Tesis Presentada Por El Bachiller: Raúl Orlando Herencia Montesinos para Optar El Título Profesional de

UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACETICAS, BIOQUMICAS Y

BIOTECNOLGICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERA BIOTECNOLGICA
HERRAMIENTAS BIOINFORMTICAS EN EL ESTUDIO

TERMODINMICO SOBRE LA ESPECIFICIDAD DE LAS TOXINAS
Cry1Aa Y Cry4Ba DE Bacillus thuringiensis COMO AGENTES
ENTOMOPATGENOS
Tesis presentada por el Bachiller:

RAL
ORLANDO
HERENCIA
MONTESINOS
Para optar el Ttulo Profesional de
INGENIERO BIOTECNLOGO
Asesor: Dr. Badhin Gmez Valdez, PhD.
AREQUIPA PER
2011
Algo he aprendido en mi larga vida: que toda

nuestra ciencia, contrastada con la realidad, es
primitiva y pueril; y, sin embargo, es lo ms valioso
que tenemos A.E.
Agradecimientos:
A Dios y a la Virgen de la Estrella, a mi

pap Lulo, mam Rita, pap Ral, mam Ely
y hermanita Mily por ser mi apoyo, mi
fuerza, mis guas y mi razn de alegra.
A mis tos: Edgar, Juan y Carlos por sus
palabras de aliento.
Al Dr. Badhin Gmez por los sabios consejos
y valiosa colaboracin en el presente
Trabajo de Investigacin.
A Claudia, por tu compaa y cario
A los chicos del laboratorio de
Bioinformtica.
ndice
ndice
I
ndice de Figuras
IV
ndice de Tablas
VIII
Glosario
IX
Resumen
Abstract
XI
1. Introduccin
Objetivos
1.0.1. Objetivo General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.0.2. Objetivos Especficos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
Hiptesis
2. Marco Terico
2.1. Biopesticidas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
NDICE
II
2.2. Bacillus thuringiensis. . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . .
2.3. Protenas Cry . . . . . . . . . . .

. . . . .. . . . . . . . . . . . .
..
2.3.1. Tipos de protenas Cry . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
2.3.2. Modos de accin. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
11
2.3.3. Cry1Aa. . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . .
12
2.3.4. Receptor APN de Cry1Aa. . . . . .. . . . . . . . . . . . .
14
2.3.5. Cry4Ba. . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . .
14
2.3.6. Receptor APN de Cry4Ba.
. . . . .. . . . . . . . . . . . .
15
2.3.7. Futuro de las Toxinas Cry . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
16
2.4. Bioinformtica . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .
16
2.4.1. Mtodos bioinformticos. .
. . . . .. . . . . . . . . . . . .
17
2.4.2. Termodinmica Estadstica. . . . . .. . . . . . . . . . . . .
31
3. Metodologa y Detalles Computacionales
34
3.1. Equipos y Software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
34
3.2. Eleccin de las estructuras usadas en las simulaciones. . . . . . . .
35
3.3. Construccin de una toxina modificada: Cry1Mosq. . . . . . . . . ..
36
3.4. Optimizacin de la geometra. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
37
3.5. Dinmica Molecular de estructuras terciarias. . . . . . . . . . . . .
38
3.6. Docking de estructuras terciarias. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
39
3.7. Dinmica Molecular de estructuras cuaternarias. . . . . . . . . . . ..
40
3.8. Obtencin y Estudio de Parmetros Termodinmicos
41
. . . . . . . . .
4. Resultados y Discusin
4.1. Estructuras
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
42
42
NDICE
III
4.2. Construccin de la Toxina modificada . . . . . . . . . . . . . . . . .
45
4.3. Estabilidad de estructuras terciarias. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
49
4.4. Docking de Estructuras terciarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
75
4.5. Estabilidad de estructuras cuaternarias . . . . . . . . . . . . . . . . .
77
4.6. Termodinmica . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . . . . . . . . . . 103
Conclusiones
107
Sugerencias
109
Bibliografa
110
Anexos
117
A. Archivos utilizados
118
B. Ecuaciones Utilizadas
122
C. Datos de la Simulacin
124
D. Resultados QUESC
128
ndice de Figuras
2.1. Filograma de identidades entre las secuencias Cry. . . . . . . . . . .
10
2.2. Modo de accin de las toxinas Cry. . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
11
2.3. Estructura terciaria de la toxina Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . ... . ..
12
2.4. Cry1Aa y sus dominios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
2.5. Estructura terciaria de la toxina Cry4Ba. . . . . . . . . . . . . . .
15
2.6. Cry4Ba y sus dominios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
2.7. Funcin x2 + 2y2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
19
2.8. Bsqueda lineal en una dimensin . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
20
4.1. Modelado de APN Manduca sexta . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
4.2. Modelado de APN Aedes aegypti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
43
4.3. Estructuras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
44
4.4. Alineamiento de las secuencias FASTA de Cry1Aa y Cry4Ba . . . . ..
46
4.5. Secuencia FASTA de Cry1Mosq. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
47
4.6. Toxinas Cry y sus respectivos tamaos de loops. . . . . . . . . . . . .
48
4.7. Estabilidad Energtica Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
50
4.8. Estabilidad Estructural Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
51
4.9. Estabilidad Energtica Cry4Ba.
52
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
IV
NDICE DE FIGURAS
4.10. Estabilidad Estructural Cry4Ba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
53
4.11. Estabilidad EnergticaCry1Mosq
. . . . . . . . . . . . . . . . . . .
54
4.12. Estabilidad Estructural Cry1Mosq. . . . . . . .. . . . . . . . . . .
55
4.13. Estabilidad Energtica de APN de Manduca sexta . . . . . . . . . . .
56
4.14. Estabilidad Estructural de APN de Manduca sexta. . . . . . . . . . .
57
4.15. Estabilidad Energtica de APN de Aedes aegypti. . . . . . . . . . . .
58
4.16. Estabilidad Estructural de APN de Aedes aegypti. . . . . . . . . . . .
59
4.17. Grfica de Ramachandran Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
60
4.18. Grfica de Ramachandran Cry4Ba. . . . . . . . . . . . . . . . . .
61
4.19. Grfica de Ramachandran Cry1Mosq . . . . . . ... . . . . . . . . . . .
62
4.20. Grfica de Ramachandran AP Nms . . . . . . . . . . . . . . . . . .
63
4.21. Grfica de Ramachandran AP Nae
. . . . . . . . . . . . . . . . . .
64
4.22. Vista isomtrica de Cry1Aa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
65
4.23. Vista Isomtrica de Cry1Aa. Potencial Electrosttico . . . . . . . . .
66
4.24. Vista Isomtrica de Cry4Ba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
67
4.25. Vista Isomtrica de Cry4Ba. Potencial Electrosttico . . . . . . . . .
68
4.26. Vista Isomtrica de Cry1Mosq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
69
4.27. Vista Isomtrica de Cry1Mosq. Potencial Electrosttico. . . . . . . .
70
4.28. Vista Isomtrica de AP Nms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
71
4.29. Vista Isomtrica de AP Nms. Potencial Electrosttico . . . . . . . .
72
4.30. Vista Isomtrica de AP Nae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
4.31. Vista Isomtrica de AP Nae. Potencial Electrosttico. . . . . . . . . .
74
4.32. Scores de energa: Docking. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..
76
..
NDICE DE FIGURAS
VI
4.33. Estabilidad Energtica AP Nms Cry1Aa . . . . . . . . . . . . . . .
77
4.34. Estabilidad Estructural AP Nms Cry1Aa . . . . . . . . . . . . . . .
78
4.35. Estabilidad Energtica AP N ms Cry4Ba.
. . . . . . . . . . . . . .
79
4.36. Estabilidad Estructural AP Nms Cry4Ba . . . . . . . . . . . . . . .
80
4.37. Estabilidad Energtica AP Nms Cry1Mosq . . . . . . . . . . . . . .
81
4.38. Estabilidad Estructural AP Nms Cry1Mosq . . . . . . . . . . . . . .
82
4.39. Estabilidad Energtica AP Nae Cry1Aa. .
. . . . . . . . . . . . . .
83
4.40. Estabilidad Estructural AP Nae Cry1Aa. .
. . . . . . . . . . . . . .
84
4.41. Estabilidad Energtica AP Nae Cry4Ba. .
. . . . . . . . . . . . . .
85
4.42. Estabilidad Estructural AP Nae Cry4Ba. .
. . . . . . . . . . . . . .
86
. . . . . . . . . . . . . .
87
. . . . . . . . . . . . . .
88
4.43. Estabilidad Energtica AP N ae Cry1Mosq

4.44. Estabilidad Estructural AP Nae Cry1Mosq
4.45. Ploteo de Ramachandran para AP Nms Cry1Aa. .
. . . . . . . . . .
89
4.46. Ploteo de Ramachandran para AP Nms Cry4Ba. .
. . . . . . . . . .
90
4.47. Ploteo de Ramachandran para AP Nms Cry1Mosq . . . . . . . . . .
91
4.48. Ploteo de Ramachandran para AP Nae Cry1Aa. .
. . . . . . . . . .
92
4.49. Ploteo de Ramachandran para AP Nae Cry4Ba. .
. . . . . . . . . .
93
4.50. Ploteo de Ramachandran para AP Nae Cry1Mosq . . . . . . . . . .
94
4.51. Estructura cuaternaria AP Nms Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . .
97
4.52. Estructura cuaternaria AP Nms Cry4Ba. . . . . . . . . . . . . . . .
98
4.53. Estructura cuaternaria AP Nms Cry1Mosq .. . . . . . . . . . .
99
4.54. Estructura cuaternaria AP Nae Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . 100

4.55. Estructura cuaternaria AP Nae Cry4Ba. . . . . .. . . . . . . . . . . 101
NDICE DE FIGURAS
VII
4.56. Estructura cuaternaria AP Nae Cry1Mosq. . . . . . . . . . . . . . 102

A.1. Archivo minima.mpd con integrador steepest descent. . . . . . . .
119
A.2. Archivo minima.mpd con integrador l-bfgs. . . .. . . . . . . . . . . . 120

A.3. Archivo nvt.mpd con integrador MD . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
D.1. Resultados de QUESC para AP Nms Cry1Aa. .
. . . . . . . . . . . 129
D.2. Resultados de QUESC para AP Nms Cry4Ba. .
. . . . . . . . . . . 130
D.3. Resultados de QUESC para AP Nms Cry1Mosq . . . . . . . . . . . 131

D.4. Resultados de QUESC para AP Nae Cry1Aa. .
. . . . . . . . . . . 132
D.5. Resultados de QUESC para AP Nae Cry4Ba. .
. . . . . . . . . . . 133
D.6. Resultados de QUESC para AP Nae Cry1Mosq. . . . . . . . . . . . 134
ndice de Tablas
3.1. Conformaciones para el dockeo de protenas terciarias . . . . . . . .
40
4.1. Protenas y sus valores de Energa . . . . . . . . . . . ... . . . . . . . 103

4.2. Sistemas y sus caractersticas fsicas. . . . . . . . . . . . . . . . . 104
4.3. Sistemas y sus caractersticas termodinmicas para Manduca sexta . . 105
4.4. Sistemas y sus caractersticas termodinmicas para Aedes aegypti. . . 105
B.1. Relaciones Termodinmicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
C.1. Valores de Energa Potencial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124
C.2. Valores de Energa Cintica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
C.3. Valores de Energa Total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125
C.4. Valores de Radio de Giro. .
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
C.5. Valores de Nmero de enlaces de Hidrgenos . . . . . . . . . . . . . 126

C.6. Valores de RMSD. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Glosario
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
PIPs. Plant-Incorporated-Protectants.
ICPs. Insecticidal Crystal Proteins.
BT. Bacillus thuringiensis.
NCBI. National Center for Biotechnology Information.
PDB. Protein Data Bank.
Cry1Aa. Toxina especfica para lepidpteros.
Cry4Ba. Toxina especfica para dpteros.
Cry1Mosq. Toxina modificada para presentar actividad frente a lepidpteros
y dpteros.
9. APNms. Aminopeptidasa N de Manduca sexta.
10. APNae. Aminopeptidasa N de Aedes aegypti.
11. FFT. Fast Fourier Transform.
12. MM. Mecnica Molecular.
13. DM. Dinmica Molecular.
14. RMSD. Root Mean Square Deviation.
15. RMSF. Root Mean Square Fluctuation.
16. Rg. Radius of Gyration
Resumen
En el presente trabajo de investigacin se busc simular la interaccin Toxina
Receptor, con la finalidad de obtener un mejor entendimiento de la especificidad de
las Toxinas Cry1Aa y Cry4Ba procedentes de Bacillus thuringiensis.
Para ello, se realizaron simulaciones de Dinmica Molecular para los seis sistemas de
interaccin utilizando tres toxinas Cry ( Cry1Aa, Cry4Ba y Cry1Mosq) y la posible
protena receptora Aminopeptidasa N de Manduca sexta y Aminopeptidasa N de
Aedes aegypti. Luego de realizar una simulacin de Dinmica Molecular para las
cinco protenas antes mencionadas y los seis sistemas de interaccin Toxina
Receptor, se obtuvieron los datos de Energa de Interaccin; a partir de los cuales se
obtuvo la Energa Interna (U), Entropa (S), Entalpa (H) y Energa Libre de
Helmholtz (A). Posteriormente, para las seis interacciones descritas se obtuvo una
A igual a 0 y para el caso de las interacciones que involucran a la Aminopeptidasa
N de Manduca sexta, los parmetros termodinmicos antes mencionados indican que
las reacciones fueron exotrmicas y tienden al orden. En el caso de las interacciones
relacionadas a la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti, las reacciones fueron
endotrmicas y tienden al desorden.
Finalmente, la especificidad de las Toxinas Cry de Bacillus thuringiensis, no
involucrara solo a las protenas Aminopeptidasa N, pero estas si jugaran un papel
importante debido a que presentan varios sitios activos de interaccin.
Abstract
In the present work of investigation the interaction Toxin - Bonding Protein was
simulated, with the purpose of obtaining a better understanding of the specificity of
Toxins Cry1Aa and Cry4Ba of Bacillus thuringiensis.
For that purpose, there were realized simulations of Molecular Dynamics for six
systems of interaction using three toxins Cry (Cry1Aa, Cry4Ba and Cry1Mosq) and
the possible binding protein Aminopeptidase N of Manduca sexta and
Aminopeptidase N of Aedes aegypti. After realized a simulation of Molecular
Dynamics for the five proteins before mentioned and the six systems of interaction
Toxin - Binding Protein, there was obtained the information of Interaction Energy;
from which there was obtained the Internal Energy (U), Entropy (S) and
Helmholtz Free energy (A). After that, for the six described interactions it was
obtained A equally to 0 and for the interactions that involve the Aminopeptidasa N
of Manduca sixth, the thermodynamic parameters before mentioned indicate that the
reactions were exothermic and stretch to the order. In the case of the interactions
related to the Aminopeptidasa N of Aedes aegypti, the reactions were endothermic
and they tend to the disorder.
Finally, the specificity of the Toxins Cry of Bacillus thuringiensis, would not involve
only to the proteins Aminopeptidasa N, but these would play an important work due
to the fact that they present several actives sites of interaction.
Captulo 1
Introduccin
Si tenemos en cuenta la tendencia hacia la conservacin del medio ambiente y el
potencial peligro para la salud humana que muchos insecticidas convencionales
causan, se ha generado una demanda de bioinsecticidas, la cual se ha incrementado
notoriamente por todo el mundo. Los bioinsecticidas ofrecen varias ventajas sobre
los insecticidas tradicionales, fundamentalmente en la diferencia del tiempo de vida
media en el ambiente (59), y su capacidad de biodegradacin. Los bioinsecticidas
presentan una actividad altamente especfica para cierto tipo de familias de insectos,
a diferencia de los insecticidas convencionales, que a menudo afectan a un amplio
espectro de insectos, y en algunos casos afectando a aves y especies de mamferos
pequeos que pueden ser necesarios en el nicho ecolgico de las plantas. Otra de las
ventajas de los bioinsecticidas, es la eficacia a bajas concentraciones y con una
exposicin inferior.
Actualmente los insectos considerados plagas son uno de los factores que limitan
la produccin agrcola, dado que atacan a los cultivos vegetales desde su siembra
hasta la cosecha e incluso en la etapa de almacenamiento, causando prdidas de hasta
en un 40 % de la produccin total (42). Todos estos aspectos son de mucha
importancia para las prcticas agrcolas en general, y deberan ser tomados muy en
cuenta para el estudio de protenas con propiedades de biocontroladores.
Para la produccin de bioinsecticidas, se han venido utilizando algunos tipos de
bacterias (46), dentro de los cuales tenemos a la Bacillus thuringiensis, la cual es una
1
bacteria Grampositiva, aerobia estricta, que durante su ciclo de vida presenta dos
fases principales: crecimiento vegetativo, donde las bacterias se duplican por
biparticin, y esporulacin. Bacillus thuringiensis es considerada una bacteria
ubicua, ya que se ha aislado en diferentes partes del mundo y en muy diversos
ecosistemas; como suelos, aguas, hojas de plantas, insectos muertos, telaraas, etc.
Al Bacillus thuringiensis, se le caracteriza por producir un cuerpo paraesporal
conocido como cristal durante su fase de esporulacin, el cual es de naturaleza
proteica y tienes propiedades insecticidas. El cristal proteico est constituido por
protenas denominadas endotoxinas tambin conocidas como protenas Cry Cyt.
Se han encontrado -endotoxinas activas contra insectos lepidpteros (mariposas),
colepteros (escarabajos), dpteros (mosquitos), himenpteros (hormigas), caros y
tambin contra otros invertebrados como nematodos, gusanos planos y protozoarios.
Un incremento en el empleo de pesticidas en base a toxinas de Bacillus thuringiensis

sobre insectos plagas, depende del progreso de varias reas. Resultados recientes
indican que se estn obteniendo avances en la comprensin de la regulacin de
toxinas Bt en Bacillus thuringiensis y su aplicacin de estos conocimientos para el
desarrollo de nuevas toxinas.
La bsqueda de nuevas toxinas siguen progresando, y hasta ahora, los
descubrimientos han proporcionado la diversidad suficiente para encontrar el desafo
de las diferentes resistencias que se encuentran en el campo; nuevos descubrimientos
tambin son activamente desarrollados en productos (53). Muchas preguntas y dudas
fueron hechas en torno a la base de la resistencia en los diferentes insectos. La
combinacin de todas las investigaciones debera inducir a preservar y extender el
uso de los biocontroladores.
Objetivos
1.0.1.
Estudiar
Objetivo General
termodinmicamente,
mediante
herramientas
bioinformtica
las
interacciones Toxina Receptor conformadas por las protenas Cry1Aa, Cry4Ba y

Cry1Mosq con los receptores Aminopeptidasa N de
Manduca sexta y
Aminopeptidasa N de Aedes aegypti.
1.0.2.
Objetivos Especficos
1. Disear la toxina modificada Cry1Mosq, mediante sustitucin de aminocidos a

partir del alineamiento de las toxinas Cry1Aa y Cry4Ba.
2. Obtener la estabilidad energtica y estructural de las toxinas Cry1Aa, Cry4Ba,
Cry1Mosq; de los receptores Aminopeptidasa N de Manduca sexta y Aedes aegypti
mediante una simulacin de Dinmica Molecular; utilizando un ensamble cannico y
software GROMACS.
3. Obtener las estructuras cuaternarias de las interacciones ToxinaReceptor
mediante una simulacin de Docking Molecular, utilizando el servidor ClusPro.
4. Obtener la estabilidad energtica y estructural de las seis interacciones Toxina
Receptor, utilizando un ensamble cannico y software GROMACS.
5. Evaluar las propiedades termodinmicas de energa interna, entropa, entalpa y
energa libre de Helmholtz de los sistemas estudiados a partir de los datos de Energa
Total obtenida durante las simulaciones de Dinmica Molecular.

3
Hiptesis
Dado que la aplicacin de la Bioinformtica nos brinda datos de la estabilidad
energtica de interacciones Toxina Receptor, es probable que determine
termodinmicamente dicha interaccin utilizando toxinas de Bacillus thuringiensis y
Aminopeptidasa N como receptoras.
Captulo 2
Marco Terico
Para poder entender adecuadamente el desarrollo de esta investigacin, es
indispensable hacer una breve descripcin de los mtodos aplicados por la mecnica
cuntica, para resolver los diversos problemas a nivel molecular, as como de la
importancia de las molculas que son la materia de nuestra investigacin. Para ello,
en el presente captulo, daremos un breve pero completo vistazo a las toxinas Cry de
Bacillus thuringiensis, as como los modos de interactuar de las toxinas con los
receptores en sus respectivos insectos blancos. Tambin daremos una introduccin a
los diferentes conceptos tericos a ser utilizados para la sistematizacin de la
informacin extrada desde clculos mecnico cunticos.
2.1.
Biopesticidas
Los biopesticidas son tipos de pesticidas obtenidos de materiales naturales como

animales, plantas, bacterias, y ciertos minerales (42). Por ejemplo, canola el aceite y
el bicarbonato de sodio tienen usos pesticidas y son considerados biopesticidas. Al
final de 2001, haba aproximadamente 195 registros de ingredientes para producir
biopesticidas activos y 780 productos finales.
Los biopesticidas pueden caer en tres diferentes categoras:
Pesticidas microbianos; a base de un microorganismo (p.ej., una bacteria, el hongo,

el virus o protozoario) como el ingrediente activo. Los pesticidas microbianos
pueden controlar muchas clases diferentes de parsitos, aunque cada uno es
relativamente especfico para su parsito blanco. Por ejemplo, hay hongos que
controlan ciertas plantaciones, y otros hongos que matan insectos especficos. Dentro
de los biopesticidas, los organismos ms extensamente es Bacillus thuringiensis o Bt.
Cada cepa de esta bacteria produce una mezcla diferente de protenas, y
expresamente mata larvas de insecto. Mientras algunas toxinas de Bacillus
thuringiensis, tienen eficacia en larvas de polillas, otro toxina es especfica para las
larvas de mosquitos. La especificidad de las toxinas hacia el insecto blanco, es
determinada por si Bacillus thuringiensis produce una protena que pueda unirse a un
receptor visceral en las larvas, y as infectar las larvas.
Plant Incorporated-Protectants (PIPs); son sustancias pesticidas que las plantas
producen utilizando el material gentico que se les ha sido aadido. Por ejemplo, los
cientficos pueden tomar el gen de Bacillus thuringiensis que codifica la toxina, e
introducir el gen en el propio material gentico de la planta. Entonces la planta, en
vez de la bacteria Bt, fabrica la sustancia que infecta al parsito.
Pesticidas bioqumicos;
naturalmente se producen sustancias que controlan a
parsitos por mecanismos no txicos. Pesticidas convencionales, por el contrario,

son en base a materiales generalmente sintticos que directamente matan al parsito.
Los pesticidas bioqumicos incluyen sustancias, como las feromonas de insectos o
varios extractos de plantas perfumadas que atraen insectos a trampas.
Cules son las ventajas de usar biopesticidas?
Los biopesticidas son por lo general intrnsecamente menos txicos que los
pesticidas convencionales. Los biopesticidas generalmente afectan slo al insecto
blanco y organismos estrechamente relacionados, en contraste con el amplio espectro
de los pesticidas convencionales que pueden afectar organismos como pjaros,
insectos, y a menudo se descomponen rpidamente, as se usan en exposiciones

inferiores y en gran parte evitan los problemas de contaminacin causados por
pesticidas convencionales (19).
2.2. Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis fue descrita por Berliner cuando aisl un Bacillus de una
polilla del Mediterrneo (Anagasta kuehniella), y lo nombr de acuerdo al Thringia
en Alemania, donde fue encontrada la polilla (50). Es una bacteria insecticida Grampositiva, aerobia estricta que produce inclusiones proteicas durante su esporulacin
(5), pertenece a la familia Bacillaceae y est relacionada a Bacillus cereus. Su ciclo
de vida presenta dos fases principales que son el crecimiento vegetativo, donde las
bacterias se duplican por biparticin, y esporulacin, que consiste en la
diferenciacin de bacteria a espora. Las inclusiones son compuestas de protenas
conocidas como toxinas Cry, o las -endotoxinas, que son sumamente importantes
para el control agrcola de insectos relacionados con la salud, as como otros
invertebrados; adems de no ser nocivos para el ser humano. A causa de su alta
especificidad y su amistad con el ambiente, estas protenas son una alternativa
valiosa frente a los pesticidas qumicos para el control de de plagas (54).
La actividad como bioinsecticida de Bacillus thuringiensis es debida a inclusiones
intracelulares en forma de cristal producidas durante el proceso de esporulacin.
Estos cristales producidos durante la esporulacin, son de naturaleza proteica y
tienen propiedades insecticidas. El cristal proteico est constituido por protenas
denominadas endotoxinas, tambin conocidas como protenas Cry (cristales) y
Cyt (citolticas). Se han encontrado endotoxinas activas contra insectos
lepidpteros (mariposas), dpteros (mosquitos) y tambin contra otros invertebrados
como nematodos, gusanos planos y protozoarios (55).
2.3. Protenas Cry

Bacillus thuringiensis produce inclusiones citoplasmticas conteniendo uno o ms
protenas cristalizadas, que tienen actividad insecticida (ICP). La mayora de ICPs
son sintetizadas intracelularmente como protoxinas inactivas que espontneamente
forman pequeos cristales, de aproximadamente 1 m de tamao (22). Luego que se
produce la ingestin por insectos susceptibles, los cristales son solubilizados por
secreciones intestinales (41). La protoxinas solubilizadas es activada por proteasas
que se encuentran en las secreciones intestinales. Luego de este proceso se forma en
si las toxinas activadas.
La diversidad estructural de toxinas Cry, son clasificadas en base a una secuencia
homologa de aminocidos, donde cada toxina a adquirido un nombre que consiste en
el Cry mnemnico y cuatro letras jerrquicas que consisten en nmeros naturales y
letras maysculas (44), dependiendo de su lugar en el rbol filognico. (Figura 2.1)
2.3.1. Tipos de protenas Cry

A la fecha, las protenas Cry estn distribuidas en 50 grupos y varios subgrupos.
Cada grupo muestra una especificidad muy grande hacia ciertos tipos de insectos. La
Figura 2.1, muestra un filograma de las toxinas Cry descritas a la fecha (56). Las
lneas verticales representan los lmites en identidad que marcan las diferentes
categoras en la nomenclatura. El nmero arbigo se designa con la primera fila que
corresponde a identidades hasta 45% de identidad (por ejemplo: Cry1, Cry2, etc.). La
segunda hilera cataloga a las protenas con una letra mayscula y corresponde a
identidades de 45 a protenas 78% (Cry1A, Cry1B, etc.). La tercera fila asigna una
letra minscula y corresponde a identidades de 78 a 95% (Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac,
etc.). La ltima fila influye un nmero arbigo al final al final de la nomenclatura
indicando ms de 95% de identidad. (Cry1Aa1, Cry1Aa2, etc.). El grupo mayoritario
de toxinas Cry se les conoce como la familia de tres dominios, ya que estn
constituidas por tres dominios estructurales (55).
Figura 2.1: Filograma de identidades entre las secuencias Cry. Las lneas verticales denotan los cuatro
niveles de la nomenclatura. Tomado y adaptado de Las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis: modo
de accin y consecuencias de su aplicacin (Sobern, 2007)
2.3.2. Modos de accin

Las protenas Cry son producidas como protoxinas que requieren ser procesadas
proteolticamente por proteasas presentes en el intestino de insectos susceptibles
(46). Este procesamiento proteoltico libera fragmentos txicos de 55 a 65 kDa que
interaccionan con protenas receptoras presentes en la microvellosidad de las clulas
intestinales de los insectos blancos. Posteriormente, las toxinas se insertan en la
membrana formando un poro ltico. Los sntomas que se observan a partir de que las
larvas de insectos susceptibles ingieren los cristales y esporas de Bacillus
thuringiensis son: cese de la ingesta, parlisis del intestino, diarrea, parlisis total y
finalmente la muerte (11). De manera general se acepta que las toxinas Cry son
toxinas formadoras de poro que ejercen su actividad txica al provocar un
desequilibrio osmtico en las clulas epiteliales donde se insertan en la membrana.
Figura 2.2: Modo de accin de las toxinas Cry, desde la ingestin (a), activacin (b-c), interaccin (d)
y formacin del poro ltico (e). Adaptado de How Bacillus thuringiensis has evolved specific toxins to
colonize the insect world (Maagd, 2001)
En la Figura 2.2 se ilustra el modo de accin de las toxinas Cry. (a) Luego de la
ingestin, las toxinas Cry se disuelven en el jugo intestinal de las toxinas.
11
(b) Las proteasas en el intestino, retiran secuencia C-terminal (zona morada), as

como la secuencia N-terminal (zona amarilla). (c) La toxina activada (ej. Figura 2.3)
se uno a los receptores en la membrana de clulas epiteliales, un proceso en el cual el
Dominio II y III, se ven envueltos (44). (d) El dominio I, queda fuera de la
interaccin, pero forma parte de una nueva insercin en la membrana. (e) Las toxinas
insertadas, forman poros probablemente como oligomricos.
A la actualidad se han resuelto las estructuras tridimensionales de varias toxinas Cry
activas contra insectos colepteros, lepidpteros, dpteros y una con actividad dual. A
pesar que la identidad entre estas toxinas es baja (en algunos casos menores al 25%),
muestran una estructura similar compuesta por tres dominios.
2.3.3. Cry1Aa
Figura 2.3: Estructura terciaria de la toxina Cry1Aa. Dominio I (color azul), dominio II (color verde) y
dominio III (color rojo). Estructura en formato adaptada a partir del trabajo Bacillus thuringiensis
CrylAa Insecticidal Toxin: Crystal Structure and Channel Formation (Grochulski, 1995). Foto
obtenida mediante Chimera 1.5.3
La toxina Cry1Aa es molcula globular compuesta por tres diferentes dominios

(Figura 2.3), que presenta especificidad en lepidpteros. El dominio I (Figura 2.4.a),
que se extiende desde el residuo 33 al residuo 253, est constituido por siete hlices
12
(a)
(b)
(c)
Figura 2.4: Cry1Aa y sus dominios. Dominio I (a), dominio II (b) y dominio III (c). Estructura
adaptada del trabajo: Bacillus thuringiensis CrylAa Insecticidal Toxin: Crystal Structure and Channel
Formation (Grochulski, 1995). Foto obtenida mediante Chimera 1.5.3
antiparalelas y anfipticas. Seis de stas forman un ramillete que rodea a la hlice a

5. ste es el dominio que forma el poro inico (22). El domino menos conservado en
secuencia y estructura terciaria entre las toxinas Cry es el dominio II (Figura 2.4.b).
Este dominio, se extiende desde el residuo 264 al 461, est formado por tres lminas
plegadas y por tres asas. En las asas de estas lminas se observa la mayor
diferencia estructural. El dominio II juega un papel fundamental en la especificidad
de la toxina, donde las asas interaccionan con el receptor localizado en las
microvellosidades de las clulas epiteliales del intestino medio. El dominio III
(Figura 2.4.c), que tambin est involucrado en la interaccin con receptores, es un
sndwich de dos cadenas antiparalelas y comprende desde el residuo 461 a 609.
Las protenas que se han propuesto como posibles de las toxinas Cry1A en insectos
lepidpteros son la aminopeptidasa N (APN) y una protena de la familia de las
cadherinass (BTR). El alineamiento de la secuencia de aminocidos muestra que
Cry4Ba mantiene 5 conformaciones de Cry1Aa, por lo cual se entiende que ambas
protenas muestren una topologa muy parecida.
Se presume que Cry1Aa y Cry4Ba tienes un modo de actuar similar, pero que tienen
diferentes especies de insectos blanco (41). Cry1Aa es una toxina especfica para
lepidpteros pero no tiene alguna actividad sobre mosquitos.
2.3.4.
Receptor APN de Cry1Aa
La APN es una protena con masa aparente de 120 kDa que se encuentra anclada a la
membrana a travs de un poro glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) (1). Una de las
isoformas de APN, localizadas en las clulas epiteliales del intestino de insectos se
une especficamente a las toxinas Cry1 de Bacillus thuringiensis. Esta interaccin es
reportada para muchos insectos lepidpteros, como Manduca sexta.
Manduca sexta, es un lepidptero conocido tambin como gusano del tabaco (62).
Los gusanos de tabaco y el tomate son orugas grandes que defolian plantas de tomate
(36). Su gran tamao les permite destruir plantas del follaje en un corto perodo de
tiempo.
Aunque APN fuera la primera protena Cry1A obligatoria identificada en Manduca
sexta (31, 57), su papel como receptor funcional es todava polmico (3). Estos datos
al parecer polmicos, podran ser explicados si un receptor adicional secundario
pudiera jugar el mismo papel que APN en M. sexta. En cuanto a esto, una protena
ALP, tambin fue identificada en M. sexta, aunque su papel como un receptor Cry1A
no haya sido analizado hasta ahora.
2.3.5.
Cry4Ba
La toxina Cry4Ba aislada a partir de Bacillus thuringiensis, es una toxina especfica

para larvas de mosquitos Aedes y Anopheles.
De la misma manera que Cry1Aa, Cry4Ba posee 3 dominios:
El primer Dominio (Figura 2.6.a), los residuos 84-282 forman 5 hlices (9). El
dominio II (Figura 2.6.b), formado por los residuos 283-466 es un prisma , que en si
son 3 hojas formadas antiparalelamente. Al final de estas conformaciones , se
forman loops como en Cry1Aa. En la mayora de toxinas Cry los loops que se
forman en el dominio II son altamente variables en la longitud y composicin de
aminocidos. Las horquillas en Cry4Ba son las ms cortas dentro de las familias de
toxinas Cry.
Por ltimo el dominio III (Figura 2.6.c) comprende los residuos 467 a 641 y est
formado por un emparedado de b hlices antiparalelas. Este dominio se encuentra por
encima del dominio II y a un costado del dominio I (Figura 2.5)
Figura 2.5: Estructura terciaria de la toxina Cry4Ba. Dominio I (color azul), dominio II (color verde) y
dominio III (color rojo). Estructura adaptada del trabajo: Crystal Structure of the Mosquito-larvicidal
Toxin Cry4Ba and Its Biological Implications (Boonserm, 2005). Foto obtenida mediante Chimera
1.5.3
(a)
(b)
(c)
Figura 2.6: Cry4Ba y sus dominios. (a), dominio II (b) y dominio III (c). Estructura adaptada del
trabajo: Estructura adaptada del trabajo: Crystal Structure of the Mosquito-larvicidal Toxin Cry4Ba
and Its Biological Implications (Boonserm, 2005). Foto obtenida mediante Chimera 1.5.3
2.3.6. Receptor APN de Cry4Ba

La toxina Cry4Ba, es especfica para larvas de mosquitos Aedes (9). Aedes aegypti es
el mosquito causante de la fiebre amarilla, es una especia de mosquito culcido que
15
puede ser portador del virus del dengue y de la fiebre amarilla (63). En insectos,
varios APNs tambin han sido identificadas y reproducidas en clulas epiteliales del
intestino de varia especies, como en Manduca sexta, Heliothis virescens y Aedes
aegypti (15). La Aminopeptidasa N (APN) pertenece a un grupo de las proteasas, es
una enzima ubicua que es encontrada en una amplia gama de organismos desde
insectos a mamferos. Por ejemplo, se encontraron APNs en mastocitos de ratones, en
clulas de ciertas razas de gatos, riones de conejo, en clulas humanas intestinales
(49). En varias experimentaciones, utilizando tecnologa transgnica, se observo que
APN est fuertemente implicada como receptor de las toxinas Cry.
2.3.7. Futuro de las Toxinas Cry

Las toxinas Cry, han demostrado que son una herramienta valiosa para el control de
plaga, especialmente con el desarrollo de plantas transgnicas. Esta tecnologa tiene
el fin de disminuir el uso de insecticidas qumicos. Un gran inconveniente en cuanto
al uso de estas Toxinas, es que solamente un limitado nmero de protenas Cry son
producidas en cultivos transgnicos (10). Las nuevas protenas Cry, que son eficaces
frente a pestes importantes, debern ser introducidas en cultivos transgnicos, y as
disminuir la posibilidad de que aparezcan nuevos insectos resistentes. La insercin
en cultivos continuar con genes de nuevas Toxinas Cry identificadas en Bacillus
thuringiensis, o haciendo trabajos de re-ingeniera en este tipo de Toxinas. Por lo
tanto, este futuro brillante de cultivos Bt, necesita de un entendimiento del modo de
accin de las toxinas y como los insectos responden a estas.
2.4. Bioinformtica
Los
trminos
bioinformtica,
biologa
computacional
y,
en
ocasiones,
biocomputacin, utilizados en muchas situaciones como sinnimos, hacen referencia

a campos de estudios interdisciplinarios muy vinculados, que requieren el uso o el
desarrollo de diferentes tcnicas que incluyen informtica, matemtica aplicada,
16
estadstica, ciencias de la computacin, inteligencia artificial, qumica y bioqumica

para solucionar problemas, analizar datos, o simular sistemas o mecanismos, todos
ellos de ndole biolgica, y usualmente (pero no de forma exclusiva) en el nivel
molecular (13). El ncleo principal de estas tcnicas se encuentra en la utilizacin de
recursos computacionales para solucionar o investigar problemas sobre escalas de tal
magnitud que sobrepasan el discernimiento humano. La investigacin en biologa
computacional se solapa a menudo con la biologa de sistemas.
Los principales esfuerzos de investigacin en estos campos incluyen el alineamiento
de secuencias, la prediccin de genes, montaje del genoma, alineamiento estructural
de protenas, prediccin de estructura de protenas, prediccin de la expresin gnica,
interacciones protena-protena, y modelado de la evolucin (26).
Dos de los campos de estudio de la biologa computacional, necesarios para el
alineamiento de secuencias, alineamiento y prediccin de estructuras, as como las
interacciones protenaprotena es la Minimizacin de Energa de un sistema
Molecular y la Dinmica Molecular.
2.4.1. Mtodos bioinformticos

El software GROMACS (8, 39, 61, 24), es un motor para realizar simulaciones de
optimizacin geomtrica y de dinmica molecular.
Optimizacin geomtrica
Se entiende como campo de fuerza, un campo escalar que implica una superficie de
Energa potencial que no es posible visualizar debido al gran nmero de grados de
libertad involucrados.
Para los sistemas complejos, la Energa potencial es una complicada funcin
multidimensional de coordenadas. Por ejemplo, la Energa de una molcula de etano
se basa en una funcin de 18 coordenadas internas o de 24 coordenadas cartesianas
que son requeridas para especificar completamente la estructura.
17
Para un sistema de N trminos la Energa potencial es por lo tanto una funcin de

3N-6 de coordenadas internas o 3N de coordenadas cartesianas. Por ejemplo, si
tomamos la estructura de un pentano y rotamos los dos enlaces C-C centrales para
que los ngulos de torsiones varen de 0 a 360 y calculamos la energa de cada
estructura generada, en este caso, es una funcin de solamente dos variables y puede
ser graficada como un diagrama de contorno.
Sin embargo, los elementos bsicos que encontramos en una superficie en tres
dimensiones se pueden aplicar a dimensiones superiores: encontraremos zonas de
baja energa o mnimos, as como tambin mximos y puntos de bifurcacin o de
silla (saddle points). Los mximos corresponden a estructuras de transicin entre dos
o ms mnimos y un mnimo corresponde a un estado estable del sistema (en
ausencia de otras fuerzas externas). En la bsqueda de conformaciones de baja
Energa son necesarios algoritmos de optimizacin que permitan encontrar estos
mnimos.
Existen razones de tipo prctico que hacen necesarios los algoritmos de
minimizacin. Sabemos que las coordenadas iniciales de nuestro sistema se derivan
de una estructura cristalogrfica o de la secuencia FASTA. De este modo, las
posiciones de los tomos en archivo PDB no corresponden a una sola molcula, sino
a un ajuste sobre una densidad electrnica. Tomando eso en cuenta, y que un campo
de fuerza es una aproximacin al comportamiento cuntico, se espera que la
estructura no corresponda a una estructura de baja energa. Y si se tiene en cuenta el
tipo de interacciones involucradas en el campo de fuerza, esto implica que habr
grandes fuerzas internas, que pueden hacer que el sistema se desestabilice en una
simulacin de dinmica molecular.
El problema de Minimizacin puede ser formulado de la siguiente manera: Dada una
funcin f que dependa de una o dos variables independientes x1, x2,. . . xi, encontrar
los valores de las variables para que f tenga un valor mnimo. En un punto mnimo la
primera derivada de la funcin con respecto a cada una de las variables es cero y la
segunda derivada son todos los valores positivos.
18
La funcin de mayor inters para nosotros es la de Energa con respecto a mecnica

molecular con las variables xi, cartesiana o coordenadas internas de tomos. Las
minimizaciones de mecnica molecular son casi siempre desarrolladas con
coordenadas cartesianas en donde la Energa est en funcin de 3N, y es para el caso
de mecnica cuntica es ms comn trabajar con coordenadas internas. Para
funciones analticas, el mnimo de una funcin puede ser encontrada usando Mtodos
de clculos estndar. Sin embargo, esto no es posible para sistemas moleculares
debido a la complejidad de la Energa debido a la complejidad en la que la Energa
vara de acuerdo a las coordenadas.
La Energa potencial mnima se localiza usando Mtodos numricos, que
gradualmente cambian de coordenadas para producir configuraciones con Energa
cada vez ms baja, hasta que se alcanza la Energa mnima. Una manera de ilustrar
como los diferentes algoritmos de Minimizacin trabajan, se considera una funcin
simple de dos variables f (x.y) = x2 + 2y2. Esta funcin es representada como un
diagrama de contorno como en la figura 5.1. Esta funcin tiene un punto mnimo,
que est localizado al origen.
Figura 2.7: Funcin x2 + 2y2
Los Mtodos de Minimizacin de Energa ms usados para dinmica molecular son

aquellos que utilizan informacin de la forma de la superficie de Energa potencial,
en base a las primeras derivadas y segundas derivadas del campo de fuerza. El
algoritmo ms simple que usa la primera derivada es el mtodo del descenso rpido
19
steepest descent). En cada interaccin k del algoritmo, se calcula la direccin s

opuesta al gradiente g:
sk = gk /|gk |
(2.1)
Este mtodo se mueve en una direccin paralela a la net fuerza, que en una analoga
geogrfica, sera como caminar directamente colina abajo. Para un sistema de
coordenadas cartesianas 3N esta direccin es representada convenientemente por una
unidad vector de dimensiones 3N: sk.
Si nos movemos a lo largo de la lnea del vector s, se busca el punto de mnima
Energa, y en este punto se repite el procedimiento. Al moverse en la direccin
contraria del gradiente, la Energa disminuye rpidamente, por ello este algoritmo es
eficiente para optimizar configuraciones de alta Energa.
Teniendo definida la direccin por la cual moverse, es necesario decidir cun lejos se
puede mover a lo largo de la gradiente. Si nosotros imaginamos un corte transversal
en la superficie, la superficie pasara a travs un mnimo y despus incrementara.
Figura 2.8: Bsqueda lineal en una dimensin
Sin embargo, al calcular la nueva direccin siempre se obtiene una perpendicular a la

anterior, no importando la forma del potencial local. Este comportamiento hace que
las soluciones oscilen alrededor del mnimo si este es muy amplio. Para evitar este
comportamiento de oscilacin cerca del mnimo, se puede utilizar un algoritmo de
gradiente conjugado. En este mtodo, el primer paso es igual al del mtodo steepest
20
descent, sin embargo la nueva direccin no se hace perpendicular a la anterior si no

que se sopesa con la direccin anterior.
Hay tres clases de Mtodos de optimizacin que son comnmente usados para
encontrar el mnimo, cada una con sus ventajas y desventajas.
Mtodo del Descenso por Etapas

Conocida tambin por Steepest Descent, los puntos del vector gradiente en la
direccin donde la funcin incrementa ms, el valor de la funcin puede siempre ser
disminuida por etapas en la direccin opuesta (64). En el mtodo Steepest Descent,
una serie de evaluaciones de la funcin son resueltas en la direccin negativa del
gradiente a lo largo de una direccin de bsqueda definida.
Por naturaleza del mtodo Steepest Descent puede solamente localizar mnimos en
las funciones. La ventaja es que algoritmo es muy simple, y solamente requiere el
almacenamiento del vector gradiente.
Mtodo del Gradiente Conjugado

Algunos problemas no pueden ser resueltos por mtodo Steepest Descent, por lo que
una mejora a ello fue el mtodo de Conjugate Gradient. Si la superficie es puramente
cuadrtica, cada Minimizacin sucesiva no generara componentes del gradiente a lo
largo de alguna direccin previa, la primera etapa es equivalente a un Steepest
Descent, pero subsecuentes bsquedas son resueltas a lo largo de una lnea la cual es
una mezcla del actual gradiente negativo y las previas direcciones de bsqueda.
d i=+
d ii
(2.2)
Existen diversas formas de escoger los valores . Algunos de los nombre asociados
con este mtodo son: Fletcher-Reeves, Polak-Ribiere y Hestenes-Stiefel.
21
La prescripcin de Polak-Ribiere es usualmente preferido en la prctica. La

desventaja es que necesita mayor espacio de almacenamiento.
Mtodo de Newton-Raphson
Este mtodo es por lo general el utilizado para obtener las estructuras que se
encuentran en un estado fundamental (38). Presenta la desventaja que para algunas
funciones, el clculo de las segundas derivadas con respecto de la posicin son
computacionalmente demandantes. En otros casos, el nmero de variables es muy
grande. Hoy en da esto se ve parcialmente resuelto por la utilizacin de maquinas de
sper computo o cmulos de computadoras.
En la qumica computacional, la optimizacin de la geometra o la Minimizacin de
la Energa (tambin llamada optimizacin de la Energa), son los Mtodos utilizados
para calcular la configuracin de equilibrio de las molculas y slidos (2). Los
estados estables de sistemas moleculares, corresponden a mnimos locales y globales
en su superficie de Energa potencial. A partir de una geometra molecular, la
Minimizacin de la Energa emplea un procedimiento matemtico de optimizacin
para mover los tomos, con el fin de reducir las fuerzas de red (el gradiente de
Energa potencial) de los tomos hasta que se vuelven insignificantes. Un mtodo
interesante es el Mtodo de Pendientes (Steepest Descent Method), que simplifica un
algoritmo para optimizar la bsqueda del mnimo local en una funcin. Este mtodo
comienza en un punto P0y, se mueve tantas veces como sea necesario, de Pi a Pi+1.
Esto se da cuando se realiza una Minimizacin a lo largo del trayecto que se da desde
Pi hasta f (Pi), que es el gradiente mnimo local.
Este mtodo es por lo general el utilizado para obtener las estructuras que se
encuentran en un estado fundamental. Presenta la desventaja que para algunas
funciones, el clculo de las segundas derivadas con respecto de la posicin son
computacionalmente demandantes. En otros casos, el nmero de variables es muy
grande. Hoy en da esto se ve parcialmente resuelto por la utilizacin de maquinas de
sper computo o cmulos de computadoras (38).
22
La Dinmica Molecular (DM) es una tcnica de simulacin en la que se permite

que tomos y molculas interacten por un perodo, permitiendo una visualizacin
del movimiento de las partculas (25). Originalmente fue concebida dentro de la
fsica terica, aunque hoy en da se utiliza sobre todo en biofsica y ciencia de
materiales. Su campo de aplicacin va desde superficies catalticas hasta sistemas
biolgicos como las protenas.
Elementos de Dinmica Molecular.

A travs de los Mtodos experimentales es posible estudiar muchas propiedades
fisicoqumicas de las macromolculas. Por un mtodo como geles de electroforesis
en condiciones de desnaturalizacin es posible separar protenas de acuerdo a su peso
molecular; estudiar la va de desplegamiento de equilibrio utilizando agentes
caotrpicos como cloruro de guanidinio o urea y la va cintica usando Mtodos de
mezcla rpida; calcular propiedades termodinmicas tales como la capacidad
calorfica entalpa utilizando microcalorimetra diferencial, y hasta obtener una idea
de cules son los hidrgenos que son lbiles al solvente utilizando intercambio
isotpico. Todos los fenmenos experimentales que se utilizan para medir estos
fenmenos, generalmente por Mtodos espectrofotomtricos nos entregan una
medida estadstica as como la suma de muchas contribuciones individuales
provenientes de muchas molculas de protena, que sumadas, dan sentido a la
observacin microscpica.
Campo de fuerza.
Como se sabe es posible obtener datos microscpicos de las protenas. Estos datos
experimentas son vital importancia para las simulaciones de dinmica molecular,
corresponden a las coordenadas inciales de las molculas a estudiar, o la secuencia
de aminocidos que pueden conformar las molculas. Pero una de las preguntas que
podemos hacernos al momento de hacer una investigacin que incluya dinmica
molecular es Cmo a partir de esa molcula se puede simular movimiento? Cmo
calcularemos la trayectoria de los tomos?
23
Las simulaciones de Dinmica Molecular de protenas estn fundadas en la idea de

usar funciones diferenciales de las coordenadas at micas para representar la Energa
del sistema. Esta funcin es una aproximacin de la funcin de onda de la mecnica
cuntica. Las funciones de derivadas parciales con respecto a las coordenadas
cartesianas de un tomo, pueden propagar el sistema mediante el tiempo usando la
mecnica clsica. Adems de ser dependientes de las coordenadas at micas, el valor
de la funcin tambin depende de los diferentes parmetros que describen las
propiedades energticas y geomtricas de las interacciones intrapartculas. Diferentes
a las coordenadas, estos parmetros son invariantes durante el desarrollo de la
simulacin. La combinacin de la funcin matemtica y los parmetros es
comnmente conocido como Campo de Fuerza (35).
Tenemos que para una partcula con su posicin r, es posible conocer su trayectoria si
se conoce la dependencia de su velocidad v y aceleracin a respecto del tiempo:
r (t) = r + v (t).t + (a (t).t2)/2
(2.3)
Para el caso de una protena conocemos r (una estructura cristalogrfica, las

coordenadas inciales) y la velocidad inicial puede asignarse en base a ciertas
suposiciones como se explicara despus. Lo nico que necesitamos es conocer las
fuerzas que actan sobre el sistema para deducir la aceleracin de las partculas. Lo
que requerimos encontrar es entonces el campo vectorial F de las fuerzas del sistema,
una funcin vectorial que entregue las componentes de fuerza aplicada sobre las
partculas. Cuando se desea hacer una descripcin detallada de la energa de una
molcula se requiere de Mtodos de mecnica cuntica. Por lo tanto, la Energa de
una molcula depende tanto de la configuracin espacial de los ncleos como de la
densidad de la probabilidad electrnica. Si bien se necesita de un nivel de teora
avanzado para describir las interacciones moleculares, este nivel no es suficiente
incluso para una molcula tan simple como H2+, puesto que este sistema consta de 3
cuerpos, y se ha demostrado un sistema dinmico de tres cuerpos es sensible a la
24
representacin numrica, haciendo imposible la prediccin de su comportamiento a

tiempos largos (20). Para solucionar este inconveniente, y resolver las ecuaciones de
mecnica cuntica, se utiliza la aproximacin de Born-Oppenheimer, segn la cual es
posible calcular las propiedades electrnicas de las molculas dejando los ncleos
fijos, pues el movimiento de los electrones es mucho ms rpido que el de los
ncleos, pudiendo ajustarse casi instantneamente a cambios de conformacin. Este
desacoplamiento entre ncleo y electrn, nos permite estudiar la dinmica de los
tomos suponiendo que sus propiedades electrnicas no cambian. En ausencia de
electrones, es necesario utilizar funciones empricas que describan la Energa del
sistema en base a las posiciones de los tomos. Estas funciones deben reproducir lo
ms fielmente
posible el comportamiento cuntico, siendo a la vez suficientemente
2
simples para no requerir un esfuerzo computacional elevado. Los campos de fuerza
para simulacin de protenas estn compuestos por dos componentes, una que
modela las interacciones de enlace, funciones que permiten mantener la geometra
local de las protenas, y las interacciones de no enlace, las cuales modelan la
interaccin entre tomos que se encuentran separados por ms de dos tomos. Los
trminos que representan las interacciones de enlace describen el estiramiento de los
enlaces, el doblamiento de los ngulos y la rotacin de los diedros. Mientras que los
trminos que representan las interacciones de no enlace describen la electrosttica,
dispersin y exclusiones de Pauli. Por lo tanto los trminos de Energa para un
campo de fuerza se dan de la siguiente manera.
La primera de las interacciones enlazantes modela el comportamiento vibracional de

los enlaces. Se le puede considerar al enlace at mico como un resorte con cierta
constante de fuerza Kb y distancia de referencia b . Con este componente, es posible
simular vibraciones de estiramiento o tencin. El siguiente trmino envuelve un
25
triplete de tomos y describe el doblamiento de un ngulo. es el ngulo formado

por dos vectores de enlace, K y 0 son parmetros que describen la rigidez y el
equilibrio geomtrico de un ngulo y al igual que el trmino anterior, es un trmino
cuadrtico. El ltimo trmino es una suma de los tomos dispuestos de cuatro en
cuatro, y se describe la Energa asociada con la rotacin de los ngulos diedros
formados por los cuatro tomos. Se usa una funcin coseno para representar el perfil
de rotacin entre dos grupos. X es el valor del diedro, Kx es el parmetro energtico
que determina los mnimos energticos.
En la segunda ecuacin se describe las interacciones de no enlace. En todos los
campos de fuerza, las interacciones de no enlace entre tomos estn definidas cuando
ocurre una interaccin entre tomos en molculas separadas por tres o ms enlaces en
la misma molcula. Esta ecuacin se compone de dos partes. La primera es conocida
como la ecuacin de Lennard-Jones (LJ) y la segunda parte que es la ley de
Coulomb. La ecuacin de Lennard-Jones es la parte que est dentro de los corchetes
junto al factor ij (que es un parmetro basado en los tipos de los tomos i y j), y
modela la dispersin y las interacciones de exclusin de Pauli, que comnmente es
conocida como el termino de van der Waals. Si dos tomos se juntan desde la
separacin infinita, el trmino negativo en los corchetes, que tiene la inversa de la
separacin interatmica rij elevado a la sexta potencia, domina la interaccin y los
tomos aumentan su atraccin con la disminucin de la distancia a medida que la
Energa se vuelve negativa. Esta parte de la ecuacin de Lennard-Jones modela la
dispersin, y la parte de (1/r)6 deriva de la Energa de interaccin de un dipolo
instantneo y un dipolo inducido, de acuerdo a la definicin de la dispersin de
London. A manera que los tomos se acercan, un mnimo de Energa se alcanza; y a
distancias ms cortas, el trmino (1/r) 12, que es positivo, empieza a dominar y induce
al incremento de la Energa, por lo tanto aumenta la repulsin. El prefactor ij, antes
mencionado es un parmetro basado en el tipo de loa tomos interactuantes (i y j). A
manera de que este valor aumenta, la interaccin mnima se vuelve menor y la pared
de repulsin decrece. Rminij es un parmetro que tambin depende de los tipos de lo
tomos que interactan y define la distancia en la que la Energa de Lennard-Jones es
26
mnima. En la segunda parte de la ecuacin se hace uso de la ley de Coulomb y es

usada para modelar la interaccin electrosttica entre pares de tomos no enlazados.
En esta parte de la ecuacin, como en la parte de Lennard-Jones, rij es la distancia
interatmica. Los parmetros qi y qj se utilizan para describir las cargas efectivas de
los tomos i y j.
De la misma manera es importante enfatizar en que las interacciones no enlazadas,
envuelven solamente un par de tomos. Las interacciones entre tomos que se
encuentran a ms de dos tomos de distancia dependen principalmente de sus
propiedades electrnicas. Como se dijo anteriormente, en una dinmica molecular no
se considera la presencia de electrones en forma explcita, sino que se considera que
las propiedades de los tomos de mantienen constantes. De esta manera, una de las
propiedades no consideradas en los campos de fuerza es la fluctuacin de las nubes
electrnicas, debido a que sufre cambios instantneos en la distribucin de los
electrones. Estas fluctuaciones generan dipolos inducidos en los tomos generando
fuerzas de atraccin inespecficas o como ya se vio, la dispersin de London. La
forma en que el campo de fuerza modela esta tendencia es asignando cargas parciales
a cada uno de los tomos, y calculando su interaccin en base a la ley de Coulomb.
Un campo de fuerza, adems de la forma funcional, requiere un conjunto de
parmetros, como las constantes de fuerza de los osciladores, las distancias y ngulos
de referencia, y las cargas parciales de los tomos. Para no generar un nmero
enorme de ellos, se define tipos at micos, que corresponden a generalizaciones de
tomos en base a sus propiedades locales de interaccin. Dependiendo de la forma
funcional del campo de fuerza y sus parmetros, se tienes distintos campos de fuerza.
Los ms utilizados para la simulacin de protenas, lpidos y cidos nucleicos son
AMBER (Ponder y Case, 2003), CHARM (MacKerell y cols, 1998), OPLS
(Jorgensen y Tirado-Rives 1998) y GROMOS (Schuler y cols, 2001). La forma
funcional de estos campos de fuerza es la ms usada para simulacin de protenas
debido a que su relacin eficiencia-exactitud es suficientemente buena para llevar a
cabo simulaciones de sistemas con muchas partculas. Al hacer detallado el modelo,
es posible reproducir mayor nmero de propiedades de las molculas. Por ejemplo.
27
El uso de trminos cruzados, potenciales enlazantes que correlacionan en forma

explcita vibraciones y torsiones, permiten modelas mucho mejor las propiedades
vibracionales de molculas pequeas; las vibraciones de enlace pueden ser
modeladas mejor con un potencial armnico como el potencial de Morse, o bien
utilizando una expansin en serie de potencias; las interacciones de van der Waals
son mejor modeladas con un potencial donde la componente repulsiva sea
exponencial, como lo que se usa en el potencial de Buckingham; as como tambin es
posible representar de mejor manera el comportamiento electrosttico de las
molculas si generamos varios tomos fantasma con carga en vez de limitarnos a
cargas parcialmente at micas.
OPLS.
Es un campo de fuerza desarrollado a principios de 1980. Este campo de fuerza
envuelve el desarrollo de potenciales por Jorgensen y sus colaboradores para simular
propiedades de lquidos, inicialmente para agua y para ms de 40 lquidos orgnicos
(27). Es por esta razn que es llamado OPLS (Optimized Potentials for Liquid
Simulations). En este campo de fuerza se enfatiz la derivacin de las interacciones
no enlazantes en comparacin con las propiedades termodinmicas de lquidos.
Las primeras aplicaciones en protenas usaron una representacin polar de
hidrgenos, tomando los tipos de tomos y los parmetros (enlaces, ngulos, diedros)
del campo de fuerza AMBER de 1984. Este campo de fuerza se desarrollo en 1988 y
fue llamado AMBER/OPLS. Despus de unos aos se desarrollo una versin all
atoms, la cual es la que se us para la presente investigacin. En este campo de
fuerza OPLS- AAm se uso la misma filosofa de derivar las cargas y los parmetros
de van der Waals para las simulaciones de lquidos puros.
En general, los sistemas moleculares son complejos y consisten de un gran nmero
de partculas, por lo cual sera imposible encontrar sus propiedades de forma
analtica. Para evitar este problema, la DM utiliza Mtodos numricos (29). La DM
representa un punto intermedio entre los experimentos y la teora. Puede ser
entendida como un experimento en la computadora.
28
La dinmica molecular es un campo multidisciplinario (17). Sus leyes y teoras

provienen de las Matemticas, Fsica y Qumica. Emplea algoritmos de las Ciencias
de la Computacin y Teora de la informacin. Permite entender a los materiales y las
molculas no cmo entidades rgidas, sino como cuerpos animados. Tambin se le ha
llamado estadstica mecnica numrica o la visin de Laplace de la mecnica
Newtoniana, en el sentido de predecir el futuro al animar las fuerzas de la
naturaleza.
Para utilizar esta tcnica de forma correcta, es importante entender las
aproximaciones utilizadas y evitar caer en el error conceptual de que estamos
simulando el comportamiento real y exacto de un sistema molecular. La integracin
de las ecuaciones de movimiento estn mal condicionadas, lo cual genera errores
numricos acumulativos, que pueden ser minimizados seleccionando apropiadamente
los algoritmos, pero no eliminados del todo. Por otro lado, las interacciones entre las
partculas se modelan con un campo de fuerza aproximado, que puede o no ser
adecuado dependiendo del problema que queremos resolver. De cualquier forma, la
dinmica molecular nos permite explorar su comportamiento representativo en el
espacio fsico.
La funcin de Energa potencial U (X) son las atracciones y repulsiones que sienten
los tomos entre s debido a los enlaces qumicos, interacciones electrostticas, van
der Waals, etc. de las molculas. A U (X) tambin se le conoce como campo potencial
de fuerza y es una funcin de las coordenadas de las partculas X. Normalmente
proviene de clculos de qumica cuntica y/o experimentos espectroscpicos. Sin
embargo, el campo de fuerza generalmente tiene una forma funcional que lo hace
pertenecer a la mecnica clsica.
La trayectoria de las partculas es discreta en el tiempo. Normalmente se elige un
paso de tiempo suficientemente pequeo (p.ej. 1 femtosegundo) para evitar errores
numricos. Para cada paso de tiempo, se integra la posicin X y velocidad V con un
mtodo simplecito como la integracin de Verlet. Dadas las posiciones iniciales (p.ej.
29
la estructura de rayos X de una protena) y las velocidades iniciales (p.ej. aleatorias y

Gaussianas), es posible calcular todas las posiciones y velocidades en el futuro.
Dockeo molecular es un estudio de como 2 o ms estructuras moleculares, por
ejemplo, una droga y un enzima, o un receptor de protena; interaccionan
correctamente (60). En otras palabras, se trata de un rompecabezas tridimensional.
La aplicacin ms importante del dock es el screening virtual (58). En el screening
virtual lo ms interesante y prometedor es que las molculas son escogidas a partir de
una base de datos existente y se utiliza para investigaciones. Por ende este screening
necesita de un mtodo computacional que sea rpido y confiable.
Fsica del Dock Para estudiar las interacciones entre dos estructuras, se hace uso de
la mecnica cuntica. Especficamente, la interaccin entre dos molculas puedes ser
hallada resolviendo la combinacin de las ecuaciones de Schrodinger en ambos
sistemas. Para resultados ms productivos, se utiliza un modelo mecnico, un poco
ms primitivo. Esto significa que necesitamos estudiar la calidad y cantidad de las
fuerzas entre partculas de interaccin.
Cluspro Server
Es un servidor gratuito disponible desde el 2004. Cluspro Server utiliza una
aproximacin que primero explora globalmente la superficie de Energa usando
modelos energticos simplificados para descubrir regiones de inters, y finalmente se
concentran en esos sitios usando un muestreo y puntuacin. Cluspro Server utiliza
Transformada rpida de Fourier. (FFT), un mtodo que referencia mtodo nuevo que
genera sitios de reconocimiento (DARS), una tcnica de unin usando las
conformaciones nativas, un mtodo de eliminacin de sitios que no son aptos para la
unin analizando datos de Energa libre, y un mtodo de optimizacin usando una
programacin para obtener las coordenadas de las diferentes interacciones dadas en
el dockeo (28).
30
2.4.2.
Termodinmica Estadstica
Mecnica Estadstica o Termodinmica estadstica, es una rama de la fsica que

utiliza la teora de la probabilidad, que utiliza herramientas de la matemtica para
trabajar con una gran cantidad de datos. La mecnica estadstica, nos brinda un
marco para relacionas la propiedades microscpicas individuales de los tomos y
molculas con las propiedades macroscpicas de los materiales que puedes ser
observados a diario, por lo tanto, la explicacin termodinmica es el resultado de la
descripcin de la mecnica clsica y mecnica cuntica en relacin a la estadstica de
la mecnica a nivel microscpico.
La mecnica estadstica nos provee una interpretacin a nivel molecular de las
cantidades termodinmicas macroscpicas, como el trabajo, calor, Energa libre y
entropa. Esto permite que las propiedades a nivel microscpico, nos permita
entender fenmenos a nivel macroscpico. Esta habilidad para hacer predicciones
macroscpicas, es la principal ventaja de la mecnica estadstica sobre la
termodinmica clsica. Ambas teoras estas gobernadas por la segunda ley de la
termodinmica. Sin embargo, la entropa en termodinmica puede ser conocida
empricamente, porque, en mecnica estadstica, la entropa est en funcin de la
distribucin del sistema en sus microestados (12).
Postulado principal.- El postulado fundamental
es mecnica estadstica es el
siguiente Dado un sistema asilado, el equilibro es encontrado con la misma

probabilidad en el sistema como en cada uno de los micro-estados
Este postulado es de suma importancia porque permite concluir que para un sistema
de equilibrio, el estado termodinmico que puede resultar de un nmero largo de
microestados, es tambin el macro-estado ms probable del sistema.
Ensambles estadsticos.- La moderna formulacin de mecnica estadstica est
basada en la descripcin fsica del sistema mediante un ensamble que representa
31
todas las posibles configuraciones del sistema y la probabilidad de realizar cada

configuracin.
Cada ensamble est asociado con una funcin matemtica que puede ser usada para
extraer valores de las propiedades termodinmicas del sistema (21). De acuerdo con
la relacin del sistema con el universo, uno de los tres tipos generales de ensambles
deberan ser usados.
Ensamble microcannico: describe a sistema aislado completamente,

teniendo constante la Energa, por lo que se entiendo que no se intercambia
Energa o masa con el resto del universo.
Ensamble cannico: describe un sistema en equilibrio termodinmico con su

entorno. Se debera tener como nico intercambio de Energa, el calor
intercambiado con el exterior.
Ensamble gran cannico: usado para sistemas abiertos en donde hay

intercambio de masa y Energa con el exterior.
Ensamble cannico.- En el ensamble cannico el nmero de tomos (N), volumen

(V) y la temperatura (T) son fijados. Sabiendo el concepto de ensamble cannico, es
posible derivar la probabilidad Pi que un sistema macroscpico en equilibrio
termodinmico y en su ambiente, ser dado en un microestado con Energa Ei y de
acuerdo a la distribucin de Boltzman:
Pi = eEi / X .eEj
(2.6)
Donde:
= 1/kbT
(2.7)
32
En la ecuacin anterior Ei es la Energa de un microestado i de un sistema. La

funcin de particin est dada por el nmero de estados accesibles en un sistema a
una temperatura dada.
Para sumar la probabilidad de encontrar un sistema de temperatura T es un cualquier
estado con Energa E, es
Pi = eEi /Z
(2.8)
Es por esta razn que la funcin de particin, es el factor ms importante de un
ensamble cannico.
33
Captulo 3
Metodologa y Detalles
Computacionales
3.1.
Equipos y Software
Dentro de los requerimientos para poder realizar la parte computacional,

necesitaremos los siguientes equipos:
Computador HP G60-235DX. INTEL PENTIUM DUAL CORE T4200

2.0GHz, 1MB L2 CACHE, 3072MB DDR2 SDRAM, 320GB
Software:
o Gromacs 4.5 (Hess, 2008). Disponible en www.gromacs.org

o Molden 5.0 (Schaftenaar, 2000). Disponible en
www.cmbi.ru.nl/molden
o Chimera 1.5.3 (Pettersen, 2004). Disponible en
www.cgl.ucsf.edu/chimera
o DeepView/Swiss-PdbViewer (Guex, 1997). Disponible en
www.expasy.org/spdbv
o APBS (Baker, 2001). Disponible en www.poissonboltzmann.org/apbs

o Aplicacin online ClusPro (Kozakov, 2010). Disponible en
cluspro.bu.edu/home.php
o Aplicacin online Swiss Model (Kopp, 2006). Disponible en
swissmodel.expasy.org
o Aplicacin online MolProbity (Chen, 2010). Disponible en
molprobity.biochem.duke.edu/
o Pymol 1.2r2 (Schrodinger, 2010). Disponible en www.pymol.org/
o QUESC. Desarrollo Propio
El Sistema Operativo utilizado en esta investigacin es Linux, distribucin Ubuntu

11.04.
3.2.
Eleccin de las estructuras usadas en las simulaciones
En la siguiente investigacin se us a NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) y PDB

(www.pdb.org/pdb/home/home.do) como fuente de base de datos, las cuales son
confiables para la bsqueda de archivos utilizados en bioinformtica.
Dentro de las bases de datos se encontr publicaciones referentes a las toxinas de
Bacillus thuringiensis. Las protenas consideradas como toxinas, fueron obtenidas
por cristalografa de rayos x, y se encontraron bajo el nombre de CryIAa (22) y
Cry4Ba (9). Luego se utiliz el software Swiss-PdbViewer (23), el cual elimin
duplicidad de tomos y corrigi aminocidos no enlazados, obteniendo as un nuevo
archivo el cual resulta ms seguro para trabajar. Luego de comprobar la
compatibilidad con GROMACS se procedi a la bsqueda de las protenas
consideradas como receptoras dentro del intestino medio de las larvas. La protena
fue publicada bajo el nombre de Aminopeptidase N en la especie Manduca Sexta. (1)
y Amonopeptidase N en la especie Aedes aegypti. (49)
Al obtener dichas protenas en formato de secuencia FASTA, se procedi a trabajar

con la secuencia FASTA. Para el proceso de conversin de estructura secundaria a
estructura terciaria se utilizo la tcnica de templates, utilizando el servidor
SwissModel. (30, 32, 4), para la cual se procedi al upload del archivo FASTA, en la
seccin de ModellingAutomatedMode.
Luego de obtener la estructura de las protenas a partir de su estructura secundaria, se
precedi nuevamente a comprobar la compatibilidad con GROMACS. Una vez
realizado esta comprobacin, se procedi a una Optimizacin de geometra.
3.3. Construccin de una toxina modificada: Cry1Mosq

Para la construccin de una modificada a partir de la toxina Cry1Aa, se hizo un
estudio del alineamiento homlogo con el programa ClustalX (37). Las regiones loop
son blancos excelentes para hacer reingeniera gentica de nuevas toxinas para
especificidad diversa (41), intercambiando residuos o variando las longitudes de los
sitios activos, sin interrumpir la integridad de la toxina.
Basados en un alineamiento de secuencia y anlisis estructural (40), se encontr
diferencias significativas es los 2 primeras regiones loop del dominio II.
En el loop 1 los residuos
311
RG
312
en Cry1Aa, se reemplazaron por YQDL, que es la
secuencia perteneciente al loop de Cry4Ba, con el propsito de extender su longitud.

Usando el software Molden (52), la secuencia LY367RRIILGSGPNNQ378 de la segunda
regin loop se alter de dos maneras. LY RRI I L se elimin, y luego NNQ, se
reemplazo por G, para mantener la torsin entre las hojas y para imitar la corta
longitud de Cry4Ba.
3.4. Optimizacin de la geometra

Muchos problemas en qumica computacional pueden ser formulados como una
Optimizacin de una funcin multidimensional. Optimizacin es un trmino general
para encontrar puntos estacionarios en una funcin, puntos donde la primera derivada
es cero. En la mayora de los casos, el punto estacionario deseado es un mnimo,
todas las segundas derivadas deberan ser positivas. En algunos casos el punto
deseado es un punto de ensilladura de primer orden, la segunda derivada es negativa
en algunos y positiva en otras direcciones.
Se cuenta con 5 molculas, dos receptores (APN de Manduca sexta y APN de Aedes
aegypti), 2 toxinas nativas (Cry1Aa y Cry4Ba), ambas producidas por Bacillus
thuringiensis y una toxina obtenida a partir de re-ingeniera.
Luego de tener las estructuras, el siguiente paso es prepararlas para la simulacin. En
primer lugar se necesita escoger el campo de fuerza a utilizar, para nuestro caso ser
OPLS, y crear el archivo de topologa. El software GROMACS, realiza estos dos
procesos en un mismo paso, mediante la utilizacin del comando pdb gmx. Una vez
obtenido el archivo de topologa, se obtienen tambin el archivo (.gro) que contiene
las coordenadas por tomos de la protena, el cual es compatible con GROMACS.
Con el archivo .gro, se procede a limitar el sistema. Se entiende por manejar la
variable de que tan grande nuestro sistema puede ser. Mediante el comando editconf,
podemos escoger el tamao de nuestra caja (unidades en nm), teniendo presente
que entre la protena y los lmites del sistema, debe haber una distancia que permita a
la molcula estudiar, moverse libremente. La caja tiene una configuracin
geomtrica cbica. Luego de obtener las molculas dentro de las cajas, se procede
a preparar el archivo .mdp, el cual nos brinda los parmetros que se necesitan para la
Optimizacin de la geometra perteneciente a las estructuras a estudiar. Para que el
programa empiece el clculo de Optimizacin de estructuras se utiliza el comando
mdrun, mediante el cual se puede obtener los archivos necesarios para monitorizar el
clculo durante su curso y al final del mismo.
Se procedi a realizar dos procesos de Optimizacin de geometra; en primer lugar se

realizo una Minimizacin utilizando el mtodo de Steepest Descent. Una vez
obtenido la estructura Optimizada se procedi a realizar una segunda Minimizacin,
en este caso se utiliz el mtodo Quasi-Newtoniano l-bfgs. Ambos archivos
utilizados, se encuentran en el Apndice.
Cabe resaltar que se utiliz esta Optimizacin de Energa despus de cada simulacin
de Dinmica Molecular, despus del proceso de Dock y finalmente para la
simulacin de Dinmica Molecular de las estructuras cuaternarias.
3.5.
Dinmica Molecular de estructuras terciarias
Mediante la utilizacin de GROMACS, se busc la estabilidad de las estructuras de

las protenas realizando una simulacin de Dinmica Molecular, utilizando el
ensamble cannico.
El procedimiento para la simulacin de Dinmica Molecular, es muy parecido al de
la Optimizacin de la geometra. Mediante el comando pdb gmx, se escoge el campo
de fuerza, se convierte el archivo .pdb a .gro y se obtiene el archivo de topologa.
Luego de se procede a limitar el sistema mediante el comando editconf y utilizando
una configuracin geomtrica cbica. Para el caso de la Dinmica Molecular, se
puede utilizar un tamao de caja mucho mayor que el de la protena, esto con la
finalidad de dar libertad de movimiento a la protena. Una vez que el tamao del
sistema este definido, el comando grompp, nos permite utilizar el archivo .mdp
perteneciente a la simulacin de Dinmica Molecular con un ensamble cannico y
solvente implcito. Para empezar el clculo de la simulacin de Dinmica Molecular,
se utiliza el comando mdrun.
Al final de la simulacin de Dinmica Molecular, se obtuvo los archivos que nos
permiten determinar la estabilidad estructural de las molculas. Para comprobar esta
estabilidad, se utiliz la estructura promedio en la simulacin y se procedi al
realizar el clculo para la validacin de la Estructura, mediante el grfico de
38
Ramachandran. (43) Para tal propsito se utiliz el servidor Molprobity, (16) en el

cual se pide que se analice la geometra de los tomos para proceder con el clculo
necesario para el Grafica de Ramachandran.
Para determinar, mediante la visualizacin de la hpersuperficie del Potencial
Electrosttico, los posibles sitios activos para la interaccin Toxina Receptor. Para
obtener los datos de Energa Potencial, Cintica, Total, Temperatura y Presin se
utiliza el comando g_energy, el cual utiliza como input el archivo con extensin .edr
obtenido al final de la simulacin de Dinmica Molecular. Para obtener los grficos
de Radio de Giro, Nmero de Enlaces de Hidrgeno, Desviacin Media Cuadrtica
de la Distancia entre tomos y para la Desviacin Media Cuadrtica de la
Fluctuacin por residuos se utilizan los archivos .tpr y .trr obtenidos al final de la
simulacin.
Para las estructuras promedio se utilizo el comando g covar el cual utiliza los
archivos .tpr y .trr. Con el archivo correspondiente a la estructura promedio, se
utiliz el software APBS (7) que, mediante una aplicacin de Mtodos numricos y
la ecuacin de Poisson-Boltzmann, nos permite calcular la hipersuperficie del
Potencial Electrosttico para las estructuras de las protenas que se estudiaron en este
trabajo de investigacin.
Luego se utiliza los ltimos 5 nanosegundos de los datos de Energa (zona estable)
para obtener los datos de Energa. Despus de esta simulacin de Dinmica
Molecular, se utilizo el software UCSF Chimera (48), para obtener las imgenes de
alta resolucin presentadas en esta investigacin.
3.6. Docking de estructuras terciarias

Para la realizacin del dockeo de las estructuras terciarias, se procedi a la utilizacin
del servidor online ClusPro 2.0 (34, 33, 14). En el servidor se procede al upload de
los archivos. El servidor Cluspro 2.0, nos pide como mnimos 2 archivos. En nuestro
39
caso se procedi al upload de 6 pares de archivos. Esto exigi 6 clculos, para cada
una de las conformaciones descritas en la Tabla 3.1.
Tabla 3.1: Conformaciones para el dockeo de protenas terciarias
Receptor
Toxina
APN (Manduca sexta)
Cry1Aa (Bacillus thuringiensis)
APN (Manduca sexta)
Cry4Ba (Bacillus thuringiensis)
APN (Manduca sexta)
Cry1Mosq (modificada)
APN (Aedes aegypti)
Cry1Aa (Bacillus thuringiensis)
APN (Aedes aegypti)
Cry4Ba (Bacillus thuringiensis)
APN (Aedes aegypti)
Cry1Mosq (modificada)
Durante el proceso de dockeo realizado en el servidor ClusPro, se inform que se

realiza una Optimizacin de geometra pre-Dock, este proceso se realiza en la
supercomputadora del Laboratorio de Bioinformtica Estructural de la Universidad
de Boston. Una vez, realizada la Optimizacin de la geometra segn el campo de
fuerza del Laboratorio en la Universidad de Boston, el clculo entra en cola para
realizar el proceso de Docking. Este proceso, dependiendo del tamao de las
estructuras, tiene una demora de clculo de 2 das.
Este servidor, luego de los clculos nos brinda 120 resultados por proceso de Dock.
El servidor tambin nos brinda los valores de Energa resultantes del proceso de
dock. En nuestro caso, al tratarse de un receptor intra membrana, se utilizaron los
resultados del Dock hidrofbico y teniendo en cuenta las lminas, que son
importantes en las interacciones de estructuras cuaternarias. (18, 47)
3.7.
Dinmica Molecular de estructuras cuaternarias
Despus de obtener, los mejores resultados para cada conformacin, se procedi a

hacer la Minimizacin de Energa de las estructuras resultantes del proceso de
40
Docking de acuerdo a los procedimientos mencionados para la Optimizacin de la

Geometra de las estructuras.
Luego de concretar la Optimizacin de las 6 diferentes estructuras con GROMACS,
y nuevamente con los tipos de integradores (Steep Descent y l-bfgs), se busc la
estabilidad de las protenas mediante la Dinmica Molecular de las 6
conformaciones, haciendo uso de un ensamble cannico y de los pasos mencionados
para la Dinmica Molecular de estructuras terciarias. La nica diferencia es que en
este caso el archivo .pdb, contiene ahora dos cadenas y el sistema debe incluir a las
mismas. Esto se realiz mediante el uso del comando grompp, el cual permite incluir
a varias estructuras dentro de un sistema.
3.8.
Obtencin y Estudio de Par metros Termodinmicos
Para el anlisis termodinmico, se trabaj con los datos de Energa Total al tratarse
de un ensamble cannico. Si tomamos en cuenta que la funcin de particin describe
las propiedades de un sistema termodinmicamente en equilibrio (6), el promedio de
las Energas Totales de los microestados para cada sistema, se puede considerar como
la Energa Total del Sistema. Luego de la simulacin de Dinmica Molecular se
obtiene, datos referentes a la Energa del sistema. Al tratarse de un elevado nmero
de datos, y para evitar manipular los mismos, se diseo un programa utilizando
FORTRAN, un compilador para programas cientficos. El algoritmo procesa los
datos, desde el mismo archivo de Energa, y hace promedios y desviaciones medias
cuadrticas. Con los promedios se realiza los clculos de Energa de Interaccin y las
dems relaciones termodinmicas para los resultados y conclusiones de las 6
diferentes reacciones y luego compararlas, de igual manera se trabaj con los datos
de volumen de las protenas cuaternarias y la presin del sistema.
41
Captulo 4
Resultados y Discusin
4.1.
Estructuras
Mediante la utilizacin de la base de datos PDB, se obtuvieron dos estructuras

correspondientes a las toxinas Cry1Aa y Cry4Ba, cuyos cdigos son: 1CIY (22) y
1W99 (9) respectivamente.
De la NCBI, se obtuvo la secuencia FASTA de las protenas receptoras en los dos
diferentes insectos blancos. Fueron encontrados con los cdigos: CAA66466.2 (1) y
AAK73351.1 (49), para APN de Manduca sexta y APN de Aedes aegypti
respectivamente. Luego de obtener las secuencias FASTA, se procedi a la
generacin de las estructuras terciarias haciendo uso del servidor SwissModel. El
servidor luego de 3 horas de clculo, arroj como resultado una estructura en formato
.pdb. El servidor SwissModel, para la generacin de APN de Manduca sexta,
encontr una similitud de 27 %, con la estructura tridimensional de la
Aminopeptidasa1 presente en el Retculo Endoplasmtico de Humanos. En este
caso se utiliz desde el residuo 2 al 806 (ver Figura 4.1). De la misma manera,
SwissModel, nos dio como resultado que para el modelamiento de APN de Aedes
aegypti, se utiliz como template a la estructura 2yd0 anteriormente sealada. Se
utiliz el template desde el residuo 33 al 930, encontrando una similitud entre
secuencias del 26 %(ver Figura 4.2).
42
Figura 4.1: Modelado de APN Manduca sexta. Realizado con la aplicacin Online SwissModel,
disponible en swissmodel.expasy.org. Se utiliz el template 2yd0A, y se utilizaron desde el residuo 2
al 806 del receptor de Manduca sexta
Figura 4.2: Modelado de APN Aedes aegypti. Realizado con la aplicacin Online SwissModel,
disponible en swissmodel.expasy.org. Se utiliz el template 2yd0A, y se utilizaron desde el residuo 33
al 930 del receptor de Aedes aegypti
En la Figura 4.3, podemos observar las estructuras obtenidas del servidor

SwissModel, as como las pertenecientes a las toxinas, con las cuales hemos
realizado la simulacin de la Dinmica Molecular, en busca de la estructura
cuaternaria en su fase de equilibrio (estructura de mnima Energa en el tiempo). A
las cuatro estructuras tridimensionales se les realizar una simulacin de Dinmica
Molecular con la finalidad de saber si las estructuras mantienen su conformacin en
el transcurso de la simulacin.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.3: Estructuras utilizadas para la simulacin de Dinmica Molecular. (a) Cry1Aa,
especfica para lepidpteros; (b) Cry4Ba, especfica para dpteros; (c) receptor Aminopeptidasa N de
Manduca sexta y (d) receptor Aminopeptidasa N de Aedes aegypti. Foto obtenida con Chimera 1.5.3
4.2. Construccin de la Toxina modificada

Mediante el uso del software ClustalX (37), se obtuvo el alineamiento entre las
toxinas Cry1Aa y Cry4Ba.
Se introdujo alteraciones en los loops del dominio II de Cry1Aa para promover
toxicidad frente a mosquitos del gnero Aedes. Las regiones loop son objetivos
excelentes para el diseo gentico de toxinas nuevas con especificidad diversa,
cambiando residuos o longitudes de cadenas sin afectar el la estructura de la toxina
(40). Mostraremos en la Figura 4.4 el alineamiento en donde se muestra las dos
secuencias de Cry1Aa y Cry4Ba.
Basados en un alineamiento de secuencia y anlisis estructural (40), se encontr
diferencias significativas es los 2 primeras regiones loop del dominio II.
En el loop 1 los residuos
311
RG
312
en Cry1Aa, se reemplazaron por YQDL, que es la
secuencia perteneciente al loop de Cry4Ba, con el propsito de extender su longitud.

Usando el software Molden (52), la secuencia LY
367
RRI I LGSGPNNQ378 de la
segunda regin loop se alter de dos maneras. LYRRIIL se elimin, y luego NNQ, se
reemplazo por G, para mantener la torsin entre las hojas y para imitar la corta
longitud de Cry4Ba.
Luego de construir la toxina modificada se observaron las siguientes caractersticas

en la estructura Cry1Mosq:
Se extendi el loop 1 en comparacin con Cry4Ba.
Se mantuvo los dobles en las hojas del loop 2.
Se imit la longitud del loop 2 de Cry4Ba.
Figura 4.4: Alineamiento de las secuencias FASTA de Cry1Aa y Cry4Ba realizada con el software
ClustalX. En donde " " se refiere a residuos idnticos, : para sustituciones conservadas y . para
sustituciones semiconservadas
Como parte de nuestros resultados presentamos la secuencia en formato FASTA de la

nueva toxina modificada. Figura 4.5
Figura 4.5: Secuencia FASTA de Cry1Mosq. Protena modificada por sustitucin de aminocidos.
Modificacin realizada con el programa MOLDEN 5.0
Tambin se muestran las imgenes comparativas entre las 3 diferentes toxinas Cry
utilizadas en esta investigacin, con la finalidad de comparar los tamaos de los
loops (ver Figura 4.6). En esta grfica se observa que la modificacin en Cry1Mosq
mantuvo la conformacin en los loops en los cuales se realiz las modificaciones
comparando la toxina Cry1Aa y Cry4Ba. Mediante la modificacin tambin se
recort la longitud del loop 2 de Cry1Aa y se simul la longitud de Cry4Ba.
(a)
(b)
(c)
Figura 4.6: Toxinas Cry y sus respectivos loop. (a) Cry1Aa, especfica para lepidpteros con un
tamao de 39.9 A en el loop 1, (b) Cry4Ba, especfica para dpteros con un loop 1 de 31.3 A y (c)
Cry1Mosq, toxina modificada a partir de Cry1Aa y Cry4Ba de 34.8 A
4.3.
Estabilidad de estructuras terciarias
Para buscar la estabilidad de las estructuras terciarias realizamos una simulacin de

Dinmica Molecular. Para las toxinas de las cuales se obtuvieron las estructuras
terciarias, se procedi a una simulacin de 5000 ps (5 ns), realizando un total de 5
millones de pasos, manteniendo una temperatura de 291.15 K. Para reportar la fase
de estabilidad, se grafic los datos de Energa, tango como Energa Potencial,
Energa Cintica y la Energa Total, as como, el Radio de Giro, que nos indica si el
centro de masa es estable durante el proceso de simulacin molecular, el Nmero de
enlaces de Hidrgeno que nos indica si las estructuras dependientes de los enlaces
de hidrgeno se mantienen constantes durante la simulacin; Distancia Media
Cuadrtica (RMSD) y fluctuacin media cuadrtica (RMSF) por residuo. La RMSD
de estructuras alineadas indica las divergencias entre ellas. El alineamiento
estructural puede complicarse por la existencia de mltiples dominios proteicos en el
interior de una o ms de las estructuras de entrada, ya que cambios en la orientacin
relativa de los dominios entre dos estructuras a alinear, pueden modificar la RMSD
artificialmente.
Cry1Aa
Para la Cry1Aa, la fase de equilibrio se presenta a partir de 150 ps (0.15 ns) (Figura
4.7), sin embargo presenta tambin entre los 650 y 850 ps una perturbacin
probablemente debida a una modificacin conformacional. Si observamos la grfica
correspondiente al Radio de Giro y RMSD, (ver Figura 4.8), que en el lapso de
tiempo antes mencionado, se presenta el mismo fenmeno.
Como anteriormente se mencion, reportamos el equilibrio de la estructura de menor
Energa y para poder determinar la estabilidad estructural, se grafic el Radio de
Giro, que como ya mencionamos, presenta perturbacin entre los 650 y 850 ps, sin
embargo el centro de masa se mantiene estable luego del tiempo sealado. En cuanto
al Nmero de enlaces de Hidrgeno, se observa que la protena no se desnaturaliz
debido a que se mantiene el nmero de enlaces de hidrgeno.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.7: Estabilidad Energtica Cry1Aa a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), por
5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y (d) Energas de la simulacin.
Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas
se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
La media cuadrtica de la distancia entre tomos (ver Figura 4.8, nos confirma que
no hubo disrupcin de la cadena de aminocidos. Luego de saber que entre el lapso
650850 ps, se present un fenmeno que caus una perturbacin energtica,
utilizamos la RMSF, para saber que aminocidos presentan una mayor fluctuacin,
los cuales son la Treonna 90 y la Glicina 510. La treonna 90, se encuentra
localizado en el Dominio I, enlazando 2 hlices. Para el caso de la glicina 510, se
encuentra en el Dominio III, y conforma un loop que enlaza hojas .
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.8: Estabilidad Estructural Cry1Aa a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), por un
periodo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF
de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos g_gyrate, g_hbond, g_rms y g_rmsf de
GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
Cry4Ba
Para el caso de Cry4Ba (Figura 4.9), el equilibrio se obtuvo pasados los 100 ps de la
simulacin de Dinmica Molecular, tambin se presentaron perturbaciones a los
1000, 2600 y 4100 ps. En cuanto al Radio de Giro, se observ que a los 1000 ps hay
una zona estable, pero pasados los 2600 encontramos una perturbacin con lapso de
tiempo de 200 ps. Comparando en la Figura 4.10 la grfica de RMSD, encontramos
que en los tiempos sealados anteriormente, se presenta una pequea variacin en las
distancias entre tomos. Los tomos que presentan una mayor fluctuacin, los
podemos sealar utilizando la grfica RMSF.
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 4.9: Estabilidad Energtica Cry4Ba a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), por
5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y (d) Energas de la simulacin.
Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas
se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
Para la Cry4Ba, se presenta una mayor fluctuacin en los aminocidos Glicina 14,
Arginina 52, Asparragina 55, Alanina 119, Arginina 152 y Arginina 153. La Glicina
14, no presenta una conformacin ni . En los 5 casos restantes se trata de

aminocidos pertenecientes a loops en los Dominios II y III. Hay que tener en cuenta
que el rango de fluctuacin es 5 A.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.10: Estabilidad Estructural Cry4Ba a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT),

durante un tiempo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de Hidrgeno, (c) RMSD y
(d) RMSF de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos g_gyrate, g_hbond, g_rms y
g_rmsf de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
Cry1Mosq
Para la toxina modificada Cry1Mosq, se realiz una simulacin de 5000 ps (5 ns).
Durante la simulacin, se present estabilidad a partir del mismo lapso de tiempo
(150 ps) que la Cry1Aa.
En las figuras 4.11, podemos apreciar las diferentes grficas para la Energa Total, al
igual que la Energa Potencial y Cintica. En esta simulacin de Dinmica
Molecular, no se present mayor perturbacin en las Energas, lo que nos indica que
nuestra estructura se halla en la zona de equilibrio; esto debido a que la Cry1Mosq se
modific a partir de la estructura en equilibrio de la protena Cry1Aa.
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 4.11: Estabilidad Energtica Cry1Mosq a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT),

durante 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y (d) Energas de la
simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008).
Las grficas se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
En cuanto a la estabilidad estructural de la Cry1Mosq, observamos en las Figuras

4.12, la grfica correspondiente al Radio de Giro que presenta pequeas variaciones
de 0.6 A y el Nmero de enlaces de Hidrgeno se mantiene constante con un valor
promedio de 681.85 y una desviacin standart de 24.40. Tomando en cuenta la
grfica RMSD, podemos decir que la distancia entre tomos sufre pequeas
variaciones de 0.5 A.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.12: Estabilidad Estructural Cry1Mosq a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), por
un periodo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de Hidrgeno, (c) RMSD y (d)
RMSF de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos g_gyrate, g_hbond, g_rms y
g_rmsf de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
En el caso de la RMSF, los aminocidos que fluctan con mayor intensidad son los
aminocidos Asparragina 53 y 103, Glutamina 84, Treonna 90, cido asprtico 153,
Alanina 155 y Asparragina 158. Todos los aminocidos pertenecen al dominio I.
APN de Manduca sexta

Para el caso de los receptores, el tiempo de simulacin de Dinmica Molecular es
diferente. Se tom en cuenta que se generaron las estructuras terciarias a partir de
templates, por lo tanto, se necesita un mayor lapso de tiempo para poder lograr una
relajacin. Luego de haber realizado una simulacin de 5000 ps (5 ns), se observ
que en el caso de APN de Manduca sexta la estabilidad energtica se presenta desde
casi el comienzo de la simulacin, sin embargo se present una estabilidad
estructural luego de los 10000 ps (10 ns).
Por esta razn se decidi esperar hasta las 25000 ps para poder obtener as la
estabilidad estructural deseada. (Ver Figura 4.13)
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.13: Estabilidad Energtica APNms a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), durante
25000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y (d) Energas de la
Para comprobar la estabilidad estructural, se observ un estado de relajacin a los

10000 ps (10 ns) para el Radio de Giro y la RMSD. La grfica ms resaltante es la
perteneciente a la RMSF. En sta grfica observamos que hay por lo menos 9 picos
que superan la fluctuacin de 0.25 nm. Esto es debido a que lo zona donde se
presenta una mayor fluctuacin est dada entre los aminocidos 400 y 807. Se
entiende que luego de utilizar el template, los aminocidos presentan una
modificacin conformacional buscando una zona de relajacin. (Figura 4.14)
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.14: Estabilidad Estructural de APN de Manduca sexta a 291.15 K en un ensamble

cannico (NVT), por un periodo de tiempo de 25000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces
de Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos
g_gyrate, g_hbond, g_rms y g_rmsf de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas se realizaron con
el programa GNUplot 4.4.
APN de Aedes aegypti

En el caso de APN de Aedes aegypti, se observ la estabilidad energtica desde los
200 ps (0.2 ns), sin presentar perturbaciones de mayor consideracin. (Figuras 4.15)
En cuanto a las grficas en la Figura 4.16, correspondientes a la estabilidad
estructural, se da el caso que hay un descenso en cuanto a los valores de Radio de
Giro, el cual se presenta entre los 0 ps y 20000 ps, lo que nos indica que nuestro
receptor esta en bsqueda del pozo global de la superficie de potencial. La
estabilidad se logra a partir de los 2000 ps. Pasado ste tiempo de relajacin el centro
de masa se mantiene constante.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.15: Estabilidad Energtica APNae a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), durante
25000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y (d) Energas de la
La estabilidad estructural, se puede corroborar con la grfica de la media cuadrtica

de la distancia entre tomos (RMSD). Los aminocidos que presentan una mayor
fluctuacin son los aminocidos 937 y 939 en la zona terminal de la protena.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.16: Estabilidad Estructural APN de Aedes aegypti a 291.15 K en un ensamble cannico
(NVT), por un tiempo de simulacin de 25000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de
Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos
Para comprobar la estabilidad estructural de nuestras protenas mediante la

simulacin de Dinmica Molecular, se hizo uso de las grficas de Ramachandran, el
cual nos permite validar los conformaciones de los ngulos y y aproximar a
priori cual ser la estructura terciaria de la protena, ya que existen combinaciones de
ngulos para cada estructura como son las hlice y hojas (43). Los Graficas de
Ramachandran sern presentados en las siguientes hojas.
Figura 4.17: Grfica de Ramachandran Cry1Aa. Primer cuadrante corresponde a los casos
generales, en donde se ve en la parte superior izquierda las conformaciones , en la parte inferior
izquierda del primer cuadrante las hlices con orientacin a la derecha y en el primer cuadrante parte
superior derecha las hlices alpha con orientacin hacia la izquierda. Grfica obtenida gracias al
servidor Online Molprobity (Chen, 2010).
Para el caso de la Cry1Aa, obtuvimos como resultado 573 de 575 residuos (99.7 %)
en zonas permitidas y 543 en zonas altamente favorecidas (94.4 %). Los aminocidos
que encontramos fuera de la zona permitida son las Glicinas 220 y 496, las cuales no
se encuentran en hlices y lminas , ni tampoco en posibles sitios de accin (ver
Figura 4.17).
En cuanto a la Cry4Ba (Figura 4.18), se obtuvo 100 % de residuos en zonas

permitidas, pero 522 de 556 aminocidos (93.9 %), en zonas favorecidas, esto queda
comprobado desde el estudio energtico resultante de la simulacin de Dinmica
Molecular de nuestra protena.
Figura 4.18: Grfica de Ramachandran Cry4Ba. Primer cuadrante corresponde a los casos
Figura 4.19: Grfica de Ramachandran Cry1Mosq. Primer cuadrante corresponde a los casos
Para la toxina modificada, obtuvimos 566 de 568 aminocidos en zonas permitidas,

(99.6 %) y 504 aminocidos en zonas favorecidas (88.7 %). Los aminocidos que
estn fuera de la zona permitida son la Fenilalanina 152 y el cido asprtico 281,
pertenecientes a loops presentes en los Dominios I y II, respectivamente (ver Figura
4.19). Tanto la fenilalanina como el cido asprtico, son aminocidos que tienen una
gran posibilidad de ser parte de centros activos de protenas, en nuestro caso estos
aminocidos forman parte de zonas loop, por lo tanto no afectan nuestros resultados.
Figura 4.20: Grfica de Ramachandran Aminopeptidasa N de Manduca sexta. Primer cuadrante

corresponde a los casos generales, en donde se ve en la parte superior izquierda las conformaciones ,
en la parte inferior izquierda del primer cuadrante las hlices con orientacin a la derecha y en el
primer cuadrante parte superior derecha las hlices alpha con orientacin hacia la izquierda. Grfica
obtenida gracias al servidor Online Molprobity (Chen, 2010).
Para APNms, obtuvimos como resultados 793 residuos de un total de 805 en zonas
permitidas, (98.5 %) y 676 residuos en zonas favorecidas (84 %) Figura 4.20. El
conjunto de 12 aminocidos que se hallan fuera de zonas permitidas, se encuentran
fuera de la zona que puede ser potencialmente un sitio activo para la interaccin
Toxina Receptor, la zona que presenta hojas . Si bien un 98.5 % es un valor alto,
probablemente se pueda mejorar este porcentaje si se realiza un simulacin con un
mayor tiempo de equilibrio, de aproximadamente unos 80 ns, que para el caso de la
presente investigacin, se halla fuera de nuestro alcance, debido a los requisitos

computacionales.
Figura 4.21: Grfica de Ramachandran Aminopeptidasa N de Aedes aegypti. Primer cuadrante

corresponde a los casos generales, en donde se ve en la parte superior izquierda las conformaciones ,
en la parte inferior izquierda del primer cuadrante las hlices con orientacin a la derecha y en el
primer cuadrante parte superior derecha las hlices alpha con orientacin hacia la izquierda. Grfica
obtenida gracias al servidor Online Molprobity (Chen, 2010)
Para el segundo de nuestros receptores, la APNae, obtuvimos un 98.5 % de residuos

en zonas permitidas y 84 % en zonas favorecidas de un total de 805 residuos. (Ver
Figura 4.21). En este caso es notorio que la Glutamina 98, se halla fuera de la zona
permitida, pero esta se encuentra n un loop de las hojas y, por lo tanto, se puede
descartar como posible participante del sitio activo. En el caso de los tres
aminocidos restantes, se resalta que no se encuentran en una posible zona de

interaccin.
Estructuras terciarias y sus superficies de Potencial Electrosttico

Para un mejor entendimiento de nuestros resultados, presentamos una vista
isomtrica de las 5 protenas, las cuales sern utilizadas en el siguiente paso de
nuestra investigacin, la interaccin Toxina Receptor.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figura 4.22: Vista isomtrica de Cry1Aa luego de la simulacin de Dinmica Molecular. En donde
(a) muestra la vista Frontal, (b) la vista Lateral izquierda, (c) una vista Posterior, (d) la vista Lateral
derecha, (e) la vista Superior y (f) la vista Inferior. Se marca con una flecha negra el Dominio II
responsable de la toxicidad (Grochulski, 1995). Figuras obtenidas mediante el programa Chimera
1.5.3
En la Figura 4.22(a), se presenta con un color verde el Dominio II, responsable de la

toxicidad (44). Para identificarlo y compararlo, se seala con una flecha negra la
zona responsable de la toxicada y el sitio de interaccin en la protena Cry1Aa.
Cuando calculamos utilizando el software APBS las grficas en donde se aprecia la
hper superficie del Potencial Electrosttico de la Cry1Aa (Figura 4.23),
observamos que la zona del Dominio II, en Cry1Aa, presenta un potencial
electrosttico positivo. Esto es de suma importancia cuando se busca zonas de
interaccin electrosttica en una protena.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figura 4.23: Vista isomtrica de Cry1Aa luego de la simulacin de Dinmica Molecular.

Potencial Electrosttico. En esta figura se muestra tambin la superficie de potencial electrosttico,
el cual se grafico con APBS (Baker, 2001), en donde el potencial electrosttico negativo es de color en
tonos de rojo y potencial electrosttico positivo de color en tonos de azul. Se utiliza la seal negra
para marcar de igual manera el Dominio II de la Toxina Cry1Aa. Figura obtenida mediante la
utilizacin del Chimera 1.5.3.
Para la toxina Cry4Ba, tambin sealamos el Dominio II, en color verde, responsable
de la toxicidad (ver Figura 4.24).
(a)
(d)
(b)
(e)
(c)
(f)
Figura 4.24: Vista isomtrica de Cry4Ba luego de la simulacin de Dinmica Molecular En donde
(a) muestra la vista Frontal, (b) la vista Lateral izquierda, (c) una vista Posterior, (d) la vista Lateral
derecha, (e) la vista Superior y (f) la vista Inferior. Se marca con una flecha negra el Dominio II
responsable de la toxicidad (Boonserm, 2005). Figuras obtenidas mediante el programa Chimera 1.5.3
En las grficas de la Figura 4.25 que muestran la hper superficie del Potencial
Electrosttico, la zona perteneciente al Dominio II, presenta un potencial positivo.
De la misma manera al ser una zona con una caracterstica de aceptacin de densidad
electrnica.
(a)
(d)
(b)
(e)
(c)
(f)
Figura 4.25: Vista isomtrica de Cry4Ba luego de la simulacin de Dinmica Molecular,

Potencial Electrosttico. En esta figura se muestra tambin la superficie de potencial electrosttico,
el cual se grafico con el software APBS (Baker, 2001) en donde el potencial electrosttico negativo es
de color en tonos de rojo y potencial electrosttico positivo de color en tonos de azul. Se utiliza la
seal negra para marcar de igual manera el Dominio II de la Toxina Cry4Ba. Figura obtenida mediante
la utilizacin del Chimera 1.5.3.
En cuanto a las Figuras 4.26, que muestran la toxina modificada diseada en esta
investigacin, el Dominio II ha sido sealado con la una flecha. El Dominio II es
responsable de la toxicidad, adems de ser la zona en donde se realiz la
modificacin por sustitucin de aminocidos.
(a)
(d)
(b)
(e)
(c)
(f)
Figura 4.26: Vista isomtrica de Cry1Mosq luego de la simulacin de Dinmica Molecular. En

donde (a) muestra la vista Frontal, (b) la vista Lateral izquierda, (c) una vista Posterior, (d) la vista
Lateral derecha, (e) la vista Superior y (f) la vista Inferior. Se marca con una flecha negra el Dominio
II responsable de la toxicidad (Liu, 2005). Figuras obtenidas mediante el programa Chimera 1.5.3
El Potencial Electrosttico (Figura 4.27) para el caso de la Cry1Mosq, refleja zonas

con un potencial positivo. Esta caracterstica es importante para todas las toxinas, ya
que como veremos a continuacin, los receptores presentan potenciales
electrostticos negativos.
(a)
(d)
(b)
(e)
(c)
(f)
Figura 4.27: Vista isomtrica de Cry1Mosq luego de la simulacin de Dinmica Molecular,

Potencial Electrosttico. En esta figura se muestra las diferentes vistas que en la Figura4.27. Se
muestra tambin la superficie de potencial electrosttico, el cual se grafico con el software APBS
(Baker, 2001) en donde el potencial electrosttico negativo es de color en tonos de rojo y potencial
electrosttico positivo de color en tonos de azul. Se utiliza la seal negra para marcar de igual manera
el Dominio II de la Toxina Cry1Mosq. Figura obtenida mediante la utilizacin del Chimera 1.5.3 .
Para el caso de APNms, observamos en la Figura 4.28, que en la zona azul se forman
lminas antiparalelas. Las lminas , cumplen funciones en las interacciones intra e
intermoleculares. Esta zona azul podra formar parte de la interaccin. Se seala
tambin la parte inferior de la protena, si comparamos con la Figura 4.29, hay
presencia de potencial electrosttico negativo (color rojo). Se sabe que la protena
Aminopeptidasa N de Manduca sexta es una protena que est presente en la
membrana de las clulas epiteliales del intestino medio de las larvas
(microvellosidad), podra tratarse de una zona de interaccin posible.
(a)
(d)
(b)
(e)
(c)
(f)
Figura 4.28: Vista isomtrica de la Aminopeptidasa N de Manduca sexta luego de la simulacin

de Dinmica Molecular. En donde (a) muestra la vista Frontal, (b) la vista Lateral izquierda, (c) una
vista Posterior, (d) la vista Lateral derecha, (e) la vista Superior y (f) la vista Inferior. Se marca con
una flecha de los posibles sitios de interaccin. Figuras obtenidas mediante el programa Chimera 1.5.3
Si observamos la Figura 4.29 que presenta el Potencial Electrosttico, observamos

que hay dos zonas con potenciales negativos, la que se colorea con un rojo ms
intenso, donde hay poca presencia de hlices (zona verde), y la zona de hojas .
Con esta grfica comprobamos que la zona con lminas , es un buena zona para que
las toxinas interaccionen. Podemos observar en la Figura 4.29 que la superficie
negativa del potencial electrosttico se encuentra posicionada en dos zonas, en la
zona de hojas y en la parte inferior, donde hay presencia de hlices alpha.
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
Figura 4.29: Vista isomtrica de la Aminopeptidasa N de Manduca sexta luego de la simulacin

de Dinmica Molecular, Potencial Electrosttico. En esta figura se muestra las diferentes vistas que
en la Figura4.28. Se muestra tambin la superficie de potencial electrosttico, el cual se grafico con el
software APBS (Baker, 2001) en donde el potencial electrosttico negativo es de color en tonos de
rojo y potencial electrosttico positivo de color en tonos de azul. Se utiliza la seal negra para marcar
de igual manera el Dominio II de la Toxina Cry1Mosq. Figura obtenida mediante la utilizacin del
Chimera 1.5.3.
Para el caso de la APNae, observamos en la Figura 4.30 que hay presencia de

lminas beta en la zona azul. Como ya se dijo, es una zona con potencial oportunidad
para ser sitio activo de interaccin.
Para corroborar lo que se dijo anteriormente, observamos una protena con una hper
superficie de potencial electrosttico negativo. Esto indica, que podra tratarse de un
sitio activo potencial para la interaccin (ver Figura 4.31)
(a)
(d)
(b)
(c)
(e)
(f)
Figura 4.30: Vista isomtrica de de la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti luego de la simulacin

de Dinmica Molecular. En donde (a) muestra la vista Frontal, (b) la vista Lateral izquierda, (c) una
vista Posterior, (d) la vista Lateral derecha, (e) la vista Superior y (f) la vista Inferior. Se marca con
una flecha negra el Dominio II responsable de la toxicidad (Boonserm, 2005). Figuras obtenidas
mediante el programa Chimera 1.5.3
(a)
(d)
(b)
(c)
(e)
(f)
Figura 4.31: Vista isomtrica de la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti luego de la simulacin de

Dinmica Molecular. Potencial Electrosttico. En esta figura se muestra las diferentes vistas que en
la Figura4.30. Se muestra tambin la superficie de potencial electrosttico, el cual se grafico con el
software APBS (Baker, 2001) en donde el potencial electrosttico negativo es de color en tonos de
rojo y potencial electrosttico positivo de color en tonos de azul. Se utiliza la seal negra para marcar
de igual manera el Dominio II de la Toxina Cry1Mosq. Figura obtenida mediante la utilizacin del
Chimera 1.5.3.
4.4.
Docking de Estructuras terciarias
Para realizar el dock de nuestras Toxinas con los receptores, hicimos uso del servidor
ClusPro 2.0, que luego de 2 das de clculo, nos devolvi 120 estructuras por cada
interaccin, valga decir Docking Electrosttico, Docking Hidrofbico, Docking
mediante las Energas de van der Waals y un Docking balanceado. El servidor nos
brinda tambin los datos de Energa referencial para cada una de las 120 estructuras.
Como se observa en las siguientes grficas (Figura 4.32), comparamos los resultados
de Energa procedentes del Docking, lo cual nos sirve para seleccionar las estructuras
que presentan una menor Energa referencial.
El Docking que toma en cuenta la hidrofobicidad, presenta los menores valores de
Energa, siendo esto lo ideal para una interaccin. Este fenmeno es debido a que los
receptores de las protenas cumplen funciones a nivel membrana y pueden presentar
un efecto hidrofbico en las interacciones inicas (ver Figura 4.32).
Teniendo 120 estructuras por cada simulacin de interacciones, se escoge solo las
estructuras en donde se utiliz la hidrofobicidad de la protena para el proceso del
docking, esto hace que el nmero de posibles estructuras que simulan el proceso de
interaccin, se reduzca a 30. Nosotros escogimos las estructuras que utilicen el
dominio II en las toxinas, ya que en ste dominio segn Xinyan en el 2005, se
presenta el loop 2 que es el de reconocimiento e insercin en el intestino para la
interaccin Toxina Receptor.
Luego de tener nuestras 6 estructuras y, despus de optimizar la geometra de las
mismas, se procedi a una simulacin de dinmica molecular, para reportar el valor
de Energa del sistema y observar la estabilidad estructural de los mismos.
(a)
(b)
(b)
(d)
(e)
(f)
Figura 4.32: Scores de Energa: Docking. Grficas en donde se compara los valores de Energa de las
seis interacciones, utilizando los cuatro diferentes tipos de interaccin: Balanceado, Electrosttico,
Hidrofbico y de van der Waals. Para nuestro caso de estudio se observa que en la simulacin de interaccin de Docking tipo Hidrofbico, presentan los menores valores de Energa. Datos obtenidos de la
simulacin de Docking utilizando el servidor online ClusPro (Kozakov, 2010)
4.5.
Estabilidad de estructuras cuaternarias
Si tomamos en cuenta que para las toxinas Cry se realiz una simulacin de
Dinmica Molecular con un periodo de tiempo de 5000 ps; que en el caso de los
receptores APN en los insectos blancos, se present un estado de relajacin de 5000
ps; se realizo para las estructuras cuaternarias resultantes de la interaccin entre
Toxinas y Receptores, un tiempo de simulacin de 5000 ps, con la intensin de tener
el mismo lapso de tiempo y la misma cantidad de datos.
- APNms Cry1Aa
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 4.33: Estabilidad Energtica APNms Cry1Aa a 291.15 K en un ensamble cannico

(NVT), durante un tiempo de 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total
y (d) Energas de la simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de GROMACS
4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
Para la interaccin APNms Cry1Aa, presentamos la Figura 4.33 en donde la

estabilidad energtica se obtiene pasados los 200 ps. Para esta interaccin, no se
observ perturbaciones notorias. Se calcul un valor promedio de -39492.67 kJ/mol
para el caso de la Energa Potencial(a), 13176.56 kJ/mol para la Energa Cintica (b)
y -26286.8 kJ/mol para la Energa Total (c) del sistema.
En cuanto al Radio de Giro, se observ estabilidad a partir de 100 ps con un
promedio de 3.75 nm y para el Nmero de enlaces de Hidrgenos, correspondiente a
esta interaccin, observamos que no hay un cambio brusco, esto indica que la
estructura no present mayor variacin. Podemos obtener la misma conclusin si
observamos las grficas pertenecientes a la Media Cuadrtica de las Distancias,
(RMSD) (ver Figura 4.34). En cuanto a la grfica correspondiente a RMSF,
notoriamente se presenta una fluctuacin alta entre los residuos 800 y 1000.
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 4.34: Estabilidad Estructural APNms Cry1Aa. Simulacin realizada a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT),
durante un periodo de tiempo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF de
aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos g_gyrate, g_hbond, g_rms y g_rmsf de GROMACS 4.5.4 (Hess,
2008). Las grficas se realizaron con el programa GNUplot 4.4.
- APNms Cry4Ba
En el caso de la Figura 4.35, perteneciente a la interaccin APNms Cry4Ba, la
estabilidad se observ a los 200 ps, sin observar mayor perturbacin. La Energa
Potencial (a) presenta un promedio de -40271.19 kJ/mol, 13065.16 kJ/mol para la
Energa Cintica (b) y 27232.11 kJ/mol para la Energa Total(c) de la interaccin.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.35: Estabilidad Energtica APNms Cry4Ba a 291.15 K en un ensamble cannico

(NVT), en un lapso de tiempo de 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa
Total y (d) Energas de la simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de
Para APNms Cry4Ba, se observ estabilidad a partir de los 1400 ps en el caso del
Radio de Giro, Se aprecia un fenmeno parecido en el caso de las grficas
correspondientes al Nmero de enlaces de Hidrgenos y a RMSD. La fluctuacin
expresada en la grfica de RMSF, indica que la interaccin tuvo a lugar el domino II
de la toxina y la zona terminal del receptor (ver Figura 4.36).
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.36: Estabilidad Estructural APNms Cry4BaEstabilidad Estructural APNms Cry4Ba.

Simulacin realizada a 291.15 K en un ensamble cannico (NVT), por un periodo de tiempo de 5000
ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF de aminocidos.
Las grficas se obtuvieron con los comandos g_gyrate, g_hbond, g_rms y g_rmsf de GROMACS
- APNms Cry1Mosq
De la misma manera que en los casos anteriores, la estabilidad energtica para la
interaccin APNms Cry1Mosq se obtuvo a los 200 ps de empezar la Dinmica
Molecular (ver Figura 4.37). Se obtuvo para la Energa Potencial(a) un valor de
-39493.18 kJ/mol, para la Energa Cintica (b) 13008.16 kJ/mol y para la Energa
Total (c) -26383.47 kJ/mol.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.37: Estabilidad Energtica APNms Cry1Mosq a 291.15 K en un ensamble cannico

(NVT), por un periodo de simulacin de 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c)
Energa Total y (d) Energas de la simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de
En el sistema APNms Cry1Mosq, se observa relajacin en la grfica de RMSD, a

partir de los 500 ps, esto es corroborado, por el Radio de Giro y el Nmero de
enlaces de Hidrgeno. De la misma manera, se observa gracias a la grfica RMSF,
que se presenta una mayor fluctuacin en los ltimos aminocidos de la APNms y los
que forman parte del comienzo de la toxina Cry1Mosq. (Ver Figura 4.38)
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.38: Estabilidad Estructural APNms Cry1Mosq. Simulacin realizada a 291.15 K en un

ensamble cannico (NVT), por un lapso de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de
Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los comandos g
- APNae Cry1Aa
En la interaccin APNae Cry1Aa, se observa estabilidad a partir de los 100 ps, sin
presentar perturbacin alguna tanto como para la Energa Potencial (a) con valor
promedio de -44151.62 kJ/mol, para la Energa Cintica (b) con un valor de 14040.18
kJ/mol y Energa Total con un promedio de Energa de -30187.43 kJ/mol (ver Figura
4.39).
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.39: Estabilidad Energtica APNae Cry1Aa a 291.15 K en un ensamble cannico

(NVT), por un periodo de tiempo de 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c)
Energa Total y (d) Energas de la simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de
Caso contrario se da en la grfica de Radio de Giro, ya que se presenta una pequea

alteracin en el lapso de tiempo 1000 a 1300 ps. Para respaldar esta informacin
podemos observar la grfica de RMSD (ver Figura 4.40).
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.40: Estabilidad Estructural APNae Cry1Aa. Simulacin realizada a 291.15 K en un

ensamble cannico (NVT), por un lapso de tiempo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de
enlaces de Hidrgeno, (c) RMSD y (d) RMSF de aminocidos. Las grficas se obtuvieron con los
comandos g_gyrate, g_hbond, g_rms y g_rmsf de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008). Las grficas se
realizaron con el programa GNUplot 4.4.
- APNae Cry4Ba
En la interaccin APNae Cry4Ba, para la estabilidad energtica (ver Figura 4.41),
podemos observar que alcanza su estado de relajacin a partir de los 150 ps y la
ausencia de perturbaciones notorias tanto como para la Energa Potencial (a) que
report un valor promedio de -45131.04 kJ/mol, para la Energa Cintica (b) con un
valor promedio de 13927.40 kJ/mol y un valor promedio de la Energa Total (c) de
-31223.03 kJ/mol.
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.41: Estabilidad Energtica APNae Cry4Ba a 291.15 K en un ensamble cannico

(NVT), por un periodo de 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y
(d) Energas de la simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de GROMACS
Se observa una relajacin estructural a partir de los 1000 ps, como se ve en la grfica
(a), correspondiente al Radio de Giro. Esto indica que no hay presencia de cambios
bruscos en el centro de masa. En la grfica (b), el Nmero de enlaces de Hidrgenos
es estable. En cuando a la RMSD, se observa una pequea variacin entre los 2500
ps y 4000 ps de 2 A. (Ver Figura 4.42)
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.42: Estabilidad Estructural APNae Cry4Ba. Simulacin realizada a 291.15 K en un

ensamble cannico (NVT), por un tiempo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de
- APNae Cry1Mosq
A continuacin observamos que en la interaccin APNae Cry1Mosq, se observa una
relajacin a partir de los 150 ps, sin presentar una perturbacin notable durante el
proceso de simulacin. Se reportaron los valores promedios de -44220.16 kJ/mol
para la Energa Potencial, 13951.40 kJ/mol para la Energa Cintica y -30336.80
kJ/mol para la Energa Total del Sistema (ver Figura 4.43).
(a)
(c)
(b)
(d)
Figura 4.43: Estabilidad Energtica APNae Cry1Mosq a 291.15 K en un ensamble cannico

(NVT), por un periodo de 5000 ps. (a) Energa Potencial, (b) Energa Cintica, (c) Energa Total y
(d) Energas de la simulacin. Las grficas se obtuvieron con el comando g_energy de GROMACS
En el caso de la estabilidad estructural, observamos que a partir de los 2000 ps, se

presenta en el Radio de Giro, perturbaciones de 0.2Aa partir de los 2500
nanosegundos. Se presenta en la grfica correspondiente a la RMSF, fluctuaciones de
2.5A entre los residuos 600 y 1000 (ver Figura 4.44)
(a)
(b)
(c)
(d)
Figura 4.44: Estabilidad Estructural APNae Cry1Mosq. Simulacin realizada a 291.15 K en un

ensamble cannico (NVT), por un tiempo de 5000 ps. (a) Radio de Giro, (b) Nmero de enlaces de
En las siguientes pginas se presentaran las grficas de Ramachandran de los seis

sistemas estudiados.
Figura 4.45: Grfica de Ramachandran APNms Cry1Aa. Primer cuadrante corresponde a los
casos generales, en donde se ve en la parte superior izquierda las conformaciones , en la parte
inferior izquierda del primer cuadrante las hlices con orientacin a la derecha y en el primer
cuadrante parte superior derecha las hlices alpha con orientacin hacia la izquierda. Grfica obtenida
gracias al servidor Online Molprobity (Chen, 2010).
Para la interaccin APNms Cry1Aa (Figura 4.45), un 98.6 % de 1380 residuos, en

zonas permitidas. Los 20 aminocidos que no se encuentran dentro de zonas
permitidas, no se encuentran ubicados en las lminas de la Toxina (Cry1Aa) ni del
receptor Aminopeptidasa N de Manduca sexta. Los aminocidos que se encuentran
en zonas no permitidas son: A12 ARG, A34 THR, A79 ASP, A150 HIS, A274 ASP,
89
A298 GLU, A361 PRO, A441 PHE, A561, ASN, A564 VAL, A634 TRO, A637 ALA,
A706 ASP, A726 ARG, A743 ASN, B911 BASP, B995 GLY, B1069 PRO, B1086
ARG, B1178 ARG; perteneciendo los cinco ltimos a la toxina Cry1Aa y el resto a la
Aminopeptidasa N de Manduca sexta.
Figura 4.46: Grfica de Ramachandran APNms Cry4Ba. Primer cuadrante corresponde a los
gracias al servidor Online Molprobity (Chen, 2010).
En cuanto a APNms Cry4Ba (Figura 4.46), obtuvimos con 98.5 %, 20 aminocidos

fuera de zonas permitidas. Se da el caso que los 20 aminocidos. Tenemos tambin
1131 aminocidos que corresponden al 83.1 % de aminocidos en zonas favorables.
90
Los aminocidos que se encontraron fuera de zonas permitidas fueros los siguientes:
A10 ARG, A27 ALA, A34 THR, A150 HIS, A156 PRO, A274 ASP, A389 LEU,
A424, SER, A531 ASP, A629, A637 ALA, A726 ARG, A743 ASN, B831 TYR, B924
SER, B1039, B1115, B1180 ASN, B1317 PRO y B1340 ASN. Cabe mencionar que
ninguno de estos residuos se encontr en la zona de interaccin.
Figura 4.47: Grfica de Ramachandran APNms Cry1Mosq. Primer cuadrante corresponde a los
gracias al servidor Online MolProbity (Chen, 2010).
Para APNms Cry1Mosq, se presentan 1358 de 1373 aminocidos en zonas permitidas, esto
hace un 98.9 % y 1190 aminocidos en zonas favorecidas (ver Figura 4.47).
91
Los aminocidos que no presentaron una conformacin dentro de las zonas

permitidas fueron los siguientes: A49 GLN, A79 ASP, A150 HIS, A188 ALA, A274
ASP, A298 GLU, A361 PRO, A370 ILE, A375 GLN, A424 SER, A531 ASP, A564
VAL, A637 ALA, A726 ARG y B1088 ASP. Siendo el cido asprtico (ASP) 1088 el
nico presente en la toxina modificada Cry1Mosq.
Figura 4.48: Grfica de Ramachandran APNae Cry1Aa. Primer cuadrante corresponde a los casos
En esta interaccin, se observa un porcentaje mayor de aminocidos en regiones

permitidas, ya que el receptor APNae, tena un menor nmero de aminocidos en
92
zonas no permitidas. El porcentaje en esta interaccin es de 99.3 %, un total de 1461

de 1472 aminocidos en zonas permitidas. (Ver Figura 4.48). Estos diez aminocidos
fuera de zonas permitidas son: A31 SER, A34 GLN, A337 GLY, A379 PRO, A700
SER, B952 ASN, B1022 VAL, B1185 GLY, B1270 ARG, B1340 ILE y B1391 VAL;
perteneciendo los ltimos seis a la toxina Cry1Aa.
Figura 4.49: Grfica de Ramachandran APNae Cry4Ba. Primer cuadrante corresponde a los casos
Para el caso de APNae Cry4Ba (Figura 4.49), si tomamos en cuenta que las
protenas terciarias pertenecientes a APNms y Cry4Ba, presentaban porcentajes muy
93
altos de aminocidos en zonas permitidas; en esta interaccin tambin se presenta

una relacin de aminocidos en regiones permitidas muy alta. Son 1446 de 1456
residuos en zonas permitidas (99.5 %). Los aminocidos que no se encuentran en
zonas permitidas son: A31 SER, A34 GLN, A379 PRO, B953 PRO, B966 PHE,
B1272 ASN y B1432 ASN. Los ltimos cuatro ltimos pertenecientes a la toxina
Cry4Ba.
Figura 4.50: Grfica de Ramachandran APNae Cry1Mosq. Primer cuadrante

corresponde a los casos generales, en donde se ve en la parte superior izquierda las
conformaciones , en la parte inferior izquierda del primer cuadrante las hlices
con orientacin a la derecha y en el primer cuadrante parte superior derecha las
hlices alpha con orientacin hacia la izquierda. Grfica obtenida gracias al servidor
Online Molprobity (Chen, 2010).
94
Para el sistema de protenas APNae Cry1Mosq, se presentaron 13 aminocidos

fuera de zonas permitidas. Lo que corresponde a un 99.1 % de un total de 1465
residuos y 1294 aminocidos en zonas favorecidas (ver Figura 4.50). Los residuos
que se encuentran fuera del 99.1 % (zona permitida), son: A31 SER, A379 PRO,
A382 SER, A530 ASP, A644 LYS, A719 GLY, A861 GLY, B1011 ALA, B1180 ASP,
B1197 PHE, B1234 GLY, B1237 PRO y B1240 LEU. En este grfico se puede
observar que cuatro de los seis aminocidos fuera de zonas permitidas son: cido
asprtico 1180, Glicina 1234, Prolina 1237 y Leucina 1240 forman parte del loop 2,
en el cual se hizo la modificacin por sustitucin de aminocidos para que pueda
presentar toxicidad frente a los dpteros (Aedes aegypti).
De la misma manera que para las estructuras terciarias, se muestran a continuacin
las estructuras resultantes (estructuras cuaternarias), luego del proceso Docking
Molecular.
En la Figura 4.51, la interaccin se realiz entre el Domino II y III de la Cry1Aa, que
corresponde al color rojo y anaranjado en (b.2); y la zona de las hojas , de la APN
de Manduca sexta, como se observa en (a) de la misma figura, lo que estuvo previsto
teniendo en cuenta la superficie de potencial electrosttico desarrollada previamente,
en donde observamos que un potencial negativo de la Aminopeptidasa N y un
potencial electrosttico azul del Dominio II, de Cry1Aa (Figuras 4.29 y 4.23,
respectivamente). Para el caso de APNms Cry4Ba (ver Figura 4.52), observamos
que se form el sistema cuaternario interaccionando el Dominio II de Cry4Ba, color
verde en (b.2) y la zona que presenta una estructura secundaria de hojas de la
Aminopeptidasa N (a.1). De igual manera si comparamos las Figuras 4.25 de la
toxina Cry4Ba y la Figura 4.29 de la Aminopeptidasa N de Manduca sexta,
observamos potenciales electrostticos positivos (azul) frente a negativos (rojo). En
cuanto a APNmsCry1Mosq, la interaccin utiliza el Dominio II y III, color rojo y
naranja de (b.1), de la Cry1Mosq, como se muestra en la Figura 4.53. El Dominio II
de la toxina modificada, fue en donde se realiz la modificacin por sustitucin y
eliminacin de aminocidos.
95
En el grupo de interacciones en donde toma parte la APN de Aedes aegypti, se da la

utilizacin de las hojas (color azul), para la interaccin. Para la interaccin con
96
Cry1Aa, como se muestra en la Figura 4.54, se toma el Dominio II (naranja), que es

conocido por tomar parte en la formacin de la estructura cuaternaria. Para el sistema
APNae Cry4Ba (ver Figura 4.55), se observa que se utiliz el Dominio II (amarillo)
de la Cry4Ba, exactamente los loops, al final de las hojas (a.2) con la zona que
presenta tambin una conformacin de la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti
(a.1).
En la Figura 4.56, correspondiente a la interaccin APNae Cry1Mosq, se observa
que la interaccin utiliza como sitio activos el Dominio II de la Cry1Mosq, y la zona
de APNae que contiene hojas .
Con todos estos datos es muy probable que las interacciones se encuentran en la fase
de relajacin sin presentar perturbaciones notables (Grficas de Energa), el
movimiento durante la simulacin de Dinmica Molecular que nos indica que las
estructuras no han sufrido un cambio brusco en cuanto a su conformacin cuaternaria
(Grficas de Estabilidad Estructural) y que tienen un alto porcentaje de residuos en
zonas permitidas. De igual manera con los datos proporcionados es favorable hacer
los clculos necesarios para obtener los parmetros termodinmicos, haciendo uso de
los 5 nanosegundos que representan 5 millones de datos de Energa Total, para
utilizarlos con los datos de las Estructuras Terciarias.
(a)
(b)
Figura 4.51: Estructura cuaternaria APNms Cry1Aa. En (a) las conformaciones hlices
presentan un color rojo y las lminas presentan color amarillo. (a.1) pertenece a la Aminopeptidasa
N de Manduca sexta y (a.2) a la toxina Cry1Aa. En (b) se representa la coloracin rainbow, de
acuerdo con la posicin de los residuos a lo largo de una cadena: N-terminal (azul) y C-terminal
(rojo). (b.1) corresponde a la Aminopeptidasa N de Manduca sexta y (b.2) a la toxina Cry1Aa. Figura
obtenida mediante la utilizacin del software PyMol 1.2r2 (Schrodinger, 2010).
(a)
(b)
Figura 4.52: Estructura cuaternaria APNms Cry4Ba.En (a) las conformaciones hlices
N de Manduca sexta y (a.2) a la toxina Cry4Ba. En (b) se representa la coloracin rainbow, de
(rojo). (b.1) corresponde a la Aminopeptidasa N de Manduca sexta y (b.2) a la toxina Cry4Ba. Figura
obtenida mediante la utilizacin del software PyMol 1.2r2 (Schrodinger, 2010).
(a)
(b)
Figura 4.53: Estructura cuaternaria APNms Cry1Mosq. En (a) las conformaciones hlices
N de Manduca sexta y (a.2) a la toxina Cry1Mosq. En (b) se representa la coloracin rainbow, de
(rojo). (b.1) corresponde a la Aminopeptidasa N de Manduca sexta y (b.2) a la toxina Cry1Mosq.
Figura obtenida mediante la utilizacin del software PyMol 1.2r2 (Schrodinger, 2010).
(a)
(b)
Figura 4.54: Estructura cuaternaria APNae Cry1Aa. En (a) las conformaciones hlices
N de Aedes aegypti y (a.2) a la toxina Cry1Aa. En (b) se representa la coloracin rainbow, de acuerdo
con la posicin de los residuos a lo largo de una cadena: N-terminal (azul) y C-terminal (rojo). (b.1)
corresponde a la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti y (b.2) a la toxina Cry1Aa. Figura obtenida
mediante la utilizacin del software PyMol 1.2r2 (Schrodinger, 2010).
(a)
(b)
Figura 4.55: Estructura cuaternaria APNae Cry4Ba. En (a) las conformaciones hlices
N de Aedes aegypti y (a.2) a la toxina Cry4Ba. En (b) se representa la coloracin rainbow, de acuerdo
con la posicin de los residuos a lo largo de una cadena: N-terminal (azul) y C-terminal (rojo). (b.1)
corresponde a la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti y (b.2) a la toxina Cry4Ba. Figura obtenida
mediante la utilizacin del software PyMol 1.2r2 (Schrodinger, 2010).
(a)
(b)
Figura 4.56: Estructura cuaternaria APNae Cry1Mosq. En (a) las conformaciones hlices
N de Aedes aegypti y (a.2) a la toxina Cry1Mosq. En (b) se representa la coloracin rainbow, de
(rojo). (b.1) corresponde a la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti y (b.2) a la toxina Cry1Mosq.
Figura obtenida mediante la utilizacin del software PyMol 1.2r2 (Schrodinger, 2010).
4.6.
Termodinmica
La simulacin de Dinmica Molecular llevada a cabo para Estructuras terciarias,

como para Estructuras cuaternarias, nos brinda los datos de Energa Total de las 11
estructuras estudiadas. Si tomamos en cuenta que la funcin de particin describe las
propiedades de un sistema termodinmicamente en equilibrio (6), el promedio de las
Energas Totales de los microestado para cada sistema, se puede considerar como la
Energa Total del Sistema.
E U
(4.1)
Se obtuvo un total de 5 millones de datos por cada protena (5 ns) que corresponden
a la zona de equilibrio; con los cuales se obtuvo, como se muestra en la Tabla 4.1, el
promedio y la desviacin standart de los 11 sistemas.
Tabla 4.1: Protenas y sus valores de Energa
Estructuras
terciarias
Estructuras
cuaternarias
Estructura
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
U (kJ/mol)*
-10196.79
-11157.70
-10077.88
-15977.36
-20578.30
-26286.80
-27232.11
-26383.47
-30187.43
-31223.03
-30336.80
s*
122.17
135.50
124.96
115.48
128.84
236.58
222.84
225.30
243.49
245.90
239.53
*Valores a partir de los clculos del comando g_energy de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008)
Se tom en cuenta la molaridad del sistema, por lo que se hace uso del nmero de
Avogadro, para tener la Energa Total para un mol de protena. (KJ/mol).
10
4
10
5
Tabla 4.2: Sistemas y sus caractersticas fsicas

Estructura
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
P (Pa)*
1268769.90
1261696.40
1262410.30
1316109.50
1309621.60
1311294.10
Volumen m3*
0.23E-24
0.23E-24
0.22E-24
0.24E-24
0.24E-24
0.24E-24
Temperatura (K)*
291.15
291.15
291.15
291.15
291.15
291.15
*Valores a partir de los clculos de los comandos g_sas y g_energy de GROMACS 4.5.4 (Hess, 2008)
En la Tabla 4.2 se presentan las caractersticas fsicas del sistema. Para el ensamble
cannico (NVT). La presin sufre variaciones, por lo tanto presenta un diferencial
P, el cual es utilizado para el clculo de la entalpa.
Para los valores de U, se encontraron por medio de la Energa de Interaccin, que
para un sistema cannico, es igual a la Energa Interna que es obtenida fcilmente en
una simulacin de Dinmica Molecular, mediante el promedio de los estados que son
examinados durante el curso de la simulacin, como lo describi Leach en su libro
Molecular Modelling: Principles and Application. (38)
Como se ve en las Tablas 4.3 y 4.4, los valores de A, indican que los sistemas se
hallan en equilibrio (A = 0).
Observamos tambin que la Entalpa tiene el mismo valor que la Energa Interna, lo
cual se da porque la variacin del volumen es constante y no hay un trabajo de
expansin posible. Cuando el volumen es constante, el calor emitido o absorbido por
la reaccin es igual al cambio de la Energa interna que ocurre durante la misma.
Para el caso del la interaccin con el receptor APN de Manduca sexta, observamos
una entropa negativa, lo cual indica que la reaccin tiende al orden (S < 0). En el
caso de la entalpa, observamos que es menor a cero, esto indica que la interaccin
libera Energa al sistema, esta Energa se presenta en forma de calor, por lo que la
reaccin es de carcter exotrmico. Las diferencias de entalpa entre los 3 sistemas en
donde interactan el receptor APN de Manduca sexta con las 3 toxinas utilizadas en
la investigacin, nos indica que la toxina modificada libera ms Energa al realizarse
10
6
la interaccin. Entre la interaccin con Cry1Aa y Cry4Ba, no hay diferencia

significativa entre los requerimientos de Energa del sistema, ya que la diferencia es
de 0.04 kJ, y este valor no se halla por debajo de la resolucin energtica del sistema
en forma experimental.
Tabla 4.3: Sistemas y sus caractersticas termodinmicas para Manduca sexta

U (kJ/mol)*
S (kJ/mol.K)*
H (kJ/mol)*
A (kJ/mol)*
APNms Cry1Aa
-112.65
-0.39
-112.65
APNms Cry4Ba
-97.05
-0.33
-97.05
APNms Cry1Mosq
-328.23
-1.13
-328.23
*Valores a partir de los clculos del Anexo D

Probablemente con los datos obtenidos para la interaccin entre las toxinas Cry y el
receptor APN de Manduca sexta, se puede deducir que la especificidad de estas
toxinas para este lepidptero, no se presenta nicamente por la interaccin del
Dominio II, con las hojas presentes en el receptor, e inclusive que la especificidad
no est relacionada con ste receptor. Es de considerar tambin que el sistema puede
incluir otro receptor en los lepidpteros a nivel membrana como la protena parecida
a la cadherina en la microvellosidad de dicho lepidptero.
Tabla 4.4: Sistemas y sus caractersticas termodinmicas para Aedes aegypti
U (kJ/mol) *
S (kJ/mol.K) *
H (kJ/mol) *
A (kJ/mol) *
APNae Cry1Aa
587.66
2.02
587.66
APNae Cry4Ba
513.80
1.76
493.24
APNae Cry1Mosq
319.37
1.10
319.37
*Valores a partir de los clculos del Anexo D
10
7
En los sistemas donde interactan el receptor APN de Aedes aegypti, se observa que
las reacciones son endotrmicas (H > 0), lo cual nos indica que la reaccin absorbe
Energa en forma de calor proveniente del sistema; por ende la reaccin podra ser
espontnea a altas temperaturas. Si bien la interaccin APNae Cry1Mosq, est en
equilibrio (A = 0), presenta un H menor en comparacin a las toxina nativas, lo
que nos indica que esta reaccin tiene una mayor velocidad de interaccin.
Podemos observar que mediante la bioinformtica se obtuvieron resultados muy
alentadores como una tcnica de virtual screening, si comparamos lo realizado por
Arenas en el 2010 (3), en donde se reporta que la Aminopeptidasa N de Manduca
sexta presenta dos caractersticas en el modo de accin de las Toxinas Cry1Aa;
primero que presenta una afinidad baja y que presenta ms de un posible sitio de
interaccin. Arenas tambin plantea que la Aminopeptidasa N de Manduca sexta
puede ser una segunda protena receptora necesaria para la insercin de las Toxinas
Cry1A en la microvellosidad del insecto.
Finalmente, la toxina Cry4Ba presenta toxicidad para larvas de Aedes aegypti (51)
pero no presenta una tasa de mortalidad total, lo que indica que las especificidad no
puede ser relacionada nicamente a la Aminopeptidasa N y que podran interactuar
otras protenas a nivel membrana, de la misma manera, obtuvo como resultados que
la Cry1Aa, puede presentar afinidad hacia varias isoformas de la Aminopeptidasa N.
Observando nuestros resultados, es notable que la reaccin sea favorable para los seis
casos, pero no refleja la especificidad deseada para lepidpteros o dpteros.
Conclusiones
1. El diseo de la Toxina Cry1Mosq se obtuvo a partir de las estructuras terciarias
de Toxinas Cry1Aa y Cry4Ba, que se encontraron en la pgina de la PDB
(www.pdb.org/pdb/home/home.do) bajo los cdigos 1CIY y 1W99. Luego de
obtener la secuencia FASTA a partir de estas estructuras, se realiz el
alineamiento de secuencias. En el diseo de la toxina modificada se mantuvo los
dobles en las hojas del loop 2 manteniendo la longitud con respecto a la Toxina
Cry4Ba.
2. Para el caso de las estructuras terciarias de Cry1Aa, luego de iniciar la
simulacin de Dinmica Molecular en un ensamble cannico y mediante la
utilizacin del software GROMACS, se observ estabilidad energtica y
estructural a los 150 ps (0.15 ns). Para la Cry4Ba, se alcanz un estado de
relajacin energtico y estructural pasados los 100 ps (0.1 ns) y 150 ps (0.15 ns)
para la toxina Cry1Mosq. De la NCBI, se obtuvo la secuencia FASTA de las
protenas receptoras en los dos diferentes insectos blancos; fueron encontrados
con los cdigos CAA66466.2 y AAK73351.1, para APN de Manduca sexta y
APN de Aedes aegypti respectivamente. Se generaron estructuras terciarias de
Aminopeptidasa N de Manduca sexta y Aminopeptidasa N de Aedes aegypti,
usando como template a la Aminopeptidasa N presente en el retculo
endoplasmtico de Homo sapiens. En cuanto a las estructuras terciarias de los
receptores, se necesit un tiempo mayor para alcanzar la estabilidad estructural y
energtica. Para la Aminopeptidasa N de Manduca sexta, se observ una
relajacin energtica pasados los 10000 ps (10 ns) de simulacin; caso contrario
para la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti, la cual necesit de 20000 ps (20
ns) para alcanzar un estado de relajacin.
3. La simulacin del Docking para obtener estructuras cuaternarias, se realiz

utilizando el servidor online ClusPro, mediante el cual se reportaron 120
estructuras para cada tipo de interaccin. Luego de graficar los valores de
Energa de cada tipo de interaccin, se observ que la interaccin de tipo
hidrofbico present valores menores frente a los dems tipos de interaccin, y
que tambin utiliz como sitios activos de interaccin las hojas pertenecientes
al loop 2 del Dominio II de las Toxinas.
4. Para el caso de las estructuras cuaternarias de las interacciones Cry1Aa
Aminopeptidasa N de Manduca sexta, Cry4Ba Aminopeptidasa N de Manduca
sexta y Cry1Mosq Aminopeptidasa N de Manduca sexta, se observ una estado
de relajacin energtica a partir de los 200 ps (200 ns) y para el caso de las
interacciones Cry1Aa Aminopeptidasa N de Aedes aegypti, Cry4Ba
Aminopeptidasa N de Aedes aegypti y Cry1Mosq Aminopeptidasa N, se
observ estabilidad energtica y estructural a los 150 ps (0.15 ns) luego de
iniciar la simulacin de Dinmica Molecular.
5. Luego de realizar la simulacin de Dinmica Molecular para las cinco protenas:
Cry1Aa, Cry4Ba, Cry1Mosq, Aminopeptidasa N de
Manduca sexta,
Aminopeptidasa N de Aedes aegypti; y para los seis sistemas de interaccin

Toxina Receptor, se obtuvieron los datos de Energa de Interaccin; a partir de
los cuales se obtuvo la Energa Interna (U ), Entropa (S), Entalpa (H ).
Posteriormente, para las seis interacciones descritas se obtuvo una A igual a 0 y
para el caso de las interacciones que involucran a la Aminopeptidasa N de
Manduca sexta, los parmetros termodinmicos antes mencionados indican que
las reacciones fueron exotrmicas y tienden al orden. En el caso de las
interacciones relacionadas a la Aminopeptidasa N de Aedes aegypti, las
reacciones fueron endotrmicas y tienden al desorden en el punto de transicin
( A=0).
Sugerencias
De lo estudiado en la presente tesis, surgen algunas sugerencias para posteriores
estudios.
Es de suma importancia en estudios bioinformticos, trabajar con estructuras

optimizadas. Esto evita que se extienda el tiempo de clculo y memoria de
disco.
Es importante elegir las secuencias y estructuras de las protenas de una base
de datos confiable. De la misma manera se debe tener en cuenta las
referencias Bibliogrficas de las secuencias y estructuras.

Considerando que dentro del modo de accin puede intervenir ms protenas
que aumenten la afinidad y efectividad de las toxinas, sera muy interesante
poder realizar un Dock Multiprotico, o incluso una Simulacin de
membranas.
El mtodo de Screening Virtual requiere de una actualizacin constante de
conocimientos bioinformticos, para poder simular de la mejor manera
posible el proceso de interaccin.
Bibliografa
[1]
Agrawal, N., Malhotra, P., y Bhatnagar, R. K. Interaction of genecloned and

insect cell-expressed Aminopeptidase n of Spodoptera litura with insecticidal
[2]
crystal protein cry1c. Appl. Environ. Microbiol. 68, 9 (2002), 45834592.

Anderson, N. Proteome and proteomics: new technologies, new concepts, and
[3]
new words. Electrophoresis 19, 11 (1998), 18531861.

Arenas, I., Bravo, A., Sobern N, M., y Gomez, I. Role of alkaline
phosphatase from Manduca sexta in the mechanism of action of Bacillus
[4]
thuringiensis Cry1ab toxin. Biological Chemistry 285 (2010), 1249712503.

Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J., y Schwede, T. The Swiss-model workspace:
A web-based environment for protein structure homology modeling.
[5]
Bioinformatics, 22 (2006), 195201.

Aronson, A., y Shai, Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so
effective: unique features of their mode of action. FEMS Microbiology
[6]
[7]
Letters 195 (2001), 18.

Atkins, P. y De Paula, J. Atkins Physical Chemistry. Oxford, 2002.
Baker, N., Sept, D., Simpson, J., Holst, M., y Mccammon, J. Electrostatics of
nanosystems: application to microtubules and the ribosome. Proc. Natl. Acad.
[8]
Sci. 98 (2001), 1003710041.

Berendsen, H., Van der Spoel, D., y Van Drunen, R. Gromacs: A messagepassing parallel molecular dynamics implementation. Computer Physics
Communications 91, 12 (1995), 4356.
[9]
Boonserm, P., Davis, P., Ellar, D., y LI, J. Crystal structure of the mosquitolarvicidal toxin cry4ba and its biological implications. J Mol Biol. 348, 2
(2005), 363382.
[10] Bravo, A., Likitvivatanavong, S., Gill, S., y Sobern, M. Bacillus
thuringiensis: A story of a successful bioinsecticide. Insect Biochem. MolBio.
41 (2011), 423431.
[11] Bravo, A., Sobern, M., Porta, H., y Sanchez, J. Presente y futuro de las
protenas Cry insecticidas producidas por Bacillus thuringiensis en el control
de insectos plaga. Tech. rep., Instituto de Biotecnologa UNAM. Cuernavaca.,
2009. XIII Congreso Nacional de Bioingeniera y Biotecnologa.
[12] Chandler, D. Introduction to Modern Statistical Mechanics. Oxford, 1987.
[13] Claverie, J., y Notredame, C. Bioinformatic for DUMMIES. Wiley
Publishing, Inc., 2007.
[14] Comeau, S., Gatchell, D. W., Vajda, D., y Camacho, C. J. Cluspro: a fully
automated algorithm for protein-protein docking. Nucleic Acids Res. 32
(2004), 45-50.
[15] Crava, C., Bel, Y., Siu, F., Manachini, B., Heckel, D., y Escriche, B. Study of
the Aminopeptidase N gene family in the lepidopterans Ostrinia nubilalis
(hubner) and Bombyx mori (l.): Sequences, mapping and expression. Insect
Biochem. Mol Biol 40 (2010), 506515.
[16] Davis, I., Murray, L., y Richardson, J. Molprobity: structure validation and
all-atom contact analysis for nucleic acids and their complexes. Nucleic Acids
Res. 32 (July 2004), 615619.
[17] Dodson, G., Lane, D., y Verma, C. Molecular simulations of protein
dynamics: new windows on mechanisms in biology. Tech rep., University of
York, York, UK, 2008.
[18] Dou, Y., Baisn E, P., Pollastri, G., P Cout, Y., Nowick, J. S., y Baldi, P.
Icbs: a database of interaction between protein chains mediated by beta-sheet
formation. Bioinformatics. 20, 16 (2004), 27672777.
[19] EPA. Biopesticides, 2010.
[20] FONDO EDUCATIVO INTERAMERICANO. Mecnica Cuntica para
Qumicos (1985).
[21] Frenkel, D., y SMIT, B. Understanding Molecular Simulations, vol. 1.
Academic Press, 2002.
[22] Grochulski, P., Masson, L., Pusztai-Carey, M., Schwartz, J., Brousseau, R., y
Cygler, M. Bacillus thuringiensis Cry1a(a) insecticidal toxin: crystal structure
and channel formation. J. Mol. Biol., 254 (1995), 447464.
[23] Guex, N., y Peitsch, M. Swisspdbviwer: An environment for comparative
protein modeling. Electrophoresis 18 (1997), 27142723.
[24] Hess. Gromacs. J. Chem. Theory Comput 4 (2008), 435447.
[25] Hinchliffe, A. Molecular Modelling for Beginners. Wiley Publishing, Inc.,
2008.
[26] IBBA, M. Biochemistry and bioinformatics: when worlds collide. TRENDS
in Biochemical Sciences 27, 2 (2002), 64.
[27] Jorgensen, W., y Tirado-rives, J. The opls force field for proteins. energy
minimizations for crystal of cyclic peptides and crambin. J. Am. Chem. Soc.
110 (1988), 16571666.
[28] Kaapro, A., y Ojanen, J. Protein docking, Nov. 2002.
[29] Karplus, M., y McCammon, J. Molecular dynamics simulations of biomolecules. Nature Structural Biology 9, 9 (2002), 646651.
[30] Kiefer, F., Arnold, K., Kunzli, M., Bordoli, L., y Schwede, T. The swissmodel repository and associated resources. Nucleic Acids Res 37 (2009), 387
392.
[31] Knight, P. J., Crickmore, N., y Ellar, D. J. The receptor for Bacillus
thuringiensis Cryla(c) delta-endotoxin in the brush border membrane of the
lepidopteran Manduca sexta is Aminopeptidase n. Mol. Microbiol. 11, 3
(1994), 429436.
[32] Kopp, J., y Schwede, T. The swiss-model repository: new features and
functionalities. Nucleic Acids ResNucleic. Acids Research 34 (2006), 315318.
[33] Kozakov, D., Brenke, R., Corneau, D., y Vajda, S. Piper: An fft- based protein
docking program with pairwise potentials. Proteins: Structure, Function, and
Bioinformatics 65 (2006), 392406.
[34] Kozakov, D., Hall, D. R., Beglov, D., Berenke, R., Comeau, S., Shen, Y., Li,
K., Zheng, J., Vakili, P., Paschalidis, I., y Vajda, D. Achieving reliability and
high accuracy in automated protein docking: Cluspro, piper and stability
analysis in capri. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 78
(2010), 31243130.
[35] Kukol, A. Molecular Modeling of Proteins. Humana Press, 2008.
[36] Lange, H., y Bronson, L. Insect pests of tomatoes. Entomology 26 (1981),

345371.
[37] Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, H.,
Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A., Lopez, R., Thompson, J. D., Gibson, T.
J., y AND, D. G. H. Clustal w and clustal x version 2.0. Bioinformatics. 23,
29472948 (2007).
[38] Leach, A. R. Molecular Modelling, 2 ed. Pearson Education., 2001.
[39] Lindahl, E. Gromacs. J. Mol. Model 7 (2001), 306317.
[40] Liu, X. Studies of the Manduca sexta Cadherin-like receptor binding epitopes
of Bacillus thuringiensis. Cry1Aa Toxin and Protein Engineering of
Mosquitocidal activity, PhD thesis, The Ohio State University, 2005.
[41] Liu, X., y Donald, D. Redesigning Bacillus thuringiensis cry1aa toxin into a
mosquito toxin, 2006. 6th Pacific Rim Conference on the Biotechnology of
Bacillus thuringiensis and its Environmental Impact.
[42] Lpez, N. Aislamiento, Identificacin y Actividad Biocida de Cepas Nativas
de Bacillus thuringiensis a partir de suelos agrcolas de diferentes zonas de
la regin Arequipa. Universidad Catlica de Santa Mara. 2008.
[43] Lovell, S., y Davis, I. Structure validation by c-alpha geometry: phy, psi and
cbeta deviation. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 50, 3
(2003), 437450.
[44] Maagd, R., Bravo, A., y Crickmore, N. How Bacillus thuringiensis has
evolved specific toxins to colonize the insect world . TRENDS in Genetics 17,
4 (Apr. 2001), 193199.
[45] McQuarrie, D., y Simon, J. Molecular Thermodynamics. University Science
Books, 1999.
[46] Nester, E., Thomashow, L., Metz, M., y Gordon, M. 100 years of Bacillus
thuringiensis: a critical scientific assessment. American Academy of
Microbiology, 2002.
[47] Nowick, J. Exploring beta-sheet structure and interactions with chemical
model systems. Acc. Chem. Res. 41, 10 (13191330 2008).
[48] Petterse, E. F., Goddard, T. D., Huang, C. C., Couch, G. S., Green- Blatt, D.
M., Menge. C., y Ferrin, T. E. USCF chimera: a visualization system for
exploratory research and analysis. Comput. Chem. 25, 13 (2004), 16051612.
[49] Pootanakit, K., Angsuthanasombat, C., y Panyim, S. Identification of two

isoforms of Aminopeptidase n in Aedes aegypti larval midgut. Biochemestry
and Molecular Biology 36, 5 (2003), 508513.
[50] Roh, J. Y., Jae, Y. C., Ming, S. L., Byung, R. J., y Yeon, H. J. Bacillus
thuringiensis as a specific, safe, and effective tool for insect pest control.
Micriobiol. Biotechnol 17, 4 (2007), 547559.
[51] Saengwiman, S., Aroonkesorn, A., Dedvisitsakul, P., Sakdee, S., Leetachewa,
S., Angsuthanasombat, C., y Pootanakit, K. In vivo identification of Bacillus
thuringiensis cry4ba toxin receptors by RNA interference knockdown of
glycosylphosphatidylinositol-linked Aminopeptidase N transcripts in Aedes
aegypti larvae. Biochemical and Biophysical Research Communications 407
(2011), 708713.
[52] Schaftenaar, G., y Noordik, J. Molden: a pre- and post-processing program
for molecular and electronic structures. J. Comput-Aided Mol. Design 14
(2000), 123134.
[53] Schnepf, H. E. Bacillus thuringiensis toxins: regulation, activities and
structural diversity. Tech. rep., Mycogen Corpotation, San Diego, USA, 1995.
[54] Scroder, M., Poulsen, M., Wilcks, A., Kdroghsbo, S., Miller, A., Frenzel, T., y
DANIER, J. A 90-day safety study of genetically modified rice expressing
Cry1ab protein (Bacillus thuringiensis toxin) in wistar rats. Food and
Chemical Toxicology 45 (2007), 339349.
[55] Sobern, M., y Bravo, A. Las toxinas Cry de Bacillus thuringiensis: Modo de
accin y consecuencias de su aplicacin. Biotecnologa 14, CS3 (2011), 303
313.
[56] Sobern, M., Fernandez, L., Perez, C., Gill, S., y Bravo, A. Mode of action of
mosquitocidal Bacillus thuringiensis toxins. Toxicon 49 (2007), 597600.
[57] Sreedhara, S., Fred, S., Leigh, H., y Adang, M. A mixture of Manduca sexta
Aminopeptidase and phosphatase enhances Bacillus thuringiensis insecticidal
Cry1a. Biological Chemistry 269, 13 (1994), 1008810092.
[58] Taylor, R., Jewsbury, P., y Essex, J. A review of protein-small molecule
docking methods. Computer-Aided Molecular Design 16 (2002), 151166.
[59] Thakore, Y. The biopesticide market for global agricultural use. Industrial
Biotechnology 2, 3 (2006), 194208.
[60] Thornton, J. Principles of proteinprotein interactions. Proc Natl Acad Sci 93
(1996), 1320.
[61] Van der Spoel, D. Gromacs. J. Comput. Chem. 26 (2005), 17011718.

[62] VILLANUEVA, R. Featured creatures. University of Florida, 2009.
[63] VISHVANATH, N., WORTMAN, J. R., LAWSON, D., y HASS, B. Genome
sequence of Aedes aegypti, a major arbovirus vector. Science 316, 5832
(2007), 17181723.
[64] WANG, X. Method of steepest descent and its applications. 2008.
ANEXOS
Anexo A
Archivos utilizados
Figura A.1: Archivo minima.mpd con integrador steepest descent
Figura A.2: Archivo minima.mpd con integrador l-bfgs
Figura A.3: Archivo nvt.mpd con integrador MD
Anexo B
Ecuaciones Utilizadas
Anlisis de la Estructura Global de Protenas en Dinmica Molecular. Manuel de
GROMACS (8).
Radio de Giro
r gyr =
r2 . m
m
RMSD
RMSD=
N atoms
di2
i =1
N atoms
Donde;
d i= ( r f r 0 )2
RMSF
RMSFi = r 2i r i
Tabla que presenta las Relaciones Termodinmicas de Maxwell. (McQuarrie. 1999)

(45)
Tabla B.1: Relaciones Termodinmicas

U
E = T S P V
E
=T
S v
E
=P
V s
H=E+PV
A=UTS
H = T S + V P
A = U T S
H
=T
S P
H
=V
P s
A
=S
T P
A
=V
PT
Anexo C
Datos de la Simulacin
Tabla C.1: Valores de Energa Potencial
Estructuras terciarias
Estructuras cuaternarias
Estructura
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
Promedio (kJ/mol)
-15707.83
-16469.55
-15467.52
-23634.38
-29618.36
-39492.67
-40271.19
-39493.18
-44151.62
-45131.04
-44220.16
s
94.88
110.06
102.46
134.13
91.97
171.00
159.32
159.87
191.88
177.17
184.43
Tabla C.2: Valores de Energa Cintica
Estructura
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
Promedio (kJ/mol)
5479.24
5368.12
5391.46
7689.39
9077.93
13176.56
13065.16
13088.16
14040.18
13927.40
13951.40
s
68.33
75.18
73.14
78.00
79.35
125.42
122.39
122.54
130.69
132.00
130.28
Tabla C.3: Valores de Energa Total
Estructura
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
U (kJ/mol)*
-10196.79
-11157.70
-10077.88
-15977.36
-20578.30
-26286.80
-27232.11
-26383.47
-30187.43
-31223.03
-30336.80
s
122.17
135.50
124.96
115.48
128.84
236.58
222.84
225.30
243.49
245.90
239.53
Tabla C.4: Valores de Radio de Giro
Protena
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
Promedio (nm)
2.47
2.49
2.42
2.73
2.87
3.75
3.85
3.45
4.19
4.15
3.63
s
1.45 E-2
3.45 E-2
1.87 E-2
3.18E-2
9.61 E-3
1 E-2
3 E-2
1.48 E-2
1.65 E-2
1.70 E-2
1.26 E-2
Tabla C.5: Valores de Nmero de enlaces de Hidrgenos
Protena
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
Promedio (Nmero)
651.19
659.82
681.65
405.51
1123.10
862.17
916.86
940.61
990.54
852.89
1011.35
s
24.86
24.08
24.40
13.64
28.00
31.22
29.35
29.73
31.27
26.50
29.61
Tabla C.6: Valores de RMSD
Protena
Cry1Aa
Cry4Ba
Cry1Mosq
APNms
APNae
APNms-Cry1Aa
APNms-Cry4Ba
APNms-Cry1Mosq
APNae-Cry1Aa
APNae-Cry4Ba
APNae-Cry1Mosq
Promedio (nm)
0.36
0.45
0.40
0.50
0.15
0.34
0.39
0.27
0.31
0.57
0.22
s
2.84 E-2
4.20 E-2
5.32 E-2
3.9 E-2
2.79 E-2
3.47 E-2
4 E-2
1.67 E-2
3.25 E-2
4.16 E-2
2.11 E-2
Anexo D
Resultados QUESC
Figura D.1: Resultados de QUESC para APNms Cry1Aa
Figura D.2: Resultados de QUESC para APNms Cry4Ba
Figura D.3: Resultados de QUESC para APNms Cry1Mosq
Figura D.4: Resultados de QUESC para APNae Cry1Aa
Figura D.5: Resultados de QUESC para APNae Cry4Ba
Figura D.6: Resultados de QUESC para APNae Cry1Mosq

Tesis Presentada Por El Bachiller: Raúl Orlando Herencia Montesinos para Optar El Título Profesional de

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Tesis Presentada Por El Bachiller: Raúl Orlando Herencia Montesinos para Optar El Título Profesional de

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACETICAS, BIOQUMICAS Y

PROGRAMA PROFESIONAL DE INGENIERA BIOTECNOLGICA

HERRAMIENTAS BIOINFORMTICAS EN EL ESTUDIO

Tesis presentada por el Bachiller:

Algo he aprendido en mi larga vida: que toda

A Dios y a la Virgen de la Estrella, a mi

1.0.1. Objetivo General. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1.0.2. Objetivos Especficos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

2.3. Protenas Cry . . . . . . . . . . .

2.3.2. Modos de accin. . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . .

2.3.4. Receptor APN de Cry1Aa. . . . . .. . . . . . . . . . . . .

2.3.6. Receptor APN de Cry4Ba.

2.3.7. Futuro de las Toxinas Cry . . . . . .. . . . . . . . . . . . .

2.4.1. Mtodos bioinformticos. .

2.4.2. Termodinmica Estadstica. . . . . .. . . . . . . . . . . . .

3. Metodologa y Detalles Computacionales

3.1. Equipos y Software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

3.2. Eleccin de las estructuras usadas en las simulaciones. . . . . . . .

3.3. Construccin de una toxina modificada: Cry1Mosq. . . . . . . . . ..

3.4. Optimizacin de la geometra. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.5. Dinmica Molecular de estructuras terciarias. . . . . . . . . . . . .

3.6. Docking de estructuras terciarias. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

3.7. Dinmica Molecular de estructuras cuaternarias. . . . . . . . . . . ..

3.8. Obtencin y Estudio de Parmetros Termodinmicos

4.3. Estabilidad de estructuras terciarias. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.4. Docking de Estructuras terciarias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.5. Estabilidad de estructuras cuaternarias . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.2. Modo de accin de las toxinas Cry. . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

2.3. Estructura terciaria de la toxina Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . ... . ..

2.4. Cry1Aa y sus dominios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.5. Estructura terciaria de la toxina Cry4Ba. . . . . . . . . . . . . . .

2.6. Cry4Ba y sus dominios. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.7. Funcin x2 + 2y2. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

2.8. Bsqueda lineal en una dimensin . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.1. Modelado de APN Manduca sexta . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.2. Modelado de APN Aedes aegypti. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.4. Alineamiento de las secuencias FASTA de Cry1Aa y Cry4Ba . . . . ..

4.5. Secuencia FASTA de Cry1Mosq. . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.6. Toxinas Cry y sus respectivos tamaos de loops. . . . . . . . . . . . .

4.7. Estabilidad Energtica Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.8. Estabilidad Estructural Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.9. Estabilidad Energtica Cry4Ba.

4.10. Estabilidad Estructural Cry4Ba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.11. Estabilidad EnergticaCry1Mosq

4.12. Estabilidad Estructural Cry1Mosq. . . . . . . .. . . . . . . . . . .

4.13. Estabilidad Energtica de APN de Manduca sexta . . . . . . . . . . .

4.14. Estabilidad Estructural de APN de Manduca sexta. . . . . . . . . . .

4.15. Estabilidad Energtica de APN de Aedes aegypti. . . . . . . . . . . .

4.16. Estabilidad Estructural de APN de Aedes aegypti. . . . . . . . . . . .

4.17. Grfica de Ramachandran Cry1Aa. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.18. Grfica de Ramachandran Cry4Ba. . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.19. Grfica de Ramachandran Cry1Mosq . . . . . . ... . . . . . . . . . . .

4.20. Grfica de Ramachandran AP Nms . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.21. Grfica de Ramachandran AP Nae

4.22. Vista isomtrica de Cry1Aa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.23. Vista Isomtrica de Cry1Aa. Potencial Electrosttico . . . . . . . . .

4.24. Vista Isomtrica de Cry4Ba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.25. Vista Isomtrica de Cry4Ba. Potencial Electrosttico . . . . . . . . .

4.26. Vista Isomtrica de Cry1Mosq . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

4.27. Vista Isomtrica de Cry1Mosq. Potencial Electrosttico. . . . . . . .

4.28. Vista Isomtrica de AP Nms. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ..

4.29. Vista Isomtrica de AP Nms. Potencial Electrosttico . . . . . . . .