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Eucaryotes

ADN

Procaryotes
(bactries)

exon
ADN

ARN

transcription

transcription

ARNm
traduction

protine

ARNm
protine

Hybridation d'acides nucliques (AN) ou de protines


Notion de complmentarit: reconnaissance molculaire
(squence -AN- ou structure -protine-)
Complexe sonde-cible (hybride)
ADN-ADN (sonde= complmentaire antiparallle)
ADN-ARN
protine-protine (complexe Ac/Ag)
Hybridation - est spcifique (sonde /cible)
- a lieu mme en prsence d'un large excs de
molcules similaires mais non identiques
--> dtection d'une molcule d'ADN ou d'ARN, ou de
protine dans un mlange en contenant des milliers de
similaires "trouver une aiguille dans une meule de foin"

traduction

ADN: double brin (A, T, G, C)


ARN: simple brin (A, U, G, C)
Protines: acides amins

Dnaturation-renaturation ADN
Principe: Dnaturation (sparation des brins par rupture des liaisons
hydrognes: tre> Tm ou pH> 12) d'ADN double brins de squences
diffrentes
puis rassociation spcifique (conditions favorables de tre et pH)
--> hybridation des ADN simple brin pour former les homoduplex originels.

La temprature de fusion (Tm)


Un fragment d'ADN de squence donne a une Tm qui correspond la
temprature o 50% des fragments sont sous forme simple brin.

Hybridation d'acides nucliques et dtection

Mlange AN

Tm dpend de la longueur du fragment d'ADN, de sa composition en


bases, de la prsence de certains ions dans le milieu.

Les brins ne peuvent


se renaturer entre
eux, mais peuvent
s'hybrider avec une
sonde marque s'il y
a complmentarit

Tempratures d'hybridation et de lavage < Tm sonde ( 5 10C) -->


favoriser et conserver l'association de la sonde sur sa cible et dfavoriser les
msappariements de la sonde avec une squence homologue.

Hybridation peut avoir lieu

Les sondes d'acides nucliques

en solution
support solide :
immobilisation sur membrane, sur verre
colonies bactriennes
chromosome
coupe de tissus...
Objectif : dtecter la prsence d'un acide nuclique d'une
squence donne par utilisation d'une sonde complmentaire

fragment d'ADN ou ARN marqu


sonde radioactive (incorporation de nuclotides radioactifs)
sonde froide
gnre in vitro avec une squence complmentaire de la
squence recherche
fragment de restriction
produit PCR
synthse "commerciale"

Les sondes radioactives (suite)

Les sondes radioactives (chaudes)


sondes mono ou double brins
Phosphate32 (radio-isotope le + utilis), Soufre35, H3 (tritium)
Incorpor dans la sonde enzymatiquement au moyen d'un ou plusieurs
nuclotides triP radiomarqus
- marquage en 5': T4 polynuclotide kinase ajoute 1P32 en 5' (sonde peu radioactive)
- par amorage au hasard (Random Priming)

Dnaturation
de la sonde

D NA pol
+dATP,
dGTP,dTTP
+dCTP*

Ajout cocktail
hexamers (6nt,
contenant toutes le
squences possibles
Dnaturation sonde
et cible
Hybridation

- marquage en 3' :
*avec une ADN polymrase: ADN pol I ou T4, Taq pol(PCR)
(sondes trs radioactives car incorporation de x nt*)

+ ATP32

ADN pol I

5'

3'
*avec une exonuclase
*avec une terminal transfrase
- marquage par "translation de coupure" (Nick Translation): DNAseI
(conditions mnages) pour gnrer quelques coupures simple brin dans le
fragment d'intrt, puis ADN pol.I pour dgrader l'ADN dans sens 5'-3' au
niveau de ces coupures et repolymriser en prsence d'un nt radioactif.
sondes d'ARN (ribosondes) (rendements d'hybridation meilleurs par
rapport aux hybrides ADN-ADN, plus stables)

Attention : les sondes radioactives prsentent de nombreux inconvnients :


1. ncessit de se protger contre le rayonnement mis, maniement des
sondes inconfortable
2. dcroissance rapide du P32, d'ou besoin de marquer les sondes
frquemment

Les sondes froides


Hybridation in situ sur chromosome
digoxignine

marquage par la biotine-streptavidine.

fluorophore
Attention: problme de sensibilit -->leur utilisation ne fait pas toujours
l'unanimit

Objectif : dterminer sur quel chromosome et dans quelle rgion se


trouve le gne dont on possde la sonde.
En pratique:
- prparation des chromosomes
- hybridation directement sur les prparations fixes sur lame
- Sonde marque au tritium (H3): rayonnement trs court, donne donc une
localisation fine de la zone mettant la radioactivit.
- rsultat lu sous microscope : les signaux positifs
apparaissent sous forme de grains noirs disposs
sur les chromosomes.
Dtection d'un
gne de Drosophile

Hybridation sur coupe de tissu

Hybridation in situ
Dtection du virus d'Epstein-Barr (sonde reconnaissant ARN = gnome du
virus)

Objectif : dterminer quelle sous population du tissu exprime un ARN


donn (un tissu est gnralement constitu de diffrents types cellulaires, pas
toujours faciles sparer)

- coloration nuclaire bleu fonce des noyaux infectes


- contre coloration verte des autres noyaux
Indications: Syndromes lymphoproliferatifs et lymphomes

Coupe d'embryon de Drosophile qui a subi une hybridation avec


une sonde d'un gne impliqu dans le dveloppement embryonnaire

Southern-Blot
Hybridation sur colonie de bactries, sur plage de lyse
Objectif: dtecter parmi un grand nombre de bactries ou de phages
recombinants celle ou celui qui contient le fragment d'ADN recherch
(criblage de banque).

Botes avec colonies


bact ou phages
(milliers millions)

Coussin de NaOH
(clattement cellules +
dnaturation ADN

But: Dtecter la prsence de squences d'ADN spcifiques dans un


mlange
Edwin Southern eut l'ide de transfrer des fragments de restriction
spars dans un gel, sur une membrane susceptible de subir le
traitement d'hybridation
Gel

Hybridation

Membrane

Autoradiogramme

Lavages

+ Sonde
+ sonde
Prise
d'empreinte
(nylon ou
nitrocellulose)

Fixation
(cuisson ou UV)

Autoradiographi
Localisation des
clones d'intrt

Fragment
d'intrt

Electrophorse

lectrophorse sur gel d'agarose


+dnaturation dans le gel des
fragments de restriction (NaOH)

1. Mlange d'AN sparer


(chargs ngativement)
2. Dpt sur gel d'agarose (0,5 20kb) ou
polyacrylamide (< 1000b) (%)
3. Marqueur (tailles connues)
4. Champs lectrique

5. Migration: les molcules chargs


ngativement migrent vers l'anode par
les pores du gel, une vitesse
inversement proportionnelle leur
masse molculaire (nb de bases)
6. Visualisation des AN: bromure
d'thydium s'intercale entre les
bases des AN et met une
fluorescence orange aprs excitation
aux UV
7. Estimation de la taille et
quantit des fragments par
comparaison avec le marqueur
(seuil de dtection: qq ng)

Prhybridation
Avant contact avec la sonde spcifique, la membrane est princube avec de
l'ADN pour en liminer tous les sites qui n'ont pas t saturs par l'ADN lors
du transfert.
Hybridation
Ajouter la sonde dnature la solution d'hybridation
La temprature d'hybridation est dfinie par le Tm de la sonde soit ~65C pour
une sonde de + de 100 bases
Applications du Southern-blot
Carte de restriction d'un gne (utilisation de diffrentes enzymes): dtection
de r-arrangements (dltions ou insertions)
Diagnostic prnatal: diffrencier forme sauvage et mutante d'un gne
(hybridation avec sonde "sauvage" et "mutante") --> ADN ftus anormal ne
s'hybridera qu'avec la sonde "mutante"
Identification de gnes d'une parent loigne: hybridation faible
stringence (permet appariement mme imparfait) --> nouvelle famille de
rgulateurs du dveloppement embryonnaire chez la Drosophile, membres de
cette famille prsents chez l'homme

transfert sur support


solide par capillarit
(buvardage = blot)

+ fixation de l'ADN sur la


membrane
par
cuisson
(nitrocellulose) ou exposition
U.V (nylon)

Southern-blot

hybridation avec une sonde


marque dnature

Northern-blot
Mme principe que le Southern-blot mais ici ce sont les ARN qui sont
tudis (pas de digestion pralable mais traitement au formaldhyde pour casser
structures secondaires )
Applications:
- apprcier distribution d'un ARN dans les tissus, tudier son abondance relative
- dterminer la taille d'un ARN
- dtecter les intermdiaires de maturation et les diffrentes formes
d'pissage de l'ARN
NI

Dtection maximale 96h


d'un ARNm particulier dans
des globules blancs de
patients atteints de leucmie
et induit diffrencier

96h

48h

Puces ADN (Micro-arrays)

Dot-blot
Mme principe que le Southern-blot mais sans sparation des AN
(ADN ou ARN)

- 21 sondes spcifiques des gnes de virulence


bactriens dposes en tches (Dot)
A1, C4 et C8: contrles s'hybridant toutes les
souches d'E. coli
- hybridation avec l'ADN total des bactries qui
doivent tre testes ainsi qu'un contrle -si ADN est complmentaire d'une sonde,
reconnaissance,
hybridation,
et
les
tches
correspondantes sont alors marques
--> chantillon: 6 gnes de virulence sont identifis
en plus des trois gnes contrle

Fin des 90's (squenage gnomes bactriens):


expression d'un seul gne --> profil d'expression d'un maximum de gnes
Mesure simultane de l'expression de milliers de gnes en une seule
raction d'hybridation
puces ADN (reprsentatives d'un gnome) hybrides avec des
ARN ou ADN fluorescents
dtection signal par un laser (automate)
traitement informatique des donnes

"spotted micro-arrays"
ADN sb ou db (100aine de bases) est dpos par un robot sur une lamelle
de verre (1 spot = un gne)
Marquage "sonde" (ARN totaux) par incorporation nt fluorescents
(Cy3- et Cy5-dUTP) par reverse transcription
Utilisation de 2 fluorophores pour marquer le contrle et le test
Mlange des "sondes" et rvlation d'un fluorophore puis de l'autre
- E. coli cultive en milieu riche ou minimal: expression de 4290 gnes
- Mycobacteirum tuberculosis changements d'expression suite au traitement
antituberculeux --> identification des gnes cibles de l'antibiotique

Chips

Sptotted micro-arrays

15-20
reprsentations

Une seule
reprsentation
Marquage
diffrentiel

RNA 1
+ fluor

RNA 2
+ fluor

RNA 1
+ biot

RNA 2
+ biot

2 hybridations

Chips
oligont synthtiss in situ sur lamelle de verre (1 gne est reprsent par
15-20 oligont diffrents)
Marquage ARN par biotinylation
hybridation sur 2 lames diffrentes
9337 donnes/hybridation, soit par exprience 100000 donnes
--> analyse des donnes: normalisation, filtre puis dtermination des profils
niveau similaire d'expression

Western-blot

Dtection

But: Dtecter la prsence d'une protine dans un mlange grce un anticorps


spcifique de celle-ci
Sandwich d'Ac

2me Ac reconnait le 1er

Dtection du signal
- 2me Ac radioactif --> autoradiogramme
- 2me Ac coupl une enzyme (phosphatase alcaline ou
proxydase) --> raction colore
- 2me Ac coupl la biotine --> rvlation par l'avidine

Comparaison des
diffrents blots

NB: "protein arrays" existent