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DEPARTAMENTO DE FITOPATOLOGIA
LABORATRIO DE BACTERIOLOGIA DE PLANTAS
CONSIDERAES INICIAIS
Existem muitos gneros de organismos procariotas capazes de incitar enfermidades em
plantas, todos considerados genericamente como bactrias, para efeitos prticos, tais como
bactrias propriamente ditas, rickettsias, espiroplasmas, micoplasmas, clamidias, estreptomicetos
etc (ROMEIRO, 1995). Habitualmente eles so divididos em fastidiosos e no-fastidiosos
(SCHAAD, 1988) e diferenados conforme explicitado na Figura 1. Os procariotas
fitopatognicos fastidiosos (parasitas obrigatrios ou que demandam meios de cultura
extremamente complexos para serem cultivados "in vitro") no so objeto de estudo nesta
disciplina, mas podem ser distinguidos um dos outros com base em caractersticas como as
mostradas na Figura 2.
PROCARIOTAS
FITOPATOGNICOS
FASTIDIOSOS
PAREDE CELULAR
PRESENTE
PAREDE CELULAR
AUSENTE
RICKETTSIAS
CLULAS HELICOIDAIS
Bortonela
ESPIROPLASMAS
MICOPLASMAS
Spiroplasma
Micoplasma
PROCARIOTAS FITOPATOGNICOS
NO FASTIDIOSOS
FASTIDIOSOS
GRAM-POSITIVOS
ESPOROGNICOS
GRAM-NEGATIVOS
NO-ESPOROGNICOS
PLEOMRFICOS
NO INDUZEM TUMORES
INDUZEM
TUMORES
NO - PLEOMRFICOS
ANAERBICOS
FACULTATIVOS
GRUPO CORINEFORME
Rickettsias,
Micoplasmas,
etc
Bacillus sp.
Clostridium sp.
Clavibacter sp.
Rhodococcus sp.
Arthrobacter sp
Corynebacterium sp.
Agrobacterium sp.
AERBICOS ESTRITOS
ASPARAGINASE (+)
ASPARAGINASE (-)
FAT. DE CRESCIMENTO (-)
FAT. DE CRESCIMENTO (+)
XANTOMONADINAS (-)
XANTHOMONADINAS (+)
Erwinia sp.
Pseudomonas sp.
Xanthomonas sp.
GNERO
GRUPO
GNERO
GNERO
GNERO
CONSIDERADA
Agrobacterium
Corineforme
Erwinia
Pseudomonas
Xanthomonas
+
-
(1) = Algumas espcies apresentam pleomorfismo, variando de bastonetes tpicos a cocides (KRIEG & HOLT,
1984)
(2) = H relato de algumas espcies capazes de utilizar asparagina (STARR & WEISS, 1941; DYE, 1978 e
SIQUEIRA, 1988)
(3) = Uma espcie (Pseudomonas syringae pv. savastanoi) induz ndulos areos em oliveira (KRIEG & HOLT,
1984) embora a gnese da proliferao de tecido seja de origem hormonal e no neoplsmica.
PLANTA
DOENTE
TESTE DE
EXSUDAO
ISOLAMENTO
INOCULAO
DETERMINAO
DA
ESPCIE
DETERMINAO
DO
GNERO
CONFIRMAO DE
PATOGENICIDADE
Figura 3: Sequncia lgica de eventos para se determinar gnero e espcie de uma bactria
fitopatognica
Confirmada a etiologia bacteriana, necessrio realizar tentativas para isolar o patgeno
e confirmar que as culturas surgidas em placa de isolamento realmente so fitopatognicas, o que
se consegue com testes de fitopatogenicidade (HR e Inoculao artificial).
Concludas essas trs etapas, crticas e absolutamente essenciais, realizam-se os testes
bioqumicos, tintoriais e biolgicos mostrados no Quadro 1, chegando-se ao gnero
fitopatognico. Numa outra etapa, testes adicionais, mais complexos e em maior nmero so
implementados para a determinao da espcie.
Ao trmino de nossa determinao do gnero, se encontrarmos resultados diferentes dos
explicitados no Quadro 1, aps exaustivas repeties no tempo e no espao, devemos suspeitar de
um novo gnero ou de um gnero fitopatognico pouco comum de bactria fitopatognica no
fastidiosa, como os dos quais se mencionou inicialmente.
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QUANTIDADE
10,0 g
8,0 g
4,0 g
2,0 g
0,3 g
15,0 g
l.000 ml
QUANTIDADE
5,0 g
5,0 g
40,0 g
15,0 g
l.000,0 ml
c) Agar-nutriente ou Nutriente-gar
COMPONENTE
Extrato de carne
Extrato de levedura
Peptona
Cloreto de sdio
Agar
gua destilada
QUANTIDADE
1,0 g
2,0 g
5,0 g
5,0 g
15,0 g
l.000 ml
Esse meio, muito usado tambm em para bactrias no-fitopatognicas, pode ser
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FORMA DE BASTONETE
Existem inmeras maneiras de corar a clula bacteriana de modo a visualiz-la ao
microscpio tico comum. Vamos utilizar o mtodo de colorao simples com tinta nanquins, um
mtodo negativo de colorao.
a)Preparo do esfregao
Deposite na extremidade de uma lmina uma gota de tinta Nanquim e misture nela, por
meio de ala de repicagem, pequena quantidade de crescimento bacteriano (ACKERMANBROWN, 1977). A seguir, com auxlio de outra lmina, promova o espalhamento do esfregao,
conforme mostrado na Figura 4a.
b) Fixao
No feita fixao, nem qumica nem fsica.
c) Reagentes e seu preparo
O nico reagente a tinta Nanquim, de boa qualidade e no muito velha pois com o
tempo a suspenso tende a perder suas propriedades de colide.
d) Procedimento para observao
1. Aguarde o completo secamento, ao ar, do esfregao
2. Observe com objetiva de imerso
3. Clulas bacterianas so visualizadas de cor branca num fundo amarronzado (Fig. 4b)
Figura 4: Mtodo de colorao com tinta Nanquim para visualizao e estudo de forma e
arranjamento de clulas bacterianas. (a) - Preparo do esfregao, (b) - Aspecto visual de
um campo microscpico
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Saber realizar o teste de Gram est para o bacteriologista assim como saber tomar a
presso arterial est para o mdico cardiologista!
Essa tcnica, de largo emprego em Microbiologia, foi idealizada por Christian Gram, em
1848. Roux, em 1866, verificou que espcies bacterianas se comportavam diferentemente quanto
colorao de Gram e dividiu as bactrias em Gram-positivas e Gram-negativas (BROCK, 1974 ;
GERHARDT, 1994; STANIER et alii, 1986). O mtodo de Gram possui importncia na
identificao, pois, das bactrias fitopatognicas no-fastidiosas , apenas as do grupo
Corineforme possuem espcies Gram-positivas. Simplificadamente, o procedimento consiste em
colorir a clula bacteriana com corantes bsicos e descolori-la com solventes neutros (LOURES
& GUIMARES, 1974).
Conforme explicita de modo esquemtico a Figura 5, quando o esfregao coberto com a
soluo de cristal violeta, tanto as clulas Gram-positivas como as Gram-negativas absorvem o
corante e tornam-se roxas. O tratamento seguinte, que a cobertura do esfregao com lugol
(soluo de iodo), faz com que ambos os tipos de clula tambm absorvam o iodo e continuem de
colorao roxa. No interior das clulas, o iodo reage com o cristal-violeta formando complexos de
pesos moleculares elevados e a partir deste ponto comea a diferena entre clulas Gram-positiva
e Gram-negativas. As clulas Gram-negativas tm sua parede celular mais permevel e o solvente
neutro (etanol, por exemplo) consegue remover de seu interior o complexo iodo/cristal-violeta com isto as clulas se descolorem e o esfregao, antes roxo, fica incolor. Em contraposio, as
clulas Gram-positivas, de parede celular bem mais impermevel, o solvente no consegue
remover de seu interior o complexo iodo/cristal-violeta. Por uma questo de visualizao, o
corante final safranina (contraste) - as clulas Gram-positivas no o absorvem pois j esto
coradas de roxo e assim permanecem e as Gram-negativas, descoloridas pelo solvente, o
absorvem e tornam-se vermelhas.
Incolor
G+
G- Incolor
ou
Roxo
G+
G+ CV ou CV G-
ou
CV
G- Incolor
+
CRISTAL VIOLETA
Roxo
CV-I 2
SAFRANINA
Roxo
Roxo
G+
ou
CV
G-
Vermelho
+
IODO
Roxo
G+
CV-I2
CV-I G
ou CV
2
Roxo
GRAMPOSITIVA
GRAMNEGATIVA
+
ETANOL
CV-I2
Figura 5: Esquema explicativo do mtodo de colorao de Gram
PROCEDIMENTO
Existe um multiplicidade de variaes de tcnicas para a colorao de Gram, ainda que
todas se fundamentem nos mesmos princpios fundamentais. O mtodo de Burke, que se segue,
tem proporcionado excelentes resultados.
a)Preparo e fixao do esfregao
GERHARDT (1994) afirma que a fixao qumica com formalina ideal para o teste de
Gram. Prepare suspenso aquosa de clulas bacterianas que seja nitidamente turva e a ela
adicione formalina para ter uma concentrao final de 5% (v/v). Aguardar alguns minutos, e
proceder lavagem das clulas por centrifugao (15.000g/20 minutos, com descarte do
sobrenadante e ressuspenso do precipitado em pequeno volume de formalina a 5%). Preparar o
esfregao com "cotonete", aguardar secagem completa ao ar e proceder a nova fixao pelo calor.
b) Reagentes e seu preparo
Soluo A:
Cristal violeta (p.a., 90% ou mais do corante)...................................................
Etanol................................................................................................................
2,0 g
20 ml
Soluo B:
Oxalato de amneo..........................................................................................
gua destilada..................................................................................................
0,8 g
20 ml
Misturar as solues (A) e (B) e deixar em repouso por 24 horas e, aps, filtrar.
Mordente
Iodo metlico...................................................................................................
Iodeto de potssio...........................................................................................
gua destilada................................................................................................
1,0 g
2,0 g
300 ml
10 ml
100 ml
c) Procedimento de colorao
1.
2.
3.
4.
5.
6.
10
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c) Depositar na superfcie do meio lamnulas estreis. Com basto de vidro estril, pressionar as
lamnulas de modo a garantir um perfeito contato das mesmas com a superfcie. Incubar por
24-48 h.
d) Bactrias anaerbicas estritas crescem apenas de baixo da lamnula e distantes dos bordos.
Microaerfilas crescem apenas debaixo da lamnula, mas prximas dos bordos. Aerbicas
facultativas crescem em toda a superfcie do meio, inclusive debaixo da lamnula (Fig. 6).
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s vezes, ocorrem problemas com essa tcnica. A bactria pode no crescer por no ser
capaz de utilizar o acar. Algumas bactrias basificam o meio ao utilizarem a peptona e ao invs
de ficar amarelo, o meio fica azul intenso. Por fim, segundo BRADBURY (1968), produtos de
metabolizao da peptona podem neutralizar o cido produzido. De qualquer forma, mesmo com
essas limitaes, uma tcnica que tem sido extensivamente utilizada.
PROCEDIMENTO
a) Meio de cultura (HUGH & LEIFSON, 1953)
COMPONENTES
Peptona
NaCl
K2HPO4
Agar
Azul de bromotimol (1%)
gua destilada q.s.p.
QUANTIDADES
2,0 g
5,0 g
0,3 g
3,0 g
3,0 ml
1.000 ml
Figura 7: Alteraes de cor no meio de Hugh & Leifson, a saber: (A) - Bactria aerbica estrita,
(B) - Anaerbica facultativa e (C) - Anaerbica estrita.
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CO2
A
O2
TEMPO EM MINUTOS
Figura 8: Mtodo da jarra de anaerobiose, com testagem simultnea de trs bactrias, sendo (A) e
(B) anaerbicas facultativas e (C) aerbica estrita, em que 1 = Modo de semeio na
mesma placa, 2 = Variaes de tenses O2/CO2 pelo efeito do Anaerocult e 3 =
Aspecto da placa aps incubao
Procedimento
a) Providencie uma jarra de "Gas-Pak" ou um dessecador bem vedado com mistura em partes
iguais de lanolina e vaselina. Acomode em seu interior a bandeja de Anaerocult deixando
espao para as placas.
b) Proceda ao semeio dos isolamentos em estudo em placas de Petri. Trabalhe com duplicatas.
c) Imediatamente, transfira as placas para o interior da jarra, adicione gua ao reagente e vede
hermeticamente. Aps 1 h todo oxignio ter sido consumido. Incube.
d) A proporo de 35 ml de gua/bandeja/2,5 l de volume interno da jarra.
e) Incube as duplicatas das placas em condies de aerobiose para comparao. Observe os
resultados aps 24-48 h
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UTILIZAO DE ASPARAGINA
Em conformidade com o Manual de Bergey (KRIEG & HOLT, 1984) caracterstico do
gnero Xanthomonas a no utilizao de asparagina como nica fonte de carbono e nitrognio.
Repica--se, pois, o isolamento para o meio onde o aminacido asparagina a nica fonte de C e
N e observa-se se h crescimento ou no, o que indicado pela ocorrncia ou no de turvamento
do meio.
H que se atentar para alguns detalhes. Quando o Manual de Bergey diz ser uma
determinada prova bioqumica positiva ou negativa, est implcito ser isso verdade para 90% das
espcies. No caso de Xanthomonas sp., h relatos de espcies (raros) capazes de utilizar
asparagina. Alm disso, se os componentes do meio no so combinados de forma adequada,
pode ocorrer a formao de um precipitado que por sua vez pode ser confundido com turbidez.
Alm do mais, se a cultura de Xanthomonas estiver impura, o contaminante pode utilizar
asparagina e ocasionar turbidez. Se se transferir a cultura de Xanthomonas de meio slido e se se
repicar uma grande quantidade de clulas, algumas clulas podem vir a utilizar a cpsula de
outras como fonte de carbono e se multiplicarem, gerando turbidez.
a) Meio de cultura (STARR E WEISS, 1943)
COMPONENTES
KH2PO4
KCl
MgSO4.7H2O
Asparagina
gua destilada
QUANTIDADES
1,0 g
0,2 g
0,2 g
5,0 g
1000,0 ml
b)Procedimento:
1) Cultivar o organismo em estudo em meio lquido por 24 h.
2) Repicar para o meio de asparagina
3) Incubar a 28oC e observar, por at 7 dias, se ocorre turbidez.
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PRODUO DE XANTOMONADINAS
Xantomonadinas so aril-polienos brominados, um grupo de pigmentos amarelos, nohidrossolveis, presentes na parede da clula bacteriana, que conferem a tpica colorao
amarelada s colnias da maioria das espcies do gnero Xanthomonas (KRIEG & HOLT, 1984).
A presena desses pigmentos parece ser uma caracterstica tpica do gnero Xanthomonas e
somente dele, revestindo-se, consequentemente, de enorme importncia no que tange a taxonomia
e sistemtica.
Xantomonadinas, quando extradas da clula bacteriana e submetidas anlise
espectrofotomtrica para determinao do espectro de absoro, apresentam um pico em torno de
443 nm, com dois ombros, respectivamente a 420 e 467 nm (STARR & STEPHENS, 1964),
conforme mostrado na Figura 10.
No se poderia menos de ressaltar que existem espcies apigmentadas de Xanthomonas
sp. como X. campestris pv. manihotis, X. campestris pv. ricini, X. albilineans etc., que no
produzem Xantomonadinas, sendo suas colnias so brancas e no amarelas.
PROCEDIMENTO
a) Proceda ao cultivo da bactria em meio de caldo nutriente ("Nutrient broth"). O crescimento
nesse meio costuma ser lento e h que esperar vrios dias. Use Erlenmeyers de 250 ml para o
cultivo sob agitao contnua.
b) Colete as clulas por centrifugao (10.000 g / 15 minutos), ressuspenda-as em H20 destilada
e centrifugue novamente, descartando o sobrenadante.
c) Ressuspenda as clulas em metanol (grau de pureza analtico) de modo a formar uma
suspenso bem concentrada.
d) Transfira a suspenso para tubos e proceda extrao em banho-maria, a 90oC por 10
minutos.
e) Centrifugue a, pelo menos, 10.000 g/15 minutos, para remover detritos celulares.
f) Concentre o sobrenadante em rotavapor, caso esteja muito diludo (caso a cor amarela no
esteja bem ntida).
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467nm
0,5
0,24
0,22
443nm
0,4
0,20
0,18
0,3
0,16
X. campestris
P. solanacearum
0,14
0,2
4OO
450
0,12
0,10
ABSORBNCIA
Xanthomonas campestris
0,26
500
ABSORBNCIA
(Pseudomonas solanacearum)
420 nm
CONFIRMAO DO GNERO
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BIBLIOGRAFIA
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Laboratory. Second Printing. Department of Microbiology. Ohio State University. 1977.
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