas, a las concentraciones que se encuentran de manera
comercial tanto en forma farmacutica, como medicamentos.
Como podemos apreciar en las siguientes imgenes, hubo inhibicin en todos los cultivos
donde se colocaron sensidiscos impregnados con las distintas penicilinas trabajadas en el
laboratorio, la mayor inhibicin apreciada en las tres cepas fue de la penicilina comercial,
posteriormente el producto obtenido de la cromatografa y al ultimo la muestra
sobrenadante. Con los halos de inhibicin obtenidos se corrobora la presencia y
produccin de penicilina en la fermentacin, y se aprecia que la excesiva biomasa
(imagen 2) contenida al fermentar el hongo, no afecto a la obtencin del antibitico, sino
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de lo contrario produjo mayor cantidad del mismo. A pesar de haberse contaminado las
cepas de las imgenes 3 y 6, se observa una inhibicin en el crecimiento de los hongos
enemigos desarrollados, corroborando con mayor certeza la obtencin del antibitico
puro, a tal magnitud de propagarse una combinacin de hongos por invasiones de
espacio en el agar, que propagarse por el mismo, porque el antibitico impeda
mencionada propagacin, por consiguiente, la afectividad de los antibiticos ayudo a
inhibir una mayor contaminacin en las cepas cultivadas en las cajas petri. [5-7,9]
La penicilina es un antibitico que pertenece al grupo de las aminopenicilinas, de manera
general, se sabe que la accin de este tipo de antibiticos, es bactericida, por lo que
actan sobre la pared celular inhibiendo la actividad transpeptidasa de las protenas
enzimticas fijadoras en bacterias. [Fara Reyes & et al., 2000]
Un mecanismo de resistencia a este antibitico, es la disminucin de porinas de la pared
celular, disminuyendo as la permeabilidad, teniendo como consecuencia una inhibicin, la
nica bacteria capaz de inhibir por completo el antibitico, es la Gram (-) Enterobacter,
Lotto y salmonella en cambio fueron las bacterias ms susceptibles ya que muestran
halos de inhibicin ms extensos. [6-8]
Imagen 11: Antibiograma ms llamativo y sobresaliente, halos de inhibicin de la muestra
sobrenadante en la fermentacin de penicilina, a distintas concentraciones en cultivo Lotto

67.4 mg/mL

33.7 mg/mL

En esta imagen se observan los halos de inhibicin del producto sobrenadante de la


penicilina extrada a distintas concentraciones en cultivo Lotto, cabe mencionar que Lotto
es gram (+), y por ende la inhibicin tuvo lugar y no ofreci resistencia al antibitico. Los
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procesos biolgicos por los que un microorganismo puede adquirir resistencia a un


antibitico son [5-7]:
Transformacin: cuando se transfiere ADN del medio ambiente hacia la bacteria y
se modifica el ADN de sta.
Conjugacin: Transferencia de ADN de una bacteria a otra por medio de un
plsmido.
Transduccin: Paso de material gentico de una clula a otra a travs de un fago.
Evolucin: A travs de proceso de adaptacin, seleccin natural y reproduccin
diferencial.
Conclusin
Con base a los resultados obtenidos se concluye sobre la importancia de considerar los
factores necesarios para la preparacin de un medio de cultivo enriquecido, adecuado a
un determinado microorganismo a desarrollar, ya que la fermentacin de un metabolito
secundario en especifico, no solo es producto del tipo de biorreactor empleado para su
elaboracin, sino de los factores microbiolgicos adecuados al microorganismo
seleccionado para producirlo, tales como: reactivos, materiales, y condiciones
ambientales (esterilidad, pH y temperatura), ya que de ello depende el sano desarrollo del
hongo inoculado. Fundamentando que el medio de cultivo debe ser apropiado al
microorganismo de inters, y quedar exento de cualquier microorganismo contaminante,
esto se logra gracias a la aadidura de sales al medio de cultivo y la esterilizacin del
mismo, y la zona de trabajo, como cada uno de los materiales a emplear, durante la etapa
de inoculacin.
Tambin se menciona la importancia de la cantidad de biomasa producida en el medio,
porque garantiza si hubo una correcta proliferacin del hongo en el mismo y se excretaron
los metabolitos secundarios de inters, las condiciones de temperatura y pH deben ser tal
cual lo sealan trabajos experimentales y fuentes literarias, ya que el hongo Penicillium
Chrysogenum es adaptable a pH casi neutro y temperatura ambiente, ya que se propicia
su ruta metablica secundaria la cual produce el antibitico de inters.
La purificacin del caldo de cultivo resulta esencial para la obtencin del compuesto, se
necesita un antibitico 100 % puro para poderse administrar por cualquier va, por ende
su importancia, porque administrar una penicilina impura puede generar efectos
secundarios y adversos a la salud del consumidor, y como no se conoce a los otros
metabolitos secundarios producidos por el hongo Penicillium Chrysogenum, por lo tanto
se desconoce su accin y posibles efectos biolgicos en el organismo.
Las Bacterias pueden tener diferentes mtodos de resistencia a los antibiticos, esto
debido al uso descomunal que la industria farmacutica ah dado a los mismos, en el rea
de la salud, este es un tema de inters para la poblacin civil, ya que se requieren de
nuevos frmacos capaces de inhibir un determinado crecimiento bacteriano por rutas
metablicas alternas que no generen ningn tipo de resistencia. Para la realizacin de un
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estudio de resistencia a antibiticos, no se puede generalizar a las bacterias por su


taxonoma ni tampoco por ser Gram (-) o Gram (+), porque cada bacteria tiene rutas
metablicas diferentes, y puede darse el caso que bacterias del mismo gnero arrojen
resultados diferentes para cada antibitico, lo mismo ocurre con los antibiticos, que a
pesar de estar en la misma clasificacin pueden dar resultados distintos a los esperados,
por lo cual si se desean resultados precisos, lo mejor es manipular una determinada cepa,
con un seleccionado antibitico.
Por ltimo se produjo penicilina pura a una concentracin de 143.64 mg/mL, gracias a la
fermentacin del hongo Penicillium chrysogenum en un biorreactor de tanque agitado
lamba, y un medio de cultivo enriquecido con precursores necesarios para inducir al
hongo a desarrollar un metabolismo secundario propicio a la excrecin del antibitico
deseado. Se someti el producto empleando mtodos que implican bioseparaciones,
procesos utilizados en la produccin de antibiticos por la microbiologa clnica.
Cuestionario Complementario
Nota: Este cuestionario se encontr en un protocolo experimental de una prctica
de laboratorio de microbiologa, y se decidi anexar las preguntas mas destacadas
a procesos que no se elaboraron en el laboratorio de fermentaciones, pero que son
de gran utilidad conocerlos.
1. Explica en qu consiste la prueba E.
La prueba E o mtodo PDM de epsilmetro ha sido usado exitosamente para analizar
anaerobios y otros organismos aerbicos. El trmino epsilmetro se refiere a una tira fina,
de 5 x 50 mm, inerte y no porosa con un gradiente continuo exponencial de agente
antimicrobiano inmovilizado en un lado y una escala de interpretacin impresa en el otro
lado. El gradiente de agente antimicrobiano cubre un amplio rango de concentracin, que
corresponde aproximadamente diluciones dobles. La pendiente de los cambios y los
rangos de concentracin estn ptimamente diseados para corresponder a rangos y
lmites de CIM clnicamente relevantes que son seleccionados para categorizar grupos de
susceptibilidad. Se inocula una placa de agar, que contenga un medio de prueba apto,
con un organismo de prueba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se
aplican las tiras de prueba en un patrn ptimo de tal manera que la mxima
concentracin en cada tira est ms cerca al borde exterior de la placa de Petri. La placa
es inmediatamente incubada aerbicamente o anaerbicamente por el periodo de tiempo
estipulado. Cuando es aplicado a una placa de agar inoculada, el gradiente
antimicrobiano de la tira es liberado inmediatamente en el agar, creando un gradiente
continuo y exponencial de concentraciones de agente antimicrobiano debajo del eje lineal
del material de soporte. [7]
Despus de la incubacin, se observa una elipse de inhibicin de crecimiento. La
interseccin entre el borde de la zona de inhibicin y la tira de soporte se produce en la
concentracin del antimicrobiano que ya no es capaz de inhibir el crecimiento. El punto de
interseccin da la concentracin inhibitoria (CI) en g/mL una medida directa de la
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susceptibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano probado. Las CIMs se leen


directamente sobre la escala en la tira de soporte. [8]
2. Explica, ejemplifica y esquematiza un proceso de sinergismo en antibiticos.
El sinergismo de los Antibiticos ocurre cuando el efecto de una combinacin es mayor
que la suma de los efectos de los antibiticos usados individualmente. En pacientes
hospitalizados con cateterizacin venosa profunda y sonda vesical, la presencia de fiebre,
escalofros e hipotensin arterial se debe sospechar la presencia de una sepsis urinaria o
relacionada con la cateterizacin, los microorganismos ms comunes que pueden
ocasionarlas son los estafilococos y otros Gram positivos, as como algunos Gram
negativos potencialmente resistentes. En estas situaciones se han obtenido buenos
resultados al combinar oxacilina o vancomicina con un aminoglucsido, fosfomicn,
algunos monobactmicos y el augmentn. [8]
3. Discute los efectos en la salud pblica por el reciente surgimiento de MRSA en
hospitales.
La aparicin de MRSA en hospitales y recientemente en la comunidad hace ms difcil el
tratamiento mdico para infecciones con MRSA pues ya que al ser multiresistentes a
antibiticos se necesita conocer muy bien los antibiticos que an pueden ser tiles para
tratar a estas cepas y no contribuir a que aumente su multiresistencia. [2-3]
4. Discute la importancia de la reforma al artculo 226, fraccin IV de la Ley General
de Salud
respecto a l surgimiento de cepas multiresistentes.
Es importante que un mdico sea el que pueda controlar la prescripcin de un
medicamento y por su parte la adquisicin de ste por el paciente, pues ya que as se
promueve la buena aplicacin de un tratamiento mdico especfico para las enfermedades
que un paciente pudiera tener y no permitir la automedicacin de la persona enferma y
por consiguiente contribuir a la aparicin de cepas multiresistentes a antibiticos. [7,9]
Referencias
[1] Romero Caballero Ral. (2008). Microbiologa y parasitologa humana: bases
etiolgicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias (1era Edicin). Mxico.
Editorial Medica Panamericana.
[2] Melo Ruiz V. (2007). Bioqumica de los procesos metablicos (2da Edicin).
Mxico. Editorial Reverte.
[3] Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition (Volume I). Ed. H.J.
Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.
[4] R M Atlas & B Bartha. (2005). Ecologa Microbiana y Microbiologa Ambiental.
Mxico. Editorial Pearson Espaa.
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[5][ Prescott, Harley, Klein][ Microbiologa, quinta edicin] [editorial McGRAW-HILL


interamericana]
4FV1
[6] [Michael T. Madigan, John M, Jack P, Brock] [Biologia de los Microorganismos,
10 edicin] [Pearson Prentice Hall]
[7] [Reporte multicntrico de los resultados de los ensayos de susceptibilidad a
antibiticos] [Ileana Gonzlez Bonet, Fernando Travieso Ruiz,* Leonora Gonzlez
Mesa, Estrella lvarez Varela,* Gilberto Tilln Ochoa* y Rolando Contreras
Alarcn.*] [Departamento de Investigaciones Biomdicas, Centro de Qumica
Farmacutica.][ Centro Nacional de Investigaciones Cientficas. Avenida 25 y 158,
Apartado Postal 6414, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.]
[8]
[INTERPRETACION
DE
LOS
ESTUDIOS
DE
SUSCEPTIBILIDAD
ANTIMICROBIANA] [Boletn Escuela de Medicina. Pontificia Universidad Catlica de
Chile][Dra. Elizabeth Palavecino Rosales]
[9] [Clasificacin de Antimicrobianos y Quimioterpicos][Dra. Almudena Calvo
Zamorano][Capitulo 54]

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Base de Calculo
Medio PYM de cultivo composicin para 1 L
Reactivo
Glucosa
Sulfato de amonio
Extracto de
Levadura
KCl
MgSO4
FeCl3

Cantidad (g) para


1000 mL
40
3
2

Cantidad (g) para


800 mL
32
2.4
1.6

Cantidad (g) para


200 mL
8
0.6
0.4

0.5
0.5
0.5

0.4
0.4
0.4

0.1
0.1
0.1

Calculo de la concentracin de la penicilina presente en el producto de la cromatografa


Con base a la ecuacin de la lnea de tendencia (Curva mejorada)
y = 0.0103x + 0.4065
Despejamos x para obtener el valor de la ecuacin
X = (y 0.4065)/0.0103
Sustituyendo el valor de la absorbancia medida a la muestra del producto de la
cromatografa y el sobrenadante, tenemos:
X = (1.886 0.4065)/0.0103 = 143.64 mg/mL (cromatografa)
X = (1.795 0.4065)/0.0103 = 134.805 mg/mL (Muestra sobrenadante)
Con base a la ecuacin de la lnea de tendencia (Curva normal)
y = 0.1443 ln (x) + 0.3357
Despejamos x para obtener el valor de la ecuacin
X = exp ((y 0.3357)/0.1443)
Sustituyendo el valor de la absorbancia medida a la muestra del producto de la
cromatografa y el sobrenadante, tenemos:
X = exp ((1.886 0.3357)/0.1443) = 46,332.07 mg/mL (cromatografa)
X = exp ((1.795 0.3357)/0.1443) = 24,660.52 mg/mL (Muestra sobrenadante)

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Concentraciones y diluciones para el espectro UV en penicilina comercial


La concentracin total de penicilina comercial era de 800,000 UI que a mg/mL son 500
Por lo tanto tenemos una concentracin de 500 mg/mL de penicilina comercial en mpula
Se realizan diluciones de mitad en mitad para determinar la absorbancia a diferentes
concentraciones, por tanto tenemos:
C1 = 500
C2 = C1/2 = 500/2 = 250
C3 = C2/2 =250/2 =125
C4 = C3/2 =125/2 = 62.5
C5 = C4/2 =62.5/2 = 31.25
C6 = C5/2 = 31.25/2 = 15.625
C7 = C6/2 =15.625/2 = 7.8125
C8 = C7/2 =7.8125/2 = 3.90625
C9 = C8/2 =3.90625/2 = 1.953125
C10 = C9/2 =1.953125/2 = 0.9765625
C11 = C10/2 = 0.9765625/2 = 0.48828125

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera Campus Guanajuato


Profesora: Diana Ramrez Senz

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