Vous êtes sur la page 1sur 285

Stress oxydant et glycation : relation structure et

activit
es biologiques de lalbumine in vitro et in vivo
dans le cadre de la pathologie diab
etique
Philippe Rondeau

To cite this version:


Philippe Rondeau. Stress oxydant et glycation : relation structure et activites biologiques de
lalbumine in vitro et in vivo dans le cadre de la pathologie diabetique. Biomolecules. Universite
de la Reunion, 2009. French. <NNT : 2009lare0014>. <tel-00527411>

HAL Id: tel-00527411


https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00527411
Submitted on 19 Oct 2010

HAL is a multi-disciplinary open access


archive for the deposit and dissemination of scientific research documents, whether they are published or not. The documents may come from
teaching and research institutions in France or
abroad, or from public or private research centers.

Larchive ouverte pluridisciplinaire HAL, est


destinee au depot et `a la diffusion de documents
scientifiques de niveau recherche, publies ou non,
emanant des etablissements denseignement et de
recherche francais ou etrangers, des laboratoires
publics ou prives.

Universit de la Runion

THESE
Prsente pour obtenir le titre de Docteur s Sciences de lUniversit de La Runion
Spcialit: BIOCHIMIE

Par

Philippe RONDEAU
Stress oxydant et glycation : relation structure et activits biologiques de
lalbumine in vitro et in vivo dans le cadre de la pathologie diabtique

Soutenue publiquement Le lundi 21 septembre 2009

Directeur de thse : Dr Emmanuel BOURDON

Pr. B. VERGES

PU-PH CHU

(Dijon, France)

Rapporteur

Pr. A. GELON

DR INSERM U870

(Lyon, France)

Rapporteur

Pr. V. MILITELLO

PR DSFA

(Palerme, Italie)

Examinateur

Pr. F. CADET

PR LBGM Ut La Runion

(Saint Denis, France)

Examinateur

Dr. F. TALLET

PH

(Saint Denis, France)

Examinateur

(Saint Denis, France)

Examinateur

Dr E. BOURDON

CHR
t

MCF LBGM U La Runion

II

REMERCIEMENTS
Ce travail a t ralis au sein du groupe GEICO du Laboratoire de Biochimie et de Gntique
Molculaire de la Facult des Sciences et Technologies de lUniversit de La Runion, dirig
par le docteur Christian LEFEBVRE DHELLENCOURT.
A Monsieur Christian LEFEBVRE DHELLENCOURT,
Directeur du Laboratoire de Biochimie et de Gntique Molculaire
Je te remercie de mavoir permis de raliser ce travail dans le cadre dun doctorat. Je texprime
ici le tmoignage de ma sincre reconnaissance et de mon profond respect, mme si tu me fais
toujours courir aprs la balle.

A Monsieur Emmanuel BOURDON,


Matre de confrences au LBGM, directeur de thse
Manu, toi laventurier de la recherche pas encore perdue , je te remercie de mavoir accept
au sein de ton quipe Glyteam en me laissant beaucoup dopportunits et dautonomie mais
aussi en me transmettant ton dynamisme et ton enthousiasme de chercheur. Toutes ces annes
passes tes cts ont t si riches denseignements, dencouragements et de positivisme.
Laisse-moi juste te remercier de mavoir donn la chance de travailler avec toi, et davoir
aiguis mon attrait pour la recherche scientifique.

Je souhaite adresser un remerciement particulier :


A Claude ROUCH et Frdric CADET
Pour mavoir accueillie au sein de votre laboratoire, il y dj 12 ans et de mavoir donn toute
votre confiances, vos encouragements et de votre soutien pendant les moments difficiles.
Frdric, je te remercie galement pour avoir veill en moi le got de la recherche
scientifique et davoir accept de participer mon jury.

A Serge CHESNE
Je te suis trs reconnaissant de mavoir initi les techniques et les subtilits de la Biochimie
avec toute la rigueur et la passion qui te caractrisent et ainsi me mettre le pied ltrier dans
ce domaine.

III

A Bernard OFFMANN
Pour mavoir donn lide et encourag pour effectuer cette thse

Je tiens exprimer mes sincres remerciements aux personnalits scientifiques qui ont accept
de juger ce travail :

Monsieur Bruno VERGES


Professeur et Praticien Hospitalier au CHRU de Dijon

A Monsieur Alain GELON


Directeur de Recherche lunit INSERM de Lyon

A Madame Valria MILITELLO


Professeur en biophysique lUniversit de Palerme
Qui ma accueilli gentiment au sein de son laboratoire et ma donn la possibilit de raliser
une partie de mon travail.
Je les remercie vivement de me faire lhonneur de consacrer une partie de leur temps prcieux
pour juger ce travail. Quils soient assurs ici de lexpression de mon profond respect.

Je tiens galement remercier les personnes qui mont aid dans la ralisation de ce travail :
A Giovanna NAVARRA qui a fortement contribu la ralisation des expriences sur ltude
structurale de lalbumine lors de mon sjour Palerme.

A Messieurs Michel JEAN et Frank TALET


Successivement chefs de service de Biochimie du Centre Hospitalier Rgional de Saint-Denis
qui ma donn la possibilit de raliser lextension de ce travail avec des patients diabtiques
en me fournissant des chantillons sanguins et plasmatiques. A ce titre je tiens remercier la
collaboration de Mr ROBERT technicien de ce service.
Merci mes collgues, Eve, Marjo, Nihar qui ont fait de notre GlycTeam une quipe
dynamique et joyeuse.
Merci lensemble des membres du LBGM ainsi qu Facilah pour sa prcieuse aide dans
ltude in vivo.
Merci Galle pour avoir apport tes corrections et critiques mon manuscrit
IV

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES ISSUES DE CE TRAVAIL

Rondeau P., Chesne S., Armenta S., and Bourdon E., Oxidative modifications induced by the
glycation of bovine serum albumin on its structure and on cultured adipose cells, Biochimie.
2006, 10, 1467-77.
Rondeau P., Armenta S., Caillens H., Chesne S., and Bourdon E., Assessment of temperature
effects on -aggregation of native and glycated albumin by FTIR spectroscopy and PAGE :

Relations between structural changes and antioxidant properties, Arch. Biochem. Biophys .
2007, 460, 141-150.
Rajan Singh N., Rondeau P., and Bourdon E., Identification of Preferential Protein Targets for
Oxidation in Human Adipocytes Treated with Glycated Albumin, accepte Free Rad Rech
2007.
Roche M., Rondeau P., Tarnus E., Rajan Singh N., and Bourdon E., The antioxidant properties
of serum albumin, Febs Letters 2008, 582, 1783-1787.
Rondeau P., Rajan Singh N., Caillens H., and Bourdon E., Oxidative stresses induced by
glycated human or bovine serum albumins on Human monocytes, Free Rad Biol Med. 2008,
88, 1467-1477.
Rondeau P., Navarra G., Cacciabaudo F., Leone M., Bourdon E., and Militello V.,Thermal
aggregation of glycated bovine serum albumins. Soumis FEBS Journal .

COMMUNICATIONS ORALES
Rondeau P., Rajan Singh N., Tallet F., and Bourdon E., Oxidative stresses induced by glycated
human or bovine serum albumins on Human monocytes Vme chalenge Rosalind Franklin,
Saint-Denis, France, 2008.
Rondeau P., Armenta S., Caillens H., Chesne S., and Bourdon E., Analyses of structural
changes in native and glycated albumin by FTIR and PAGE : relations with modified
antioxidant and cellular effects on the protein, International Workshop of Infrared
Spectroscopy Applied to Biological and Biomimetic Systems, Buenos-Aires, Argentine, 2007.

VI

COMMUNICATIONS AFFICHEES
Chesne, S., Rondeau, P., Singh, N.R., Hoareau, L., Armenta, S., Rouch, C., and Bourdon, E.,
Oxidative modifications induced by the glycation of bovine serum albumin on its structure and
on cultured adipose cells, 30th FEBS Congress- 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary,
2005.
Navarra G., Rondeau P., Cacciabaudo F., Bourdon E., and Militello V.,Thermal aggregation of
glycated bovine serum albumin, European Biophysics Congress (EBSA), Genova, Italy, 2009.

VII

VIII

A ma famille,
A Aude, Amlie et Lucas,
A Kinou,
Merci de mavoir accompagn pendant toutes ces
soires de rdaction avec tes ronronnements

IX

RESUME
Stress oxydant et glycation : relation structure et activits biologiques de
lalbumine in vitro et in vivo dans le cadre de la pathologie diabtique
La plupart des pathologies, quelles soient dorigine gntique ou non trouvent leur origine
dans laltration structural et/ou fonctionnelle de protines dintrt. Lagrgation, la glycation
et loxydation constituent les principaux types de modification protique frquemment
observes dans de nombreuses maladies tels que le diabte, lathrosclrose ou encore les
maladies neurodgnratives. Gnralement, laltration des activits biologiques de ces
protines est troitement corrle avec ses changements conformationnels et structuraux.
L'albumine reprsente la protine circulante la plus abondante et constitue le plus important
antioxydant du plasma sanguin susceptible dtre expose un stress glycoxydant accru, et
aboutir la formation de Produits Avancs de Glycation (AGEs) dont les effets peuvent tre
nfastes au niveau cellulaire et tissulaire.
Dans cette tude, je me suis intress leffet de trois types daltrations, que sont lagrgation,
la glycation et l'oxydation, sur la structure, le statut redox et lactivit antioxydante de
lalbumine ainsi que l'incidence de cette protine modifie sur la physiologie de diffrentes
lignes cellulaires.
Au cours de ce travail, jai abord les quatre points suivants :
1. Afin de mieux comprendre limpact de ces processus altratifs sur les proprits
antioxydantes de lalbumine, jai tudi, en utilisant des techniques de la Biochimie et de la
Biophysique, les modifications structurales de la protine soumise successivement la
glycation, lagrgation et aux deux processus simultanment.
2. Jai mis en vidence et identifi des cibles protiques sensibles loxydation au niveau
dadipocytes matures humains incubs en prsence dalbumine bovine glycoxyde in vitro.
3. Jai effectu une comparaison de laction diffrentielle des modles in vitro de dAGEs
prpars partir de lalbumine dorigine bovine ou humaine au niveau de monocytes THP1.
4. Enfin, afin de valider les caractristiques structurales et biologiques obtenues partir de nos
modles in vitro dAGEs drivs de lalbumine, jai tudi sur des modles purifis partir de
plasmas de sujets, ltat structural, redox et antioxydant de lalbumine altre in vivo.
Les rsultats obtenus lors de ce travail permettent de mettre en avant limportance de la
structure native de la plus abondante des protines circulantes sur lintgrit de ses fonctions
biologiques et en particulier sur son activit antioxydante. Egalement, cette tude apporte un
nouvel clairage sur limplication de lalbumine altre dans de nombreux dsordres
mtaboliques tels que le diabte.

Discipline: Biochimie et Biologie Cellulaire


Mots-cls: Srum albumine bovine, Srum albumine humaine, Adipocytes, Monocytes,
Cellules SW872 et THP1, Glycation, Diabte, Stress oxydant.
Laboratoire: EA2526 Laboratoire de Biochimie et Gntique Molculaire
15 avenue Ren Cassin BP 7151 97715 Saint Denis Messag Cedex 09 France
XI

ABSTRACT
Oxidative stress and glycation: structural and biological properties
relationship of albumin modified in vitro or in vivo in diabetes context

Numerous pathologies are strongly linked to structural and functional alteration of target
proteins. Aggregation, glycation and oxidative damages constitute modifications of proteins,
frequently observed in numerous states of disease. The biological activities of proteins and
their conformational modifications are strictly connected. Among proteins, albumin represents
the most abundant and the most important antioxidant in blood. This circulating protein can, in
particular, undergo increased glycoxidation in case of diabetes, which can lead to the formation
of Advanced Glycation Endproducts (AGEs), and so induce various deleterious effects on cells.
In this study, I focused on the impact of aggregation, glycation and oxidative modifications on
the structural, redox and antioxidant status of albumin and the effect of this altered protein on
various cell lines physiology.
I firstly investigated, using biochemical and biophysical techniques, the structural changes of
bovine serum albumin induced by glycation, aggregation and both processes simultaneously.
By this, I tried to elucidate the impact of these processes on the antioxidant properties of the
modified protein.
Secondly, I studied the oxidative activity of in vitro glycoxidized bovine serum albumin on
mature adipocyte by identifying, in particular, specifically adipocyte carbonylated protein
targets by using proteomic techniques.
Then, I compared the effect of in vitro glucose and methylglyoxal-induced oxidative
modifications on bovine serum albumin (BSA) and human serum albumin (HSA) protein
structures and on THP1 monocyte physiology.
At last, the best way to characterize the structural and functional modification of altered
albumin is to study this protein with suitable pathological condition, in vivo instead of using an
in vitro model. In this last part, I determined simultaneously the structure, the antioxydant
properties and redox status of human plasma and its corresponding albumin purified from a
panel of plasma, in order to confirm or invalidate predictions based on in vitro models.
These investigations confirm the importance of native structure on functional properties of the
most abundant and protective protein in the circulatory system and by the way to have a better
understanding of its involvement in several physiological disorders such as Diabetes.

Subject: Biochemistry and Cellular Biology


Key words: Albumin, Adipocytes, Monocytes, SW872 and THP1 cell lines, Glycation,
Oxidative stress, Diabetes.
Research group: EA2526 Laboratoire de Biochimie et Gntique Molculaire
15 avenue Ren Cassin BP 7151 97715 Saint Denis Messag Cedex 09 France

XII

TABLE DES MATIERES

LISTE DES FIGURES....2

LISTE DES TABLEAUX.......4

LISTE DES ABBREVIATIONS5

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.....7

OBJECTIF DU TRAVAIL...65

PARTIE EXPERIMENTALE.71

CONCLUSIONS GENERALES ET PERSPECTIVES...195

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES...203

ANNEXES....227

LISTE DES FIGURES


Figure 1: Les quatre niveaux de structure de la protine ............17
Figure 2: Les structures secondaires possibles dune protine........18
Figure 3: De lADN la protine fonctionnelle ..........20
Figure 4: Les phnomnes dagrgation et les pathologies associes ............23
Figure 5: Les principaux radicaux libres et les mcanismes de dtoxification .............25
Figure 6: Les principales sources de radicaux libres ..................27
Figure 7: Les principales ractions de dtoxification .................28
Figure 8: Exemples dattaque des ROS sur diffrents acides amins ........31
Figure 9: Devenir des protines oxydes .....32
Figure 10: Les diffrentes tapes de la raction de Maillard ... ..36
Figure 11: Structures dAGEs caractrises in vivo.... .........38
Figure 12: Effets induits par la liaison des AGEs au rcepteur RAGE...............42
Figure 13: La glycation, 1ere tape de la fuse des complications mtaboliques .......44
Figure 14: Les AGEs sources de nombreuses complications mtaboliques ..........47
Figure 15: Structure tridimensionnelle de lalbumine avec ses 3 domaines et ponts disulfures....50
Figure 16: Diffrents isomres conformationnels de la SAB en fonction du pH ..51
Figure 17: Les voies de transport des mtabolites par lalbumine .........54
Figure 18: Principaux sites de lalbumine impliqus dans son activit antioxydante ...57
Figure 19: Les diffrents sites lysine impliqus dans la glycation......62
Figure 20: Les diffrents sites arginine impliqus dans la glycation..............64

Figure 21: Caractrisation spectroscopique de lagrgation de la SAB native...107


Figure 22: Expression du rcepteur CD36 sur les cellules SW872 par immunocytochimie..147
Figure 23: Plusieurs profils MS de digestion possibles pour la protine glyque......170
Figure 24: Expression du rcepteur CD36 la surface des THP1 par FACS....172

Figure 25: Expression ARN du gne de la Mn-SOD.........174


Figure 26: Electrophorse PAGE en condition native des fractions lues de plasma..181
Figure 27: Taux de carbonyle (%) dans les diffrents plasmas .183
Figure 28: Temps de demi-hmolyse HT50 (% par rapport PBS) dans les diffrents plasmas184
Figure 29: Relation entre les missions de fluorescence de lANSA et du tryptophane (UA)...186
Figure 30: Emission de fluorescence du glycophore dans les SAH purifies ...186
Figure 31: HT50 des SAH compar entre les groupes A et B .187
Figure 32: Corrlation entre HT50 plasmas et HT50/qt de protine SAH ....188
Figure 33: Nombre de mole de thiols par mole dalbumine ..188
Figure 34 : Carte factorielle des 54 individus du panel dtude tablie selon les axes 1 et 2189
Figure 35 : Carte factorielle des 17 variables du panel dtude tablie selon les axes 1 et 2.190
Figure 36 : Schma bilan sur les relations structure et fonction des albumines altres....200

LISTE DES TABLEAUX


Table au 1: Prsence des AGEs dans le srum et tissus dans diffrentes pathologies........................45
Tableau 2: Lalbumine : le routier de lorganisme ...........................53
Tableau 3: Caractrisation des sujets participant ltude in vivo............................................180
Tableau 4: Principaux paramtres de fluorescence des SAH provenant des sujets des groupes A et B.191

LISTE DES ABBREVIATIONS

AAPH ................................................................2,2 azo-bis (2-aminopropane) dihydrochloride


AG ...............................................................................................................................Acide gras
AGE........................................Produits avancs de glycation (advanced glycation endproducts)
AGPI.....................................................................................................Acides gras polyinsaturs
CEL ..............................................................................................................Carboxy-thyllysine
CMA.......................................................................................................Carboxy-mthylarginine
CML...........................................................................................................Carboxy mthyllysine
CMH ................................................................................Complexe majeur d'histocompatibilit
Cys34..........................................................................................................................Cystine 34
DID.....................................................................................................Diabte insulinodpendant
DNID...........................................................................................Diabte non insulinodpendant
DTNB............................................................................................Dithiobis 2-nitro benzoic acid
ELISA.............................................................................Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ESB....................................................................................Encphalopathie spongiforme bovine
GA ....................................................................................Albumine glyque (glycated albumin)
GOLD..............................................................................................glyoxal-derived lysine dimer
GSH...........................................................................................................Glutathion peroxydase
HbA1c........................................................................................................Hmoglobine glyque
HDL..................................................... Lipoprotine de haute densit (high density lipoprotein)
IL-8........................................................................................................................ Interleukine-8
INSEE.............................................Institut national de la statistique et des tudes conomiques
KD................................................................................................................................Kilodalton
LDL......................................................Lipoprotine de basse densit (Low density lipoprotein)
MAP-kinases...............................................................Mitogen-activated protein (MAP) kinases
MCP-1.......................................................................................Monocyte chemotactic protein-1
MOLD.................................................................................Methylglyoxal-derived lysine dimer
MSR.......................................................................................... .Macrophage scavenger receptor
NADPH............................................................... Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NEM.............................................................................................................. N-thyl- malimide
NF-B......................................................................................................Nuclear factor-kappa B
OMS........................................................................................Organisation mondiale de la sant
5

PAGE..........................................................................Electrophorse sur gel de polyacrylamide


PBS ......................................................................................................Phosphate buffered saline
pI......................................................................................................................Point isolectrique
PrPsc............................................................................................................Protine prion scrapie
RAGE........................................................................................................Rcepteurs aux AGEs
ROS......................................................Drivs ractifs de l'oxygne (reactive oxygen species)
SAB.........................................................................................................Srum albumine bovine
SAH .....................................................................................................Srum albumine humaine
SOD...........................................................................................................Superoxyde dismutase
SRAS.......................................................................................Syndrome respiratoire aigu svre
UA.........................................................................................................................Unit arbitraire
TNF-...............................................Facteur de ncrose tumorale (tumor necrosis factor alpha)
VCAM-1.................................................................................Vascular cell adhesion molecule-1
VLDL.....................................Lipoprotine de trs basse densit (very low density lipoprotein)

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

Sommaire de ltude bibliographique


I TOUR DHORIZON DES DIFFERENTES PATHOLOGIES DE NOTRE SOCIETE
1. Les maladies du vieillissement
2. Les maladies infectieuses
3. Les maladies mergentes
4. Les maladies gntiques et maladies mtaboliques

II LALTERATION DES PROTEINES AU CENTRE DE CES PATHOLOGIES


1. Du gnome au protome
2. Rle primordial de la protine dans lorganisme
a) Fonction
b) Structure : le repliement 3D est la base de l'activit des protines
c) Modification post-traductionnelle des protines
3. Les phnomnes de dnaturation et dagrgation des protines
a) Aspect structural
b) Lagrgation des protines dans les pathologies dites conformationnelles
4. Loxydation et le stress oxydatif
a) Les radicaux libres oxygns ou ROS
b) La production des ROS
c) Les systmes de dtoxification
d) Les effets bnfiques des ROS : le bon, la brute ou le mchant ?
e) Les consquences du stress oxydatif : loxydation des protines
i) Oxydation des rsidus acides amins
ii) Le devenir des protines oxydes
f) Consquences pathologiques
5. La glycation et la glycoxydation des protines
a) Formation des produits avancs de glycation (AGE)
b) Caractrisation des produits avancs de glycation
c) Toxicit des produits avancs de glycation
i) Interaction des AGEs avec leur environnement
ii) Les AGEs et les rcepteurs cellulaires
iii) Les AGEs et lauto-immunit
iiii) La glycoxydation : un mcanisme qui sauto entretient
iiiii) Les AGEs et les complications mtaboliques
9

III LALBUMINE : UNE PROTEINE SENSIBLE


1. Structure
2. Fonction : formation, distribution et rles
a) Rles circulatoires
b) Le transporteur
c) Le protecteur
d) Les proprits antioxydantes
i) Fixation de ligands
ii) Cys34, pigeur de radicaux libres
iii) Lalbumine, lponge oxydants
3. Altration des proprits antioxydantes
a) Au niveau fonctionnel
b) Au niveau structural

10

I TOUR DHORIZON DES DIFFERENTES PATHOLOGIES DE NOTRE SOCIETE


Au cours des 50 dernires annes, lesprance de vie a gagn plus de 20 ans (OMS,
2003). Dans les pays en dveloppement, ce gain a pu se faire grce au recul rapide de la
mortalit lie aux maladies infectieuses chez lenfant. Dans les pays industrialiss, ce gain
desprance de vie (2 3 mois par an en France en 2000) rsulte de la diminution de la
mortalit aux ges levs. Sajoutent cette volution la baisse ou la stagnation des taux de
fcondit avec pour consquence majeure le vieillissement de la population mondiale et une
augmentation trs sensible des plus de 60 ans (un franais sur trois en 2040, INSEE). Cette
volution positive de cette esprance de vie, nempche pas de mettre en exergue de
nombreuses maladies, proccupantes pour les principales instances sanitaires, qui affectent
lesprance de vie en bonne sant.

1. Les maladies du vieillissement


Le vieillissement de la population entrane des retentissements considrables en
termes de morbidit, avec la prvalence croissante des maladies chroniques lies lge
(cancer, maladies cardiovasculaires et neurodgnratives). Parmi les pathologies
neurodgnratives, les maladies dAlzheimer et de Parkinson sont des affections crbrales
volution lente dont la probabilit dapparition augmente avec lavance en ge. Par exemple,
la maladie dAlzheimer, qui se manifeste par des troubles de la mmoire saggravant
progressivement, touche prs dun million de franais. Elle reprsente 1,5 % chez les
personnes ges de 65 ans et double peu prs tous les quatre ans pour atteindre environ
30 % chez celles ges de 80 ans (Wolf, 2007).

En 25 ans, la mortalit attribue la maladie dAlzheimer a fait un bond en France, de


37 % chez les hommes et de 34 % chez les femmes (Wolf, 2007). La maladie de Parkinson
quant elle, touche 0,3 % de la population gnrale et 3 % des personnes de 65 ans et plus.
Avec de telles volutions, il ne fait pas de doute que les maladies neurodgnratives vont
devenir un rel problme de socit dici quelques annes.

En dpit dune meilleure prvention et de traitements plus efficaces, la France et plus


largement les pays occidentaux sont confronts un accroissement sensible du nombre de
nouveaux cas de cancers (300 000 cas de plus entre 2004 et 2006 en Europe), en raison du
11

vieillissement de la population. Sil est avr quun dpistage de plus en plus prcoce du
cancer augmente lefficacit de la prise en charge de la maladie, il nempche pas le fait que
cette pathologie soit devenue en 2004 la premire cause de mortalit en France (30 %) juste
devant les maladies cardiovasculaires (28,9 %) (Aouba, 2007).

2. Les maladies infectieuses


La mobilit et linterconnexion extrmes du monde daujourdhui crent une multitude
de conditions favorables la propagation rapide des maladies infectieuses, avec lmergence
de nouveaux agents infectieux dus aux disparits sanitaires croissantes entre pays riches et
pays pauvres. Des exemples rcents sont nombreux, en particulier le SRAS (syndrome
respiratoire aigu svre), la premire maladie grave et transmissible merger en ce XXIme
sicle, partie de Chine fin 2002 et qui a clat au niveau mondial en 2003 faisant plus de 8000
cas et prs de 800 morts. Ces maladies infectieuses se propagent plus rapidement et elles
apparaissent plus brutalement quelles ne lont jamais fait par le pass et affectent galement
le domaine de lalimentation. La chane alimentaire connat une volution rapide avec une
tendance la complexification et linternationalisation, ce qui engendre la flambe de
maladies dorigine alimentaire dues aux contaminations par des micro-organismes, des
substances chimiques ou des toxines courantes dans de nombreux pays. De nouvelles
maladies hautement pathognes pour lhomme, suscitent de fortes proccupations comme cela
a t le cas lorsque lon a dcouvert que la maladie de Creutzfeldt Jakob tait lie
lencphalite spongiforme bovine (ESB), et plus rcemment la flambe de la grippe aviaire
virus H5N1.

3. Les maladies mergentes


Lvolution des modes de vie dans notre socit a vu lmergence dune alimentation
de plus en plus inadapte ( la malbouffe avec une alimentation trop riche en graisses et en
sucres, dveloppement de la restauration rapide, .) associe une augmentation de la
sdentarit (diminution de lactivit physique), qui sest opre avec lindustrialisation,
lurbanisation et la mcanisation. Cette volution dans nos comportements alimentaires et
sanitaires explique lapparition et le dveloppement fulgurant de lobsit, le diabte et plus
globalement des maladies mtaboliques. Concernant lobsit, si les socits industrialises
ont t les premires concernes, avec leurs richesses, leurs habitudes alimentaires et le
12

manque d'activit physique, les pays en dveloppement, qui adoptent dsormais ces pratiques,
se retrouvent touchs par ce flau que lon nhsite pas qualifier maintenant de pandmie.
Le surpoids et lobsit entranent de graves consquences pour la sant : en premier lieu, les
maladies cardiovasculaires qui reprsentent la premire cause de dcs dans le monde (17
millions de morts par an) et la deuxime en France ; le diabte, qui a rapidement pris les
proportions dune pidmie mondiale, les troubles musculo-squelettiques comme larthrose et
galement certains cancers (sein, colon). Aujourdhui, on recense prs de 200 millions de
diabtiques dans le monde, soit six fois plus quil y a 15 ans. Les prvisions pour 2025 font
tat de 300 millions de diabtiques. A cause de leur tendue et de leur progression fulgurante,
lobsit et les maladies associes sont devenues une des premires proccupations de sant
publique.

4. Les maladies gntiques et maladies mtaboliques

Les maladies gntiques sont dues une ou plusieurs anomalies sur un ou plusieurs
chromosomes qui sont transmises la descendance et qui entranent un dfaut de
fonctionnement de cellules prcises de l'organisme. Certaines maladies gntiques sont dites
monofactorielles car les anomalies gntiques sont le rsultat d'une simple mutation de gne
et peuvent tre transmises la moiti des gnrations suivantes.

Dautres maladies sont dites multifactorielles car elles sont dues linteraction entre
des vnements gntiques et des facteurs environnementaux. Mme si elles sont congnitales
(prsentes la naissance), ces maladies sont galement provoques par un caractre
environnemental qui prend de plus en plus dimportance dans notre socit actuelle
(alimentation, boisson, tabagisme, qualit de lair, sdentarit, stress, choc psychologique,
etc). Pour ces anomalies congnitales, le risque de transmission est infrieur 5%. Cest le
cas de nombreuses pathologies cites prcdemment comme le diabte, certains cas de cancer,
mais galement les maladies neurodgnratives comme Alzheimer ou Parkinson. Parmi ces
pathologies, sont galement concernes les nombreuses maladies mtaboliques dites
congnitales qui reprsentent une large classe de maladies gntiques impliquant les troubles
du mtabolisme. Elles affectent les systmes biologiques communs toutes les cellules et
ainsi que les mtabolismes lis aux diffrentes classes de molcules biologiques : les
protines, les lipides et les glucides mais galement les mtaux comme le fer
13

(hmochromatose), le cuivre (maladie de Menks). Les paramtres environnementaux actuels,


comme lalimentation, accroissent le risque dapparition de ces maladies mtaboliques qui
peuvent non seulement diminuer l'esprance de vie, et augmenter lapparition de pathologies.
Ces maladies peuvent tre congnitales mais aussi acquises en raison de la dfaillance dun
organe ou dune voie mtabolique importante. Cest le cas pour le diabte et lobsit dont
lincidence est la plus leve.

En rsum, avec laugmentation de lesprance de vie, lhomme moderne est, plus


susceptible aux maladies lies au vieillissement. En effet, laccumulation de mutations
dltres, affectant des processus cellulaires cls (lapoptose, prolifration) dans un
organisme dont les dfenses sattnuent, favorise lapparition de pathologies telles que le
cancer ou les maladies neurodgnratives. Dautre part, les nouvelles conditions alimentaires
et sanitaires reprsentent un terrain propice au dveloppement des maladies mtaboliques et
infectieuses.

Do cette proccupation actuelle dans notre socit, de non seulement augmenter la


dure de vie en bonne sant mais aussi de retarder le vieillissement et ses effets nfastes. De
nouvelles thrapies se dveloppent dans ce sens et ceci grce une meilleure comprhension
des altrations des protines qui sont la plupart du temps lorigine de toutes ces pathologies.
En effet, la plupart des pathologies rpertories ci-dessus ont pour origine une modification de
protine. Ces modifications protiques peuvent tre dorigine gntique ou non.

14

II LALTERATION DES PROTEINES AU CENTRE DE CES PATHOLOGIES

1. Du gnome au protome
Si lachvement du squenage du gnome humain a apport une somme
dinformations incomparables sur lensemble des moyens dont dispose la cellule pour
fonctionner, la gnomique a montr ses limites en matire de comprhension des mcanismes
molculaires au sein de la cellule et plus gnralement dans lorganisme, particulirement
dans ltude des diffrentes pathologies. En effet la simple lecture de lADN dun gnome ne
suffit pas pour dcrypter les moyens actifs dont dispose la cellule. Ce dcryptage suppose tout
dabord un reprage des gnes prsents sur ce gnome, mais galement lidentification de ses
produits de transcription (les ARN) et de traduction (les protines), et enfin la caractrisation
du rle jou par chaque protine dans le fonctionnement de la cellule. Le transcriptome et le
protome apportent cette notion dynamique par rapport au gnome, dans la mesure o un seul
gnome peut conduire diffrents protomes en fonction des types cellulaires, mais aussi
selon ltat physiologique et pathologique. Ainsi le protome reflte les rpercussions des
vnements cellulaires que cela soit au niveau traductionnel, ou post-traductionnel.
Lavantage de la protomique par rapport la gnomique repose sur le fait que les protines
identifies sont les produits biologiques terminaux (Martin, 2001). Etant donn que les
pathologies sont souvent le rsultat de dysfonctionnements des protines et que ces dernires
sont aussi des cibles pour des actions thrapeutiques, il est primordial de passer par lanalyse
protique pour avoir une image globale des systmes biomolculaires dans leur complexit et
ainsi apprhender les mcanismes molculaires des maladies afin damliorer le diagnostic et
les thrapies. Ainsi, comprendre les diffrentes pathologies existantes revient apprhender
les altrations protiques qui peuvent trouver leur origine en amont dans des mutations au
niveau du gnome mais le plus souvent en aval avec des modifications post-traductionnelles.

2. Rle primordial de la protine dans lorganisme


Les protines sont les agents organisateurs de la matire vivante. En effet, si certains
biologistes ont longtemps considr les acides ribonucliques (ARN) comme les composants
ayant le pouvoir dorganisation de la matire vivante, ce rle est dsormais dvolu aux
protines porteuses principales de linformation dans lorganisme.
15

a) Fonction

Les protines reprsentent lune des plus importantes classes de molcules prsentes dans tous
les organismes vivants. Notre organisme en fabriquerait environ 100 000 diffrentes les unes
des autres, dont chacune possde une structure et des proprits chimiques qui lui sont
propres. Elles assurent lessentiel des fonctions de la cellule que lon peut sparer en deux
catgories :

- Les protines de structure, intgres aux membranes, interviennent dans larchitecture des
tissus et des organes. Ces protines peuvent former des fibres de structures aussi diverses que
les tendons, ligaments, mais aussi larmature interne des cellules ou les fibres des caillots
sanguins. Le collagne est la protine de structure la plus abondante de l'organisme et le
constituant essentiel du derme de la peau, ainsi que de tous les artres et vaisseaux.

- Les protines fonctionnelles, qui assurent le fonctionnement de la cellule et de lorganisme,


sont sous diffrentes formes :

Transporteur : plusieurs substances chimiques sont transportes dans le sang en se


combinant temporairement une protine comme lhmoglobine (transport dO2) ou
lalbumine srique (transport dacide gras). Elles peuvent galement assurer le
transport travers la membrane cellulaire (par exemple par le biais de canaux
protiques...) (Petit, 1997).

Anticorps : certaines grosses protines (immunoglobulines) fabriques par des


globules blancs (lymphocytes) jouent le rle danticorps pour la dfense de
lorganisme contre les cellules trangres.
Hormones : de nombreuses hormones sont des protines comme linsuline ou
lhormone de croissance qui agissent distance de leur site de production par fixation
sur des rcepteurs spcifiques.
Identification des cellules et de molcules : les glycoprotines appeles CMH
(complexe majeur dhistocompatibilit) sont situes au niveau des membranes
cellulaires et permettent au systme immunitaire de distinguer ses propres cellules des
cellules trangres. De mme, certaines protines membranaires font office de
rcepteurs dans la dtection spcifique de molcules de signalisation (hormones,
facteurs de croissance, interleukines). Celles-ci dclenchent une cascade de raction
16

biochimique de transduction de signaux, ou bien interviennent dans la fixation de


complexes molculaires (lipoprotines) circulants en vue de leur absorption par la
cellule.
Enzymes : La plupart des ractions chimiques des diffrents mtabolismes se
produisant dans la cellule sont catalyses par des protines possdant une activit
enzymatique.

b) Structure : le repliement 3D est la base de l'activit des protines

Du point de vue structural, les protines sont des macromolcules constitues de longues
chanes d'acides amins (les lments de base). La protine est la rsultante du message
gntique contenu dans un gne. Il existe 4 niveaux de structuration de la protine
(Figure 1) :
La structure primaire ou squence d'une protine correspond la succession linaire des
acides amins (ou rsidus) la constituant. Les protines sont donc des polymres d'acides
amins, relis entre eux par des liaisons peptidiques.

Figure 1 : Les quatre niveaux de structure de la protine


La structure secondaire dcrit le repliement local de la chane principale de la protine.
L'existence de structures secondaires vient du fait que les repliements nergtiquement
favorables de la chane peptidique sont limits et que seules certaines conformations sont
possibles. Certaines conformations se trouvent nettement favorises car stabilises par des
liaisons hydrognes. Il existe trois catgories principales de structures secondaires selon
17

l'chafaudage de liaisons hydrognes, et donc selon le repliement des liaisons peptidiques


(Figure 2): les hlices, les feuillets et les coudes (Voet, 1998).
- L'hlice correspond une structure hlicodale priodique trs frquente dans le
repliement des protines et des peptides. Elle se caractrise par la formation de liaisons
hydrognes entre le groupement carbonyle -CO d'un rsidu n et le groupement amide -NH
d'un rsidu n+4.

Figure 2 : Les structures secondaires possibles dune protine


- Le brin est une structure priodique tendue. Les liaisons hydrognes qui le
stabilisent se font entre rsidus distants plutt qu'entre rsidus conscutifs, comme dans le cas
de l'hlice . En fait, un brin seul n'est pas stable. Il a besoin de former des liaisons
hydrognes avec d'autres brins pour se stabiliser. On parle alors de feuillets .
- Les coudes ne sont pas des structures priodiques. Il s'agit plutt d'un repliement
particulier du squelette carbon localis 3 ou 4 rsidus conscutifs. Les coudes permettent
bien souvent de relier 2 structures secondaires priodiques (hlices et/ou brins).

18

La structure tertiaire ou structure tridimensionnelle correspond au repliement de la chane


polypeptidique dans l'espace. La structure 3D d'une protine est intimement lie sa fonction.
Lorsque cette structure est casse par l'emploi d'agent dnaturant, la protine perd sa fonction:
elle est dnature.
La structure tertiaire d'une protine dpend de sa structure primaire, mais galement
des conditions locales qui existent l'intrieur de chaque compartiment cellulaire : le solvant,
la force ionique, la viscosit et la concentration contribuent moduler la conformation. Ainsi,
une protine membranaire aura besoin de l'environnement hydrophobe de la membrane pour
adopter une conformation. La structure tertiaire est maintenue par diffrentes interactions:
interactions covalentes (ponts disulfures), lectrostatiques (liaisons ioniques, liaisons
hydrognes), interactions avec le solvant et l'environnement (ions, lipides...).
Les deux principales structures tridimensionnelles sont dune part, les protines
globulaires dont leur rle se limite une fonction structurelle (enzyme, messager, transport ou
stockage) et dautre part les protines fibreuses qui jouent principalement un rle constitutif
(tissus, cartilage, vaisseaux et ligaments).
La structure quaternaire des protines regroupe l'association d'au moins deux chanes
polypeptidiques - identiques ou diffrentes - par des liaisons non covalentes (liaison H, liaison
ionique, interaction hydrophobe), mais rarement des ponts disulfures. Chacune de ces chanes
est appele monomre (ou sous-unit) et l'ensemble oligomre ou protine multimrique
(Voet, 1998).
Chaque protine, constitue dune chane polypeptidique spcifique, adopte sa propre
structure tridimensionnelle, en se repliant dune seule faon aprs sa synthse. Sa forme
native, correspondant son repliement naturel dans les conditions physiologiques, dpend non
seulement de la squence protique, mais galement des interactions nergtiques existant
entre les diffrentes structures secondaires (Dill, 1990).

Les liaisons hydrogne jouent un rle fondamental dans le repliement de la protine


(Bryant, 1998). Les interactions lectrostatiques ont lieu sur des protines ayant des charges
lectriques permanentes. En fonction du signe de ces charges, les interactions sont soit
attractives ou bien rpulsives. Le signe et la rpartition de celles-ci dpendent avant tout du
pH de la solution et du point isolectrique (pI) de la protine (Howell, 1992). Les liaisons
covalentes qui jouent un rle important dans la stabilisation des domaines protiques, sont les
ponts disulfures intramolculaires forms par loxydation de groupements thiols (-SH) de
19

deux rsidus cystine. Cette interaction forte peut se faire galement entre rsidus cystine de
diffrentes molcules protiques pour former des agrgats stables.

c) Modification post-traductionnelle des protines

La synthse des protines a lieu dans le cytosol. Pendant leur traduction ou quand elles
sont entirement synthtises, certaines protines subissent des modifications chimiques que
l'on appelle respectivement modifications co-traductionnelles ou post-traductionnelles. Ces
modifications sont nombreuses et entranent un changement de la fonction de la protine
considre, que ce soit au niveau de son action, de sa demi-vie, ou de sa localisation
cellulaire.

Figure 3 : De lADN la protine fonctionnelle

20

Ces modifications peuvent, soit impliquer laddition dun groupe fonctionnel


(lactylation, glycosylation, biotinylation, phosphorylation), ou bien laddition de
groupements peptidiques (lubiquitination), soit changer la nature chimique des acides
amins (damidation, citrullination), soit impliquer des changements structuraux (clivage
protique ou tablissement de ponts disulfures).

Ces modifications ont notamment pour but de :


-

Rguler lactivit de la protine.

Ltiqueter afin quelles soient reconnues par un systme de dgradation, par dautres
molcules ou pour les adresser un compartiment cellulaire.

Les intgrer dans une cascade de signalisation.

Les ancrer la membrane

La protine ainsi modifie adopte une structure et des proprits physicochimiques trs
diffrentes de la molcule directement code par le gne. Ces modifications posttraductionnelles ont gnralement pour objectif de rendre la protine fonctionnelle dans son
environnement physiologique (Figure 3). De ce fait, labsence de modifications posttraductionnelles de certaines protines seront dans certains cas lorigine dune pathologie.
Par exemple, la maladie de Still, affectant le plus souvent lenfant, est un rhumatisme
inflammatoire rare se caractrisant par des pics de fivre, des ruptions cutanes et des
douleurs articulaires, et sexpliquant en partie, par un taux anormalement bas de ferritine
glycosyle (20 % au lieu de 80% chez un sujet sain) (Fautrel, 2002). La ferritine constitue
un facteur protique important du mtabolisme du fer.

A contrario certaines modifications post-traductionnelles seront galement la source


de certaines maladies. Cest le cas dans la maladie dAlzheimer, ou la phosphorylation
anormale des protines Tau est un lment cl de la fonction anormale de la protine et de son
caractre fibrinogne (Leger, 1997). Parmi les modifications entranant une altration de la
protine, celles induites par la glycation et loxydation sont les plus rpandues avec celles
issues de mauvais repliements ( unfolding ) lorigine des phnomnes dagrgation
(Figure 3).

21

3. Les phnomnes de dnaturation et dagrgation des protines


a) Aspect structural

La plupart des protines sont susceptibles de sagrger dans certaines conditions


particulires, mais de diffrentes faons et des degrs divers. Cette agrgation rsulte dun
mauvais repliement de la structure tridimensionnelle caractristique dans laquelle la protine
est fonctionnelle. Le processus dagrgation dpend de nombreux facteurs, tels que la
temprature, le pH, la concentration, la force ionique ou bien la prsence dun co-solut
(Aymard, 1996; Fink, 1998), mais surtout dune altration du repliement naturel de la
protine. De nombreuses maladies neurodgnratives ou autres sont considres comme
rsultant d'une accumulation de protines mal replies . En effet, un repliement incomplet
de la protine induit une exposition de certains sites hydrophobes ou de groupements thiols
(-SH), alors inaccessibles lorsque la protine est sous sa forme native. Par ailleurs, un mauvais
repliement entrane une perte de fonctionnalit de la protine.

Les repliements tridimensionnels des protines sont trs vulnrables une multitude
de facteurs, dorigine exogne comme les agressions physiques (choc thermique), chimiques
(mtaux lourds, ROS), ou endogne (souvent gntique) comme des changements dacides
amins suite des mutations. Ces repliements partiels peuvent aussi sexpliquer par des
changements conformationnels au niveau de la structure secondaire de la protine. En effet,
dans la plupart des cas, les changements conformationnels ce niveau, entrane la formation
dagrgats riches en structure de type . Lagrgation induit une augmentation des structures

en feuillet au dtriment des hlices (Fang, 1997). De nombreuses tudes permettent de


considrer que le processus dagrgation implique des interactions entre diffrentes structures

en feuillets-. Dautre part, les protines riches en structures et en rsidus hydrophobes ont
une meilleure susceptibilit la formation dagrgats (Chiti, 2002; Fink, 1998).

b) Lagrgation des protines dans les pathologies dites conformationnelles

Pendant des dcennies, les scientifiques se sont intresss au mcanisme de formation des
agrgats insolubles dans diffrentes pathologies. En effet, la modification des peptides et
22

protines en agrgats est troitement corrle avec de nombreuses conditions pathologiques


humaines (Figure 4) (Wang, 2008).

Par exemple, dans l'anmie hmaties falciformes, maladie gntique lie la


prsence de gnes d'hmoglobine anormaux qui produisent une protine d'hmoglobine non
fonctionnelle, les globules rouges sont dforms en forme de faucille (d'o son nom
falciforme, en anglais sickle ) lorsquelles sont sous leur forme dsoxygne (Dobler,
1968).

Figure 4 : Les phnomnes dagrgation et les pathologies associes

La polymrisation de lhmoglobine en fibrilles est lorigine de la dformation de


ces globules rouges provoquant non seulement une obturation des petits vaisseaux (vasoocclusion) mais galement une mort prmature (Weatherall, 2001). Dans la maladie

dAlzheimer, laccumulation, dans le systme nerveux central, de peptides -amylode (AP),


constituant majeur des plaques sniles, contribue principalement aux phnomnes de
dgnration neuronale et de dmence (Selkoe, 2002). Cependant, il apparat galement que
lagrgation des protines Tau, protines fortement exprimes dans les neurones au niveau des
axones, participe cette neurodgnrescence. En effet, dans la maladie dAlzheimer, ces
23

protines sagrgent pour former des structures trs stables et rsistantes la protolyse
(Sadqi, 2002). Dans ce processus dapparition des lsions crbrales, les dpts amylodes
semblent potentialiser le phnomne agrgatif des protines Tau (Buee, 2000).

De faon similaire, dautres pathologies neurodgnratives ont mis en vidence


limplication de lagrgation protique. Par exemple, les maladies prions, telles que
Creutzfeld-Jacob et lencphalopathie spongiforme bovine (vache folle), sont les
consquences de laccumulation de substances amylodes de protines prion PrPsc (Prusiner,
1994). La protine prion anormale (PrPsc) prsent chez les individus infects, diffre du prion
normal (PrP) par un repliement anormal en feuillet-, empchant sa dgradation complte et
efficace par les protinases (Madec, 1997). De mme dautres maladies neurologiques, dites
par expansion de polyglutamine, comme la maladie de Huntington, se caractrise notamment
pas des inclusions intranuclaires de fibrilles de type amylode (DiFiglia, 1997). Enfin, dans
la maladie de Parkinson, ces inclusions sont connues sous le nom de corps de Lewy et sont
situes dans le cytoplasme des cellules neuronales et sont composes, en partie, dagrgats de
type amylode de la protine -synucleine (Conway, 2000).

Par ailleurs, les phnomnes dagrgation concernent galement le diabte de type 2.


En effet, les plaquettes dun patient diabtique ont de fortes prdispositions lagrgation, ce
qui peut conduire des athrothromboses (Vitek, 1994), si bien quune thrapie antiagrgante
plaquettaire est souvent prescrite pour ce genre de patients.
Globalement, toutes ces pathologies sont associes la multimrisation de protines
non replies dans les agrgats extracellulaires ou des inclusions intracellulaires insolubles.

4. Loxydation et le stress oxydatif


Les ractions d'oxydation dans les cellules sont des phnomnes habituels et
conditionnent leur bonne marche. Comme tout phnomne important, ils ne sont pas sans
danger puisque tout drglement va entraner une agression appele stress oxydatif. On peut
galement le dfinir comme une rupture dquilibre entre les espces antioxydantes et
pro-oxydantes en faveur de ces derniers (Fridovich, 1978; Sies, 1985). Les premiers travaux
dans le domaine ont montr le rle important jou par les intermdiaires oxygns, appels
24

galement radicaux libres, dans les phnomnes physiologiques et leurs effets dltres dans
les processus cellulaires (Gerschman, 1954; Gilbert, 1950).

a) Les radicaux libres oxygns ou ROS

Le mtabolisme cellulaire normal produit et utilise en permanence des espces oxygnes


ractives. Cest le cas au cours de la respiration o chaque cellule rduit l'oxygne en eau.

Figure 5 : Les principaux radicaux libres et les mcanismes de dtoxification

Les espces oxydantes sont des drivs de loxygne radicalaire ou non, hautement
ractifs et instables, impliqus dans de nombreux processus biologiques (Figure 5). Parmi ces
espces, les moins ractives comme lion superoxyde (O2-) et le peroxyde dhydrogne
(H2O2) sont peu impliqus dans la dgradation protique, mais ont la capacit de diffuser
travers les membranes et ainsi dagir des distances relativement importantes (Halliwell,
1992). Ils sont galement lorigine despces plus ractives comme le peroxynitrite (NO3-)
25

et le radical hydroxyle (OH) responsable de fragmentation protique ou de la formation


dagrgats molculaires mais avec un court rayon daction (30 ) compar lion superoxyde
et au peroxyde dhydrogne (Martinez-Cayuela, 1995). Le peroxynitrite est obtenu par
interaction entre O2- et loxyde nitrique (NO), un radical vasodilatateur produit par de
nombreuses cellules comme les phagocytes et les cellules vasculaires endothliales (Crow,
1994). Le peroxynitrite est connu pour ses effets dltres au niveau des protines, o il ragit
fortement avec les mtaux qui y sont fixs (Pacher, 2007). Il participe galement la
nitration de la cystine et de la tyrosine.

b) La production des ROS

Les sources de production des radicaux libres sont multiples (Figure 6), parmi
lesquels les systmes endognes : ils peuvent avoir pour origine lauto-oxydation des aldoses
comme le glucose conduisant la formation de H2O2 ainsi que des intermdiaires radicalaires
(Wolff, 1991). Les protines glyques peuvent galement ragir avec loxygne pour former
des radicaux libres oxygns. En effet, les produits avancs de glycation (AGEs) comme le

N-carboxymthyllysine (CML), rsultent de loxydation de la fructoselysine. La pentosidine,

quant elle, provient dune raction dautooxydation entre les rsidus lysine et arginine (Sell,
1989).

La production de ROS peut provenir dun processus enzymatique ou non enzymatique


(Thannickal, 2000). Des enzymes cytoplasmiques comme la xanthine oxydase ou laldhyde
dshydrognase sont lorigine de la formation de radicaux libres lors de leur cycle
catalytique (Martinez-Cayuela, 1995). De mme, la voie de synthse des prostaglandines
catalyse par la lipoxygnase et la cyclo-oxygnase, deux enzymes membranaires, implique la
production de radicaux libres. Au niveau de la membrane plasmique, la NADPH oxydase
active par le processus phagocytaire de la cellule est lorigine dune large production de
radicaux superoxyde (Orient, 2007; Vignais, 2002).

26

Figure 6: Les principales sources de radicaux libres

Au niveau des peroxysomes, les ROS sont aussi bien dgrads que produits. Les
antioxydants y rsidant, comme la glutathion peroxydase ou la catalase, participent au
processus dinactivation du peroxyde dhydrogne. Les enzymes oxydases, quant elles,
participent au processus inverse. De plus, les peroxysomes contiennent de nombreux ions
mtalliques lorigine de la formation de nombreux radicaux libres via la raction de Fenton
(Schrader, 2006).

Une majorit des ROS provient de la respiration mitochondriale. En effet, au cours du


transport des lectrons par la chane respiratoire, des substances oxygnes ractives, sont
gnres et environ 2% de loxygne sont convertis en radicaux superoxyde directement
ractifs au voisinage de la mitochondrie (Inoue, 2003).

Il existe galement de nombreuses sources exognes, tels les polluants photochimiques


le tabac, les drogues ou les radiations ionisantes, pntrant l'organisme via le systme
respiratoire, l'alimentation ou les muqueuses (Blache, 1992; Kohen, 2002). La surproduction
27

de ROS peut tre aussi induite par des processus de type ischmie-reperfusion qui est
l'origine d'une partie des rejets des greffes (Serrano, 2000). Enfin, la gnration de ROS est
galement le rsultat de la mort cellulaire via lapoptose ou la ncrose (Dalle-Donne, 2006) .

c) Les systmes de dtoxification

Ces molcules, trs agressives, sont normalement limines par des systmes de
dfense enzymatiques ou biochimiques. Il existe aussi deux types de systmes rparateurs
chargs de corriger les effets toxiques des radicaux libres.
Le systme de dfenses primaires diminue la production de radicaux libres et
comprend diffrentes enzymes comme la superoxyde dismutase (SOD) catalysant la
dismutation de O2- en H2O2 et O2 (Darley-Usmar, 1996), la catalase permettant
llimination de H2O2 excdentaire (Harris, 1991), et la glutathion peroxydase (GSH)
catalysant aussi bien la rduction de H2O2 que les peroxydes organiques (ROOH) (Figure 7)
(Harris, 1992). Ce systme primaire comprend galement un systme non enzymatique
utilisant de petites molcules comme la vitamine C, vitamine E ou le glutathion qui ont la
capacit de rduire les radicaux libres. Le glutathion peut rduire H2O2

en eau et les

peroxydes (ROOH) en alcool. Les vitamines C et E inhibent la peroxydation lipidique.

Figure 7 : Les principales ractions de dtoxification

Les systmes de dfenses secondaires peuvent rduire les dommages que les radicaux
libres font subir aux protines, aux lipides et lADN. Les attaques radicalaires au niveau des
acides nucliques stoppent notamment la rplication de lADN. Diffrentes enzymes comme
la ligase, lADN polymrase I ou des endonuclases peuvent intervenir pour protger la
transmission de linformation gntique (Ames, 1993). De mme, de nombreuses
oxydorductases catalysent la rduction au niveau de nombreux rsidus amins des protines
28

pralablement oxyds par les radicaux libres comme la tyrosine, lhistidine, la mthionine et
la cystine. Enfin, grce son caractre liposoluble, la vitamine E reprsente un bon systme
de dfense contre la peroxydation au niveau des lipides (Yamauchi, 2007).

Tous ces systmes de dfense produits par lorganisme sont capables dinactiver les
ROS nocifs et ainsi de maintenir une balance optimale oxydants/antioxydants permettant
dassurer une fonction cellulaire normale. Cependant, sous leffet dun fort stress oxydatif, les
capacits de ces antioxydants liminer les ROS sont souvent dpasses et par consquent,
dautres sources dantioxydants, dites dittiques, sont ncessaires. Les plus rpandus et
connus tant ceux trouvs dans lalimentation comme le -carotne (provitamines A), l'acide

ascorbique (vitamine C), le tocophrol (vitamine E) et les polyphnols. Beaucoup de ces


antioxydants proviennent des fruits (fruits rouges, orange, raisin) et des lgumes (tomate,
cresson, ail).

d) Les effets bnfiques des ROS : le bon, la brute ou le mchant ?

Les espces ractives de loxygne sont souvent prsentes comme les troubles
fte et les responsables de nombreux processus dltres. Cependant, ces ROS sont des
intermdiaires ncessaires dans les fonctionnements cellulaires, notamment dans les ractions
enzymatiques. Ils sont gnrs dans de nombreuses ractions essentielles la vie. Et les
exemples mettant en exergue le rle indispensable des radicaux oxygns dans la cellule sont
nombreux. Parmi les leucocytes, les neutrophiles sont spcialiss dans la production de
radicaux indispensables dans la destruction des agents pathognes. Ils participent aussi
lactivation de gnes impliqus dans la rponse immunitaire (Chew, 2004). Par ailleurs, dans
le muscle, tissu le plus rpandu dans le corps humain, la gnration de radicaux libres
intervient dans le contrle de sa tonicit (McArdle, 2004).
Les ROS participent de nombreux processus cellulaires, que ce soit la prolifration
cellulaire, la diffrentiation ou bien lapoptose. Par exemple, les ROS relargus par les
cellules phagocytaires (macrophages) lors de linflammation contribuent lutter contre les
bactries. De plus, laugmentation des ROS peut induire lexpression de certains gnes relatifs
aux activits antioxydantes (Lecarpentier, 2007). Une rponse antioxydante une lgre
augmentation de ROS est souvent suffisante pour rtablir lhomostasie redox.

29

e) Les consquences du stress oxydatif : loxydation des protines

Hormis les lipides et lADN, les attaques radicalaires gnres par les ROS affectent
les protines, parmi lesquelles les protines plasmatiques, particulirement exposes lorsque
les sources dun stress sont augmentes au dtriment des dfenses antioxydantes (Soriani,
1994). Les protines peuvent tre attaques par les radicaux libres mme des concentrations
trs leves en antioxydants (vitamine E, trolox), alors que dans les mmes conditions, le
processus de lipoperoxydation est presque supprim (Dean, 1991). De plus, loxydation des
protines apparat de faon prcoce par rapport la peroxydation lipidique (Davies, 1987).

i) Oxydation des rsidus acides amins

Au niveau de la protine, loxydation touche la chane latrale de certains acides


amins constitutifs des protines. Une majorit dacides amins sont particulirement
sensibles au stress oxydant tels que la lysine, larginine, la cystine, la mthionine, lhistidine et
la phnylalanine (Figure 8).

Parmi les acides amins soufrs, la cystine est oxyde en acide sulfnique (-SOH)
conduisant la formation de ponts disulfures S-S (Stadtman, 1993) ou bien dacide sulfonique (SO3H). La mthionine, quant elle, donne par oxydation la mthionine sulfone (Brot, 1983). Ces
rsidus, situs gnralement dans des zones exposes de la protine, donc les plus susceptibles
loxydation, apparaissent comme un systme antioxydant interne la protine et prviendraient
ainsi loxydation dautres acides amins essentiels (Levine, 1996).

Par ailleurs, loxydation des rsidus mthionine peut induire un changement


conformationnel se traduisant par un dpliement partiel de la protine (Hoshi, 2001). Les
mthionine sulfoxydes sont dailleurs fortement impliqus au niveau des protines du cortex
crbral dans les pathologies neurodgnratives (Moskovitz, 2005).

Concernant les rsidus aromatiques, la tyrosine peut tre oxyde par le radical
hydroxyle pour donner la di-tyrosine qui apparat comme un marqueur spcifique in vivo du
statut oxydatif des protines (Giulivi, 2003). La nitration de ce rsidu par le peroxynitrite
donne lieu la formation de 3-nitrotyrosine, produit doxydation mis en vidence dans les
plasmas de patients diabtiques (Ceriello, 2001). La phnylalanine soxyde quand elle en

30

o-tyrosine ou m-tyrosine, puis est convertie en driv de la dopamine (adrnaline) (Matthews,


2007; Stadtman, 2003).

Figure 8 : Exemples dattaque des ROS sur diffrents acides amins

De nombreux rsidus, tels que la lysine, larginine et lhistidine, souvent situs dans des
sites de fixation de mtaux, constituent des cibles sensibles loxydation via les radicaux libres.
La prsence de mtaux de transition facilite la modification de ces rsidus en drivs carbonyls

tels que le 2-oxohistidine et le semi aldhyde -aminoadipique. Certains acides amins comme la
lysine et larginine peuvent galement se combiner avec des carbohydrates selon le processus de
glycoxydation pour donner des AGEs.

31

ii) Le devenir des protines oxydes

Non seulement, les protines oxydes sont affectes dans leurs fonctions, mais
galement dans leur structure. Par exemple, les protines altres ne sont plus reconnues par
leurs rcepteurs ou bien leurs activits enzymatiques sont diminues.

Figure 9 : Devenir des protines oxydes

Par ailleurs, ces altrations de type oxydatif sont des phnomnes propageables. La
surveillance de la qualit des protines intracellulaires est capitale pour la survie des cellules.
Les protines oxydes seront prises en charge par des systmes de rparation ou dlimination
(Figure 9).

Les systmes de rparation des protines :

Paralllement au systme protasome, il existe des mcanismes enzymatiques capables


de rduire certains produits doxydation des acides amins soufrs et de permettre ainsi la
rparation de la protine oxyde. Par exemple, le peptide mthionine sulfoxyde rductase
32

(PMSR) comporte deux familles denzymes (MsrA et MsrB) susceptibles de rduire les
diffrentes formes de la mthionine sulfoxyde, produit de loxydation de la mthionine. Cette
enzyme extracellulaire a t successivement mise en vidence chez les bactries (Brot, 1995),
les plantes (Sadanandom, 1996) et lanimal (Moskovitz, 1996). Son rle dans la rparation
de protines oxydes a t confirm dans de nombreuses tudes, notamment celle dcrivant
des lymphocytes humains surexprimant cette enzyme et qui prsentent une plus grande
rsistance au stress oxydant (Moskovitz, 1997).

Une autre enzyme, la sulfirdoxine, est capable de rparer les protines oxydes,
particulirement celles possdant des cystines oxydes (Biteau, 2003). Cette nouvelle
enzyme dcouverte chez la levure, rduit l'acide sulfinique (-SO2H), prouvant ainsi que la
suroxydation des cystines n'est pas irrversible. Les cystines oxydes sont prises en charge
par la protine disulfide isomrase, enzyme catalysant la rduction des disulfures et qui
semble implique dans le repliement correct de la protine (Freedman, 1989).

Le systme protolytique : le protasome

Lorsque ltat oxydatif des protines devient irrversible, cause dun potentiel de
dfense antioxydant totalement dpass, les systmes protolytiques prennent le relais pour
assurer la dgradation des protines altres (Pacifici, 1991).

Les processus biochimiques au sein de la machinerie cellulaire sont le rsultat dune


synchronisation et dune complmentarit parfaite des nombreuses protines ayant chacune
un rle bien spcifique. La dgradation dune seule de ces protines peut enrayer le processus
biochimique. De telles protines doivent tre dgrades afin de limiter leurs effets toxiques
potentiels : cest le rle dvolu au protasome responsable de la dgradation de ces protines
altres (Poppek, 2006). Le protasome est un grand complexe protolytique constitu de
plusieurs activits peptidase. Une fois quelles sont marques lubiquitine, les protines
dgrader sont reconnues par le systme protasome qui les hydrolyse en acides amins et
petits peptides. Le protasome a ainsi un rle vital dans la dgradation des protines oxydes
et donc dans le renouvellement continu des protines.

33

Dautres systmes protolytiques ont t auparavant mis en vidence comme


machineries de reconnaissance et de dgradation des protines oxydes : les complexes
macroxyprotinase et protinase multi catalytique. Le systme multi-catalytique protinase
comprend une protase cytosolique de haut poids molculaire capable de dgrader
spcifiquement les glutamines synthtases oxydes (Rivett, 1985a; Rivett, 1985b). La
macroxyprotinase, est un complexe protolytique de haut poids molculaire prsentant trois
sites actifs, isols partir drythrocytes et dgradant slectivement les protines dnatures
par oxydation (Pacifici, 1991; Pacifici, 1989). Ces deux complexes protolytiques sont
maintenant considrs comme appartenant au protasome 20S (Friguet, 2002).

Cependant, certaines de ces protines modifies sont moins susceptibles la


dgradation. Cest le cas de la glucose-6-phosphate dshydrognase qui, sous sa forme
glycoxyde, rsiste la protolyse (Bulteau, 2001). De plus, dans certaines conditions
inflammatoires, les fonctions protolytiques du complexe protasome peuvent tre inhibes.
En effet, le stress oxydant peut induire la scrtion de cytokines pro-inflammatoires comme
IL-8 qui est fortement implique dans linactivation du protasome (Fernandes, 2008). Ces
deux observations permettent dexpliquer laccumulation progressive dagrgats de protines
oxydes lorigine de nombreuses pathologies, particulirement celles lies au vieillissement.

f) Consquences pathologiques

Si la prsence de ces ROS est utile pour les cellules, une surproduction ou une
diminution des dfenses antioxydantes entrane des dommages cellulaires (Cheeseman,
1993). Ainsi, ces espces ractives participent la dsorganisation des structures
membranaires, l'oxydation de protines qui perdent alors leur fonction, l'oxydation des
lipoprotines circulantes, mais galement des altrations de lADN. Le stress oxydatif tant
un facteur dinflammation et de mutagense, il touche donc l'ensemble des tissus et des
mtabolismes et de ce fait, contribue un grand nombre de pathologies comme le cancer, les
maladies cardiovasculaires et crbro-vasculaires. Il jouerait un rle dans les maladies
neurodgnratives et particulirement la maladie dAlzheimer. Dans ces pathologies, le
stress oxydant contribue au mauvais repliement de certaines protines et ainsi
laccumulation dagrgats (Pacifici, 1993) (Figure 9). Mme si des nouvelles thrapies
anticancreuses sont dveloppes partir de lutilisation de radicaux libres (Hileman, 2004),
34

les ROS auraient paradoxalement un rle promoteur dans le dveloppement de certains


cancers (Halliwell, 2007). Le stress oxydant serait impliqu dans les allergies et lasthme par
le biais de la NADPH oxydase du pollen (Boldogh, 2005).

Enfin, dans les deux formes du diabte (I et II), les phnomnes dinsulino-scrtion et
dinsulino-rsistance seraient en partie lis au stress oxydant. En effet, dans le cas du diabte
insulinodpendant (DID), dune part son rle dans les lsions de la cellule- pancratique est
avr, dautre part les radicaux libres inhibent la scrtion dinsuline (Krippeit-Drews,
1994). Concernant le diabte non insulinodpendant (DNID), la gnration de radicaux libres
est un mdiateur des effets du facteur TNF- sur la sensibilit des tissus priphriques
linsuline et pourrait ainsi tre implique dans linsulino-rsistance lie lge (Paolisso,
1999). Toutefois la production de ROS par les mitochondries serait un facteur indispensable
dans la scrtion insulinique induite par le glucose (Leloup, 2008).

Par son implication dans ces complications mtaboliques, le stress oxydant est souvent
troitement li un autre mcanisme altratif que lon rencontre le plus gnralement dans la
pathologie du diabte (Gillery, 2006). Ces deux processus dltres qui sauto entretiennent
sont gnralement regroupes sous le terme de " glycoxydation ".

5. La glycation et la glycoxydation des protines


Comme dcrit prcdemment, plusieurs mcanismes sont impliqus dans la gense de
ce stress oxydant, parmi lesquels la glycation des protines. En effet, les protines glyques
peuvent galement ragir avec loxygne pour former des radicaux libres oxygns et ainsi
induire un stress oxydant.

Ce type de modification est notamment constat au niveau des protines plasmatiques


dans le cas du diabte. Cette pathologie saccompagne gnralement de complications
vasculaires ainsi que de dommages fonctionnels des protines telles que lalbumine (Cohen,
2003a). Lhyperglycmie est considre comme la principale cause des complications
diabtiques qui affectent entre autre les protines circulantes. Ses effets dltres sont
attribus la formation accrue de produits avancs de glycation (AGE) partir de lexcs de
sucre sanguin et des protines circulantes, parmi lesquelles lalbumine est la plus expose.
35

Ces phnomnes de glycation touchent galement les lipoprotines de basse densit (LDL) in
vivo chez des patients diabtiques (Schleicher, 1981).

a) Formation des produits avancs de glycation (AGE)

La glycation des protines correspond une glycosylation non enzymatique, dont le processus
se droule en trois tapes : (Figure 10)

Figure 10 : Les diffrentes tapes de la raction de Maillard (Hartog, 2007)


Formation rapide et rversible dune base de Schiff instable par combinaison de la fonction
aldhyde du glucose avec un rsidu amin de la protine (Lysine, Arginine) (Day, 1979) ou
avec la fonction amine N-terminale (Cohen, 1986).

36

Rarrangement dAmadori pour aboutir aux produits de glycation dit prcoce ou


fructosamines qui sont des protines intermdiaires.
Accumulation lente et irrversible, par rarrangements, transferts dhydrogne et
oxydation, de produits avancs de glycation (AGE) ou produits de raction de Maillard. Ces
produits terminaux de glycation sont des protines de dure de vie prolonge se caractrisant
par une pigmentation brune, leur fluorescence (Degenhardt, 1998; Niwa, 1999) et leur
implication dans la formation de liaisons croises entre protines (Yang, 2003).

Si les deux premires tapes ont une rversibilit potentielle en fonction du niveau de
la glycmie du patient, la troisime tape et la formation des produits avancs de glycation ne
sont pas affectes par un meilleur contrle glycmique (Lyons, 1985).

La formation des produits avancs de glycation, outre le cas du diabte, est un


phnomne accru dans diverses pathologies comme linsuffisance rnale terminale (BordasFondrede, 1990), et au cours du vieillissement (Sell, 1990). Outre le glucose, dautres oses ou
drivs sont susceptibles de participer la glycation des protines comme le galactose, le

fructose, le ribose, lacide ascorbique. Les -oxoaldhydes trs ractifs comme le


mthylglyoxal et le 3-deoxyglucosone sont galement des prcurseurs importants des AGE in
vivo (Degenhardt, 1998; Niwa, 1999).

b) Caractrisation des Produits avancs de glycation

La formation des diffrents AGE implique une tape doxydation partir des produits
dAmadori ou fructosamines. Il apparat donc plus appropri de dsigner ces produits
terminaux comme des produits de glycoxydation plutt que de glycation (Baynes, 1999).

Seulement quelques AGE ont pu tre caractriss et identifis in vivo (Figure 11) : les
drivs hydroimidazolones produits de la raction avec le 3-dsoxyglucosone ont t
retrouvs dans les rtines de patients diabtiques (Hammes, 1999a). Des drivs monolysyles

ont galement t caractriss. Cest le cas du N-carboxymthyllysine (CML) issu du clivage

37

de rsidus fructose-lysine des fructosamines et dont la concentration au niveau du collagne


de la peau est fortement lie au dveloppement de la rtinopathie (Hammes, 1999b).

Figure 11 : Structures dAGEs caractrises in vivo (Ahmed, 2002; Biemel, 2001;


Nakamura, 1997; Thorpe, 2003)
La N-carboxythyllysine (CEL) et les sels dimidazolium (GOLD et MOLD) ont
galement t isols in vitro et sont issus de la raction du mthylglyoxal et du glyoxal avec
les protines (Wells-Knecht, 1996). De mme, des produits obtenus par couplage entre deux
acides amins glyqus, comme la pentosidine (Sell, 1989) ou les crosslines, ont t identifis.
La pyrraline a t dtecte au niveau des protines sriques de patients diabtiques (Hayase,
1989). Les CML et la pentosidine sont dailleurs utiliss comme marqueurs cliniques de la
formation de produits de glycoxydation in vivo (Lyons, 1993).
38

De plus, des produits dAmadori peuvent galement tre obtenus par la glycation des

rsidus arginine et aboutissent notamment la N -carboxymthylarginine (CMA) (Yu, 1997).

Ces produits doxydation terminaux, ne sont plus modifis mais augmentent au cours dun
diabte sucr et sont les marqueurs dune hyperglycmie durable et mal contrle chez les
patients diabtiques. Enfin, plus rcemment, a t t identifie une nouvelle classe dAGEs
intracellulaires rsultant de la modification des groupements sulphydryle des protines
(cystine) (Thorpe, 2003). En effet, compar lamine, le groupement thiol de la cystine est
un nuclophile puissant et celui-ci ragit rapidement sur des composs dicarbonyls tels que
le glyoxal ou mthylglyoxal pour donner respectivement le S-carboxymthycystine (CMC)
et le S-carboxythylcystine (CEC) (Zeng, 2005). La concentration de CMC est dailleurs
comparable celle du CML au niveau des protines intracellulaires des cellules musculaires
et augmente de faon identique chez des patients diabtiques (Alt, 2004).

c) Toxicit des produits avancs de glycation

i) Interaction des AGEs avec leur environnement

Les consquences fonctionnelles de la glycoxydation sur les protines sont


nombreuses. Elles touchent prfrentiellement les protines directement exposes au glucose
sanguin ou dure de vie longue, comme certaines protines circulantes et les protines de la
matrice extracellulaire. Concernant les protines circulantes, la glycoxydation touche
principalement lhmoglobine, les immunoglobulines, linsuline et lalbumine.

La glycoxydation de lhmoglobine augmente la viscosit sanguine et inhibe le


relargage de loxygne (McDonald, 1979). Elle altre galement la liaison de molcules de
rgulation comme lhparine sur lantithrombine III. Pour cette dernire, la glycoxydation
compromet son activit et induit un accroissement des phnomnes de thrombose (Brownlee,
1984). Les immunoglobulines comme les IgG et les IgM sont galement impliques puisque
la glycoxydation affecte leur activit et les diabtiques sont ainsi plus sujets linfection
(Cheta, 1991; Danze, 1987). De mme les fonctions de transport du cholestrol et
dlimination des triglycrides par les HDLs et VLDLs sont altres lorsque ces lipoprotines
sont glycoxydes au cours dun diabte (Duell, 1991). Par ailleurs, les cellules sanguines sont
39

galement touches par les phnomnes de glycation que cela soit les plaquettes
(thrombocytes) ou les rythrocytes. Par exemple, La formation dAGEs la surface des
hmaties semble induire une diminution de llasticit et de la fluidit de leur membrane
(Bryszewska, 1988).

Enfin, il est maintenant reconnu que linsuline, mdiateur de lafflux de glucose dans
la plupart des tissus, peut tre galement glycoxyde au niveau des cellules pancratiques en
condition dhyperglycmie (McKillop, 2002). De nombreux travaux ont montr la diminution
de la capacit de linsuline glyque maintenir lhomostasie du glucose, stimuler la
lipogense et la captation du glucose au niveau du tissu adipeux (Boyd, 2000; Lindsay,
2003). De ce fait, linsuline glyque contribue en partie linsulino-rsistance dans le diabte
de type 2 (Hunter, 2003).

Au niveau de la matrice extracellulaire, les protines sont facilement sujettes la


glycation de par leur faible taux de renouvellement. Elle affecte notamment la victonectine,
le collagne IV et la laminine en altrant leur capacit se polymriser et ainsi organiser
entre eux le rseau tridimensionnel de la membrane basale (Charonis, 1990). Llasticit du
collagne est de ce fait abaisse, ce qui entrane une rigidit structurale au niveau artriel. De
plus, la glycation de la laminine au niveau dune squence riche en lysine a un effet dltre
sur le processus de rgnration neuronale (Federoff, 1993).

Les AGEs issus des protines de la matrice extracellulaire sont moins sensibles la
protolyse, ce qui contribue lallongement de leur dure de vie et dans le cas du collagne
lirrversibilit de lpaississement de la membrane basale observe dans le cas des
micro-angiopathies. Dans le cas du fibrinogne, les AGEs induisent une rsistance relative de
la fibrine la fibrinolyse, favorisant ainsi les dpts vasculaires de la fibrine et pouvant crer
une situation prothrombogne (Juhan-Vague, 1989).

Enfin, la glycation peut galement affecter les activits enzymatiques des protines par
des altrations lies la prsence de rsidus lysine au voisinage dun site actif ou par des
modifications conformationnelles lies la rticulation de protines modifies. Dautre part,
les AGEs forms par glycosylation non enzymatique jouent un rle important dans la
conversion de la protine prion cellulaire (PrPc) en protine prion scrapie (PrPsc)
responsable des encphalopathies dont la plus connue est la maladie dite de la vache folle
40

(ESB) (Choi, 2004). Les sites catalytiques denzymes se retrouvent altrs, de mme que les
pitopes dantignes. Aussi, la glycoxydation ne sarrte pas la modification des rsidus
lysine et arginine. Ce processus, impliquant les espces ractives de loxygne, peut propager
les dommages de la protine au-del de ces rsidus et peut notamment affecter dautres acides
amins fortement impliqus dans les activits enzymatiques. Cest le cas du tryptophane,
rsidu le plus sensible au dommage oxydatif (Halliwell, 1999), qui joue un rle cl dans
lactivit enzymatique du lysozyme (Chetyrkin, 2008) .

En rsum, laugmentation du taux dAGE au sein de lorganisme est lorigine de


nombreux dsordres mtaboliques, en agissant directement au niveau des protines circulantes
ou de la matrice extracellulaire. Ils peuvent galement causer de multiples dommages en
agissant indirectement par le biais de rcepteurs, ou en induisant une auto-immunit morbide.

ii) Les AGEs et les rcepteurs cellulaires

Les produits avancs de glycoxydation extracellulaire peuvent galement agir au


niveau cellulaire en se liant des rcepteurs membranaires et induire des rponses cellulaires
trs diverses et appropries. Plusieurs rcepteurs aux AGEs, impliqus dans lactivation
cellulaire ont t caractriss : le macrophage scavanger receptor class A ou rcepteur
MSR-A (Horiuchi, 1996), le rcepteur CD36 de la famille des MRS-B qui fait galement
office de rcepteur pour les LDLs oxydes (Ohgami, 2001; Ohgami, 2002) et qui participe
llimination des AGEs, une protine proche de lenzyme oligosaccharyltransfrase-48 (OST48 ou AGE-R1), un autre rcepteur proche dun substrat de la protine kinase C (80K-H ou
AGE-R2)(Li, 1996). La galectine-3, une protine prsentant un motif de reconnaissance des
sucres fortement conserv en partie C-terminale se comporte galement comme un rcepteur
aux AGEs (Pricci, 2000).

Le rcepteur des AGEs le mieux dcrit actuellement est le RAGE. Il sagit dune
molcule denviron 50 KD qui appartient la super famille des immunoglobulines (Neeper,
1992) et qui est prsent sur de nombreux types cellulaires : monocytes, macrophages, cellules
musculaires lisses, cellules msangiales et cellules nerveuses (Chappey, 1997). Si le RAGE
fixe de faon prfrentielle les AGEs, d'autres molcules comme l'amphotrine ou la

41

substance -amylode, dans le cas de la maladie dAlzheimer sont capables de se lier au


RAGE (Yan, 1996).

La liaison des AGEs au RAGE initie une srie de signaux cellulaires en cascade
(Figure 12), dbutant par la formation despces ractives de loxygne ou ROS, induisant
ainsi un stress oxydatif (Wautier, 1996). Ce stress saccompagne de signaux cellulaires
impliquant lactivation de la p21ras et des MAP-kinases (Lander, 1997), ainsi que du facteur
de transcription NF-B (Yan, 1994) qui permet lactivation de diffrents gnes impliqus
dans linflammation comme les cytokines pro-inflammatoires (Il-1a, IL-6 et TNF-a), ou
impliqus dans ladhsion cellulaire (VCAM-1), la vasoconstriction (endothline-1) ou la
coagulation (thrombomoduline).

Figure 12 : Effets induits par la liaison des AGEs au rcepteur RAGE

A contrario, les phnomnes de glycoxydation sont responsables de dfauts de


reconnaissance des protines mdiatrices modifies engages dans la signalisation cellulaire
ou lendocytose. La glycoxydation des LDL, par exemple, rduit leur captation par leurs
rcepteurs normaux comme les rcepteurs B/E.
42

Tous

ces

vnements,

altrant

les

proprits

cellulaires,

prdisposent

au

dveloppement de complications au niveau vasculaire et inflammatoire du diabte. Par


exemple, les malaises cardiaques conscutifs des dysfonctionnements vasculaire ainsi que
myocardique, trouvent leurs origines dans linteraction des AGEs avec le RAGE (Hartog,
2007). De faon similaire, le complexe AGE-RAGE induit, par scrtion de facteurs comme
MCP-1 ou TNF-, une diminution de la sensibilit linsuline au niveau adipocytaire
(Unoki, 2007).

iii) Les AGEs et lauto-immunit

Toutes les protines ont un potentiel immunogne, c'est--dire quelles peuvent


provoquer une rponse auto-immune et cela concerne notamment les protines glycoxydes.
En effet, si cette immunognicit est rduite pour les produits dAmadori, elle semble au
contraire accrue pour les produits terminaux de glycation, ce qui laisse supposer que les AGEs
prsents in vivo peuvent dclencher une rponse auto-immune (Virella, 2003).

Des auto-

anticorps dirigs contre des AGEs dalbumine et dIgG ont pu tre mis en vidence dans des
srums provenant aussi bien de patients diabtiques que de sujets sains (Turk, 2001; Vay,
2000). Le niveau des anticorps anti-AGE, disotypes IgA et IgM, se rvle, en effet, lev
chez des patients diabtiques atteints darthrite rhumatode (Newkirk, 1998). Ces anticorps
peuvent se combiner avec les AGEs circulants et former ainsi des complexes immunitaires
(AGE-IC) susceptibles dtre impliqus dans les processus dathrognse. Cest le cas
notamment des AGEs de lipoprotine (AGE-LDL), dont les proprits immunognes
contribuent, par le biais des complexes LDL-IC, au dveloppement de lathrosclrose
cardiovasculaire (Kiener, 1995; Steinbrecher, 1984).

iiii) La glycoxydation : un mcanisme qui sauto entretient


Les phnomnes de glycation peuvent tre assimils au 1er tage dune fuse menant
de faon irrversible une cascade de ractions aboutissant plus ou moins directement de
nombreuses pathologies et complications mtaboliques (Figure 13). En effet, partir de la
formation des AGEs, dcoule une srie de processus dltres, dtaills auparavant, tels que
linflammation par le biais des rcepteurs, loxydation, des modifications conformationnelles
aboutissant des accumulations dagrgats ou bien une rponse immunitaire lie
43

limmunognicit des AGEs. Ces diffrents processus vont non seulement contribuer aux
dveloppements de pathologies diverses, mais aussi aggraver certains processus
physiologiques. En effet, la rponse inflammatoire des AGEs via les rcepteurs RAGE peut
tre lorigine du stress oxydant qui, lui-mme, va favoriser la formation dAGEs.

De mme ces AGEs, qui sont dans la plupart des cas la consquence dune
hyperglycmie, vont non seulement directement favoriser un stress oxydant et une rponse
inflammatoire, mais galement indirectement renforcer une insulino-rsistance ou inhiber une
insulino-scrtion et ainsi aggraver lhyperglycmie dorigine. Ainsi, avec les AGEs dbute
une sorte de cercle vicieux o les diffrents processus altratifs vont sentretenir et
saggraver avec le temps, dbouchant sur des complications chroniques.

Figure 13 : La glycation, 1ere tape de la fuse des complications mtaboliques

44

iiiii) Les AGEs et les complications mtaboliques

A cause de leur forte ractivit directe ou indirecte par le biais de rcepteurs cellulaires
spcifiques, les AGEs se retrouvent impliqus dans le dveloppement de nombreuses
complications (Figure 14). Une formation accrue de ces AGEs a t mise en vidence au
niveau sanguin et tissulaire de diabtiques, mais galement dans de nombreux cas
physiopathologiques comme lathrosclrose, la maladie dAlzheimer, les maladies rnales en
phase terminale, larthrite rhumatode et la cirrhose du foie (Sebekova, 2002; Sebekova,
2001) (Tableau 1).

Tableau 1 : Prsence des AGEs dans le srum et tissus dans diffrentes


pathologies (Jakus, 2004)
Ces AGEs peuvent induire des phnomnes dathrosclrose, de thrombose, de
fibrose, de vasoconstriction sans oublier un stress oxydatif accru aboutissant au
dysfonctionnement de fonctions primordiales comme les reins, le cur, la vue. Par exemple,
un lien troit est tabli entre la formation des produits avancs de glycation dans la matrice
extracellulaire et le dveloppement des complications chroniques du diabte sucr
(Brownlee, 1988).

En effet, les AGEs saccumulent chez les patients diabtiques dans les diffrents
tissus. Cest le cas du CML et de la pentosidine saccumulant au niveau des capillaires des
glomrules du rein, avec pour consquence des micro-angiopathies lorigine de
nphropathies (Makita, 1991). Cette micro-angiopathie affecte galement les capillaires au
45

niveau de la rtine. Les AGEs issus des protines de la matrice extracellulaire ont ainsi un rle
dcisif dans le dveloppement des rtinopathies (Lu, 1998). Par ailleurs, les protines
vasculaires glycoxydes comme les lipoprotines sont impliques dans la production de
molcules dadhsion au niveau des cellules endothliales interagissant avec les facteurs de
coagulation, les plaquettes et les leucocytes et contribuant ainsi au dveloppement de
macro-angiopathie dbouchant sur lathrosclrose (MacDonald, 1992). Enfin, une
accumulation excessive dAGEs, particulirement de CML, a t constate au niveau du
systme nerveux priphrique chez les diabtiques atteints de neuropathie dgnrative
dmylinisante (Vlassara, 1981). Toutefois il na pas t tabli une corrlation entre ce dpt
dAGEs et laltration de la gaine de myline des cellules du systme nerveux (Sugimoto,
1997).
Des tudes ont mis en vidence une forte prdisposition des patients diabtiques pour
la maladie dAlzheimer (Arvanitakis, 2004; Kalaria, 2009; Leibson, 1997). Le lien troit
entre ces deux pathologies sexplique dune part, par le rle protecteur jou par linsuline
crbral dans la rgnration neuronale et dans le bon fonctionnement des fonctions
cognitives. Le mcanisme de neurodgnrescence tant associ une insulinoresistance ou
une dficience en insuline lie au diabte, la maladie dAlzheimer est dsormais qualifie de
diabte de type 3 (Moroz, 2008; Steen, 2005). Dautre part, la contribution des AGEs
dans cette maladie neurodgnrative est galement mise en avant. Certaines similitudes
associent cette maladie neurodgnrative et les surcharges glucidiques de patients

diabtiques au travers de la glycation des protines, et particulirement de la substance amylode (Colaco, 1996; Munch, 1997). Les AGEs faciliteraient, en effet, lagrgation des
peptides -amylodes ainsi que lallongement de leur dure de vie dans la pathologie
Alzheimer (Vitek, 1994).

La prsence et les effets dltres des AGEs ont galement t rpertoris chez des
sujets non diabtiques. En effet la pentosidine, lun des types dAGE, a t identifie in vivo
aussi bien chez des patients hmodialyss (Odetti, 1992), que chez des personnes ges
sujettes la cataracte (Nagaraj, 1991), ou bien au niveau des plaques sniles du cortex
crbral des patients Alzheimer (Smith, 1994). De plus, il a t mis en vidence un niveau
plus lev de fructosamine, chez des patients sujets au syndrome dapne du sommeil (Faure,
2008a). Enfin, le phnomne de glycoxydation, en particulier au niveau du collagne,
contribue de faon importante la progression des mcanismes du vieillissement (Reiser,
1998).
46

Figure 14 : Les AGEs sources de nombreuses complications mtaboliques (Hartog, 2007)

47

Les rles dltres des AGEs en particulier, et du stress oxydant en gnral sont avrs
dans de multiples pathologies, que cela soient des maladies mtaboliques, neurodgnratives
ou cancreuses. Les thrapies font de plus en plus souvent appel aux antioxydants pour
renforcer lefficacit des traitements. Par ailleurs, ces altrations de type oxydatif touchent de
nombreuses protines, parmi lesquelles les protines circulantes exposes aux altrations et en
contact avec de nombreuses cibles biologiques. Lalbumine reprsente la plus abondante
parmi celles-ci. De plus elle est rpute tre continuellement soumise au stress oxydant
(Soriani, 1994) et savre galement possder des proprits antioxydantes.

48

III LALBUMINE : UNE PROTEINE SENSIBLE

Lalbumine est sans doute lune des premires protines dcouvertes, puisque ses proprits
physiologiques ont t reconnues lpoque dHippocrate vers lan + 400 (Hippocrate,
1978). Cest probablement la protine la plus tudie, dans la mesure o ses multiples
fonctions ont intress des gnrations de biologistes, biochimistes, chimistes, physiciens et
pharmacologistes depuis plus de 150 ans, commencer par C. Denis qui fut le premier
isoler cette protine par dialyse en 1840 (Denis, 1859). Cest la protine soluble la plus
abondante chez les vertbrs et la plus importante dans le plasma avec une concentration se
situant entre 35 et 50 g/L (Rothschild, 1988).

1. Structure
La structure de lalbumine permet dexpliquer ses fonctions multiples et son rle dans
lorganisme, qui seront dtaills ultrieurement. Cette structure est identique chez tous les
individus de lespce humaine mais prsente des diffrences de squence avec celles des
autres espces animales. Ainsi, la srum albumine bovine (SAB) et humaine (SAH) ont une
troite homologie dans la squence polypeptidique ainsi que dans leur structure.

La structure primaire consiste en une chane polypeptidique de 585 et 583 acides


amins respectivement pour la SAH et la SAB. Les seules diffrences rsident dans la
substitution de plusieurs rsidus ayant cependant des proprits hydrophobes identiques
naffectant en rien la structure tridimensionnelle de la protine (Carter, 1994). Parmi leurs 35
rsidus cystine, un seul dentre eux (Cys34) se trouve ltat rduit et nest donc pas
impliqu dans ldification de liaisons disulfures.

La structure, constitue de 3 domaines homologues diviss en 9 boucles (sousdomaine) dont la stabilit est assure par les 17 ponts disulfures, confre la protine une

certaine flexibilit (Figure 15). La forme hlicodale (hlice ) reprsente 67% de la structure
secondaire, tandis que la forme en feuillet est totalement absente ltat natif.

49

Figure 15 : Structure tridimensionelle de lalbumine avec ses 3 domaines et ses ponts


disulfures

Les 17 ponts disulfures qui assurent la stabilit de la structure tertiaire de la protine


temprature ambiante et pH neutre, nempchent pas des modifications significatives de
taille et de forme en fonction de la variation de ces deux paramtres physiques (Carter, 1994;
Foster, 1977). Par exemple, la SAB prsente des changements de conformation spatiale
(isomrisation) en fonction du pH, qui peuvent tre attribus des ruptures dinteractions de
type ionique suite au changement de pH (Figure 16). En particulier, un pH de 4,5 marque une
transition entre la forme native (N) de la protine et la forme fast (F) pour laquelle une
diminution des structures en hlice est observe (Carter, 1994). Avec la diminution du pH, la
structure est de plus en plus tire.

Comme la plupart des protines globulaires, lalbumine prsente une tendance


sagrger sous forme de complexes macromolculaires lorsque la protine est soumise une
augmentation de temprature (Barone, 1992). Lagrgation thermique de la SAB se
caractrise par des changements conformationnels de sa forme native constitue
50

majoritairement par des hlices vers une structure enrichie en feuillet . Ces changements
peuvent tre moduls par la concentration de la protine, la valeur du pH, la temprature et le
temps du traitement thermique (Giancola, 1997; Militello, 2004), mais galement par la
prsence ou labsence de mtaux de transition tel que le cuivre (Cu2+) ou le Zinc (Zn2+)
(Navarra, 2007). Par exemple, la dnaturation de la SAB par traitement 80C est rversible
quelque soit le pH, tandis que les modifications sont irrversibles lorsque la protine est
traite de faon durable 60C (Barone, 1992; Gelamo, 2000). De plus, de nombreux
travaux ont pu mettre en avant limplication du seul rsidu cystine libre (Cys34) dans le
processus dagrgation thermique (Militello, 2003; Peters, 1985). En effet, le blocage de ce
rsidu avec de liodoactamide, ou du glutathion empche la formation de liaisons
intermolculaires et ainsi la formation dagrgats.

Figure 16 : Diffrents isomres conformationnels de la SAB en fonction du pH (Navarra,


2008)

Comme la plupart des protines du plasma, lalbumine possde un pH isolectrique


(pHi) trs acide, dont la valeur est variable en fonction de la nature des molcules qui sont
fixes. Il varie de 4,8 lorsque elle est associe aux acides gras, 5,28 lorsquelle est lie des
substances non lipidiques (Lefvre, 1996). Son pHi tant infrieur au pH du plasma cette
protine se comporte in vivo comme un anion. Contrairement aux autres protines du plasma
(immunoglobulines, transferrine, fibrinogne), lalbumine prsente la plus faible masse
molculaire autour de 66 438 Da et 66 411 Da pour respectivement la SAB et la
SAH (Brown, 1975; Meloun, 1975).

51

2. Fonction : formation, distribution et rles


Des travaux sur foies de rats isols et perfuss ont dmontr que la biosynthse de
lalbumine a lieu exclusivement au niveau du foie (Miller, 1951; Peters, 1950). Dautres
tudes, utilisant des techniques dimmunocytochimie, ont montr que tous les hpatocytes
synthtisaient lalbumine. (Brands, 1983; LeBouton, 1980a; LeBouton, 1980b).

Chez lhomme, lalbumine a une demi-vie voisine de 3 semaines (Brodersen, 1980;


Waldmann, 1977). La synthse journalire stablit 120 mg.kg-1 soit 8 10 g pour un
adulte de 70 kg. Cette production correspond un renouvellement quotidien de 4 6 % de la
protine. La quasi-totalit de lalbumine synthtise (99,9 %) va directement dans le plasma
sanguin o elle effectue environ 15 000 passages dans le systme circulatoire entre sa
synthse et sa dgradation. Limportance confre cette protine est particulirement due
la multitude de rles bnfiques : au niveau circulatoire, au niveau du transport dun large
ventail de mtabolites qui lui a donn la rputation de tramp steamer du systme
circulatoire (Peters, 1996), ainsi quau niveau de son rle protecteur.

a) Rles circulatoires

Lalbumine, qui reprsente 60% en masse de toutes les protines plasmatiques, est
responsable 80% du maintien de la pression oncotique (25-33 mm Hg). Cette pression
empche l'eau de sortir des vaisseaux sanguins. Elle y contribue de faon disproportionne,
cause de sa faible masse molculaire (67 kDa) par rapport aux globulines du plasma dont la
masse molculaire moyenne est autour de 170 kDa (Scatchard, 1944), mais galement
cause de son faible point isolectrique (pI = 4,7) qui confre la protine une charge nette
ngative pH 7.4 (pH sanguin) contribuant ainsi lquilibre de Donnan (Figge, 1991).
Lalbumine est indispensable pour la bonne rpartition des liquides entre les vaisseaux
sanguins et les tissus ou le milieu interstitiel. En effet une diminution du taux d'albumine dans
le sang (hypoalbuminmie) est problmatique: la pression oncotique est abaisse, l'eau quitte
alors les vaisseaux pour gagner les tissus provoquant ainsi des oedmes. Cest le cas chez les
enfants atteints par la maladie de kwashiorkor affectant principalement les rgions pauvres
dAfrique o les enfants sont victimes de malnutrition (Waterlow, 1984; Williams, 1958).

52

b) Le transporteur
La deuxime grande fonction de lalbumine est lie ses capacits de transport et de fixation
de petites molcules de tout type (Waldmann, 1977; Wood, 1986). Cette forte aptitude qui
permet de comparer cette protine une ponge , sexplique essentiellement par la
flexibilit de sa structure qui sadapte volontiers aux diffrents ligands. Lalbumine interagit
avec un large spectre de composs dont la liste est dtaille dans le tableau 2. La protine
transporte notamment des molcules endognes telles que les acides gras (AG), des ions
mtalliques (Ca2+, Cu2+), des hormones thyrodiennes (Thyroxine ou T4) et strodes, mais
galement des acides amins tels que le tryptophane et la cystine (Figure 17).

Composs

Composs

Hormones / Stroides

Acide gras libre


Cortisol

Acides biliaires

Progestrone

Hmatine

Testostrone

Bilirubine

Aldostrone

Drogues

L-Thyroxine

Wafarine

Vitamine D

Digitoxine

Ions

Diazepan
Cuivre (II)
Ibuprofene
Zinc(II)
Indomethacin
Calcium
Acides amins
Magnsium

L-Tryptophane

Chlorure

L-Cystine

Tableau 2 : lalbumine : le routier de lorganisme

Elle assure galement le retour des sels biliaires particulirement hydrophobes entre
lintestin grle et le foie. Cest ainsi le cas de la bilirubine forme dans la rate et achemine
vers le foie par le biais de lalbumine. Les principales routes de transport des diffrents
53

mtabolites par lalbumine sont galement dcrites (Figure 17). Cette protine vhicule
galement des substances exognes, en particulier des mdicaments par lintermdiaire de 4
sites de fixation sur lesquels les diffrents ligands peuvent se concurrencer en modifiant
laccessibilit de ces sites par changement conformationnel de la structure tertiaire de la
protine.

Figure 17 : Les voies de transport des mtabolites par lalbumine (Peters, 1978)

De faon gnrale, lalbumine sert tout dabord, transporter ces diffrents composs
peu ou pas hydrosolubles, ensuite les protger dun catabolisme excessif et ainsi constituer
des formes de rserves circulantes, inactives tant que les substances sont lies, mais
immdiatement utilisables ds que dtaches de lalbumine (Lefvre, 1996).

54

c) Le protecteur

Par ses capacits de fixation et de transport, lalbumine se prsente comme un


neutralisateur de substances toxiques. De nombreuses toxines exognes sont squestres
par la protine et rendues inoffensives pour lorganisme. Cest le cas du benzne qui forme un
thiother, le S-phnylcystine, avec le seul rsidu cystine rduit (Cys34) (Bechtold, 1992).
Mais galement laflatoxin G1, un carcinogne largement rpandu qui est directement pris en
charge par la protine pour tre dtruit au niveau du foie (Ewaskiewicz, 1991). De manire
similaire, lalbumine prend en charge la bilirubine, produit de dgradation de lhmoglobine,
qui sous forme libre peut devenir fortement toxique. Mais la protine assure son transport
jusquau foie o elle va tre conjugue lacide glucoronique et ainsi tre inoffensive. Enfin,
de nombreuses drogues vises thrapeutiques sont squestres par lalbumine afin de
contrler la fois leur libration et leur concentration et faire ainsi office de rservoir pour
une action durable.

d) Les proprits antioxydantes

Parmi les proprits bnfiques de lalbumine, il nous est apparu important de nous
focaliser sur les capacits antioxydantes de la protine dans la mesure o ce sont ces
proprits particulires qui sont mis en exergue dans le cadre de la pathologie diabtique.
Lalbumine reprsente lantioxydant majoritaire du plasma, un compartiment du corps
fortement sollicit par le stress oxydatif. La plupart de ses proprits antioxydantes est
attribue sa capacit de fixation de nombreux ligands, par ladaptabilit de sa structure. De
plus le seul groupement thiol libre au niveau du rsidu Cys34 de lalbumine (Peters, 1985),
lui confre des capacits supplmentaires de fixation (Kashiba-Iwatsuki, 1997) et la
possibilit de piger des radicaux libres (Gutteridge, 1986).

i) Fixation de ligands
Parmi les ligands de type cationique, les mtaux de transition tels que le cuivre (Cu2+)
et le fer (Fe2+) mritent une attention particulire dans la mesure o ils participent la
formation de radicaux peroxydes qui ont des effets dltres dans lorganisme. En effet les
ions (Cu2+) et (Fe2+) peuvent ragir avec le peroxyde dhydrogne (H2O2) selon la raction de

55

Fenton qui en prsence de composs organiques (R-H) gnre des ROS selon les ractions
suivantes :
Fe2+ + H2O2
R-H + OH
O2

+ R

Fe(OH)2+

+ OH

H2O + R
ROO

Mme si les ions (Fe2+) sont une concentration physiologique plus importante, les
ions (Cu2+) ragissent plus rapidement (60 fois) avec H2O2 pour former des radicaux
hydroxyle (OH) (Halliwell, 1990).

Fixs lalbumine, ces ions mtalliques sont moins susceptibles de participer la


raction de Fenton et ainsi gnrer des radicaux oxygns. En effet, la protine est capable de
neutraliser les radicaux hydroxyles (OH) produits par cette raction (Halliwell, 1988). Le
radical OH est une espce trs ractive, de courte demi vie et avec un faible rayon daction,
mais capable doxyder les protines, lADN ainsi que les lipides.

Dans le plasma, ces mtaux sont galement fixs par dautres protines comme la
transferrine, la lactoferrine pour le fer et la cruplasmine pour le cuivre et le fer. Mais une
grande partie de ces mtaux est lie lalbumine, notamment dans le cas de la maladie du
mtabolisme du fer comme lhmochromatose ou la thalassmie conduisant une surcharge
en fer (Walter, 2006).

Certaines albumines comme la SAH et la SAB contiennent un site spcifique de forte


affinit pour le Cu (II) endogne (Laussac, 1984; Sadler, 1994), ainsi que pour le Nickel
Ni (II) (Figure 18). Les 4 premiers acides amins de la partie N-terminale de la protine, AspAla-His-Lys (DAHK) forment ce site de liaison (Figure 18). De nombreux travaux ont
dailleurs mis en avant limportance de ce site (DAHK) dans la prvention de la formation de
radicaux hydroxyles induite par le cuivre (Bar-Or, 2001a; Bar-Or, 2001b; Gum, 2004). En
effet, parmi ces tudes, Bar-Or a montr que des polypeptides ayant la partie N-terminale
analogue la SAH (DAHK), ont galement la capacit de squestrer le Cu (II) et dempcher
ainsi la formation de ROS ou bien la coupure oxydante de lADN double brin.

Il faut noter que certaines tudes ont montr le rle chlateur de mtal des rsidus
mthionine. En effet, le blocage de ces rsidus par du N-ethylmaleimide (NEM) ou par de la
56

chloramine T induisent une diminution des proprits protectrices de lalbumine et de sa


capacit de fixation des ions cuivre (Bourdon, 2005). Pour dautres albumines (porc, chien,
poulet), la substitution, dans le site DAHK, de lhistidine His3 par une tyrosine empche la
fixation de ces mtaux sur ce site terminal (Appleton, 1971; Predki, 1992).

Un second site de fixation du Cu (II) a t caractris dans la forme bovine et humaine


de lalbumine, et a t localis dans la rgion de contact entre les domaines I et II de la
protine (Sadler, 1996). Ce second site nest pas spcifique au Cu (II) puisque de nombreux
mtaux comme Ni (II), Zn (II) ou Cd (II) peuvent sy lier avec des affinits comparables (Bal,
1998).

(DAHK)

Figure 18 : Principaux sites de lalbumine impliqus dans son activit antioxydante


(Roche, 2008)

57

Dautres aspects de lactivit antioxydante de lalbumine proviennent de la capacit de


la protine fixer de nombreuses molcules dont des antioxydants. Cela concerne notamment
la bilirubine, connue pour ses proprits toxiques, et qui nen est pas moins un puissant
antioxydant qui combat les radicaux libres susceptibles d'infliger des dommages majeurs aux
cellules (Sedlak, 2004). Ce pigment rouge est li la protine au niveau du rsidu Lys240
(Figure 18) (Jacobsen, 1978) et protge la fois contre laltration de l-tocopherol induit
par les radicaux peroxydes et contre la peroxydation lipidique des LDL (Neuzil, 1994).
Concernant la peroxydation lipidique, celle-ci peut tre initie par un systme comprenant des
radicaux superoxydes en prsence de fer chlat. Lalbumine bovine inhibe cette
peroxydation au niveau des membranes des liposomes phosphatidycholine en empchant
linteraction entre le fer chlat avec la membrane (Fukuzawa, 2005).

Parmi les lipides, les acides gras polyinsaturs (AGPI) constituent une importante
partie des composs biologiques oxydables du plasma. Ces AGPI sont des graisses
protectrices contre les maladies cardio-vasculaires qui favorisent la baisse du taux de
cholestrol port par les lipoprotines de basse densit (LDL). Lalbumine possde trois
principaux sites de forte affinit pour ces acides gras au niveau des rsidus Lys351, Lys475 et
Arg117 dans les poches hydrophobes (Figure 18) (Peters, 1996). Il apparat que les AGPI
lis lalbumine peuvent tre protgs de la peroxydation lipidique par la proximit
dantioxydants (bilirubine) galement fixs la protine (Quinlan, 2005).

La protine plasmatique a galement la capacit de se lier lhomocystine, un acide


amin soufr rsultant du catabolisme de la mthionine. Un niveau important dhomocystine
dans le plasma sanguin contribue un stress oxydatif au niveau des tissus avec la formation
de ROS fortement impliqus dans le dveloppement de lathrosclrose. Le pigeage de
lhomocystine par lalbumine permet dattnuer ces phnomnes dltres (Papatheodorou,
2007).

ii) Cys34, pigeur de radicaux libres

Chez un adulte normal, environ 70-80 % du rsidu Cys34 de lalbumine est ltat
rduit (S-H), le reste est sous forme de liaison disulfure (S-S) avec plusieurs composs soufrs
comme la cystine, lhomocystine et le glutathion (Oettl, 2007). Le groupement SH de
lalbumine reprsente un site de protection antioxydant, contre les radicaux libres hydroxyles
58

OH (Gutteridge, 1986) et contre des agents oxydants et nitrants puissants comme le


peroxynitrite NO3- et loxyde nitrique NO (Pacher, 2007). En effet loxydation du rsidu
Cys34 (RSH) par le radical hydroxyle ou par le peroxynitrite entrane la formation dacide
sulfnique (RSOH) qui reprsente le principal intermdiaire dans la modulation du statut
redox (Carballal, 2003; Turell, 2008). Ce dernier est notamment impliqu dans la formation
de disulfide (RSSR), attestant du rle rgulateur du rsidu Cys34 de lalbumine humaine dans
le compartiment extracellulaire (Carballal, 2007). Dautre part, de nombreux travaux ont pu
montrer que la prsence dun seul groupement thiol permet la protection totale de lalbumine
contre les radicaux peroxyles (ROO) et empche la formation dhydroperoxyde au niveau de
la protine (Platt, 2003).

iii) Lalbumine, lponge oxydants

Lalbumine humaine possde six rsidus mthionine (Figure 18), particulirement


sensibles loxydation et entranant la formation de mthionine sulfoxide en prsence dune
grande varit doxydants (Berlett, 1997). Il a t observ que loxydation prfrentielle des
rsidus mthionine (Met) chez des enzymes, comme la glutamine synthtase, naffecte en rien
leur fonction biologique. A partir de ces rsultats, Levine et al proposent que les rsidus Met
des systmes biologiques, soumis des cycles de rduction et doxydation, peuvent servir de
systme de neutralisation des ROS (Levine, 1999; Levine, 2000). Au niveau de lalbumine,
les rsidus Met peuvent servir dponge oxydants et protgent ainsi la protine de
modifications plus importantes.

Lacide hypochloreux (HOCl) est un puissant oxydant qui peut inactiver plusieurs
cibles biologiques et prfrentiellement l-antiprotease qui rgule lactivit lastase
pancratique. Lalbumine peut piger lacide hypochloreux et ainsi empcher compltement
linactivation de l-antiprotease (Halliwell, 1988).
A travers des tudes in vivo et in vitro, la protine plasmatique aurait galement
dautres potentialits comme la capacit de se lier des cellules et induire un changement
phnotypique (Trigatti, 1995). Lalbumine joue ainsi un rle important dans la captation
cellulaire des acides gras longue chane (Stremmel, 2001; Trigatti, 1995), mais inhibe
galement la diffrentiation adipocytaire sans en affecter la prolifration (Schlesinger, 2006).
59

De plus, elle contribue au niveau de ces modles cellulaires in vitro (3T3-L1, pradipocyte)
la production de cytokines proinflammatoires mais galement in vivo au niveau des cellules
rnales (Tang, 2003).

3. Altration des proprits antioxydantes


a) Au niveau fonctionnel

Toutes les proprits bnfiques de lalbumine sont troitement lies la structure de


la molcule, que cela soit au niveau de la rgulation de la pression oncotique, le transport de
molcules endognes ou exognes et surtout ses capacits antioxydantes. Cependant ces
altrations et la modification de ses proprits biologiques qui en dcoulent peuvent tre
considres comme biologiquement insignifiantes cause de limportante quantit de
cette protine dans le plasma. De plus, les protines altres sont rapidement dgrades par les
systmes protolytiques et aussitt remplaces (Davies, 1986). Dailleurs, dans le cas de
lalbumine humaine (SAH) du plasma sanguin, les gammes de concentrations en fructosamine
et AGE sont respectivement de 6-15 % et 1-7% (Day, 1979). Pourtant, de nombreux travaux
ont mis en avant que le statut antioxydant de lalbumine altre est associ des conditions
pathologiques particulires. En effet, du fait de sa longue dure de vie (> 20 jours) et par ses
nombreux passages dans le systme circulatoire (15 000), la protine peut subir des
dommages importants qui peuvent affecter notamment ses proprits antioxydantes (Peters,
1985).

De nombreuses tudes in vitro et in vivo ont en effet montr que les phnomnes de
glycoxydation affectent de faon significative les proprits antioxydantes de lalbumine.
Dans les tudes in vivo effectues sur la srum albumine, il a t montr que la capacit de
fixation du fer par la protine est fortement diminue dans le cas de patients diabtiques (Van
Campenhout, 2006). De mme, une diminution sensible des groupements thiol libres a t
observe en comparaison avec lalbumine de personnes saines (Faure, 2008b) avec des
modifications proches de celles observes sur des modles dalbumine modifis in vitro
partir de mthylglyoxal (Faure, 2005). Par contre, laltration de la capacit de pigeage des
ions cuivre par lalbumine glycoxyde a t mise en vidence uniquement in vitro (Bourdon,
1999). De plus, cette albumine glycoxyde augmente loxydation des LDL induite par les ions
60

cuivre due la formation probable dions superoxides (O2-) (Sakata, 2002). Dune manire
gnrale, les phnomnes de glycation avance affectent les capacits de fixation et de
pigeage de lalbumine, que cela concerne des ions mtalliques et des radicaux libres, mais
galement le tryptophane, principal acide amin essentiel (Barzegar, 2007). Enfin, la fixation
de molcules, autre que la glycosylation, au niveau de la protine peut galement affecter le
statut redox de lalbumine. En effet, des acides gras lis la protine contribuent non
seulement loxydation de lunique cystine (Cys34), mais aussi la conversion du complexe
Cu-albumine du statut antioxydant au statut prooxydant (Gryzunov, 2003).

b) Au niveau structural

Laltration de ces proprits antioxydantes par la glycoxydation sexplique


principalement par les phnomnes doxydation et les modifications structurales induites par
la glycosylation non enzymatique suivi des rarrangements. Ces modifications multiples, se
traduisent notamment par une diminution de la fluorescence du tryptophane due une
modification conformationnelle de la protine et dun changement dexposition des rsidus
(Bourdon, 1999). Elles entrainent galement une augmentation du brunissement et du taux
doxydation des protines (Stolzing, 2006) qui affecte galement le taux de cystine libre
(Faure, 2005). De mme, ces modifications saccompagnent par une augmentation de la
masse molculaire de la protine en troite corrlation avec le degr de glycosylation
(Schmitt, 2005).

Paralllement, ces modifications structurales saccompagnent de la fixation dune ou


plusieurs units glucose ou drivs sur certains rsidus azots de la protine. De nombreuses
tudes, effectues in vivo chez des patients diabtiques mais galement in vitro, ont dtermin
les diffrents sites de lalbumine humaine (SAH) susceptibles dtre modifis par la
glycosylation non enzymatique. Environ 28 sites ont t rpertoris (Figure 19), parmi
lesquels se trouve 18 rsidus lysine et 8 rsidus arginine. Dans la plupart des travaux, le rsidu
lysine en position 525 (Lys525) apparat comme le principal site de glycation avec environ
33% de la glycosylation totale seffectuant au niveau de ce site (Garlick, 1983). Une
diminution importante de laffinit de certaines macromolcules, comme la bilirubine ou les
acides gras longue chane, pour lalbumine glyque a t observe, suggrant le rle cl de
la Lys525 dans la capacit de fixation de ligands par lalbumine (Shaklai, 1984). Dautres

61

sites lysine ont galement t clairement identifis, mais dune importance moindre comme
Lys199, Lys439 et Lys233 (Iberg, 1986; Kisugi, 2007; Lapolla, 2004; Wa, 2007).

La position de ces sites peut sexpliquer par la nature des acides amins environnants
qui influence la glycosylation non enzymatique en catalysant les ractions de rarrangement
dAmadori (Baynes, 1984; Mori, 1986). En effet il est tabli que la catalyse acido-basique
facilite ces rarrangements et les rsidus chargs positivement comme His ou Lys contribuent
fortement cette catalyse. Par exemple, parmi les principaux sites de glycosylation, Lys525
est adjacent une lysine, de mme Lys439 est situ ct dune histidine, enfin Lys534 se
trouve au niveau dune squence Lys-His-Lys. Dautres sites comme Lys199 ou Lys281 sont
quant eux ct de ponts disulfure, ce qui les rapproche de rsidus chargs positivement
plus loigns dans la squence (Iberg, 1986).

Figure 19 : Les diffrents sites lysine impliqus dans la glycation

Enfin, il apparat que la partie N-terminal est galement un site potentiel de glycation
cause de la prsence du groupe voisin (DAHK) qui est capable de participer aux
62

rarrangements dAmadori. Cette hypothse est dailleurs renforce par le fait que les
complexes Cu (II)-albumine prsent in vivo ne subissent pas de glycosylation (Robb, 1989).

Dans les tudes in vitro, il apparat galement que le taux dalbumine glyque (GA)
est troitement li au nombre de sites de glycation de la protine plasmatique (Kisugi, 2007).
En effet, dans le cas svre dun diabtique non contrl (taux albumine glyque = 94,1 %),
ont t identifis pas moins de 10 sites de glycosylation, tandis quaprs un traitement dun
mois linsuline, ce taux dalbumine glyque chute (19,9 %) et seulement 3 sites de glycation
sont mis en vidence.

Non seulement il a t possible de dterminer quels rsidus sont altrs par la


glycosylation, mais aussi quels types de modification et dAGE se sont forms au niveau de
ces rsidus (Wa, 2007). Par exemple, de nombreux rsidus lysine (Lys12, Lys51, Lys199,
Lys205, Lys439 et Lys538) sont le sige de la formation de fructose-lysine, tandis que la
modification des rsidus Lys159 et Lys286 implique respectivement la formation du pyrraline
et du CML. Enfin, le rsidu Lys378 est modifi en CEL.

Mme si ils sont moins nombreux dans la squence peptidique de lalbumine,


quelques rsidus arginine sont aussi concerns par la glycosylation non enzymatique, parmi
lesquels Arg410 est le sige dune importante modification en hydroimidazolone (Ahmed,
2005b). Dailleurs, contrairement au glucose, la glycation par le mthylglyoxal est dirige
principalement vers les sites arginine et plus particulirement au niveau de Arg410, avec
formation dhydroimidazolone (Figure 20). Le rsidu Arg410 est localis dans lun des
principaux sites de fixation des drogues ( drug-binding site II ), comme le Ktoprofne, un
anti-inflammatoire non strodien (Petitpas, 2001). Ce site est galement associ lactivit
de lenzyme estrase (Watanabe, 2000) plus prcisment au niveau de la Tyr411 (Dirks,
1951). La glycoxydation de lalbumine par le mthylglyoxal inhibe la capacit de fixation du
Ktoprofne ainsi que lactivit estrase (Ahmed, 2005a).

Dautres sites arginine mineurs sont impliqus dans la glycation comme les rsidus
Arg160, Arg472 et Arg428 (Ahmed, 2005b; Wa, 2007).

63

Figure 20 : Les diffrents sites arginine impliqus dans la glycation

La modification des proprits intrinsques de lalbumine, telles que sa structure, ses


nombreuses fonctions bnfiques et son mtabolisme, est mettre sur le compte des
nombreux rsidus lysine et arginine impliqus dans la protine. En effet ils constituent autant
de rsidus chargs positivement qui sont bloqus et donc de ce fait affects par la glycation
(Nakajou, 2003).

Laltration des proprits antioxydantes peut galement sexpliquer par des


changements conformationnels. En effet, dans les changements physiologiques que cela soit
au niveau du pH, de la temprature ou de la prsence dions mtalliques peuvent induire des
changements conformationnels (Murayama, 2004; Okuno, 2006; Qing, 1996). Par ces
modifications de la structure 3D, certains sites ou rsidus, contribuant au pouvoir antioxydant
de lalbumine, peuvent devenir moins fonctionnels.

64

OBJECTIF DU TRAVAIL

65

66

Le syndrome mtabolique, maladie qui reprsente la premire cause de mortalit dans


les pays occidentaux, et les maladies neurodgnratives ont des origines multifactorielles. En
particulier, les altrations de types oxydatifs et conformationnels jouent un rle indniable
dans ces pathologies.

Comme il a t dtaill dans la partie bibliographique, il est maintenant clairement


tabli du rle prpondrant jou par les espces ractives de loxygne dans les processus
dltres de vieillissement cellulaire. Plusieurs tudes mettent en vidence une augmentation
des marqueurs du stress oxydant chez le sujet g, accompagn dune baisse de ses dfenses
antioxydantes. Les ROS participent aux dsordres mtaboliques, dans lesquels loxydation
des protines est principalement responsable des maladies cardiovasculaires, de la baisse des
fonctions immunitaires et des dysfonctionnements crbraux. Par ailleurs, les processus de
glycation et de glycoxydation que lon rencontre principalement dans les pathologies
associes aux diabtes, sont stimuls en partie par les ROS mais contribuent galement
largement au dveloppement du stress oxydant. Ces deux phnomnes sont troitement lis et
sauto entretiennent selon un processus sans fin menant laggravation des complications
mtaboliques.

Paralllement ces modifications oxydatives, peuvent intervenir des changements dits


conformationnels engendrant la fois des pertes de fonctionnalits pour les protines
incrimines mais galement la formation et laccumulation dagrgats insolubles diffrents
niveaux de lorganisme.

Enfin, nous avons galement mentionn le lien troit quil peut exister entre la
structure et la conformation native de la protine sur sa fonction et leur rle final dans les
processus mtaboliques. En effet, la moindre altration au niveau de la structure primaire de
la protine peut la rendre inactive. Aussi, une modification au niveau de sa structure
secondaire peut induire une modification du repliement naturel de sa structure
tridimensionnelle et engendrer une perte de fonctionnalit.

Par rapport cette dualit structure/fonction, jai choisi de focaliser mon travail sur
ltude dune protine particulire qui prsente deux caractristiques essentielles : lalbumine

67

Cette protine possde de nombreuses proprits bnfiques et particulirement ses


capacits antioxydantes qui peuvent avoir une grande importance dans le cas dun stress
oxydant accru.

Par ailleurs, en tant que protine circulante la plus abondante, elle est non seulement,
continuellement expose toute altration se manifestant au sein de lorganisme. Ensuite,
elle ctoie de nombreux tissus cellulaires qui peuvent tre affectes par ses modifications
altratives, et en retour peuvent affecter ses proprits intrinsques.

En consquence, lobjectif de mon travail de thse est dtudier la relation structure/fonction


de lalbumine dans diffrents cas physiologiques ou non physiologiques.

Dans un premier temps, dans le cadre dune tude structurale de lalbumine bovine in
vitro, je dterminerai les modifications structurales de la protine traite dans des conditions
non physiologiques (changement de temprature) ou/et des conditions pathologiques mimant
un tat dhyperglycmie (glycoxydation). Non seulement nous analyserons limpact de ces
changements structuraux sur les proprits intrinsques de la protine, particulirement ses
capacits antioxydantes, mais galement nous valuerons leffet de la glycoxydation sur la
susceptibilit de la protine au changement conformationnel en conditions non
physiologiques.

Les produits avancs de glycation ont t, avant tout, mis en vidence dans le cas de la
pathologie diabtique. Or, dans plus de 9 cas sur 10, il sagit du diabte noninsulinodpendant (DNID ou diabte de type 2), rencontr chez des adultes ayant dpass la
cinquantaine, souvent sdentaire et en surpoids. De plus, la gravit du diabte de type 2
provient de ses complications dordre cardio-vasculaires. Nous avons mis en vidence les
dfauts de reconnaissance des protines plasmatiques glycoxydes et de leur internalisation
par la cellule. De plus il a t montr lexistence de nombreux rcepteurs spcifiques des
AGEs au niveau de nombreux tissus. Cest le cas notamment du rcepteur scavenger
CD36, jouant un rle actif au niveau du tissu adipeux (Horiuchi, 2003). En consquence, jai
trouv pertinent didentifier les effets physiopathologiques des AGEs sur des cultures
primaires dadipocytes humains. Parmi ces effets, il tait important de notamment dterminer
et de mettre en vidence les protines cellulaires les plus exposes leffet combin de la
glycation et de loxydation au niveau de ces cellules adipeuses.

68

La littrature rapporte de nombreuses donnes sur leffet de la glycoxydation dans la


physiopathologie cellulaire en utilisant des AGEs gnrs in vitro cherchant simuler les
conditions dhyperglycmie du diabte. La plupart de ces tudes ont utilis la srum albumine
bovine glycoxyde comme modle in vitro. Il mest apparu important de comparer deux
modles dAGEs obtenus partir de la glycoxydation des srums albumines bovine et
humaine. Dans cette troisime partie, je comparerai les diffrences de modification structurale
entre les modles bovin et humain dalbumine glycoxyde avec les rpercutions engendres
sur leurs statuts redox et antioxydants. Ensuite, janalyserai la rponse physiologique de ces
deux modles dAGEs sur un modle de ligne humaine de monocytes.

Enfin, jai choisi dtendre mon travail ltude in vivo sur les influences des
phnomnes oxydatifs sur les proprits de lalbumine dans le cadre de la pathologie
diabtique. En effet, les travaux raliss prcdemment concernent leffet in vitro des
phnomnes de glycoxydation de lalbumine sur sa structure, son statut antioxydant et son
impact sur la physiopathologie de diffrents modles cellulaires. Dans cette dernire partie,
jessayerai de dterminer si les modifications observes au niveau des modles in vitro se
retrouvent au niveau de lalbumine plasmatique de patients diabtiques en me focalisant plus
particulirement sur le statut antioxydant et ltat redox de la protine plasmatique. Cette
tude devrait permettre dapporter une rponse sur la pertinence des modles in vitro dAGEs
utiliss dans de nombreuses tudes prcdentes, mais galement de donner des lments de
comprhension de limpact des phnomnes de glycoxydation dans le dveloppement des
complications chroniques lies au diabte.

Les rsultats obtenus au cours de ce travail de thse, devraient dmontrer limportance


de la structure native dans les proprits fonctionnelles de la protine circulante la plus
abondante.
De plus, ltude de leffet du stress glycoxydant sur la physiologie adipocytaire
pourrait nous aider mieux comprendre le lien troit entre le stress oxydant, lobsit et les
syndromes mtaboliques qui en dcoulent.

69

70

PARTIE EXPERIMENTALE

71

72

Sommaire de la partie exprimentale


I Etude structurale de lalbumine srique bovine modifie in vitro dans des
conditions non physiologique et pathologique
antioxydantes

incidence sur ses proprits

1. Introduction
2. Rsultats
Acticle 1: Assessment of temperature effects on beta-aggregation of native and glycated
albumin by FTIR spectroscopy and PAGE: relations between structural changes and
antioxidant properties. Arch Biochem Biophys. 2007 Apr 1; 460(1):141-50.
Acticle 2: Thermal aggregation of glycated bovine serum albumins. Soumis Febs Journal
Rsultats complmentaires : Etude spectroscopique de lagrgation de la SAB native
3. Discussion
4. Conclusions et perspectives

II Effets cellulaires de lalbumine srique bovine modifie in vitro par


glycation sur le tissu adipeux humain
1. Introduction
2. Rsultats
Acticle 3: Effects of oxidative modifications induced by the glycation of bovine serum
albumin on its structure and on cultured adipose cells. Biochimie 2006 Oct; 88(10):1467-77.
Acticle 4: Identification of preferential protein targets for carbonylation in human mature
adipocytes treated with native or glycated albumin. Free Radic Res. 2007 Oct; 41(10):107888.
3. Discussion
Prsence du rcepteur CD36 au niveau des SW872 ?
Est-ce que ce sont de bons modles dAGEs ?
4. Conclusions et perspectives
73

III Etude compare de deux modles in vitro de produits avancs de glycation


issus des formes humaine et bovine de lalbumine srique: structure et
fonction

1. Introduction
2. Rsultats
Acticle 5: Oxidative stresses induced by glycoxidized human or bovine serum albumin on
human monocytes. Free Radic Biol Med. 2008 Sept; 45 (6) 799-812.
3. Discussion
La rponse physiologique des THP1 aux AGEs via le rcepteur CD36
La rponse physiologique des THP1 et les systmes de dfense
4. Conclusions et perspectives

IV Etude in vivo du statut redox et antiradicalaire de lalbumine srique dans


le cadre de la pathologie diabtique

1. Introduction

2. Protocoles exprimentaux
a) Recrutement des sujets
b) Purification de lalbumine des plasmas
c) dosage de lalbumine
d) Dosage du taux de carbonyle par ELISA (tat rdox)
e) Test KRL ou hmolyse des globules rouges (proprits antioxydantes)
f) Etude de fluorescence
g) Dosage des groupements cystine libre (tat redox)
h) Statistiques
3. Rsultats
a) Paramtres doxydation et antiradicalaire au niveau des plasmas :
b) Paramtres structuraux, redox et antioxydant au niveau des albumines :
c) Relation structure / fonctions:
4. Discussion
5. Conclusions et perspectives
74

PARTIE I
Etude structurale de lalbumine srique bovine
modifie in vitro dans des conditions non physiologique
et pathologique : incidence sur ses proprits
antioxydantes

75

1. Introduction

Comme nous lavons dtaill prcdemment, les modifications post-traductionnelles


exercent un rle dterminant dans la fonctionnalit de la protine. Par ailleurs, les conditions
environnementales auxquelles sont soumises les protines ont une action dterminante. Parmi
ces conditions, nous pouvons considrer les facteurs physiologiques (pH, force ionique, la
concentration, la temprature ou bien la prsence dun co-solut) (Aymard, 1996; Fink,
1998), mais galement pathologiques (stress oxydant, hyperglycmie). Parmi les
nombreuses protines, lalbumine apparat comme une protine particulirement intressante
tudier, dans la mesure o elle possde des proprits intrinsques bnfiques et quelle est
continuellement soumise toutes sortes daltrations. Enfin, nous avons galement mentionn
les liens troits entre la structure native de cette protine circulante, que cela soit au niveau de
la squence peptidique, la structure secondaire ou la structure tridimensionnelle avec les
proprits bnfiques qui lui sont confres.

Concernant les modifications conformationnelles de cette protine, mme si les


nombreux ponts disulfures assurent une certaine rigidit la structure tridimensionnelle, ils
nempchent pas les modifications conformationnelles sur leffet dun changement du pH ou
de la temprature (Carter, 1994; Foster, 1977). Ainsi, sous laction dun traitement
thermique, lalbumine peut subir des changements de conformation associs un dpliement
partiel de la structure 3D provoquant le processus dagrgation (Militello, 2004; Militello,
2003; Vetri, 2005) et, au dessus dun seuil critique de concentration de la protine, le
processus de glation (Bryant, 1998; Mulvihill, 1987; San Biagio, 1999). De mme, avec
une diminution sensible de pH, la conformation de la protine subit une transition vers une
forme dploye dans laquelle ses proprits de fixation et dinteraction avec dautres
molcules sen trouvent affectes (Lee, 2005).

Dans cette tude, jai, suivi, dans un premier temps, lvolution dans le temps du
processus dagrgation de lalbumine bovine soumise une condition non physiologique
(traitement thermique) en utilisant diffrentes approches pour valuer les modifications
structurales : mthodes spectroscopiques dune part (infrarouge, UV-visible et fluorescence),
mthode lectrophortique dautre part (PAGE) et enfin une technique granulomtrique
(diffusion dynamique de la lumire). Paralllement, jai tent de dterminer si ces
76

modifications pouvaient tre mises en relation avec des changements de la capacit


antioxydante de la protine.

De plus, en tant que protine plasmatique la plus abondante et de longue demi-vie,


lalbumine est sensible aux modifications rsultantes de pathologies particulires
(hyperglycmie, stress oxydant) et sa structure native sen trouve affecte (Bourdon,
1999 ; Van Campenhout, 2006). Parmi ces modifications pathologiques, le phnomne de
glycoxydation reprsente lune des altrations les plus rencontres. Cest pourquoi, dans un
deuxime temps, nous nous intresserons linfluence de la glycation de la protine
plasmatique sur sa facult changer de conformation et former des agrgats sous leffet
dun traitement thermique. En utilisant les mmes approches que prcdemment, on
sintressera galement la rpercussion de la glycoxydation combine la dnaturation
thermique sur le statut antioxydant de la protine. La plupart des rsultats, relatifs cette
tude, sont prsents dans la publication dArchives of Biochemistry and Biophysics.

Dans une deuxime tape, nous nous sommes focaliss sur une approche plus
structurale de leffet combin de la glycoxydation et de lagrgation en faisant appel des
techniques de spectroscopie et de biophysique afin de mieux comprendre un mcanisme qui
est encore loin dtre lucid. Ces expriences complmentaires qui viennent tayer les
premires conclusions dABB sont prsentes sous forme dun article soumis FEBS Journal.

Lintrt scientifique de cette tude dagrgation de lalbumine trouvera sans doute un


meilleur cho dans le domaine de la biotechnologie alimentaire. En effet, de nombreux
procds de transformation des aliments reposent sur les traitements thermiques. De plus la
raction de Maillard, correspondant la glycosylation non-enzymatique des protines, est lun
des processus chimiques les plus rencontrs dans ce domaine alimentaire. Enfin, lalbumine
constitue une protine prsente dans notre lalimentation, notamment dans le petit lait.
Cependant, ltude de modifications structurales lies simultanment aux phnomnes
dagrgation et de glycation peut contribuer galement une meilleure comprhension du
comportement physiologique de lalbumine.

77

2. Rsultats
Acticle 1: Assessment of temperature effects on beta-aggregation of native and
glycated albumin by FTIR spectroscopy and PAGE: relations between structural
changes and antioxidant properties. Arch Biochem Biophys. 2007 Apr 1 ;
460(1) :141-50. Rondeau P, Armenta S, Caillens H, Chesne S, Bourdon E.

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

Cette premire tude nous a permis de mettre en vidence dune part que le processus
dagrgation pouvait affecter les proprits antioxydantes de lalbumine bovine, que cela soit
au niveau de sa capacit de pigeage des radicaux libres ou de sa capacit de fixation des
mtaux. Ensuite, il semblerait que les phnomnes de glycation puissent altrer la capacit de
la protine former des agrgats. Cette observation, tant obtenue qualitativement par le biais
des gels PAGE de protines, ncessite dtre confirme par le biais dautres techniques. Do
lintrt de cette tude complmentaire, utilisant principalement des outils de spectroscopie
(absorption, fluorescence et infra rouge), et qui a pu tre mene bien grce une
collaboration troite avec le Dpartement des Sciences Physiques et Astronomiques (DSFA)
de luniversit de Palerme, Italie. Cette tude se focalise principalement sur les modifications
structurales de la protine lies lagrgation et la glycation.

Acticle 2: Thermal aggregation of glycated bovine serum albumins. Soumis FEBS Journal
Rondeau P, Navarra G, Cacciabaudo F, Leone M, Bourdon E, Militello V.

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

100

101

102

103

104

105

106

Rsultats complmentaires:
Etude spectroscopique de lagrgation de lalbumine bovine native
La deuxime tude a galement donn lieu des rsultats non prsents dans larticle
prcedant, concernant le suivi de lvolution structurale de lagrgation de la SAB native par
spectroscopie en fluorescence du tryptophane et de lANSA. Les figures 21a et 21b, dcrivent
la diminution de lemission de fluorescence relative au tryptophane avec le processus
dagrgation (B) caractris par laugmentation de la fluorescence du pic de dispersion (A).

(A)

(B)

21b

21a

21c
Figure 21: Caractrisation spectroscopique de lagrgation de la SAB native
(a) Suivi cintique des spectres dmission de fluorescence de la SAB native 58C, entre
250-450 nm avec une excitation 270 nm. (b) Cintique de lintensit de fluorescence du
tryptophane mesure 337 nm () et du pic lastique de dispersion (elastic scattering
peaks) mesure 270 nm () pour SAB 58C. (c) Cintique de lintensit de fluorescence
ANSA de SAB 58C mesure 440 nm avec une excitation 355 nm.

107

La figure 21c, met en vidence le quenching de fluorescence de lANSA attestant une


diminution de lhydrophobicit de la protine suite au changement conformationel lors du
processus dagrgation de lalbumine.

3. Discussion
Si lintrt biologique de ltude des effets combins de lagrgation et de la glycation
sur la structure et les proprits physiologiques de lalbumine trouve toute sa place dans le
domaine des biotechnologies alimentaires, il est galement de grande importance dans le
domaine mdical. En effet, de nombreuses tudes rcentes ont mis en avant la formation
dagrgats pendant le processus de glycation in vitro (Sattarahmady, 2007; Wei, 2009). Ces
agrgats protiques de type fibre amylode sont toxiques au niveau des cellules neuronales
(Sanghera, 2008) et sont dailleurs reconnus pour tre impliqus dans les neurodgnrations
(Dukic-Stefanovic, 2001).

A partir de nos deux tudes, nous avons maintenant une vision plus globale des
modifications structurales engendres par les deux processus que sont la glycation et
lagrgation, ainsi que leur impact sur les proprits antioxydantes de lalbumine bovine. Les
deux processus entranent un dpliement partiel de la structure tridimensionnelle de la
protine, dont lamplitude est fonction du degr dagrgation ou de glycation. Par contre, les
modifications conformationnelles au niveau des poches hydrophobes ne sont pas similaires
comme lattestent les mesures contrastes de la fluorescence de lANSA. En effet, le
processus dagrgation saccompagne dune ouverture des poches hydrophobes, tandis que
dans celui de la glycation, ces mmes poches se referment. Dans le cas de lagrgation,
louverture de ces poches rend accessible certains rsidus hydrophobes, qui peuvent ainsi
participer des interactions intermolculaires.

Par ailleurs, si les phnomnes dagrgation saccompagnent dun changement

conformationnel au niveau de la structure secondaire en faveur des structures en feuillets , le


processus de glycation ne semble pas induire de modifications notables ce niveau de
structure.
Les changements conformationnels spcifiques la glycation de lalbumine peuvent
tre lune des raisons de sa faible susceptibilit lagrgation lors dun traitement thermique.
108

Lautre raison peut provenir de ltat redox de la cystine 34, qui dans un processus de
glycation, peut tre la fois glycosyle (Zeng, 2005) et oxyde comme le montre les rsultats
obtenus selon la mthode dEllmann. Il est clairement tabli que la seule cystine libre joue
son rle dans ldification des agrgats.

Paralllement aux changements conformationnels, les deux processus induisent des


effets contrasts au niveau des proprits antioxydantes de la protine srique. En effet, il a
t tabli que sous laction dun traitement thermique, lagrgation saccompagne dune chute
du rle protecteur de la protine contre les radicaux libres. Alors que la glycosylation de cette
mme protine avec des teneurs croissantes en glucose a tendance accrotre sa capacit de
piger ces radicaux libres. Ces effets antagonistes peuvent sans doute tre attribus aux
diffrences constates au niveau des changements conformationnels, entre les deux processus.

4. Conclusions et perspectives
A travers ces deux tudes, nous nous rendons compte de toute la complexit de la
structure de lalbumine lorsque celle-ci nest plus ltat natif. Mme si nous avons progress
dans la comprhension des modifications induites, au niveau structural et fonctionnel, lorsque
celle-ci est soumise des conditions non-physiologiques ou pathologiques, de nombreux
aspects restent explorer :

Notre tude prcdente a notamment montr que la capacit de fixation du Cu (II) par
la protine srique est diminue avec la formation progressive des agrgats, alors quil a t
montr que lors du processus de glycation de lalbumine bovine cette capacit est accentue
(Rondeau, 2008). Par ailleurs, la prsence de Cu (II) au niveau de pr-agrgats dalbumine
induit la formation froid dun gel rsultant dinteractions protiques par le biais du Cu (II)
(Navarra, 2009). Etant donn que la capacit de fixation du cuivre est renforce dans le cas
de la glycation, il serait intressant de dterminer si lalbumine modifie aurait la capacit de
former des gels froid en prsence de Cu (II).

Enfin, une autre approche est envisage pour comprendre les modifications
structurales et les incidences au niveau physiologique : ltude des interactions entre un ligand
et lalbumine laide de la rsonance magntique nuclaire (RMN). Ici, le ligand serait du
109

Dtmir, un analogue de linsuline basale, qui a la particularit de se fixer fortement


lalbumine (98-99%) (Havelund, 2004). La mthode utilise, appele FAXS (fluorine
chemical shift anisotropy and exchange for screening) implique le radiomarquage du Dtmir
avec la fluorine

19

F et le suivi par RMN de son interaction avec lalbumine (Dalvit, 2003).

Cette approche aurait lavantage de comparer laffinit de lalbumine native pour un


analogue de linsuline avec celle de lalbumine modifie par glycation.

110

111

112

PARTIE II
Effets cellulaires de lalbumine srique bovine
modifie in vitro par glycation sur le tissu adipeux
humain

113

1. Introduction
Lhyperglycmie, lune des principales causes des complications diabtiques, est
lorigine de la formation de la plupart des produits avancs de glycation. En effet, de
nombreux AGEs ont t caractriss et identifis in vivo chez des patients diabtiques. Parmi
les AGEs, forms in vivo, reconnus dans les complications du diabte figurent le

mthylglyoxal et les rsidus N-carboxymethyllysine (CML) (Uribarri, 2003; Vlassara,


1996).

En pratique, on distingue deux types de diabte :

le diabte insulinodpendant (diabte de type 1) marqu par une carence absolue en

le diabte non insulinodpendant (diabte de type 2), dont la pathognie est plus

insuline cause par une dficience des cellules du pancras.

complexe, caractris notamment par une rsistance de la rponse insulinique dans la


rgulation du taux de glucose sanguin.

Le diabte de type 2 reprsente 90% de tous les types de diabte et touchait 157 millions
de personnes dans le monde en 2000. De nombreuses tudes ont montr le rle de lobsit et
de laccumulation de masse grasse abdominale dans les causes du diabte de type 2 (Favier,
2005; Rocchini, 2002). En effet, le risque de dvelopper un diabte de type 2, ou diabte gras,
est troitement li aux indices de masse corporelle (IMC) et de tour de taille, indices associs
la masse grasse et principaux indicateurs de surpoids et dobsit (Balkau, 2007). Par
ailleurs, laugmentation de la prvalence pour le diabte de type 2 sexplique principalement
par une prvalence alarmante de lobsit et du surpoids qui a t en augmentation de 50%
entre 1997 et 2006 (Charles, 2008).

Lobsit se caractrise par une accumulation de tissus adipeux au niveau abdominal


(Despres, 2008; Xu, 2003), associe une inflammation chronique lorigine du
dveloppement de maladies cardiovasculaires et du diabte de type 2. Ainsi, le tissu adipeux
et les cellules qui le composent jouent un rle important dans lobsit et les pathologies qui
lui sont associes comme le diabte gras.

114

Le tissu adipeux, tissu htrogne comprenant diffrents types de cellules dont les adipocytes,
est avant tout connu pour son rle essentiel de stockage de lnergie. Plus rcemment son rle
endocrinien a t mis en vidence cause de sa contribution linsulino-rsistance et
linflammation (Ailhaud, 2000; Trayhurn, 2001). Parmi les diffrents types cellulaires
composants le tissu adipeux, les adipocytes contribuent aux diffrentes fonctions qui lui sont
attribues.

En effet, les cellules adipocytaires sont spcialises dans le stockage de lnergie et


dans la scrtion de molcules signales (Fischer-Posovszky, 2007). Leur rle de stockage se
traduit dune part, par la mise en rserve de lnergie excdentaire (acide gras et glucose) lors
de la prise alimentaire (la lipogense) et dautre part, par une libration des acides gras lors
dun besoin nergtique de la part des organes priphriques (lipolyse) (Langin, 2006).
Ladipocyte contribue ainsi lhomostasie lipidique. Par ailleurs, ladipocyte est le sige de
la scrtion de nombreux facteurs protiques qui lui sont soit spcifiques comme les
adipokines (leptine, adiponectine et resistine), soit identiques ceux dautres tissus comme les
cytokines (Tumor Necrosis Factor- (TNF-), interleukine) facteurs de linflammation
(Fruhbeck, 2004; Scherer, 2006; Trayhurn, 2006). Les fonctions associes ces diffrentes
protines, dont linflammation et linsulinosensibilit, supposent limplication de la cellule
adipocytaire dans le dveloppement des complications mtaboliques lies lobsit comme
le diabte de type 2.

En parallle ces fonctions scrtrices, ladipocyte est la cible de signaux pouvant


rguler de nombreux processus comme notamment ceux de lapptit, linsulinosensibilit ou
le stress oxydatif (Ailhaud, 2000; Scherer, 2006). De nombreux rcepteurs membranaires,
lorigine de ces processus, ont t mis en vidence au niveau des cellules adipocytaires. Par
exemple, certains rcepteurs (CB1 et CB2) du systme des endocannabinoides, impliqus
dans le contrle de la prise alimentaire et initialement dcrits au niveau du cerveau, ont
galement t identifis au niveau des cellules adipocytaires (Roche, 2006). Il a t montr,
par ailleurs, la prsence du rcepteur de la famille RAGE dit scavenger nomm CD36 au
niveau adipocytaire (Horiuchi, 2003; Kuniyasu, 2003). Ce rcepteur CD 36, dcouvert tout
dabord comme liant les LDL oxydes au niveau des macrophages, est lorigine de la
formation de la plaque dathrome. Au niveau adipocytaire, ce rcepteur interagit avec les
LDL oxyds (Kuniyasu, 2002) et est galement capable de fixer les produits avancs de
glycation.
115

Jusqu prsent, les tudes des interactions entre AGEs et cellules concernaient
principalement les cellules sanguines. La liaison des AGEs au rcepteur RAGE de ces cellules
conduit la formation de radicaux libres, la scrtion de messagers extracellulaires
(cytokines, facteurs de croissance) pouvant tre le point de dpart dune raction
inflammatoire (Cohen, 2003b; Uchida, 2004). Le rcepteur CD36, liant les AGEs tant mis
en vidence la surface des adipocytes, jai choisi dtudier les effets physiopathologiques
des AGEs sur le modle adipocytaire. En effet, la rponse biologique des cellules adipeuses
un stress glycoxydant, mimant un tat hyperglycmique, a t trs peu tudie jusqu
prsent.

Dans la premire tude in vitro, jai soumis des adipocytes matures humains
diffrents modles dAGEs, prpars in vitro partir de la srum albumine bovine et de
glucose dans des conditions physiologiques et pathologiques. Aprs une premire partie
consacre la caractrisation des modifications structurales de la protine, les effets de
lalbumine modifie par glycation sont analyss au niveau de culture primaire dadipocytes
humains. Au niveau des effets physiopathologiques des AGEs sur ce modle cellulaire, jai
notamment suivi la cytotoxicit et le stress oxydatif induit par mes modles in vitro dAGEs.

Ce premier travail ayant notamment montr une augmentation du taux de protines


oxydes intracellulaires au niveau des adipocytes matures incubs avec de lalbumine
modifie dans des conditions suprapathologiques, il est apparu intressant de complter cette
tude.

Ainsi, dans la continuit de la premire tude, nous nous sommes focaliss sur leffet
oxydatif de lalbumine glyque sur les adipocytes humains. Dans cette deuxime tude, nous
avons tout dabord isol et identifi les protines cellulaires adipocytaires particulirement
sensibles leffet oxydatif des AGEs en utilisant llectrophorse bidimensionnelle suivie
dune identification des spots dintrt par la spectromtrie de masse. En parallle, nous avons
suivi lactivit protolytique du protasome au niveau des adipocytes soumis ce stress
glycoxydant. En effet, les protines oxydes sont la plupart du temps dgrades par le
protasome (Friguet, 2006). Concernant, ltude du rle du complexe protolytique dans la
dgradation de protines oxydes, nous avons utilis une ligne cellulaire de liposarcome
humain (SW872) comme modle adipocytaire.
116

2. Rsultats
Acticle 3: Effects of oxidative modifications induced by the glycation of
bovine serum albumin on its structure and on cultured adipose cells. Biochimie
2006 Oct; 88(10):1467-77. Chesne S, Rondeau P, Armenta S, Bourdon E.

117

118

119

120

121

122

123

124

125

126

127

128

129

130

Acticle 4: Identification of preferential protein targets for carbonylation in


human mature adipocytes treated with native or glycated albumin. Free Radic.
Res. 2007 Oct; 41(10):1078-88. Singh NR, Rondeau P, Hoareau L, Bourdon E.

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

141

142

143

144

3. Discussion
Ces travaux ont permis de mettre en vidence des modifications de type oxydatif au
niveau des cellules adipeuses matures lorsquelles sont mises en prsence dAGEs prpars in
vitro partir dalbumine bovine commerciale. Cette rponse oxydative se traduit non
seulement, par une accumulation de protines intracellulaires carbonyles mais galement par
une augmentation du taux disoprostane, un des produits de peroxydation lipidique, libr
dans le milieu. Nous montrons ainsi que les protines des adipocytes matures sont sujettes
des modifications de type oxydatif sous laction dun stress glycoxydant initi par les AGEs.
Ce rsultat conforte lide dune implication essentielle de ladipocyte dans la progression des
dsordres mtaboliques associe lobsit et le diabte gras.

Dans le deuxime travail, nous avons pu identifier huit protines qui se retrouvent
oxydes dans les adipocytes matures. Parmi ces protines, deux apparaissent fortement
carbonyles dans les adipocytes matures traites avec de lalbumine glyque : ACTB et
annexine A2. Ces deux protines ubiquitaires du cytosquelette sont gnralement fortement
reprsentes dans la cellule, ce qui peut expliquer la dtermination prfrentielle de ces deux
protines particulirement sensibles loxydation. Si lannexine A2 peut tre implique dans
les phnomnes dexocytose et dendocytose (Kassam, 1998), elle peut galement interagir
avec lACTB (ou -actine) dans la rgulation de la dynamique du cytosquelette (Hayes,

2006). Lannexin A2 joue donc un rle essentiel dans la plasticit de la membrane associe
au cytosquelette dactine. Loxydation accrue de lune de ces deux protines, voire des deux,
peut sans doute contribuer altrer cette interaction essentielle ; ce qui reste dmontrer.
Enfin, nous avons mis en vidence que les dommages oxydatifs des protines adipocytaires
saccompagnaient dune dtrioration des activits protolytiques du protasome.

SW872 un bon modle adipocytaire ?


Lune des principales critiques qui ont t rapportes par les reviewers concernant la
deuxime tude, est lutilisation approprie des lignes cellulaires SW872 comme modle
dadipocytes humains dans ltude de lactivit du protasome, ainsi que dans la mesure de
fluorescence du DCF. Bien que dans la littrature, elle soit dcrite comme des adipocytes
matures, ce modle de liposarcome accumule toutefois de moindres quantits de lipides
compares la capacit de stockage de ladipocyte humain primaire (Izem, 2001). Par ailleurs
cette cellule exprime faiblement de nombreux facteurs de transcription impliqus dans
145

ladipognse comme PPAR- (peroxisome proliferation-activated receptor ) et C/EBP-


(CCAAT-enhancer-binding proteins) (Carmel, 2009; Wassef, 2004). Certaines adipokines
comme la leptine et ladiponectine sont galement exprimes au niveau de ces cellules
(Carmel, 2009; Tarnus, 2009). Sa capacit de prolifration est suprieure celle des
adipocytes primaires et sa morphologie diffre de celle acquise par les adipocytes matures lors
de la diffrentiation. Par contre, cette ligne prsente lavantage dtre dorigine humaine et
ne requiert pas de cocktails spcifiques pour les diffrentier en adipocyte mature (Roche,
2009). Enfin, comme mentionn dans un autre travail (cf. Annexe 2, (Roche, 2009)), ce
modle cellulaire se comporte de faon similaire aux adipocytes matures lorsquelles sont
soumises un stress glycoxydatif.

Lintrt de lutilisation de cette ligne cellulaire permet de se soustraire des


problmes de variabilit au niveau du contrle que lon aurait de faon irrmdiable dans le
cas de cellules primaires provenant de diffrents patients dont on ne contrle pas tous les
paramtres.
A ce titre, la ligne cellulaire humaine de liposarcome (SW872) reprsente donc un
bon modle pour notre tude du stress glycoxydant et linflammation de la cellule adipeuse
chez lhomme.

Prsence du rcepteur CD36 au niveau des SW872 ?


Nos travaux ont mis en vidence une rponse de type oxydatif des cellules SW872
lorsquelles sont soumises un stress glycoxydant. Cette rponse aux AGEs suggre quelle
soit, peut tre, attribue la prsence dun rcepteur RAGE la surface des SW872, tel que le
rcepteur scavenger CD 36 prsent au niveau des adipocytes humains.

Lexpression du rcepteur CD36 nayant jamais t tudie au niveau des SW872, il nous est
apparu important de dterminer sa prsence au niveau de ces cellules par immunocytochimie.

Protocole :
Les cellules SW872 (20 000 cellules/cm2) en suspension dans du milieu DMEM/SVF 10%
sont dposes sur des lamelles et mises en culture pendant 24 heures. Aprs lavage des
cellules avec du PBS, les cellules adhrentes sont fixes avec une solution de
146

formaldhyde (0,4 %). Sur un lot de lamelles, on ralise un double marquage en les incubant
dune part, avec un anticorps anti- CD36 coupl au FITC et dautre part avec le fluorochrome
DAPI (4',6' Di Amidino-2-Phnyl Indole) afin de marquer les noyaux. Les cellules contrles
sont uniquement marques avec le DAPI. Les cellules sont ensuite examines avec un
microscope fluorescence (TE2000-U, Nikon).

Rsultat et conclusion :

La figure 22 nous montre tout dabord le marquage en bleu DAPI du noyau des cellules pour
les deux lots de lamelles. Ensuite, la fluorescence du FITC (couleur verte) observe pour le lot
immunomarqu avec un anticorps anti CD36, atteste la prsence de ce rcepteur la surface
des cellules SW872.Le DAPI s'in

Figure 22 : Expression du rcepteur CD36 sur les cellules SW872 par


immunocytochimie

147

Est-ce que ce sont de bons modles dAGEs ?


Plusieurs questions se posent concernant la prparation in vitro des modles dAGEs. En
effet, les concentrations de glucose utilises ne correspondent pas toutes des conditions
physiologiques ou pathologiques. Si la concentration physiologique en glucose dun individu
normal est autour de 5 mM et celle dun tat hyperglycmique non contrl autour de 25 mM,
la concentration de 100 mM ne correspond aucune ralit pathologique. Cependant, nous
avons choisi de traiter les adipocytes matures avec de lalbumine modifie par cette forte
concentration de glucose, afin daugmenter le rendement de protines glycoxydes et ainsi
dinduire une forte oxydation des protines adipocytaires et de mieux les identifier. Par
ailleurs, ltude structurale des diffrentes albumines modifies a mis en vidence un fort taux
de carbonylation de lalbumine bovine native commerciale. Comme le montre le dosage des
thiols, ainsi que le Western-Blot carbonyl, dans la premire tude, lalbumine native est dj
fortement oxyde. Toutes ces donnes sont prendre en compte lorsque lon souhaite
comparer leffet physiologique dune albumine mimant les conditions pathologiques dun tat
hyperglycmique (25 mM) celle mimant des conditions physiologiques normales (5 mM).
Enfin, dans le cadre dune tude physiopathologique dun modle cellulaire dorigine
humaine, ne serait-il pas plus judicieux dutiliser la forme humaine de lalbumine (SAH)
plutt que celle dorigine bovine (SAB) ?

4. Conclusions et perspectives
Lobsit est lune des consquences majeures du mode de vie adopt par lhomme
moderne, qui se traduit entre autre par une suralimentation riche en gras et en sucre, mais
galement par une augmentation de la sdentarit. Toutes ces causes sont galement la source
de phnomnes dltres au niveau des tissus comme la glycation et le stress oxydant. Les
dommages engendrs participent non seulement au vieillissement cellulaire mais sont
galement lorigine des complications mtaboliques comme le diabte. Ainsi lobsit,
lorigine du diabte insulino-rsistant, contribue la formation dAGEs pouvant agir au
niveau de diffrents tissus. Les effets oxydatifs des AGEs peuvent contribuer des dommages
fonctionnels au niveau des cellules insulino-scrtrices du pancras provoquant ainsi une
insulinopenie progressive et inluctable. Le tissu adipeux peut galement tre la cible de ces
AGEs avec pour consquence une glycoxydation accrue de plusieurs protines constitutives
ainsi que la dgradation du systme protolytique.
148

Cependant il reste dterminer comment les rles principaux de ladipocyte, savoir ses
fonctions de stockage et endocriniennes sont affectes par les AGEs. Enfin, il serait
intressant de se focaliser sur limplication des rcepteurs RAGE, et notamment du rcepteur
scavenger CD36 dans les altrations oxydatives de ladipocyte.

149

150

PARTIE III

Etude compare de deux modles in vitro de produits


avancs de glycation issus des formes humaine et
bovine de lalbumine srique: structure et fonction

151

1. Introduction
Etant donn leur caractre dltre tant au niveau cellulaire et tissulaire, ainsi que leurs
contributions aux diffrentes pathologies, les produits avancs de glycation ont donn lieu
de trs nombreuses tudes dans la littrature scientifique. En effet, les AGEs prsentent un
fort intrt aussi bien dans la recherche biomdicale que dans le domaine de lagroalimentaire
o on parle plutt de produits de Maillard. Dans le domaine de la Biologie et de la sant, les
produits avancs de glycation et le phnomne de glycation sont tudis aussi bien sur le plan
des modifications structurales induites sur les protines que sur le plan de lincidence
physiologique in vitro ou in vivo. Toutefois, on peut remarquer que la plupart des tudes
structurales ou biologiques ralises partir de modles in vitro dAGEs, ne respectent pas
ncessairement les conditions qui peuvent tre rencontres in vivo dans certaines pathologies
comme dans le cas dun diabte.

En effet, dans de nombreux travaux, les modles dAGEs sont obtenus partir
dalbumine incube avec des concentrations en glucose ne correspondant aucune ralit
physiopathologique (jusqu 1M au lieu de 25 mM dans le cas dune hyperglycmie mal
contrle) (Lo, 1994; Stolzing, 2006), pendant une dure pas toujours adapte avec la priode
de demi vie de la protine (jusqu 10 semaines au lieu de 3 semaines dans le cas de
lalbumine). Lutilisation de ces conditions exprimentales particulires est justifie par
lobjectif dobtenir une rponse suffisamment significative au niveau de cellules traites par
des AGEs. Par ailleurs, le modle in vitro dAGE prpar partir dalbumine bovine (SAB)
est souvent privilgi sur celui obtenu partir de la forme humaine (SAH), en particulier dans
le cadre dtudes in vitro deffets physiologiques au niveau des modles cellulaires humains.

Dans ltude suivante, jai souhait valuer la rponse biologique de modles dAGEs
sur une ligne cellulaire en essayant de me rapprocher le plus possible des conditions
physiopathologiques dun tat hyperglycmique. Ce qui ntait pas le cas dans la prcdente
tude sur leffet des AGEs sur le modle adipocytaire. Dans un premier temps, jai tabli une
comparaison au niveau des modifications structurales de modles in vitro dAGEs drivant
dalbumine bovine et humaine avec celui dune albumine humaine provenant dun patient
diabtique. Dans un second temps, jai suivi leffet diffrentiel de ces deux modles dAGEs
au niveau cellulaire.
152

Pour mener bien ce deuxime aspect de ltude, jai utilis une ligne cellulaire de
monocyte (THP1), drive de cellules de leucmie monocytique aigu, qui reprsente un
modle adapt pour ltude des effets biologiques des protines glycoxydes. En effet, le
choix des monocytes se justifie non seulement par leur prsence au niveau circulatoire, mais
aussi par leur capacit de se diffrentier en macrophages responsables de la phagocytose de
particules trangres ou dgrads. Les monocytes jouent un rle central dans les processus
inflammatoires, immunitaires mais aussi dans lathrothrombose (Nguyen, 1999).

Au niveau de la rponse biologique des monocytes humains, je me suis notamment


focalis sur la gnration de ROS et lexpression du rcepteur RAGE. Ce rcepteur a t mis
en vidence la surface des cellules monocytaires et linteraction spcifique des AGEs avec
ce rcepteur provoque une cascade de signaux intracellulaires lorigine, entre autre, de la
formation des ROS (Neeper, 1992).

153

2. Rsultats
Acticle 5: Oxidative stresses induced by glycoxidized human or bovine serum
albumin on human monocytes. Free Radic Biol Med. 2008 Sept; 45 (6), 799-812.
Rondeau P, Singh NR, Caillens, H, Talet F, Bourdon E.

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

168

3. Discussion
Dans la premire partie de ce travail, consacre ltude de limpact de la glycation
sur la structure et les proprits biologiques des protines sriques, nous constatons des
modifications structurales bien distinctes en fonction de lorigine de lalbumine. En effet la
glycoxydation de la forme bovine se traduit par un tat doxydation beaucoup plus marqu
par rapport celle engendre sur la forme humaine. Par ailleurs, limpact sur les proprits
biologiques diffre galement entre les deux formes dalbumine. Comme le montre le test
dhmolyse des globules rouges, la glycation affecte de faon significative les proprits
antioxydantes de la SAH, tandis quelle les accentue chez la SAB. Lune des hypothses que
lon pourrait avancer pour expliquer cette diffrence, est la meilleure affinit de la forme
humaine de lalbumine dans un systme biologique utilisant des cellules humaines
(rythrocytes).
Par ailleurs nous avons cherch valuer les modifications produites par des glycations
modres des deux albumines en utilisant la spectromtrie de masse (MS) selon deux
approches diffrentes :

En dterminant et en comparant la masse molaire moyenne des diffrentes albumines


natives et modifies, nous avons pu estimer le nombre dunits glucose ou mthylglyoxal qui
a pu se fixer sur la protine srique. Ainsi, nous constatons que la masse molaire augmente de
faon beaucoup plus significative sur lalbumine bovine modifie (entre + 63 et 1189 Da)
que sur lalbumine humaine (entre + 182 et 255 Da).

En effectuant au pralable de lanalyse MS, une digestion trypsique des albumines natives
et glyques, nous avons cherch identifier les rgions de la protine impliques dans la
glycation.
En utilisant cette seconde approche, il na pas t possible de dterminer les sites
spcifiques de glycation de la SAB et de la SAH partir des profils trypsiques des albumines
modifies obtenus par MALDI-TOF MS. En effet, dans le cas dune protine glyque au
niveau dun rsidu arginine (K) (Figure 23), on peut sattendre deux profils de digestion
diffrents :

- (cas 1) Si la digestion par la trypsine est effective au niveau du site arginine glycosyl, on
sattend une augmentation de la masse de lespce ionique B par rapport au profil de
lalbumine native qui sexplique par ladduction dune unit glucose sur le rsidu arginine.
169

- (cas 2) La digestion par la trypsine peut se rvler inefficace au niveau dun rsidu arginine
pralablement modifi. Dans ce cas on obtientra deux fragments au lieu de trois (B et A).

Figure 23 : Plusieurs profils MS de digestion possibles pour la protine glyque

Lventualit dune efficacit partielle de digestion par la trypsine au niveau des sites
lysine ou arginine impliqus dans la glycation rend difficile linterprtation des profils de
digestion et la dtermination des sites de glycation de la protine.
Par contre, la comparaison des profils de digestion a permis de mettre en vidence de fortes
similitudes entre ceux de SAH modifis et celui dun patient diabtique, confirmant que notre
modle in vitro se rapprochait du modle dAGEs in vivo.

La rponse physiologique des THP1 aux AGEs via le rcepteur CD36

La deuxime partie de ltude met en avant le rle de lalbumine glycoxyde sur la


physiologie des cellules monocytaires humaines. Le traitement modr des monocytes par les
diffrents AGEs (10 M) entraine une rponse de type oxydatif sous forme dune
170

augmentation du taux de protines carbonyles et de la formation accrue de ROS. Cette


rponse est mdie par un ou plusieurs rcepteurs spcifiques tels que le RAGE. En effet, en
interagissant avec ce type de rcepteur situ la surface des monocytes, les AGEs peuvent
induire une rponse inflammatoire par le biais de diffrents gnes comme MCP-1 (monocyte

chemoattractant protein-1), INFIP10 (Interferon -inducible protein-10) et Cox-2


(Cyclooxygenase-2) (Figarola, 2007). Dans notre travail, la prsence du rcepteur RAGE est
confirme par Western Blot avec une expression plus prononce lorsque les cellules ont t
traites par les deux albumines incubes en prsence de mthylglyoxal.
Par ailleurs, le rcepteur scavenger CD36, pouvant galement fixer les AGEs, est
prsent la surface des monocytes/macrophages. Ce rcepteur est impliqu dans la
transformation des macrophages en cellules spumeuses la base de la formation des plaques
dathrome lorigine de lathrosclrose (Han, 2002). Le rcepteur CD36 est galement
impliqu dans la phagocytose des corps apoptotiques (Fadok, 1998). Dans le cadre de cette
tude, il mest apparu important dtudier limplication du rcepteur CD36 dans la rponse
oxydative des THP1 soumises un stress glycoxydant. Pour cela, jai suivi lvolution de son
expression en utilisant la cytomtrie de flux fluorescence.

Protocole
Aprs des traitements modrs (10, 20 et 40 M) des cellules THP1 avec diffrents
AGEs (BSAG0, BSAG25 et BSAMGO), drivs de lalbumine bovine, les suspensions cellulaires
sont laves avec du PBS en prsence de 1% de srum albumine bovine. Les cellules sont
ensuite incubes avec un anti-CD36 (1 :40) couple la fluorescine isothiocyanate (FITC)
pendant 30 minutes temprature ambiante. Les suspensions cellulaires laves avant et aprs
incubation avec du tampon PBS en prsence de 1% de srum albumine bovine sont ensuite
analyses par le cytomtre Beckman FC500. Lexpression du rcepteur CD36 est dtermine
partir de la mesure de fluorescence obtenue par FACS avec une excitation au laser argon
488 nm et une mission 530 nm (FL1). Lintensit de limmunomarquage dun antigne
donn est value par le ratio des moyennes arithmtiques de fluorescence entre une condition
de traitement et le contrle (milieu + PBS).

171

Rsultat et conclusion :
Dans cette tude en cytomtre de flux nous avons dtermin lexpression du CD36 la
surface des cellules THP1 en fonction de la nature du traitement (BSAG0, BSAG25 ou
BSAMGO) et selon la concentration de la stimulation (10, 20 ou 40 M) (Figure 24). Comme
pour le rcepteur RAGE en Western Blot, une augmentation significative de lexpression du
rcepteur CD36 par les monocytes est observe en prsence de BSAMGO. Toutefois, ce niveau
dexpression ne semble pas tre corrl la dose du traitement en AGEs.

Figure 24 : Expression du rcepteur CD36 la surface des THP1 par FACS


La significativit des rsultats est value par une analyse de variance ANOVA (suivi par un test de Tukey).
*
Effet de la BSA sur lexpression du CD36 (en comparaison avec le contrle PBS): ***P<0.001, **P<0.01,
*P<0.05. # Effet de la glycation sur lexpression du CD36 (en comparaison avec BSAG0): ###P<0.001,
##
P<0.01, #P<0.05.

Si les deux principaux rcepteurs aux AGEs, que sont CD36 et RAGE, sont stimuls au
niveau monocytaire, il a t montr que les AGEs stimulent galement lexpression dautres
rcepteurs moins spcifiques comme le CD44 ou le CD68 de monocytes humains
(Kishikawa, 2006). Le CD68 est un autre rcepteur de la famille des MSRs (macrophage
172

scavenger receptors), tandis que le CD44, fortement exprim au cours de la raction


inflammatoire, est le principal rcepteur de lacide hyaluronique.

La rponse physiologique des THP1 et les systmes de dfense

Lun des rsultats obtenus dans ce travail concerne lactivit du protasome lorsque les
cellules THP1 subissent un stress glycoxydant. Dans ltude mene prcdemment (Partie
II), nous avons mis en vidence une altration de ce systme protolytique au sein des
cellules adipocytaires soumises une stimulation excessive (+ 50 M) dAGEs. Ici, la
stimulation modre des THP1 par des AGEs drivs de lalbumine bovine favorise lactivit
du protasome (particulirement son activit de type chymotrypsine), tandis que les AGEs
issus de lalbumine humaine provoquent plutt une altration de cette activit (principalement
lactivit de type caspase). On retrouve, dailleurs cette rponse contraste au niveau de
lexpression de LMP2, lune des sous-units protiques constituant le protasome.
Paralllement aux systmes protolytiques participant la dgradation des protines, il existe
des systmes de dfense contre la formation despces issues de loxydation, tels que les ROS
ou les radicaux. Ce systme de dfenses primaires comprend diffrentes enzymes telles que la
superoxyde dismutase (SOD). Au vu des rsultats contrasts de lactivit du protasome
obtenus entre les deux formes dalbumine, jai effectu une comparaison de lexpression du
gne de la Mn-SOD au niveau des THP1 soumis de lalbumine (bovine et humaine) native
ou modifie par du mthylglyoxal. Toutefois, il serait intressant de dterminer si les rsultats
prsents ci-dessous peuvent tre associe avec une modification de lactivit enzymatique de
la Mn-SOD.

Protocole

Le protocole de lexpression du gne de la Mn-SOD est dcrit dans une autre tude
place en Annexe 2 (Roche, 2009). Les cellules THP1 sont traites 16h avec 10 M
lalbumine (bovine et humaine) native ou modifie par le mthylglyoxal. Ensuite les ARN
totaux sont extraits et doss. La PCR en temps rel est ralise sur les ADN codants
correspondants partir du systme ABI PRISM utilisant la mthode Sybrgreen . La
quantit dARN du gne dintrt (Mn-SOD) et du gne de rfrence (18S) est dtermine
partir de courbes standards relatives ces deux gnes. Afin de prendre en compte la
variabilit de la concentration en ARN de chaque chantillon, les valeurs obtenues pour le
173

gne dintrt sont normalises par rapport aux valeurs obtenues pour le gne de rfrence.
Les cellules traites avec du PMA (phorbol 12-myristate 13-actetate) constituent le contrle
positif.

Rsultat et conclusion :

Comme dans le cas de lactivit du protasome et de lexpression du LMP2, nous constatons


un rsultat oppos entre les modles dAGEs humains et bovins (Figure 24).

Figure 25 : Expression ARN du gne de la Mn-SOD


La significativit des rsultats est value par une analyse de variance ANOVA (suivi par un test de Tukey).
*
Effet de la BSA ou HSA sur lexpression de la Mn-SOD (en comparaison avec le contrle PBS): ***P<0.001.
#
Effet de la glycation (MGO) sur lexpression de la Mn-SOD (en comparaison avec BSAG0 ou HSAG0):
##
P<0.01, #P<0.05.

En effet, la glycoxydation de lalbumine bovine se traduit par une augmentation de


lexpression de la Mn-SOD (BSAMGO vs. BSAG0) tandis que celle de lalbumine humaine
induit plutt une diminution de lexpression (HSAMGO vs. HSAG0). De plus lexpression
basale de la Mn-SOD, en prsence dalbumine native, est beaucoup plus importante dans le
cas de la forme humaine que celle de la bovine. Dans le cas de la glycoxydation de lalbumine
bovine, la diminution de lexpression de la Mn-SOD peut sexpliquer par le rle jou par le
facteur nuclaire de transcription NFB. En effet, lexpression de NFB, facteur fortement
impliqu dans la stimulation de lexpression de ce gne, peut tre fortement stimule par un
174

stress oxydant induit par des AGEs (Bubici, 2004). Les niveaux dexpression de la Mn-SOD
obtenus entre les formes natives et glycoxydes de lalbumine humaine sont en contradiction
avec ceux obtenus pour la forme bovine mais sont en accord avec les rsultats obtenus pour
lactivit protolytique du protasome.
Le stress glycoxydant gnr par les AGEs au niveau des monocytes, induit
loxydation de nombreuses protines intracellulaires ainsi que la formation accrue de ROS.
Ces altrations au niveau de la cellule peuvent tre contrecarres par deux types de
machinerie cellulaire : les systmes de dfense enzymatiques primaires tels que la Mn-SOD,
qui sattachent diminuer la production de radicaux libres et ainsi limiter la gnration de
ROS, mais galement les systmes protolytiques qui assurent la dgradation des protines
altres. Dans le cas de la stimulation des THP1 par des modles in vitro dAGEs dorigine
bovine, les systmes de dfense et de dgradation de la cellule semblent jouer leur rle pour
assurer son intgrit et sa survie. Par contre, le traitement des monocytes par de lalbumine
humaine glycoxyde induit un stress oxydant plus important avec pour consquence une
altration protique beaucoup plus prononce. On peut supposer que parmi les protines
cellulaires affectes se trouvent celles impliques dans les systmes de dfense primaire et
dans les activits protolytiques. Il a dailleurs t montr, dans le cas du vieillissement, que
laccumulation de protines endommages par oxydation et glycation contribuent, entre autre,
la baisse defficacit du systme protosomal (Bulteau, 2000; Petropoulos, 2000).

4. Conclusions et perspectives
Ce dernier travail montre bien limportance que requiert le choix du modle dAGEs
utilis pour les tudes physiopathologiques sur cellules in vitro. Nous avons pu mettre ici en
vidence le contraste dans les rponses biologiques dune ligne cellulaire humaine en
fonction de lorigine de lalbumine. Par ailleurs, en utilisant des modles in vitro mimant les
conditions physiopathologiques dune hyperglycmie, la rponse biologique au niveau
cellulaire nest pas assez marque et justifie, dans de nombreuses tudes, le choix de modles
dAGEs utilisant des conditions suprapathologiques (jusqu 1 M de glucose mis en prsence
dalbumine).
Dans la continuit des tudes portant sur la rponse biologique des monocytes et des
adipocytes humains soumis un stress glycoxydant, il serait pertinent dtudier limplication
des principaux rcepteurs aux AGEs (RAGE et CD36) dans la rponse inflammatoire
175

(cytokines, TNF) et oxydative (ROS) de ces deux modles cellulaires. Dans cette tude
mcanistique, il serait aussi particulirement intressant de suivre lactivit du facteur de
transcription NFB induite par les AGEs par le biais des rcepteurs RAGE et CD36.

176

PARTIE IV
Etude in vivo du statut redox et antiradicalaire de
lalbumine srique dans le cadre de la pathologie
diabtique

177

1. Introduction
Paradoxalement, le taux denzymes lactivit antioxydante est moins lev dans le
sang qu lintrieur des cellules, alors que le plasma sanguin, comparativement, semble plus
expos, un stress oxydatif soutenu. Le dficit en dfenses antioxydantes du plasma est alors
combl par sa protine la plus abondante, lalbumine, longtemps considre uniquement
comme une simple protine de transport. En effet de nombreux modles doxydation in vitro
ont mis en avant les proprits antioxydantes inhrentes cette protine plasmatique. Ses
proprits bnfiques intrinsques sont notamment attribues la prsence dun seul rsidu
cystine libre (Cys34) cible potentiel des oxydants, une structure tridimensionnelle permettant
lexposition de certains rsidus (Met, ) jouant le rle dponge oxydant et confrant la
protine des capacits de fixation de mtaux (Halliwell, 1988; Roche, 2008).

De nombreuses tudes, parmi lesquelles celles que nous avons menes prcdemment,
ont mis en vidence limpact de laltration in vitro de lalbumine sur ses proprits
fonctionnelles. Dune part, lagrgation induite la srum albumine bovine dans des
conditions non physiologiques (traitement thermique), entraine une diminution drastique de
ses capacits piger des radicaux libres et fixer le cuivre (Rondeau, 2007). Dautre part, la
glycation in vitro de lalbumine humaine ou bovine, par des concentrations modres en
glucose, affecte ses proprits antiradicalaires et modifie ltat redox de la protine
(Rondeau, 2008). De plus elle induit un stress glycoxydant au niveau cellulaire (Chesne,
2006 ; Singh, 2007). Dautres modles in vitro, qui ont mis en vidence la faible contribution
des antioxydants (catalase, SOD, glutathion peroxydase) dans lactivit antioxydante du
plasma (Blake, 1981; Halliwell, 1986), suggrent ainsi le rle cl jou par lalbumine comme
antioxydant de substitution dans le plasma (Musante, 2006). Mais quen est-il in vivo ?
Comment se comporte cette protine majeure du systme circulatoire dans le cas de
pathologies caractrises par loccurrence dun stress oxydant accru ?

Dans cette partie et en prolongement des tudes in vitro effectues prcdemment, jai
souhait valuer ltat redox, antioxydant et structural de lalbumine plasmatique dans le
cadre de la pathologie diabte.

178

Le diabte reprsente une pathologie qui se caractrise par une lvation chronique de
la glycmie. Lhyperglycmie associe un dsquilibre mtabolique, est due une
dficience de linsuline ou bien un dfaut de rponse des cellules cette hormone. Cette
maladie saccompagne gnralement dautres complications mtaboliques telles que les
micro- et macro-angiopathies. Lhyperglycmie persistante, la formation rsultante de
produits avancs de glycation et un stress oxydant accru seraient directement impliqus dans
le dveloppement des ces complications mtaboliques. De plus, les protines plasmatiques,
dont lalbumine, seraient les plus affectes par ces processus dltres.
Dans cette tude, je me suis donc intress aux paramtres structuraux et fonctionnels
(pouvoir antiradicalaire) du plasma et de son albumine purifie provenant dun panel de
sujets. Jai mesur les paramtres doxydation et les proprits antiradicalaires tout dabord au
niveau des plasmas et ensuite sur la fraction dalbumine aprs purification. Dans un deuxime
temps, jai cherch mettre en relation les modifications structurales et fonctionnelles de ces
plasmas et albumine avec les paramtres cliniques et biochimiques des patients.

2. Protocoles exprimentaux
a) Recrutement des sujets
Ltude porte sur les plasmas sanguins provenant de 54 sujets (20 hommes/ 34
femmes) recueillis auprs du service de biochimie du Centre Hospitalier de La Runion
(CHR- Saint-Denis). Le panel est divis en deux groupes (Tableau 3).

Ces groupes ont t dfinis selon le pourcentage dhmoglobine glyque. Parmi ces
sujets, 23 sont affects au groupe B avec une mesure du taux dhmoglobine glyque
(HbA1c) suprieur 7%. Le groupe A est constitu de 31 sujets dont le taux dhmoglobine
glyque est infrieur 6,8 %. Mme si nous disposons de nombreux paramtres cliniques
pour ces diffrents patients, nous navons aucune connaissance de leurs pathologies
ventuelles.

179

Groupe A

Groupe B

31

23

AGE

62,2 20,2

66,6 10,3

Paramtres cliniques
HbA1c (%)

5,74 0,58

Protine srique (g.l-1)

71,6 7,6

70,7 17,1

Ure (mmol.l-1)

8,90 9,21

9,33 6,16

Cratinine (mol.l-1)

136 146

111 44

Cholesterol (mmol.l )

4,37 1,20

4,20 1,62

HDL (mmol.l-1)

1,16 0,33

1,21 0,43

LDL (mmol.l-1)

2,78 1,08

2,33 1,30

Triglyceride (mmol.l-1)

1,07 0,46

1,11 0,39

-1

8,99 1,67

***

Tableau 3: Caractrisation des sujets participant ltude in vivo

b) Purification de lalbumine des plasmas

Lalbumine humaine est purifie partir des plasmas par chromatographie daffinit
sur du Bleu de Cibacron 3G coupl lagarose (Amersham). Le Bleu de Cibacron est un
colorant qui possde une forte affinit pour lalbumine. La chromatographie se ralise en
batch dans des tubes de 2 ml dans lesquels on conditionne 1 mL de gel Cibacron par plusieurs
lavages avec le tampon de liaison (Tris-HCl 50 mM, pH 7.4). 1 mL de plasma est dpos sur
le gel et incub pendant une heure faible agitation 4C. Le gel est ensuite incub 6 fois
avec 1 mL de tampon de liaison. Lalbumine est ensuite dcroche du gel laide du tampon
dlution (Tris-HCl 50 mM, NaCl 1,5 M, pH 7,4). Les deux premiers mL lus sont limins
et les 5 suivants sont conservs. La puret des fractions de lavage et dlution est value et
compare au plasma sur gel polyacrylamide 12% en condition native (Figure 26).

180

Figure 26: Electrophorse PAGE en condition native des fractions lues de plasmas

c) dosage de lalbumine purifie du plasma


Toutes les mesures de paramtres structuraux (fluorescence) et fonctionnels (thiol, KRL et
carbonyle), effectues sur la protine plasmatique, sont exprims en fonction de la quantit de
cette protine. La concentration en albumine purifie est dtermine par labsorbance 278
nm en utilisant le cfficient dextinction molaire de lalbumine : 278nm = 33064 mol.l-1.cm-1.

d) Dosage du taux de carbonyle par ELISA (tat redox)


Le taux de carbonylation des plasmas et des albumines correspondantes est dtermin partir
dun dosage immunoenzymatique (ELISA) direct, mis au point dans notre laboratoire, et dont
le principe repose sur la reconnaissance de la 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH) fixe sur
les sites carbonyls des protines par un anticorps anti-DNPH. Le protocole utilise en
Western-Blot (Rondeau, 2008; Singh, 2007) a t adapt pour le dosage en ELISA
(Rondeau, 2009). Le degr doxydation des plasmas et des albumines est dtermin partir
dune gamme standard de protines carbonyles.

e) Test KRL ou hmolyse des globules rouges (proprits antioxydantes)


Les proprits antiradicalaires des plasmas et des albumines correspondantes sont values
laide du test in vitro KRL bas sur la comparaison des cintiques dhmolyses des globules
rouges, induites par les radicaux libres en fonction des conditions exprimentales. Le
181

protocole est dvelopp dans les travaux prcdents (Rondeau, 2007; Rondeau, 2008). Pour
chaque plasma ou albumine purifie, on dterminera le temps de demi-hmolyse (HT50)
normalis par rapport au HT50 obtenu pour une hmolyse en prsence de PBS.

f) Etude de fluorescence
Les mesures de fluorescence, ralises sur la srum albumine isole du plasma, nous
apporterons des informations au niveau de la structure de la protine. Plusieurs mesures de
fluorescence sur lalbumine dilue (1,2 g/l) sont ralises :
-La fluorescence du tryptophane la longueur donde dexcitation de 280 nm et de 340 nm
pour lmission (Mooradian, 1996).
-La fluorescence du glycophore aux longueurs donde dexcitation et dmission respectives
de 350 nm et 425 nm (Ogino, 1995).
- La fluorescence de lacide 1-anilino-8-naphtalnesulfonique (ANSA) dont lmission est
obtenue 440 nm avec une longueur donde dexcitation 355 nm, est utilise comme un
marqueur fluorescent des sites hydrophobes de la protine (Stryer, 1965).
.

g) Dosage des groupements cystine libre (tat redox)


Le dosage des groupements thiols au niveau de lalbumine permet dvaluer le degr
doxydation de cette protine. Le protocole de dosage, bas sur la mthode dEllman et
largement dcrit dans nos prcdentes tudes, a t adapt ici pour lanalyse de faibles
volumes ractionnels en plaque 96 puits (Chesne, 2006; Rondeau, 2007; Rondeau, 2008).

h) Statistiques

La comparaison des moyennes observes pour chaque groupe et pour chaque


paramtre tudi, a t effectue en utilisant le test T de Student pour des series non
apparies. Les analyses multivaries des 54 chantillons et des paramtres cliniques et
exprimentaux, sont ralises laide du logiciel The Unscrumbler Version 7.1.

182

3. Rsultats
a) Paramtres doxydation et antiradicalaire au niveau des plasmas :
Les plasmas ont t obtenus partir dchantillons de sang centrifugs 2500 rpm et ont t
conservs 20C en vue des expriences suivantes.

- Etat redox des plasmas


Les rsultats de la comparaison du statut redox des diffrents plasmas, dtermin par
ELISA carbonyle, sont reprsents sous deux formes dans la figure 27 : dune part, la
moyenne du taux de carbonyle pour chaque groupe, dautre part ltat redox de chaque plasma
en fonction du taux dhmoglobine glyque (HbA1c).
Une augmentation significative (+10%, p<0,001) du taux doxydation est observe
pour le groupe de patients dont le taux dhmoglobine glyque est suprieure 7% (Figure
27b). Par ailleurs, une corrlation significative (r2 = 0.22, p<0,001) a pu tre tablie entre les
taux de carbonyle et de HbA1c (Figure 27a). Il est signaler que laugmentation du taux de
carbonyle est troitement corrle avec la concentration en protines dans le plasma (r2 =
0.31, p<0,0001).

b
Figure 27: Taux de carbonyle (%) dans les diffrents plasmas

a) Corrlation entre le taux de carbonyle et dhmoglobine glyque (HbA1c) ; b) Taux de


carbonyle compar entre les groupes A et B. La significativit est dtermine par le test t de
Student pour sries non apparies. ** p<0.001.
183

- Capacits antiradicalaires des plasmas


Les capacits antioxydantes des plasmas sont dtermines partir du test dhmolyse
induite par les radicaux libres. Ce test permet dvaluer la facult des diffrents plasmas
neutraliser les radicaux libres et ainsi retarder lhmolyse. Le temps de demi-hmolyse (HT50)
traduit cette capacit antiradicalaire.
Les rsultats prsents (Figure 28b), mettent en vidence limportance des proprits
antioxydantes des plasmas appartenant aux deux groupes avec une augmentation du HT50
autour de 200% (p<0,0001) par rapport lhmolyse en absence de plasma (PBS). Par contre,
aucune diffrence significative du HT50 moyen, nest observe entre les deux groupes. Par
ailleurs, le HT50 de lensemble des plasmas ne prsente pas de corrlation significative (p=
0,251) avec le taux dhmoglobine glyque (Figure 28a).

Figure 28: Temps de demi-hmolyse HT50 (% par rapport PBS) dans les diffrents plasmas
a) Corrlation entre le HT50 et le taux dhmoglobine glyque (HbA1c) ; b) HT50 moyen
compar entre les groupes A et B et le contrle (PBS). La significativit est dtermine par le
test t de Student pour sries non apparies. *** p<0,0001 (comparaison avec PBS).

Enfin, la variabilit du pouvoir antioxydant en fonction des plasmas nest aucunement


lie la quantit de protines plasmatiques (r2 = 0.01, p=0,45). Le pouvoir protecteur exerce
par le plasma contre les radicaux libres semble davantage li la qualit fonctionnelle des
protines constituantes du plasma, parmi lesquelles lalbumine reste la plus abondante.
Dans la suite de ltude, nous nous focalisons sur les proprits intrinsques
(structurales, redox et antioxydantes) de lalbumine purifie de ces plasmas afin notamment
dvaluer la contribution de cette protine dans les proprits biologiques du plasma.
184

b) Paramtres structuraux, redox et antioxydant au niveau des albumines :


- Paramtres structuraux :
Diffrentes missions de fluorescence sont mesures au niveau des albumines purifies afin
deffectuer une comparaison, dun point de vue structural, de lalbumine des diffrents sujets.
Trois mesures de lmission de fluorescence sont ralises :
-

celle du tryptophane

celle du glycophore

celle de lANSA

Les principaux paramtres struturaux relatifs aux deux groupes sont rsums dans le tableau 4 :
Groupe A

Groupe B

ANSA (AU) Ex: 355nm Em: 440 nm

4818 732

4425 672*

Glycophore (AU) Ex: 350nm Em: 425 nm

1850 320

2071 300*

Tryptophane (AU) Ex: 280nm Em: 340 nm

1337 493

1618 408*

Fluorescence

Tableau 4: Principaux paramtres de fluorescence des SAH provenant des sujets des groupes A et B
La significativit est dtermine par le test t de Student pour sries non apparies. * p<0.05.

Contrairement aux variations de fluorescence constates dans les tudes prcdentes


(Rondeau, 2009) lorsque la SAB est glyque in vitro, une augmentation significative de la
fluorescence du tryptophane (p<0.05) et une diminution de lhydrophobicit (ANSA) (p<0.05),
sont observes sur les albumines du groupe B dont le taux dHbA1c moyen est plus lev. En
effet, le modle in vitro dAGE driv de lalbumine bovine se caractrise par un quenching de
fluorescence du tryptophane et une augmentation de la fluorescence de lANSA par rapport la
forme native traduisant un changement conformationnel qui ne semble pas tre identique celui
observ chez les albumines in vivo. Par contre, de telles modifications structurales chez
lalbumine humaine modifie in vitro par glycation nont pas t dcrites jusqu prsent.
Cependant, loxydation de la forme humaine de lalbumine par de la Chloramine T a mis en
vidence un quenching de fluorecence aussi bien pour le tryptophane que pour lANSA
(Bourdon, 2005). Ces deux paramtres structuraux (ANSA et tryptophane) prsentent dailleurs
une corrlation inverse significative (Figure 29).
185

Figure 29: Relation entre les missions de fluorescence de lANSA et du tryptophane (UA)

Concernant lmission de fluorescence du glycophore, caractristique de la formation de


produits avancs de glycation, une augmentation significative est observe pour le groupe B
(+15%, p<0,0001) par rapport au groupe de sujets prsentant une hmoglobine glyque
infrieure 6,8% (Figure 30b). Il est noter que lors dune tude prcdente, laugmentation de
cette fluorescence a galement t observe sur des modles in vitro dAGE driv de la SAH
(Rondeau, 2008). De plus ce paramtre structural prsente une corrlation significative avec
lhmoglobine glyque (Figure 30a).

b
Figure 30: Emission de fluorescence du glycophore dans les SAH purifies

a) Corrlation entre lmission de fluorescence du glycophore rapporte la quantit de


protine (UA) et le taux dhmoglobine glyque (HbA1c) ; b) lmission de fluorescence du
glycophore moyen compare entre les groupes A et B. La significativit est dtermine par le
test t de Student pour sries non apparies. *** p<0.0001.

186

- Etat redox des albumines


Contrairement aux rsultats obtenus au niveau des plasmas, le taux de carbonyles des
SAH des diffrents sujets ne permettent pas de diffrencier les deux groupes. De plus, les
variations ne sont significativement pas corrles au taux dhmoglobine glyque.

- Capacits antiradicalaires des albumines


Si le temps de demi-hemolyse HT50 au niveau des plasmas nest pas apparu comme un paramtre
de discrimination entre les deux groupes, au niveau de lalbumine purifie, une augmentation
significative (+ 10%, p<0,05) de la capacit antiradicalaire est observe pour le groupe B par
rapport au groupe A (Figure 31).

Figure 31: HT50 des SAH compar entre les groupes A et B


La significativit est dtermine par le test t de Student pour sries non apparies. * p<0.05.
Comme dans le cas du plasma, aucune corrlation ne peut tre tablie entre la capacit
antiradicalaire de la SAH et lhmoglobine glyque. Par contre, partir des rsultats de HT50
obtenus pour les plasmas et leurs albumines purifies, nous pouvons corrler significativement
ces deux paramtres attestant de la contribution majeure de lalbumine dans les dfenses
antiradicalaires (Figure 32).

187

Figure 32: Corrlation entre HT50 plasmas et HT50/qt de protine SAH


- Dosage des thiols
Le dosage des groupements thiol par la mthode dEllmann permet de diffrencier
significativement les deux groupes avec une altration de ces groupements beaucoup importante
(+ 15%, p < 0,001) dans le groupe B (Figure 33a). Loxydation des thiols est corrle au taux
dhmoglobine glyque (Figure 33b). Ce rsultat peut tre mis en relation directe avec
loxydation de lalbumine observe aprs glycation de la protine (tude in vitro).

b
Figure 33: Nombre de mole de thiols par mole dalbumine

a) Corrlation entre le nombre de thiol par mole de protine et le taux dhmoglobine glyque
(HbA1c) ; b) le nombre de thiol moyen compare entre les groupes A et B. La significativit
est dtermine par le test t de Student pour sries non apparies. ** p<0.001.

188

c) Relation structure / fonctions:


Les corrlations entre les diffrents paramtres cliniques et experimentaux ont t
values travers des analyses multivaries en utilisant les 8 paramtres exprimentaux obtenues
(carbonyle, HT50, 3 fluorescences, et thiols) et les 9 paramtres cliniques appliqus au panel de
54 plasmas et de leurs albumines purifies.
Lanalyse en composante principale (ACP) nous permet de gnerer une carte factorielle
(Figure 34) permettant de visualiser le positionnement des 54 sujets selon les deux axes les plus
informatifs (PC1 et PC2).

Figure 34 : Carte factorielle des 54 individus du panel dtude tablie selon les axes 1 et 2
() Individus appartenant au groupe A ; () individus appartenant au groupe B

On peut observer que la totalit des paramtres (cliniques et exprimentaux) permettent de


sparer la population des 54 sujets selon les deux groupes tablis au dbut de ltude (suivant le
% HbA1c). Toutefois, les deux premiers axes ne decrivent que 42% de linformation globale.
De la mme manire, lACP nous a permis de gnrer une cate factorielle des variables
paramtriques permettant de visualiser sur les axes 1 et 2 des corrlations ventuelles (Figure
35).

189

Figure 35 : Carte factorielle des 17 variables du panel dtude tablie selon les axes 1 et 2
() Paramtres cliniques ; () Paramtres exprimentaux.

Si quelques correlations sont mises vidence entre certains paramtres cliniques


(Cratinine/Ure ou Cholestrol total/Cholestrol-LDL) par le biais de cette carte, nous ne
sommes pas en mesure dtablir des corrlations significatives entre des variables dcrivant la
struture (fluorescence ou thiol) et celle refltant la capacit antioxydante de la protine (HT50).

4. Discussion
Les rsultats obtenus ici, sont interprter avec prcaution car le panel de plasmas
utilis nest pas totalement adapt aux objectifs fixs pour cette tude. En effet, si nous
pouvons considrer les sujets dont le taux dhmoglobine glyque est suprieure 7% comme
des tats dhyperglycmie mal contrls provenant dun tat diabtique, nous navons aucune
information quand leur type de diabte ventuel. Par ailleurs, nous navons aucune
information sur la qualit sanitaire des sujets constituant le groupe A (Hb1Ac < 6,8 %). Une
partie de ces sujets sont probablement des diabtiques dont lhyperglycmie est bien
contrle, dautres sujets peuvent prsenter des pathologies autres que le diabte. Enfin, nous
navons aucune connaissance des traitements ventuels suivis par les sujets de cette tude.
Lhtrognit de ce groupe rend ainsi les rsultats sur les diffrents marqueurs (statut redox,
190

antiradicalaire) plus difficile interprter. Par ailleurs, notre panel de patients prsente une
mauvaise distribution en termes de % dHb1Ac dans la mesure o le nombre dindividus avec
une hmoglobine glyque trs leve (< 10% ; 7 individus) est faible par rapport celui ayant
un Hb1Ac trs faible (< 6% ; 24).

Dans ce travail nous avons tout de mme constat une augmentation significative
(+10%) de ltat doxydation des plasmas avec le taux lev dhmoglobine glyque. Cette
altration accrue ne se retrouve pas au niveau de la HSA purifie. Ce qui pourrait sexpliquer
par le fait que lalbumine, bien que protine plasmatique majoritaire, nest pas la seule
protine sensible loxydation. Concernant le statut antiradicalaire de lalbumine, celui-ci
semble plutt se renforcer avec laugmentation de lhmoglobine glyque.

Ces rsultats ne vont pas totalement dans le sens de ce que nous avons obtenus dans
les tudes in vitro. En effet, si nous avons constat une augmentation de laltration de type
oxydatif de lalbumine humaine modifie par glycation, ces phnomnes ont galement une
incidence dltre sur ses proprits antiradicalaires. In vivo, la glycation nest pas le seul
processus qui peut entrainer une altreration des proprits antioxydantes de lalbumine.

Dun point de vue structural, nous avons mis en vidence une augmentation de
lmission de fluorescence du glycophore de lalbumine, caractristique des produits avancs
de glycation, en corrlation avec le taux dhmoglobine glyque. Cette augmentation a t
galement constate sur nos modles in vitro. Il en est de mme pour le statut redox du rsidu
cystine dont loxydation est constate aussi bien in vitro quin vivo. Lanalyse globale de
toutes ces donnes nous a permis de discriminer nos groupes de dpart tabli en fonction du
taux dhmoglobine glyque. Par contre, il na pas t possible dtablir des corrlations
significatives entre les proprits structurales de la protine et ses proprits fonctionnelles.

191

5. Conclusion et perspectives
En resum, nous observons une altration de certaines proprits intrinsques de
lalbumine (thiol, changement conformationnel) lie avec laugmentation du taux
dhmoglobine glyque. Ces rsultats semblent conforter gnralement les tudes effectues
in vitro. Cependant les conclusions que lon peut tirer de cette comparaison in vitro et in vivo
sont nuancer dans la mesure o le paramtre % HbA1c ne constitue en aucune faon un
marqueur suffisant pour conclure sur ltat diabtique dun sujet.
Ce travail constitue un prliminaire une tude beaucoup plus vaste visant
dmontrer que lalbumine peut constituer un bio-marqueur de choix du statut redox dans la
pathologie diabtique. Le but tant dtablir des corrlations entre les paramtres
biochimiques de patients dont on connat clairement le type de pathologie avec les proprits
structurales et fonctionnelles de lalbumine. A travers cette tude in vivo, il serait
particulirement intressant de suivre laffinit de la protine plasmatique pour certains
mtabolites (acides gras, mdicaments) suivant le degr de gravit du diabte.

Dans le mme esprit, le statut redox et antioxydant de lalbumine pourrait faire lobjet
dautres tudes in vivo concernant dautres pathologies, comme lAtaxie de Freidreich. Cette
maladie gntique autosomique rcessive se caractrise par des troubles neurologiques,
affectant la coordination des mouvements (ataxie) et de la parole (dysarthrie) avec des
complications dordre mtabolique (diabte) et des dysfonctionnements cardiaques (Ristow,
2003). Un stress oxydatif accru a t mise en vidence chez les patients atteints de cette
maladie, par leffet bnfique de traitements antioxydants dans le recouvrement de certaines
fonctions (Rotig, 2002). Lanalyse structurale et fonctionnelle de lalbumine chez ces patients
permettrai peut tre dapporter de nouveaux lments concrets de comprhension sur
limplication de cette protine comme marqueur du stress oxydant dans cette pathologie.

192

193

194

CONCLUSIONS GENERALES ET
PERSPECTIVES

195

196

Les travaux prsents dans ce manuscrit proposent de nouveaux lments sur le statut
structural, redox et antioxydant de lalbumine soumise des conditions non physiologiques ou
pathologiques, ainsi que les interactions entre ces diffrents paramtres (Figure 34).
Du point de vue structural, nous avons dmontr que les changements
conformationnels de lalbumine bovine ne sont pas similaires lors des processus de glycation
et dagrgation. Lvolution conformationnelle au niveau des poches hydrophobes de la
protine tant diffrente, limpact sur ses proprits fonctionnelles en est la consquence
directe. En effet, lagrgation induit une perte daffinit pour lion cuivre et une diminution de
son activit antiradicalaire, alors que le processus de glycation favorise ces deux proprits.
Par ailleurs, la structure tridimensionnelle adopte par lalbumine glyque ne favorise pas
celle-ci former des agrgats. Cette perte de susceptibilit lagrgation peut tre attribue
non seulement la conformation spcifique au niveau des sites hydrophobes, mais galement
ltat doxydation du seul groupement thiol libre, Cys34.
Paradoxalement, si le processus de glycation de la forme bovine de lalbumine native
saccompagne dun changement de ltat redox de la protine, avec une carbonylation accrue
ainsi quune oxydation du rsidu Cys34, les proprits antioxydantes (antiradicalaire et
affinit pour le cuivre (II)) se retrouvent davantage renforces plutt qualtres. De plus, les
AGEs drivs de lalbumine bovine stimulent aussi bien lexpression des rcepteurs
cellulaires RAGE et CD36 au niveau de cellules adipocytaires et monocytaires. Dans ces deux
modles cellulaires, un stress oxydant est observ, accompagn dune carbonylation accrue
des protines intracellulaires. Certaines protines particulirement sensibles loxydation ont
t identifies au niveau des cellules dadipocytes humains. Cest le cas des protines

annexine A2 et -actine (ACTB), qui ont la particularit dinteragir entre elles. Laltration
oxydative de lune des deux protines, voire des deux pourrait, peut tre, affecter cette
interaction. Une des consquences du stress oxydant intracellulaire gnr par les AGEs
drivs de lalbumine bovine, au niveau des monocytes humains (THP1), est une
augmentation notoire des activits protolytiques du protasome. Ici, lalbumine modifie ne
peut plus remplir totalement sa fonction dantioxydant, les systmes protolytiques jouent
alors leurs rles dans la dgradation des protines oxydes.
Bien quil y ait une grande similitude structurale entre la forme bovine (SAB) et la
forme humaine (SAH), il est apparu que les modles in vitro dAGEs issus de ces deux
formes ont des statuts structuraux, redox et antioxydant sensiblement diffrents. En effet,
mme si les modifications structurales et conformationnelles de la SAH glyque nont pas t
tudies, il semble que cette protine soit globalement moins sensible loxydation par
197

rapport la SAB. Par ailleurs et contrairement son homologue bovin, la glycoxydation de la


SAH affecte de faon plus significative ses proprits antioxydantes (activit antiradicalaire et
affinit pour le cuivre). Par contre, avec un stress oxydant plus prononc et une expression
accrue du rcepteur RAGE, la rponse biologique des monocytes humains soumis ce
modle in vitro dAGEs est beaucoup plus probante. Enfin, ce stress oxydant intracellulaire
plus important semble altrer de faon plus consquente les protines des cellules
monocytaires, un degr tel que des protines (LMP2,..) impliques dans certaines activits
protolytiques du protasome, se retrouvent affectes au niveau de leur expression. Dans ce
cas prcis, le protasome ne peut plus remplir son rle dlimination des protines
dfectueuses.
Comme nous avons pu le voir dans les diffrentes tapes de ce travail, la moindre
altration de lalbumine se traduit par un changement conformationnel et une modification de
ses proprits intrinsques. Par ailleurs, certains rsultats qui apparaissent discordants, mettent
en avant toute la complexit de la structure de lalbumine et des proprits antioxydantes qui
lui incombent. En effet, les diffrentes tudes montrent que lalbumine bovine glyque
induit un stress oxydant intracellulaire alors que dans le mme temps, ses capacits de
pigeage de radicaux libres ou de fixation du cuivre sont renforces. La multitude de sites
(mthionine, Cys34, DAHK) contribuant aux proprits antioxydantes de la protine
plasmatique peut expliquer la contradiction de ces rsultats. Les modifications structurales
spcifiques induites par la glycation, mises en vidence lors de la premire tude, peuvent
apporter un dbut de rponse laugmentation des capacits antiradicalaires de lalbumine
glyque.

Les deux aspects, structural et biologique peuvent avoir une rpercussion sur la
physiologie des cellules et des tissus exposs cette protine circulante. Ainsi, dans la
pathologie diabtique, les changements physiologiques et pathologiques de lalbumine lis au
processus de glycoxydation, permettent de mieux comprendre limplication probable de cette
protine dans les complications mtaboliques lies cette pathologie.

En effet, dans notre tude in vivo, jai pu notamment tablir des corrlations entre les
paramtres antioxydants et structuraux de lalbumine dune part et la svrit de la
pathologie diabte (en termes dhmoglobine glyque).

198

Par rapport ces diffrentes tudes, quelques questions demeurent et restent


lucider :
- Mme si la conformation spcifique des sites hydrophobes et le statut redox de la cystine34
semblent impliqus dans le statut antioxydant de la protine, cet interaction structure/
fonction doit tre valide ([1], Figure 36). Ltude structurale de lalbumine humaine
modifie par glycation telle quelle a t ralise sur la forme bovine pourrait apporter des
lments de validation.
- De mme, ltude de la susceptibilit lagrgation de lalbumine modifie par glycation
pourrait tre ralise sur la forme humaine afin de valider limplication des poches
hydrophobes et le statut redox de la cystine 34 dans le processus agrgatif ([2], Figure 36).
- Dans le cas prcis de ltude des proprits des protines adipocytaires particulirement
sensibles la glycoxydation, il serait intressant de mettre en vidence en quoi laltration
de ces protines intracellulaires peuvent affecter certains mcanismes cellulaires ([3],
Figure 36). Par ailleurs, il serait pertinent, en utilisant les mmes mthodologies
(protomique), de dterminer les protines adipocytaires exclusivement exprimes lors dun
stress glycoxydatif ([4], Figure 36).

Au del des tudes complmentaires mentionnes prcedemment, lensemble des


rsultats prsents dans ce travail suscite de nouvelles voies dinvestigation mettant en avant
les rles cls de lalbumine dans le systme circulatoire :
Il faut rappeler que lalbumine possde des fonctionnalits aussi nombreuses que
diverses, qui passent par le transport de mtabolites, de fixation, de rgulation de la pression
oncotique et le pouvoir antioxydant. Tout au long de ce travail, je me suis principalement
focalis sur lvolution de son tat redox ainsi sur ses activits antioxydantes en relation avec
ses modifications structurales. Ltude que jai ralis sur laffinit de la protine plasmatique
modifie pour lion cuivre, un ligand cationique, constitue un aspect de ces proprits
antioxydantes. Parmi les fonctions importantes qui nont pas t abord dans cette tude,
laffinit de lalbumine pour de nombreux mtabolites exognes et endognes constitue un
vaste champ dtude qui trouve toute sa place dans le cas de la pathologie diabtique. Les
composs susceptibles dtre transport par la protine sont nombreux parmi lesquels on
retrouve les acides gras, la bilirubine mais aussi les agents thrapeutiques. Ainsi, lalbumine
joue un rle important dans la pharmacocintique et dynamique de mdicaments quelle fixe.
Cette implication de lalbumine dans la thrapie galnique prend toute son importance dans le
cas du traitement mdicamenteux du diabte.
199

Figure 36 : Schma bilan sur les relations structure et fonction des albumines altres
200

En effet, linsulinothrapie fait appel des analogues de linsuline qui ont la


particularit de se fixer lalbumine. Dans ce cadre l, et comme abord dans les conclusions
de la premire partie, nous pourrions nous intresser dans un premier lieu linteraction entre
lalbumine et le Dtemir en faisant appel de nouvelles techniques (RMN, microscopie
infrarouge) ([5], Figure 36). De mme, une tude de laffinit de lalbumine modifie par
glycation pour les acides gras trouverait toute sa place dans la comprhension de la relation
diabte/obsit et de tous les mcanismes qui en dcoulent ([5], Figure 36). Enfin cette
dmarche pourrait tre tendue dautres medicaments ayant une forte affinit pour la
protine plasmatique comme le ketoprofen, libuprofen et la warfarine.

201

202

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

203

1. Ahmed, N., Argirov, O.K., Minhas, H.S., Cordeiro, C.A., and Thornalley, P.J., Assay of
advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with
derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to
Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin.
Biochem J, 2002. vol.364(Pt 1): p. 1-14.
2.

Ahmed, N., Dobler, D., Dean, M., and Thornalley, P.J., Peptide mapping identifies
hotspot site of modification in human serum albumin by methylglyoxal involved in ligand
binding and esterase activity. J Biol Chem, 2005a. vol.280(7): p. 5724-32.

3.

Ahmed, N. and Thornalley, P.J., Peptide mapping of human serum albumin modified
minimally by methylglyoxal in vitro and in vivo. Ann N Y Acad Sci, 2005b. vol.1043: p.
260-6.

4. Ailhaud, G., Adipose tissue as an endocrine organ. Int J Obes Relat Metab Disord, 2000.
vol.24 Suppl 2: p. S1-3.
5. Alt, N., Carson, J.A., Alderson, N.L., Wang, Y., Nagai, R., Henle, T., Thorpe, S.R., and
Baynes, J.W., Chemical modification of muscle protein in diabetes. Arch Biochem
Biophys, 2004. vol.425(2): p. 200-6.
6.

Ames, B.N., Shigenaga, M.K., and Hagen, T.M., Oxidants, antioxidants, and the
degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. vol.90(17): p. 7915-22.

7.

Aouba, A., Pquignot, F., Le Toullec, A., and Jougla, E., Medical causes of death in
France in 2004 and trends 1980-2004. Bulletin pidmiologique hebdomadaire, 2007: p.
308-315.

8.

Appleton, D.W. and Sarkar, B., The absence of specific copper (II)-binding site in dog
albumin. A comparative study of human and dog albumins. J Biol Chem, 1971.
vol.246(16): p. 5040-6.

9.

Arvanitakis, Z., Wilson, R.S., Bienias, J.L., Evans, D.A., and Bennett, D.A., Diabetes
mellitus and risk of Alzheimer disease and decline in cognitive function. Arch Neurol,
2004. vol.61(5): p. 661-6.

10. Aymard, P., Durand, D., and Nicolai, T., The effect of temperature and ionic strength on
the dimerisation of beta-lactoglobulin. Int J Biol Macromol, 1996. vol.19(3): p. 213-21.
11.

Bal, W., Christodoulou, J., Sadler, P.J., and Tucker, A., Multi-metal binding site of
serum albumin. J Inorg Biochem, 1998. vol.70(1): p. 33-9.

12.

Balkau, B., Deanfield, J.E., Despres, J.P., Bassand, J.P., Fox, K.A., Smith, S.C., Jr.,
Barter, P., Tan, C.E., Van Gaal, L., Wittchen, H.U., Massien, C., and Haffner, S.M.,
International Day for the Evaluation of Abdominal Obesity (IDEA): a study of waist
circumference, cardiovascular disease, and diabetes mellitus in 168,000 primary care
patients in 63 countries. Circulation, 2007. vol.116(17): p. 1942-51.

13. Bar-Or, D., Rael, L.T., Lau, E.P., Rao, N.K., Thomas, G.W., Winkler, J.V., Yukl, R.L.,
Kingston, R.G., and Curtis, C.G., An analog of the human albumin N-terminus (Asp-AlaHis-Lys) prevents formation of copper-induced reactive oxygen species. Biochem
Biophys Res Commun, 2001a. vol.284(3): p. 856-62.
14.

Bar-Or, D., Thomas, G.W., Rael, L.T., Lau, E.P., and Winkler, J.V., Asp-Ala-His-Lys
(DAHK) inhibits copper-induced oxidative DNA double strand breaks and telomere
shortening. Biochem Biophys Res Commun, 2001b. vol.282(1): p. 356-60.

15.

Barone, G., Giancola, C., and Verdoliva, A., DSC studies of the denaturation and
aggregation of serum albumin. Thermochim. Acta, 1992. vol.199: p. 197-205.
204

16. Barzegar, A., Moosavi-Movahedi, A.A., Sattarahmady, N., Hosseinpour-Faizi, M.A.,


Aminbakhsh, M., Ahmad, F., Saboury, A.A., Ganjali, M.R., and Norouzi, P.,
Spectroscopic studies of the effects of glycation of human serum albumin on L-Trp
binding. Protein Pept Lett, 2007. vol.14(1): p. 13-8.
17. Baynes, J.W. and Thorpe, S.R., Role of oxidative stress in diabetic complications: a new
perspective on an old paradigm. Diabetes, 1999. vol.48(1): p. 1-9.
18. Baynes, J.W., Thorpe, S.R., and Murtiashaw, M.H., Nonenzymatic glucosylation of
lysine residues in albumin. Methods Enzymol, 1984. vol.106: p. 88-98.
19. Bechtold, W.E., Willis, J.K., Sun, J.D., Griffith, W.C., and Reddy, T.V., Biological
markers of exposure to benzene: S-phenylcysteine in albumin. Carcinogenesis, 1992.
vol.13(7): p. 1217-20.
20. Berlett, B.S. and Stadtman, E.R., Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress.
J Biol Chem, 1997. vol.272(33): p. 20313-6.
21.

Biemel, K., Reihl, O., Conrad, J., and Lederer, M., Formation pathways for lysinearginine cross-links derived from hexoses and pentoses by Maillard processes. J Biol
Chem 2001. vol.276: p. 2340523412.

22.

Biteau, B., Labarre, J., and Toledano, M.B., ATP-dependent reduction of cysteinesulphinic acid by S. cerevisiae sulphiredoxin. Nature, 2003. vol.425(6961): p. 980-4.

23.

Blache, D., Bouthillier, D., and Davignon, J., Acute influence of smoking on platelet
behaviour, endothelium and plasma lipids and normalization by aspirin. Atherosclerosis,
1992. vol.93(3): p. 179-88.

24.

Blake, D.R., Hall, N.D., Treby, D.A., Halliwell, B., and Gutteridge, J.M., Protection
against superoxide and hydrogen peroxide in synovial fluid from rheumatoid patients.
Clin Sci (Lond), 1981. vol.61(4): p. 483-6.

25. Boldogh, I., Bacsi, A., Choudhury, B.K., Dharajiya, N., Alam, R., Hazra, T.K., Mitra, S.,
Goldblum, R.M., and Sur, S., ROS generated by pollen NADPH oxidase provide a signal
that augments antigen-induced allergic airway inflammation. J Clin Invest, 2005.
vol.115(8): p. 2169-79.
26. Bordas-Fondrede, M., Sauser, E., Jardel, C., Jaudon, M.C., Thervet, F., Rottembourg, J.,
and Delattre, J., Glycosylated plasma proteins in chronic renal failure. Ann Biol Clin
(Paris), 1990. vol.48(10): p. 717-21.
27. Bourdon, E., Loreau, N., and Blache, D., Glucose and free radicals impair the antioxidant
properties of serum albumin. Faseb J, 1999. vol.13(2): p. 233-44.
28. Bourdon, E., Loreau, N., Lagrost, L., and Blache, D., Differential effects of cysteine and
methionine residues in the antioxidant activity of human serum albumin. Free Radic Res,
2005. vol.39(1): p. 15-20.
29. Boyd, A.C., Abdel-Wahab, Y.H., McKillop, A.M., McNulty, H., Barnett, C.R., O'Harte,
F.P., and Flatt, P.R., Impaired ability of glycated insulin to regulate plasma glucose and
stimulate glucose transport and metabolism in mouse abdominal muscle. Biochim Biophys
Acta, 2000. vol.1523(1): p. 128-34.
30.

Brands, R., Slot, J.W., and Geuze, H.J., Albumin localization in rat liver parenchymal
cells. Eur J Cell Biol, 1983. vol.32(1): p. 99-107.

31.

Brodersen, R., Bilirubin transport in the newborn infant reviewed with relation to
kernicterus. J Pediatr, 1980. vol.96: p. 349-56.
205

32.

Brot, N., Rahman, M.A., Moskovitz, J., and Weissbach, H., Escherichia coli peptide
methionine sulfoxide reductase: cloning, high expression, and purification. Methods
Enzymol, 1995. vol.251: p. 462-70.

33. Brot, N. and Weissbach, H., Biochemistry and physiological role of methionine sulfoxide
residues in proteins. Arch Biochem Biophys, 1983. vol.223(1): p. 271-81.
34. Brown, J.R., Structure of bovine serum albumin. Fed Proc, 1975. vol.34: p. 591.
35.

Brownlee, M., Cerami, A., and Vlassara, H., Advanced glycosylation end products in
tissue and the biochemical basis of diabetic complications. N Engl J Med, 1988.
vol.318(20): p. 1315-21.

36.

Brownlee, M., Vlassara, H., and Cerami, A., Inhibition of heparin-catalyzed human
antithrombin III activity by nonenzymatic glycosylation. Possible role in fibrin deposition
in diabetes. Diabetes, 1984. vol.33(6): p. 532-5.

37. Bryant, C. and McClements, D.J., Molecular basis of protein functionality with special
consideration of cold-set gels derived from heat-denatured whey. Trends in Food Science
and Technology, 1998. vol.9: p. 143-151.
38. Bryszewska, M. and Szosland, K., Association between the glycation of erythrocyte
membrane proteins and membrane fluidity. Clin Biochem, 1988. vol.21(1): p. 49-51.
39. Bubici, C., Papa, S., Pham, C.G., Zazzeroni, F., and Franzoso, G., NF-kappaB and JNK:
an intricate affair. Cell Cycle, 2004. vol.3(12): p. 1524-9.
40. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., and Hof, P.R., Tau protein
isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res
Rev, 2000. vol.33(1): p. 95-130.
41. Bulteau, A.L., Petropoulos, I., and Friguet, B., Age-related alterations of proteasome
structure and function in aging epidermis. Exp Gerontol, 2000. vol.35(6-7): p. 767-77.
42. Bulteau, A.L., Verbeke, P., Petropoulos, I., Chaffotte, A.F., and Friguet, B., Proteasome
inhibition in glyoxal-treated fibroblasts and resistance of glycated glucose-6-phosphate
dehydrogenase to 20 S proteasome degradation in vitro. J Biol Chem, 2001. vol.276(49):
p. 45662-8.
43. Carballal, S., Alvarez, B., Turell, L., Botti, H., Freeman, B.A., and Radi, R., Sulfenic acid
in human serum albumin. Amino Acids, 2007. vol.32(4): p. 543-51.
44. Carballal, S., Radi, R., Kirk, M.C., Barnes, S., Freeman, B.A., and Alvarez, B., Sulfenic
acid formation in human serum albumin by hydrogen peroxide and peroxynitrite.
Biochemistry, 2003. vol.42(33): p. 9906-14.
45. Carmel, J.F., Tarnus, E., Cohn, J.S., Bourdon, E., Davignon, J., and Bernier, L., High
expression of apolipoprotein E impairs lipid storage and promotes cell proliferation in
human adipocytes. J Cell Biochem, 2009.
46. Carter, D.C. and Ho, J.X., Structure of serum albumin. Adv Protein Chem, 1994. vol.45:
p. 153-203.
47. Ceriello, A., Mercuri, F., Quagliaro, L., Assaloni, R., Motz, E., Tonutti, L., and Taboga,
C., Detection of nitrotyrosine in the diabetic plasma: evidence of oxidative stress.
Diabetologia, 2001. vol.44(7): p. 834-8.
48. Chappey, O., Dosquet, C., Wautier, M.P., and Wautier, J.L., Advanced glycation end
products, oxidant stress and vascular lesions. Eur J Clin Invest, 1997. vol.27(2): p. 97108.
206

49.

Charles, M.A., Eschwege, E., and Basdevant, A., Monitoring the obesity epidemic in
France: the Obepi surveys 1997-2006. Obesity (Silver Spring), 2008. vol.16(9): p. 2182-6.

50. Charonis, A.S., Reger, L.A., Dege, J.E., Kouzi-Koliakos, K., Furcht, L.T., Wohlhueter,
R.M., and Tsilibary, E.C., Laminin alterations after in vitro nonenzymatic glycosylation.
Diabetes, 1990. vol.39(7): p. 807-14.
51. Cheeseman, K.H. and Slater, T.F., An introduction to free radical biochemistry. Br Med
Bull, 1993. vol.49(3): p. 481-93.
52.

Chesne, S., Rondeau, P., Armenta, S., and Bourdon, E., Effects of oxidative
modifications induced by the glycation of bovine serum albumin on its structure and on
cultured adipose cells. Biochimie, 2006.

53. Cheta, D., Manciulea, M., Santu, E., Georgescu, M., Perciun, R., Sulica, A., and Mincu,
I., Not only quantitative but also qualitative changes of serum immunoglobulins in
diabetes mellitus. Rom J Intern Med, 1991. vol.29(3-4): p. 181-7.
54. Chetyrkin, S.V., Mathis, M.E., Ham, A.J., Hachey, D.L., Hudson, B.G., and Voziyan,
P.A., Propagation of protein glycation damage involves modification of tryptophan
residues via reactive oxygen species: inhibition by pyridoxamine. Free Radic Biol Med,
2008. vol.44(7): p. 1276-85.
55. Chew, B.P. and Park, J.S., Carotenoid action on the immune response. J Nutr, 2004.
vol.134(1): p. 257S-261S.
56. Chiti, F., Taddei, N., Baroni, F., Capanni, C., Stefani, M., Ramponi, G., and Dobson,
C.M., Kinetic partitioning of protein folding and aggregation. Nat Struct Biol, 2002.
vol.9(2): p. 137-43.
57. Choi, Y.G., Kim, J.I., Jeon, Y.C., Park, S.J., Choi, E.K., Rubenstein, R., Kascsak, R.J.,
Carp, R.I., and Kim, Y.S., Nonenzymatic glycation at the N terminus of pathogenic prion
protein in transmissible spongiform encephalopathies. J Biol Chem, 2004. vol.279(29): p.
30402-9.
58. Cohen, M.P., Diabetes and Protein Glycation. 1986, New York: Springer-Verlag Inc.
144.
59. Cohen, M.P., Intervention strategies to prevent pathogenetic effects of glycated albumin.
Arch Biochem Biophys, 2003a. vol.419(1): p. 25-30.
60. Cohen, M.P., Shea, E., Chen, S., and Shearman, C.W., Glycated albumin increases
oxidative stress, activates NF-kappa B and extracellular signal-regulated kinase (ERK),
and stimulates ERK-dependent transforming growth factor-beta 1 production in
macrophage RAW cells. J Lab Clin Med, 2003b. vol.141(4): p. 242-9.
61. Colaco, C.A., Ledesma, M.D., Harrington, C.R., and Avila, J., The role of the Maillard
reaction in other pathologies: Alzheimer's disease. Nephrol Dial Transplant, 1996. vol.11
Suppl 5: p. 7-12.
62. Conway, K.A., Harper, J.D., and Lansbury, P.T., Jr., Fibrils formed in vitro from alphasynuclein and two mutant forms linked to Parkinson's disease are typical amyloid.
Biochemistry, 2000. vol.39(10): p. 2552-63.
63. Crow, J.P., Spruell, C., Chen, J., Gunn, C., Ischiropoulos, H., Tsai, M., Smith, C.D.,
Radi, R., Koppenol, W.H., and Beckman, J.S., On the pH-dependent yield of hydroxyl
radical products from peroxynitrite. Free Radic Biol Med, 1994. vol.16(3): p. 331-8.

207

64. Dalle-Donne, I., Aldini, G., Carini, M., Colombo, R., Rossi, R., and Milzani, A., Protein
carbonylation, cellular dysfunction, and disease progression. J Cell Mol Med, 2006.
vol.10(2): p. 389-406.
65. Dalvit, C., Fagerness, P.E., Hadden, D.T., Sarver, R.W., and Stockman, B.J., FluorineNMR experiments for high-throughput screening: theoretical aspects, practical
considerations, and range of applicability. J Am Chem Soc, 2003. vol.125(25): p. 7696703.
66. Danze, P.M., Tarjoman, A., Rousseaux, J., Fossati, P., and Dautrevaux, M., Evidence for
an increased glycation of IgG in diabetic patients. Clin Chim Acta, 1987. vol.166(2-3): p.
143-53.
67.

Darley-Usmar, V. and Halliwell, B., Blood radicals: reactive nitrogen species, reactive
oxygen species, transition metal ions, and the vascular system. Pharm Res, 1996.
vol.13(5): p. 649-62.

68.

Davies, K.J., Intracellular proteolytic systems may function as secondary antioxidant


defenses: an hypothesis. J Free Radic Biol Med, 1986. vol.2(3): p. 155-73.

69.

Davies, K.J. and Goldberg, A.L., Proteins damaged by oxygen radicals are rapidly
degraded in extracts of red blood cells. J Biol Chem, 1987. vol.262(17): p. 8227-34.

70.

Day, J.F., Thorpe, S.R., and Baynes, J.W., Nonenzymatically glucosylated albumin. In
vitro preparation and isolation from normal human serum. J Biol Chem, 1979. vol.254(3):
p. 595-7.

71. Dean, R.T., Hunt, J.V., Grant, A.J., Yamamoto, Y., and Niki, E., Free radical damage to
proteins: the influence of the relative localization of radical generation, antioxidants, and
target proteins. Free Radic Biol Med, 1991. vol.11(2): p. 161-8.
72. Degenhardt, T.P., Thorpe, S.R., and Baynes, J.W., Chemical modification of proteins by
methylglyoxal. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 1998. vol.44(7): p. 1139-45.
73. Denis, P.S., Mmoire sur le sang, ed. B.e. Fils. 1859, Paris.
74. Despres, J.P., Lemieux, I., Bergeron, J., Pibarot, P., Mathieu, P., Larose, E., RodesCabau, J., Bertrand, O.F., and Poirier, P., Abdominal obesity and the metabolic
syndrome: contribution to global cardiometabolic risk. Arterioscler Thromb Vasc Biol,
2008. vol.28(6): p. 1039-49.
75. DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K.O., Davies, S.W., Bates, G.P., Vonsattel, J.P., and
Aronin, N., Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic
neurites in brain. Science, 1997. vol.277(5334): p. 1990-3.
76. Dill, K.A., Dominant forces in protein folding. Biochemistry, 1990. vol.29(31): p. 713355.
77. Dirks, B.M., Boyer, P. D., Nonenzymatic cleavage of p-nitrophenyl esters. Cereal Chem,
1951. vol.448: p. 483-490.
78. Dobler, J. and Bertles, J.F., The physical state of hemoglobin in sickle-cell anemia
erythrocytes in vivo. J Exp Med, 1968. vol.127(4): p. 711-4.
79.

Duell, P.B., Oram, J.F., and Bierman, E.L., Nonenzymatic glycosylation of HDL and
impaired HDL-receptor-mediated cholesterol efflux. Diabetes, 1991. vol.40(3): p. 377-84.

80. Dukic-Stefanovic, S., Schinzel, R., Riederer, P., and Munch, G., AGES in brain ageing:
AGE-inhibitors as neuroprotective and anti-dementia drugs? Biogerontology, 2001.
vol.2(1): p. 19-34.
208

81. Ewaskiewicz, J.I., Devlin, T.M., and Ch'ih, J.J., The in vivo disposition of aflatoxin B1
in rat liver. Biochem Biophys Res Commun, 1991. vol.179(2): p. 1095-100.
82. Fadok, V.A., Warner, M.L., Bratton, D.L., and Henson, P.M., CD36 is required for
phagocytosis of apoptotic cells by human macrophages that use either a
phosphatidylserine receptor or the vitronectin receptor (alpha v beta 3). J Immunol, 1998.
vol.161(11): p. 6250-7.
83.

Fang, Y. and Dalgleish, D.G., Conformation of beta-Lactoglobulin Studied by FTIR:


Effect of pH, Temperature, and Adsorption to the Oil-Water Interface. J Colloid Interface
Sci, 1997. vol.196(2): p. 292-298.

84. Faure, P., Tamisier, R., Baguet, J.P., Favier, A., Halimi, S., Levy, P., and Pepin, J.L.,
Impairment of serum albumin antioxidant properties in obstructive sleep apnoea
syndrome. Eur Respir J, 2008a. vol.31(5): p. 1046-53.
85.

Faure, P., Troncy, L., Lecomte, M., Wiernsperger, N., Lagarde, M., Ruggiero, D., and
Halimi, S., Albumin antioxidant capacity is modified by methylglyoxal. Diabetes Metab,
2005. vol.31(2): p. 169-77.

86.

Faure, P., Wiernsperger, N., Polge, C., Favier, A., and Halimi, S., Impairment of the
antioxidant properties of serum albumin in patients with diabetes: protective effects of
metformin. Clin Sci (Lond), 2008b. vol.114(3): p. 251-6.

87. Fautrel, B., Ferritine dans la maladie de Still de ladulte : avec ou sans sucre ? Revue du
Rhumatisme, 2002. vol.69(7): p. 689-691.
88. Favier, F., Jaussent, I., Moullec, N.L., Debussche, X., Boyer, M.C., Schwager, J.C., and
Papoz, L., Prevalence of Type 2 diabetes and central adiposity in La Reunion Island, the
REDIA Study. Diabetes Res Clin Pract, 2005. vol.67(3): p. 234-42.
89. Federoff, H.J., Lawrence, D., and Brownlee, M., Nonenzymatic glycosylation of laminin
and the laminin peptide CIKVAVS inhibits neurite outgrowth. Diabetes, 1993. vol.42(4):
p. 509-13.
90. Fernandes, A.F., Zhou, J., Zhang, X., Bian, Q., Sparrow, J., Taylor, A., Pereira, P., and
Shang, F., Oxidative inactivation of the proteasome in retinal pigment epithelial cells. A
potential link between oxidative stress and up-regulation of interleukin-8. J Biol Chem,
2008. vol.283(30): p. 20745-53.
91. Figarola, J.L., Shanmugam, N., Natarajan, R., and Rahbar, S., Anti-inflammatory effects
of the advanced glycation end product inhibitor LR-90 in human monocytes. Diabetes,
2007. vol.56(3): p. 647-55.
92. Figge, J., Rossing, T.H., and Fencl, V., The role of serum proteins in acid-base equilibria.
J Lab Clin Med, 1991. vol.117(6): p. 453-67.
93. Fink, A.L., Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold
Des, 1998. vol.3(1): p. R9-23.
94. Fischer-Posovszky, P., Wabitsch, M., and Hochberg, Z., Endocrinology of adipose tissue
- an update. Horm Metab Res, 2007. vol.39(5): p. 314-21.
95. Foster, J.F., Albumin Structure, Function and Uses. 1977, Oxford: Pergamon. 53-84.
96. Freedman, R.B., Protein disulfide isomerase: multiple roles in the modification of nascent
secretory proteins. Cell, 1989. vol.57(7): p. 1069-72.
97. Fridovich, I., The biology of oxygen radicals. Science, 1978. vol.201(4359): p. 875-80.
209

98. Friguet, B., Aging of proteins and the proteasome, in Protein Degradation in Health and
Disease, M. Reboud-Ravaux, Editor. 2002, Springer.
99. Friguet, B., Oxidized protein degradation and repair in ageing and oxidative stress. FEBS
Lett, 2006. vol.580(12): p. 2910-6.
100. Fruhbeck, G., The adipose tissue as a source of vasoactive factors. Curr Med Chem
Cardiovasc Hematol Agents, 2004. vol.2(3): p. 197-208.
101. Fukuzawa, K., Saitoh, Y., Akai, K., Kogure, K., Ueno, S., Tokumura, A., Otagiri, M.,
and Shibata, A., Antioxidant effect of bovine serum albumin on membrane lipid
peroxidation induced by iron chelate and superoxide. Biochim Biophys Acta, 2005.
vol.1668(1): p. 145-55.
102. Garlick, R.L. and Mazer, J.S., The principal site of nonenzymatic glycosylation of
human serum albumin in vivo. J Biol Chem, 1983. vol.258(10): p. 6142-6.
103. Gelamo, E.L. and Tabak, M., Spectroscopic studies on the interaction of bovine (BSA)
and human (HSA) serum albumins with ionic surfactants. Spectrochim Acta A Mol
Biomol Spectrosc, 2000. vol.56A(11): p. 2255-71.
104. Gerschman, R., Gilbert, D.L., Nye, S.W., Dwyer, P., and Fenn, W.O., Oxygen poisoning
and x-irradiation: a mechanism in common. Science, 1954. vol.119(3097): p. 623-6.
105. Giancola, C., De Sena, C., Fessas, D., Graziano, G., and Barone, G., DSC studies on
bovine serum albumin denaturation. Effects of ionic strength and SDS concentration. Int J
Biol Macromol, 1997. vol.20(3): p. 193-204.
106. Gilbert, D.L., Janney, C.D., and Hines, H.M., Circulatory transfer of P32 to skeletal
muscles under various experimental conditions. Am J Physiol, 1950. vol.163(3): p. 575-9.
107. Gillery, P., [Oxidative stress and protein glycation in diabetes mellitus]. Ann Biol Clin
(Paris), 2006. vol.64(4): p. 309-14.
108. Giulivi, C., Traaseth, N.J., and Davies, K.J., Tyrosine oxidation products: analysis and
biological relevance. Amino Acids, 2003. vol.25(3-4): p. 227-32.
109. Gryzunov, Y.A., Arroyo, A., Vigne, J.L., Zhao, Q., Tyurin, V.A., Hubel, C.A., Gandley,
R.E., Vladimirov, Y.A., Taylor, R.N., and Kagan, V.E., Binding of fatty acids facilitates
oxidation of cysteine-34 and converts copper-albumin complexes from antioxidants to
prooxidants. Arch Biochem Biophys, 2003. vol.413(1): p. 53-66.
110. Gum, E.T., Swanson, R.A., Alano, C., Liu, J., Hong, S., Weinstein, P.R., and Panter,
S.S., Human serum albumin and its N-terminal tetrapeptide (DAHK) block oxidantinduced neuronal death. Stroke, 2004. vol.35(2): p. 590-5.
111. Gutteridge, J.M., Antioxidant properties of the proteins caeruloplasmin, albumin and
transferrin. A study of their activity in serum and synovial fluid from patients with
rheumatoid arthritis. Biochim Biophys Acta, 1986. vol.869(2): p. 119-27.
112. Halliwell, B., Albumin--an important extracellular antioxidant? Biochem Pharmacol,
1988. vol.37(4): p. 569-71.
113. Halliwell, B., Oxidative stress and cancer: have we moved forward? Biochem J, 2007.
vol.401(1): p. 1-11.
114. Halliwell, B. and Gutteridge, J.M., Oxygen free radicals and iron in relation to biology
and medicine: some problems and concepts. Arch Biochem Biophys, 1986. vol.246(2): p.
501-14.
210

115. Halliwell, B. and Gutteridge, J.M., Role of free radicals and catalytic metal ions in
human disease: an overview. Methods Enzymol, 1990. vol.186: p. 1-85.
116. Halliwell, B. and Gutteridge, J.M., Biologically relevant metal ion-dependent hydroxyl
radical generation. An update. FEBS Lett, 1992. vol.307(1): p. 108-12.
117. Halliwell, B. and Gutteridge, J.M., Free radicals in biology and medecine. 1999, Oxford
University Press: London. p. 936.
118. Hammes, H.P., Alt, A., Niwa, T., Clausen, J.T., Bretzel, R.G., Brownlee, M., and
Schleicher, E.D., Differential accumulation of advanced glycation end products in the
course of diabetic retinopathy. Diabetologia, 1999a. vol.42(6): p. 728-36.
119. Hammes, H.P., Brownlee, M., Lin, J., Schleicher, E., and Bretzel, R.G., Diabetic
retinopathy risk correlates with intracellular concentrations of the glycoxidation product
Nepsilon-(carboxymethyl) lysine independently of glycohaemoglobin concentrations.
Diabetologia, 1999b. vol.42(5): p. 603-7.
120. Han, S. and Sidell, N., Peroxisome-proliferator-activated-receptor gamma
(PPARgamma) independent induction of CD36 in THP-1 monocytes by retinoic acid.
Immunology, 2002. vol.106(1): p. 53-9.
121. Harris, E.D., Regulation of antioxidant enzymes. FASEB J, 1992. vol.6(9): p. 2675-83.
122. Harris, E.D. and Percival, S.S., A role for ascorbic acid in copper transport. Am J Clin
Nutr, 1991. vol.54(6 Suppl): p. 1193S-1197S.
123. Hartog, J.W., Voors, A.A., Bakker, S.J., Smit, A.J., and van Veldhuisen, D.J., Advanced
glycation end-products (AGEs) and heart failure: pathophysiology and clinical
implications. Eur J Heart Fail, 2007. vol.9(12): p. 1146-55.
124. Havelund, S., Plum, A., Ribel, U., Jonassen, I., Volund, A., Markussen, J., and
Kurtzhals, P., The mechanism of protraction of insulin detemir, a long-acting, acylated
analog of human insulin. Pharm Res, 2004. vol.21(8): p. 1498-504.
125. Hayase, F., Nagaraj, R.H., Miyata, S., Njoroge, F.G., and Monnier, V.M., Aging of
proteins: immunological detection of a glucose-derived pyrrole formed during maillard
reaction in vivo. J Biol Chem, 1989. vol.264(7): p. 3758-64.
126. Hayes, M.J., Shao, D., Bailly, M., and Moss, S.E., Regulation of actin dynamics by
annexin 2. EMBO J, 2006. vol.25(9): p. 1816-26.
127. Hileman, E.O., Liu, J., Albitar, M., Keating, M.J., and Huang, P., Intrinsic oxidative
stress in cancer cells: a biochemical basis for therapeutic selectivity. Cancer Chemother
Pharmacol, 2004. vol.53(3): p. 209-19.
128. Hippocrate, Hippocratic Writings, ed. Penguin. 1978, New York. 232.
129. Horiuchi, S., Higashi, T., Ikeda, K., Saishoji, T., Jinnouchi, Y., Sano, H., Shibayama,
R., Sakamoto, T., and Araki, N., Advanced glycation end products and their recognition
by macrophage and macrophage-derived cells. Diabetes, 1996. vol.45 Suppl 3: p. S73-6.
130. Horiuchi, S., Sakamoto, Y., and Sakai, M., Scavenger receptors for oxidized and
glycated proteins. Amino Acids, 2003. vol.25(3-4): p. 283-92.
131. Hoshi, T. and Heinemann, S., Regulation of cell function by methionine oxidation and
reduction. J Physiol, 2001. vol.531(Pt 1): p. 1-11.
132. Howell, N.K., Protein-Protein Interactions, in Biochemistry Food Proteins, B.J.F.H. ed.,
Editor. 1992, Elsevier Applied Science. p. 35-74.
211

133. Hunter, S.J., Boyd, A.C., O'Harte, F.P., McKillop, A.M., Wiggam, M.I., Mooney, M.H.,
McCluskey, J.T., Lindsay, J.R., Ennis, C.N., Gamble, R., Sheridan, B., Barnett, C.R.,
McNulty, H., Bell, P.M., and Flatt, P.R., Demonstration of glycated insulin in human
diabetic plasma and decreased biological activity assessed by euglycemichyperinsulinemic clamp technique in humans. Diabetes, 2003. vol.52(2): p. 492-8.
134. Iberg, N. and Fluckiger, R., Nonenzymatic glycosylation of albumin in vivo.
Identification of multiple glycosylated sites. J Biol Chem, 1986. vol.261(29): p. 13542-5.
135. Inoue, M., Sato, E.F., Nishikawa, M., Park, A.M., Kira, Y., Imada, I., and Utsumi, K.,
Mitochondrial generation of reactive oxygen species and its role in aerobic life. Curr Med
Chem, 2003. vol.10(23): p. 2495-505.
136. Izem, L. and Morton, R.E., Cholesteryl ester transfer protein biosynthesis and cellular
cholesterol homeostasis are tightly interconnected. J Biol Chem, 2001. vol.276(28): p.
26534-41.
137. Jacobsen, C., Lysine residue 240 of human serum albumin is involved in high-affinity
binding of bilirubin. Biochem J, 1978. vol.171(2): p. 453-9.
138. Jakus, V. and Rietbrock, N., Advanced glycation end-products and the progress of
diabetic vascular complications. Physiol Res, 2004. vol.53(2): p. 131-42.
139. Juhan-Vague, I., Roul, C., Alessi, M.C., Ardissone, J.P., Heim, M., and Vague, P.,
Increased plasminogen activator inhibitor activity in non insulin dependent diabetic
patients--relationship with plasma insulin. Thromb Haemost, 1989. vol.61(3): p. 370-3.
140. Kalaria, R.N., Neurodegenerative disease: Diabetes, microvascular pathology and
Alzheimer disease. Nat Rev Neurol, 2009. vol.5(6): p. 305-6.
141. Kashiba-Iwatsuki, M., Miyamoto, M., and Inoue, M., Effect of nitric oxide on the
ligand-binding activity of albumin. Arch Biochem Biophys, 1997. vol.345(2): p. 237-42.
142. Kassam, G., Choi, K.S., Ghuman, J., Kang, H.M., Fitzpatrick, S.L., Zackson, T.,
Zackson, S., Toba, M., Shinomiya, A., and Waisman, D.M., The role of annexin II
tetramer in the activation of plasminogen. J Biol Chem, 1998. vol.273(8): p. 4790-9.
143. Kiener, P.A., Rankin, B.M., Davis, P.M., Yocum, S.A., Warr, G.A., and Grove, R.I.,
Immune complexes of LDL induce atherogenic responses in human monocytic cells.
Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1995. vol.15(7): p. 990-9.
144. Kishikawa, H., Mine, S., Kawahara, C., Tabata, T., Hirose, A., Okada, Y., and Tanaka,
Y., Glycated albumin and cross-linking of CD44 induce scavenger receptor expression
and uptake of oxidized LDL in human monocytes. Biochem Biophys Res Commun, 2006.
vol.339(3): p. 846-51.
145. Kisugi, R., Kouzuma, T., Yamamoto, T., Akizuki, S., Miyamoto, H., Someya, Y.,
Yokoyama, J., Abe, I., Hirai, N., and Ohnishi, A., Structural and glycation site changes of
albumin in diabetic patient with very high glycated albumin. Clin Chim Acta, 2007.
vol.382(1-2): p. 59-64.
146. Kohen, R. and Nyska, A., Oxidation of biological systems: oxidative stress phenomena,
antioxidants, redox reactions, and methods for their quantification. Toxicol Pathol, 2002.
vol.30(6): p. 620-50.
147. Krippeit-Drews, P., Lang, F., Haussinger, D., and Drews, G., H2O2 induced
hyperpolarization of pancreatic B-cells. Pflugers Arch, 1994. vol.426(6): p. 552-4.

212

148. Kuniyasu, A., Hayashi, S., and Nakayama, H., Adipocytes recognize and degrade
oxidized low density lipoprotein through CD36. Biochem Biophys Res Commun, 2002.
vol.295(2): p. 319-23.
149. Kuniyasu, A., Ohgami, N., Hayashi, S., Miyazaki, A., Horiuchi, S., and Nakayama, H.,
CD36-mediated endocytic uptake of advanced glycation end products (AGE) in mouse
3T3-L1 and human subcutaneous adipocytes. FEBS Lett, 2003. vol.537(1-3): p. 85-90.
150. Lander, H.M., Tauras, J.M., Ogiste, J.S., Hori, O., Moss, R.A., and Schmidt, A.M.,
Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21(ras)dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress. J Biol
Chem, 1997. vol.272(28): p. 17810-4.
151. Langin, D., Control of fatty acid and glycerol release in adipose tissue lipolysis. C R
Biol, 2006. vol.329(8): p. 598-607; discussion 653-5.
152. Lapolla, A., Fedele, D., Reitano, R., Arico, N.C., Seraglia, R., Traldi, P., Marotta, E.,
and Tonani, R., Enzymatic digestion and mass spectrometry in the study of advanced
glycation end products/peptides. J Am Soc Mass Spectrom, 2004. vol.15(4): p. 496-509.
153. Laussac, J.P. and Sarkar, B., Characterization of the copper(II)- and nickel(II)-transport
site of human serum albumin. Studies of copper(II) and nickel(II) binding to peptide 1-24
of human serum albumin by 13C and 1H NMR spectroscopy. Biochemistry, 1984.
vol.23(12): p. 2832-8.
154. LeBouton, A.V. and Masse, J.P., A random arrangement of albumin-containing
hepatocytes seen with histo-immunologic methods. I. Verification of the artifact. Anat
Rec, 1980a. vol.197(2): p. 183-94.
155. LeBouton, A.V. and Masse, J.P., A random arrangement of albumin-containing
hepatocytes seen with histo-immunologic methods. II. Conditions that produce the
artifact. Anat Rec, 1980b. vol.197(2): p. 195-201.
156. Lecarpentier, Y., Physiological role of free radicals in skeletal muscles. J Appl Physiol,
2007. vol.103(6): p. 1917-8.
157. Lee, C.T., Jr., Smith, K.A., and Hatton, T.A., Photocontrol of protein folding: the
interaction of photosensitive surfactants with bovine serum albumin. Biochemistry, 2005.
vol.44(2): p. 524-36.
158. Lefvre, P. and Badetti, C., [Metabolism of albumin]. Ann Fr Anesth Reanim, 1996.
vol.15(4): p. 464-9.
159. Leger, J., Kempf, M., Lee, G., and Brandt, R., Conversion of serine to aspartate imitates
phosphorylation-induced changes in the structure and function of microtubule-associated
protein tau. J Biol Chem, 1997. vol.272(13): p. 8441-6.
160. Leibson, C.L., Rocca, W.A., Hanson, V.A., Cha, R., Kokmen, E., O'Brien, P.C., and
Palumbo, P.J., Risk of dementia among persons with diabetes mellitus: a populationbased cohort study. Am J Epidemiol, 1997. vol.145(4): p. 301-8.
161. Leloup, C., Tourrel-Cuzin, C., Magnan, C., Karaca, M., Castel, J., Carneiro, L.,
Colombani, A.L., Ktorza, A., Casteilla, L., and Penicaud, L., Mitochondrial Reactive
Oxygen Species Are Obligatory Signals For Glucose-Induced Insulin Secretion. Diabetes,
2008.
162. Levine, R.L., Berlett, B.S., Moskovitz, J., Mosoni, L., and Stadtman, E.R., Methionine
residues may protect proteins from critical oxidative damage. Mech Ageing Dev, 1999.
vol.107(3): p. 323-32.
213

163. Levine, R.L., Moskovitz, J., and Stadtman, E.R., Oxidation of methionine in proteins:
roles in antioxidant defense and cellular regulation. IUBMB Life, 2000. vol.50(4-5): p.
301-7.
164. Levine, R.L., Mosoni, L., Berlett, B.S., and Stadtman, E.R., Methionine residues as
endogenous antioxidants in proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. vol.93(26): p.
15036-40.
165. Li, Y.M., Mitsuhashi, T., Wojciechowicz, D., Shimizu, N., Li, J., Stitt, A., He, C.,
Banerjee, D., and Vlassara, H., Molecular identity and cellular distribution of advanced
glycation endproduct receptors: relationship of p60 to OST-48 and p90 to 80K-H
membrane proteins. Proc Natl Acad Sci U S A, 1996. vol.93(20): p. 11047-52.
166. Lindsay, J.R., McKillop, A.M., Mooney, M.H., O'Harte, F.P., Bell, P.M., and Flatt,
P.R., Demonstration of increased concentrations of circulating glycated insulin in human
Type 2 diabetes using a novel and specific radioimmunoassay. Diabetologia, 2003.
vol.46(4): p. 475-8.
167.
Lo, T.W., Westwood, M.E., McLellan, A.C., Selwood, T., and Thornalley, P.J.,
Binding and modification of proteins by methylglyoxal under physiological conditions. A
kinetic and mechanistic study with N alpha-acetylarginine, N alpha-acetylcysteine, and N
alpha-acetyllysine, and bovine serum albumin. J Biol Chem, 1994. vol.269(51): p. 32299305.
168. Lu, M., Kuroki, M., Amano, S., Tolentino, M., Keough, K., Kim, I., Bucala, R., and
Adamis, A.P., Advanced glycation end products increase retinal vascular endothelial
growth factor expression. J Clin Invest, 1998. vol.101(6): p. 1219-24.
169. Lyons, T.J., Glycation and oxidation: a role in the pathogenesis of atherosclerosis. Am J
Cardiol, 1993. vol.71(6): p. 26B-31B.
170. Lyons, T.J. and Kennedy, L., Non-enzymatic glycosylation of skin collagen in patients
with type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus and limited joint mobility. Diabetologia,
1985. vol.28(1): p. 2-5.
171. MacDonald, E., Lee, W.K., Hepburn, S., Bell, J., Scott, P.J., and Dominiczak, M.H.,
Advanced glycosylation end products in the mesenteric artery. Clin Chem, 1992.
vol.38(4): p. 530-3.
172. Madec, J.Y., Vanier, A., Dorier, A., Bernillon, J., Belli, P., and Baron, T., Biochemical
properties of protease resistant prion protein PrPsc in natural sheep scrapie. Arch Virol,
1997. vol.142(8): p. 1603-12.
173. Makita, Z., Radoff, S., Rayfield, E.J., Yang, Z., Skolnik, E., Delaney, V., Friedman,
E.A., Cerami, A., and Vlassara, H., Advanced glycosylation end products in patients with
diabetic nephropathy. N Engl J Med, 1991. vol.325(12): p. 836-42.
174.
Martin, D.B. and Nelson, P.S., From genomics to proteomics: techniques and
applications in cancer research. Trends Cell Biol, 2001. vol.11(11): p. S60-5.
175. Martinez-Cayuela, M., Oxygen free radicals and human disease. Biochimie, 1995.
vol.77(3): p. 147-61.
176. Matthews, D.E., An overview of phenylalanine and tyrosine kinetics in humans. J Nutr,
2007. vol.137(6 Suppl 1): p. 1549S-1555S; discussion 1573S-1575S.
177.
McArdle, W., Katch, F.I., Katch, V.L., Rieth, N., and Deha, J.P., Nutrition et
performances sportives. 2004: De Boeck Universit.
214

178. McDonald, M.J., Bleichman, M., Bunn, H.F., and Noble, R.W., Functional properties
of the glycosylated minor components of human adult hemoglobin. J Biol Chem, 1979.
vol.254(3): p. 702-7.
179. McKillop, A.M., Abdel-Wahab, Y.H., Mooney, M.H., O'Harte, F.P., and Flatt, P.R.,
Secretion of glycated insulin from pancreatic beta-cells in diabetes represents a novel
aspect of beta-cell dysfunction and glucose toxicity. Diabetes Metab, 2002. vol.28(6 Pt
2): p. 3S61-9; discussion 3S108-12.
180. Meloun, B., Moravek, L., and Kostka, V., Complete amino acid sequence of human
serum albumin. FEBS Lett, 1975. vol.58(1): p. 134-7.
181. Militello, V., Casarino, C., Emanuele, A., Giostra, A., Pullara, F., and Leone, M.,
Aggregation kinetics of bovine serum albumin studied by FTIR spectroscopy and light
scattering. Biophys Chem, 2004. vol.107(2): p. 175-87.
182. Militello, V., Vetri, V., and Leone, M., Conformational changes involved in thermal
aggregation processes of bovine serum albumin. Biophys Chem, 2003. vol.105(1): p. 13341.
183. Miller, L.L., Bly, C. G., Bale, W. F., The dominent role of liver in plasma protein
synthesis. A direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-14C. J.
Exp. Med., 1951. vol.94: p. 431-453.
184.
Mooradian, A.D., Lung, C.C., and Pinnas, J.L., Glycosylation enhances
malondialdehyde binding to proteins. Free Radic Biol Med, 1996. vol.21(5): p. 699-701.
185. Mori, N. and Manning, J.M., Studies on the Amadori rearrangement in a model system:
chromatographic isolation of intermediates and product. Anal Biochem, 1986. vol.152(2):
p. 396-401.
186. Moroz, N., Tong, M., Longato, L., Xu, H., and de la Monte, S.M., Limited Alzheimertype neurodegeneration in experimental obesity and type 2 diabetes mellitus. J Alzheimers
Dis, 2008. vol.15(1): p. 29-44.
187.
Moskovitz, J., Roles of methionine suldfoxide reductases in antioxidant defense,
protein regulation and survival. Curr Pharm Des, 2005. vol.11(11): p. 1451-7.
188. Moskovitz, J., Berlett, B.S., Poston, J.M., and Stadtman, E.R., The yeast peptidemethionine sulfoxide reductase functions as an antioxidant in vivo. Proc Natl Acad Sci U
S A, 1997. vol.94(18): p. 9585-9.
189. Moskovitz, J., Weissbach, H., and Brot, N., Cloning the expression of a mammalian
gene involved in the reduction of methionine sulfoxide residues in proteins. Proc Natl
Acad Sci U S A, 1996. vol.93(5): p. 2095-9.
190. Mulvihill, D.M. and Kinsella, J.E., Gelation characteristics of whey proteins and betalactoglobulin. Food Technology, 1987. vol.41(8): p. 102-111.
191. Munch, G., Thome, J., Foley, P., Schinzel, R., and Riederer, P., Advanced glycation
endproducts in ageing and Alzheimer's disease. Brain Res Brain Res Rev, 1997. vol.23(12): p. 134-43.
192. Murayama, K. and Tomida, M., Heat-induced secondary structure and conformation
change of bovine serum albumin investigated by Fourier transform infrared spectroscopy.
Biochemistry, 2004. vol.43(36): p. 11526-32.

215

193. Musante, L., Bruschi, M., Candiano, G., Petretto, A., Dimasi, N., Del Boccio, P.,
Urbani, A., Rialdi, G., and Ghiggeri, G.M., Characterization of oxidation end product of
plasma albumin 'in vivo'. Biochem Biophys Res Commun, 2006. vol.349(2): p. 668-73.
194. Nagaraj, R.H., Sell, D.R., Prabhakaram, M., Ortwerth, B.J., and Monnier, V.M., High
correlation between pentosidine protein crosslinks and pigmentation implicates ascorbate
oxidation in human lens senescence and cataractogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A,
1991. vol.88(22): p. 10257-61.
195. Nakajou, K., Watanabe, H., Kragh-Hansen, U., Maruyama, T., and Otagiri, M., The
effect of glycation on the structure, function and biological fate of human serum albumin
as revealed by recombinant mutants. Biochim Biophys Acta, 2003. vol.1623(2-3): p. 8897.
196.
Nakamura, K., Nakazawa, Y., and Ienaga, K., Acid-stable fluorescent advanced
glycation end products: vesperlysines A, B, and C are formed as crosslinked products in
the Maillard reaction between lysine or proteins with glucose. Biochem Biophys Res
Comm 1997. vol.6: p. 227230.
197. Navarra, G., Effects of metal ions on aggregation processes of whey proteins, in
Dipartimento di Scienze Fisiche ed Astronomiche. 2008, Universit degli Studi di
Palermo: Palermo. p. 187.
198. Navarra, G., Giacomazza, D., Leone, M., Librizzi, F., Militello, V., and San Biagio,
P.L., Thermal aggregation and ion-induced cold-gelation of bovine serum albumin. Eur
Biophys J, 2009.
199. Navarra, G., Leone, M., and Militello, V., Thermal aggregation of beta-lactoglobulin in
presence of metal ions. Biophys Chem, 2007. vol.131(1-3): p. 52-61.
200. Neeper, M., Schmidt, A.M., Brett, J., Yan, S.D., Wang, F., Pan, Y.C., Elliston, K.,
Stern, D., and Shaw, A., Cloning and expression of a cell surface receptor for advanced
glycosylation end products of proteins. J Biol Chem, 1992. vol.267(21): p. 14998-5004.
201.
Neuzil, J. and Stocker, R., Free and albumin-bound bilirubin are efficient coantioxidants for alpha-tocopherol, inhibiting plasma and low density lipoprotein lipid
peroxidation. J Biol Chem, 1994. vol.269(24): p. 16712-9.
202. Newkirk, M.M., LePage, K., Niwa, T., and Rubin, L., Advanced glycation endproducts
(AGE) on IgG, a target for circulating antibodies in North American Indians with
rheumatoid arthritis (RA). Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 1998. vol.44(7): p. 1129-38.
203.
Nguyen, P., Broussas, M., Bertin, E., Simon, G., Hezard, N., and Potron, G.,
Measurement of monocyte activation: perspectives in clinical application in the
investigation of the diabetic patient. J Mal Vasc, 1999. vol.24(4): p. 275-80.
204. Niwa, T., 3-Deoxyglucosone: metabolism, analysis, biological activity, and clinical
implication. J Chromatogr B Biomed Sci Appl, 1999. vol.731(1): p. 23-36.
205. Odetti, P., Fogarty, J., Sell, D.R., and Monnier, V.M., Chromatographic quantitation of
plasma and erythrocyte pentosidine in diabetic and uremic subjects. Diabetes, 1992.
vol.41(2): p. 153-9.
206. Oettl, K. and Stauber, R.E., Physiological and pathological changes in the redox state of
human serum albumin critically influence its binding properties. Br J Pharmacol, 2007.
vol.151(5): p. 580-90.
207. Ogino, T. and Okada, S., Oxidative damage of bovine serum albumin and other enzyme
proteins by iron-chelate complexes. Biochim Biophys Acta, 1995. vol.1245(3): p. 359-65.
216

208.
Ohgami, N., Nagai, R., Ikemoto, M., Arai, H., Kuniyasu, A., Horiuchi, S., and
Nakayama, H., Cd36, a member of the class b scavenger receptor family, as a receptor for
advanced glycation end products. J Biol Chem, 2001. vol.276(5): p. 3195-202.
209. Ohgami, N., Nagai, R., Ikemoto, M., Arai, H., Miyazaki, A., Hakamata, H., Horiuchi,
S., and Nakayama, H., CD36, serves as a receptor for advanced glycation endproducts
(AGE). J Diabetes Complications, 2002. vol.16(1): p. 56-9.
210. Okuno, A., Kato, M., and Taniguchi, Y., The secondary structure of pressure- and
temperature-induced aggregates of equine serum albumin studied by FT-IR spectroscopy.
Biochim Biophys Acta, 2006. vol.1764(8): p. 1407-12.
211. Orient, A., Donko, A., Szabo, A., Leto, T.L., and Geiszt, M., Novel sources of reactive
oxygen species in the human body. Nephrol Dial Transplant, 2007. vol.22(5): p. 1281-8.
212. Pacher, P., Beckman, J.S., and Liaudet, L., Nitric oxide and peroxynitrite in health and
disease. Physiol Rev, 2007. vol.87(1): p. 315-424.
213. Pacifici, R.E. and Davies, K.J., Protein, lipid and DNA repair systems in oxidative
stress: the free-radical theory of aging revisited. Gerontology, 1991. vol.37(1-3): p. 16680.
214. Pacifici, R.E., Kono, Y., and Davies, K.J., Hydrophobicity as the signal for selective
degradation of hydroxyl radical-modified hemoglobin by the multicatalytic proteinase
complex, proteasome. J Biol Chem, 1993. vol.268(21): p. 15405-11.
215. Pacifici, R.E., Salo, D.C., and Davies, K.J., Macroxyproteinase (M.O.P.): a 670 kDa
proteinase complex that degrades oxidatively denatured proteins in red blood cells. Free
Radic Biol Med, 1989. vol.7(5): p. 521-36.
216. Paolisso, G., Tagliamonte, M.R., Rizzo, M.R., and Giugliano, D., Advancing age and
insulin resistance: new facts about an ancient history. Eur J Clin Invest, 1999. vol.29(9):
p. 758-69.
217.
Papatheodorou, L. and Weiss, N., Vascular oxidant stress and inflammation in
hyperhomocysteinemia. Antioxid Redox Signal, 2007. vol.9(11): p. 1941-58.
218. Peters, T., Jr., Serum albumin. Adv Protein Chem, 1985. vol.37: p. 161-245.
219. Peters, T., Jr. and Anfinsen, C.B., Net production of serum albumin by liver slices. J
Biol Chem, 1950. vol.186(2): p. 805-13.
220. Peters, T.J., All about albumin - Biiochemistry, Genetics, and Medical Applications.
1996, San Diego: Academic Press.
221. Peters, T.J., Reed, R. G., Serum albumin as a transport protein, in Transport by
Proteins, e. G. Blauer and H. Sund, Editor. 1978, de Gruyter: Berlin and New York. p.
57-78.
222. Petit, J., Maftah, A., and Julien, R., Biologie cellulaire. Masson ed. 1997, Paris.
223. Petitpas, I., Bhattacharya, A.A., Twine, S., East, M., and Curry, S., Crystal structure
analysis of warfarin binding to human serum albumin: anatomy of drug site I. J Biol
Chem, 2001. vol.276(25): p. 22804-9.
224. Petropoulos, I., Conconi, M., Wang, X., Hoenel, B., Bregegere, F., Milner, Y., and
Friguet, B., Increase of oxidatively modified protein is associated with a decrease of
proteasome activity and content in aging epidermal cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci,
2000. vol.55(5): p. B220-7.
217

225. Platt, A.A. and Gieseg, S.P., Inhibition of protein hydroperoxide formation by protein
thiols. Redox Rep, 2003. vol.8(2): p. 81-6.
226. Poppek, D. and Grune, T., Proteasomal defense of oxidative protein modifications.
Antioxid Redox Signal, 2006. vol.8(1-2): p. 173-84.
227. Predki, P.F., Harford, C., Brar, P., and Sarkar, B., Further characterization of the Nterminal copper(II)- and nickel(II)-binding motif of proteins. Studies of metal binding to
chicken serum albumin and the native sequence peptide. Biochem J, 1992. vol.287 ( Pt 1):
p. 211-5.
228. Pricci, F., Leto, G., Amadio, L., Iacobini, C., Romeo, G., Cordone, S., Gradini, R.,
Barsotti, P., Liu, F.T., Di Mario, U., and Pugliese, G., Role of galectin-3 as a receptor for
advanced glycosylation end products. Kidney Int Suppl, 2000. vol.77: p. S31-9.
229. Prusiner, S.B. and DeArmond, S.J., Prion diseases and neurodegeneration. Annu Rev
Neurosci, 1994. vol.17: p. 311-39.
230. Qing, H., Yanlin, H., Fenlin, S., and Zuyi, T., Effects of pH and metal ions on the
conformation of bovine serum albumin in aqueous solution. An attenuated total reflection
(ATR) FTIR spectroscopic study. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc, 1996.
vol.52: p. 1795-1800.
231. Quinlan, G.J., Martin, G.S., and Evans, T.W., Albumin: biochemical properties and
therapeutic potential. Hepatology, 2005. vol.41(6): p. 1211-9.
232. Reiser, K.M., Nonenzymatic glycation of collagen in aging and diabetes. Proc Soc Exp
Biol Med, 1998. vol.218(1): p. 23-37.
233. Ristow, M., Mulder, H., Pomplun, D., Schulz, T.J., Muller-Schmehl, K., Krause, A.,
Fex, M., Puccio, H., Muller, J., Isken, F., Spranger, J., Muller-Wieland, D., Magnuson,
M.A., Mohlig, M., Koenig, M., and Pfeiffer, A.F., Frataxin deficiency in pancreatic islets
causes diabetes due to loss of beta cell mass. J Clin Invest, 2003. vol.112(4): p. 527-34.
234. Rivett, A.J., The effect of mixed-function oxidation of enzymes on their susceptibility
to degradation by a nonlysosomal cysteine proteinase. Arch Biochem Biophys, 1985a.
vol.243(2): p. 624-32.
235.
Rivett, A.J., Purification of a liver alkaline protease which degrades oxidatively
modified glutamine synthetase. Characterization as a high molecular weight cysteine
proteinase. J Biol Chem, 1985b. vol.260(23): p. 12600-6.
236. Robb, D.A., Olufemi, O.S., Williams, D.A., and Midgley, J.M., Identification of
glycation at the N-terminus of albumin by gas chromatography-mass spectrometry.
Biochem J, 1989. vol.261(3): p. 871-8.
237. Rocchini, A.P., Childhood obesity and a diabetes epidemic. N Engl J Med, 2002.
vol.346(11): p. 854-5.
238. Roche, M., Rondeau, P., Singh, N.R., Tarnus, E., and Bourdon, E., The antioxidant
properties of serum albumin. FEBS Lett, 2008. vol.582(13): p. 1783-1787.
239. Roche, M., Tarnus, E., Rondeau, P., and Bourdon, E., Effects of nutritional antioxidants
on AAPH- or AGEs-induced oxidative stress in human SW872 liposarcoma cells. Cell
Biol Toxicol, 2009.
240. Roche, R., Hoareau, L., Bes-Houtmann, S., Gonthier, M.P., Laborde, C., Baron, J.F.,
Haffaf, Y., Cesari, M., and Festy, F., Presence of the cannabinoid receptors, CB1 and
218

CB2, in human omental and subcutaneous adipocytes. Histochem Cell Biol, 2006.
vol.126(2): p. 177-87.
241. Rondeau, P., Armenta, S., Caillens, H., Chesne, S., and Bourdon, E., Assessment of
temperature effects on beta-aggregation of native and glycated albumin by FTIR
spectroscopy and PAGE: relations between structural changes and antioxidant properties.
Arch Biochem Biophys, 2007. vol.460(1): p. 141-50.
242.
Rondeau, P., Navarra, G., Leone, M., Bourdon, E., and Militello, V., Thermal
aggregation of glycated bovine serum albumins; a spectroscopic study. biophys Journal,
2009. vol.( soumettre).
243. Rondeau, P., Singh, N., Caillens, H., and Bourdon, E., Oxidative Stresses Induced by
glycated human or bovine serum albumins on human monocytes. Free Radic Biol Med,
2008. vol.45(6): p. 799-812.
244. Rothschild, M.A., Oratz, M., and Schreiber, S.S., Serum albumin. Hepatology, 1988.
vol.8(2): p. 385-401.
245. Rotig, A., Sidi, D., Munnich, A., and Rustin, P., Molecular insights into Friedreich's
ataxia and antioxidant-based therapies. Trends Mol Med, 2002. vol.8(5): p. 221-4.
246. Sadanandom, A., Piffanelli, P., Knott, T., Robinson, C., Sharpe, A., Lydiate, D.,
Murphy, D., and Fairbairn, D.J., Identification of a peptide methionine sulphoxide
reductase gene in an oleosin promoter from Brassica napus. Plant J, 1996. vol.10(2): p.
235-42.
247. Sadler, P.J., Tucker, A., and Viles, J.H., Involvement of a lysine residue in the Nterminal Ni2+ and Cu2+ binding site of serum albumins. Comparison with Co2+, Cd2+
and Al3+. Eur J Biochem, 1994. vol.220(1): p. 193-200.
248. Sadler, P.J. and Viles, J.H., 1H and (113)Cd NMR Investigations of Cd(2+) and Zn(2+)
Binding Sites on Serum Albumin: Competition with Ca(2+), Ni(2+), Cu(2+), and Zn(2+).
Inorg Chem, 1996. vol.35(15): p. 4490-4496.
249. Sadqi, M., Hernandez, F., Pan, U., Perez, M., Schaeberle, M.D., Avila, J., and Munoz,
V., Alpha-helix structure in Alzheimer's disease aggregates of tau-protein. Biochemistry,
2002. vol.41(22): p. 7150-5.
250. Sakata, N., Moh, A., and Takebayashi, S., Contribution of superoxide to reduced
antioxidant activity of glycoxidative serum albumin. Heart Vessels, 2002. vol.17(1): p.
22-9.
251. San Biagio, P.L., Martorana, V., Emanuele, A., Vaiana, S.M., Manno, M., Bulone, D.,
Palma-Vittorelli, M.B., and Palma, M.U., Interacting processes in protein coagulation.
Proteins, 1999. vol.37(1): p. 116-20.
252. Sanghera, N., Wall, M., Venien-Bryan, C., and Pinheiro, T.J., Globular and pre-fibrillar
prion aggregates are toxic to neuronal cells and perturb their electrophysiology. Biochim
Biophys Acta, 2008. vol.1784(6): p. 873-81.
253. Sattarahmady, N., Moosavi-Movahedi, A.A., Ahmad, F., Hakimelahi, G.H., HabibiRezaei, M., Saboury, A.A., and Sheibani, N., Formation of the molten globule-like state
during prolonged glycation of human serum albumin. Biochim Biophys Acta, 2007.
vol.1770(6): p. 933-42.
254.
Scatchard, G., Batchelder, A.C., and Brown, A., Chemical, Clinical, and
Immunological Studies on the Products of Human Plasma Fractionation. Vi. The Osmotic
Pressure of Plasma and of Serum Albumin. J Clin Invest, 1944. vol.23(4): p. 458-64.
219

255. Scherer, P.E., Adipose tissue: from lipid storage compartment to endocrine organ.
Diabetes, 2006. vol.55(6): p. 1537-45.
256. Schleicher, E., Deufel, T., and Wieland, O.H., Non-enzymatic glycosylation of human
serum lipoproteins. Elevated epsilon-lysine glycosylated low density lipoprotein in
diabetic patients. FEBS Lett, 1981. vol.129(1): p. 1-4.
257. Schlesinger, J.B., van Harmelen, V., Alberti-Huber, C.E., and Hauner, H., Albumin
inhibits adipogenesis and stimulates cytokine release from human adipocytes. Am J
Physiol Cell Physiol, 2006. vol.291(1): p. C27-33.
258.
Schmitt, A., Gasic-Milenkovic, J., and Schmitt, J., Characterization of advanced
glycation end products: mass changes in correlation to side chain modifications. Anal
Biochem, 2005. vol.346(1): p. 101-6.
259. Schrader, M. and Fahimi, H.D., Peroxisomes and oxidative stress. Biochim Biophys
Acta, 2006. vol.1763(12): p. 1755-66.
260. Sebekova, K., Kupcova, V., Schinzel, R., and Heidland, A., Markedly elevated levels of
plasma advanced glycation end products in patients with liver cirrhosis - amelioration by
liver transplantation. J Hepatol, 2002. vol.36(1): p. 66-71.
261. Sebekova, K., Podracka, L., Blazicek, P., Syrova, D., Heidland, A., and Schinzel, R.,
Plasma levels of advanced glycation end products in children with renal disease. Pediatr
Nephrol, 2001. vol.16(12): p. 1105-12.
262. Sedlak, T.W. and Snyder, S.H., Bilirubin benefits: cellular protection by a biliverdin
reductase antioxidant cycle. Pediatrics, 2004. vol.113(6): p. 1776-82.
263. Selkoe, D.J., Deciphering the genesis and fate of amyloid beta-protein yields novel
therapies for Alzheimer disease. J Clin Invest, 2002. vol.110(10): p. 1375-81.
264. Sell, D.R. and Monnier, V.M., Structure elucidation of a senescence cross-link from
human extracellular matrix. Implication of pentoses in the aging process. J Biol Chem,
1989. vol.264(36): p. 21597-602.
265. Sell, D.R. and Monnier, V.M., End-stage renal disease and diabetes catalyze the
formation of a pentose-derived crosslink from aging human collagen. J Clin Invest, 1990.
vol.85(2): p. 380-4.
266. Serrano, E., Diaz, J., Acosta, F., Palenciano, C.G., Parrilla, P., and Carbonell, L.F.,
Oxidative stress during ischemia-reperfusion in liver transplantation. Transplant Proc,
2000. vol.32(8): p. 2651.
267. Shaklai, N., Garlick, R.L., and Bunn, H.F., Nonenzymatic glycosylation of human serum
albumin alters its conformation and function. J Biol Chem, 1984. vol.259(6): p. 3812-7.
268. Sies, H. and Cadenas, E., Oxidative stress: damage to intact cells and organs. Philos
Trans R Soc Lond B Biol Sci, 1985. vol.311(1152): p. 617-31.
269. Singh, N.R., Rondeau, P., Hoareau, L., and Bourdon, E., Identification of preferential
protein targets for carbonylation in human mature adipocytes treated with native or
glycated albumin. Free Radic Res, 2007. vol.41(10): p. 1078-88.
270. Smith, M.A., Taneda, S., Richey, P.L., Miyata, S., Yan, S.D., Stern, D., Sayre, L.M.,
Monnier, V.M., and Perry, G., Advanced Maillard reaction end products are associated
with Alzheimer disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. vol.91(12): p. 57104.
220

271. Soriani, M., Pietraforte, D., and Minetti, M., Antioxidant potential of anaerobic human
plasma: role of serum albumin and thiols as scavengers of carbon radicals. Arch Biochem
Biophys, 1994. vol.312(1): p. 180-8.
272. Stadtman, E.R., Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by
radiolysis and by metal-catalyzed reactions. Annu Rev Biochem, 1993. vol.62: p. 797-821.
273. Stadtman, E.R. and Levine, R.L., Free radical-mediated oxidation of free amino acids
and amino acid residues in proteins. Amino Acids, 2003. vol.25(3-4): p. 207-18.
274. Steen, E., Terry, B.M., Rivera, E.J., Cannon, J.L., Neely, T.R., Tavares, R., Xu, X.J.,
Wands, J.R., and de la Monte, S.M., Impaired insulin and insulin-like growth factor
expression and signaling mechanisms in Alzheimer's disease--is this type 3 diabetes? J
Alzheimers Dis, 2005. vol.7(1): p. 63-80.
275. Steinbrecher, U.P., Fisher, M., Witztum, J.L., and Curtiss, L.K., Immunogenicity of
homologous low density lipoprotein after methylation, ethylation, acetylation, or
carbamylation: generation of antibodies specific for derivatized lysine. J Lipid Res, 1984.
vol.25(10): p. 1109-16.
276. Stolzing, A., Widmer, R., Jung, T., Voss, P., and Grune, T., Degradation of glycated
bovine serum albumin in microglial cells. Free Radic Biol Med, 2006. vol.40(6): p. 101727.
277. Stremmel, W., Pohl, L., Ring, A., and Herrmann, T., A new concept of cellular uptake
and intracellular trafficking of long-chain fatty acids. Lipids, 2001. vol.36(9): p. 981-9.
278. Stryer, L., The interaction of a naphthalene dye with apomyoglobin and apohemoglobin.
A fluorescent probe of non-polar binding sites. J Mol Biol, 1965. vol.13(2): p. 482-95.
279. Sugimoto, K., Nishizawa, Y., Horiuchi, S., and Yagihashi, S., Localization in human
diabetic peripheral nerve of N(epsilon)-carboxymethyllysine-protein adducts, an
advanced glycation endproduct. Diabetologia, 1997. vol.40(12): p. 1380-7.
280. Tang, S., Leung, J.C., Abe, K., Chan, K.W., Chan, L.Y., Chan, T.M., and Lai, K.N.,
Albumin stimulates interleukin-8 expression in proximal tubular epithelial cells in vitro
and in vivo. J Clin Invest, 2003. vol.111(4): p. 515-27.
281. Tarnus, E., Wassef, H., Carmel, J.F., Rondeau, P., Roche, M., Davignon, J., Bernier, L.,
and Bourdon, E., Apolipoprotein E limits oxidative stress-induced cell dysfunctions in
human adipocytes. FEBS lett, 2009. vol.583(12): p. 2042-8.
282. Thannickal, V.J. and Fanburg, B.L., Reactive oxygen species in cell signaling. Am J
Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2000. vol.279(6): p. L1005-28.
283. Thorpe, S.R. and Baynes, J.W., Maillard reaction products in tissue proteins: new
products and new perspectives. Amino Acids, 2003. vol.25(3-4): p. 275-81.
284. Trayhurn, P. and Beattie, J.H., Physiological role of adipose tissue: white adipose tissue
as an endocrine and secretory organ. Proc Nutr Soc, 2001. vol.60(3): p. 329-39.
285. Trayhurn, P., Bing, C., and Wood, I.S., Adipose tissue and adipokines--energy regulation
from the human perspective. J Nutr, 2006. vol.136(7 Suppl): p. 1935S-1939S.
286. Trigatti, B.L. and Gerber, G.E., A direct role for serum albumin in the cellular uptake of
long-chain fatty acids. Biochem J, 1995. vol.308 ( Pt 1): p. 155-9.
287. Turell, L., Botti, H., Carballal, S., Ferrer-Sueta, G., Souza, J.M., Duran, R., Freeman,
B.A., Radi, R., and Alvarez, B., Reactivity of sulfenic acid in human serum albumin.
Biochemistry, 2008. vol.47(1): p. 358-67.
221

288. Turk, Z., Ljubic, S., Turk, N., and Benko, B., Detection of autoantibodies against
advanced glycation endproducts and AGE-immune complexes in serum of patients with
diabetes mellitus. Clin Chim Acta, 2001. vol.303(1-2): p. 105-15.
289. Uchida, Y., Ohba, K., Yoshioka, T., Irie, K., Muraki, T., and Maru, Y., Cellular carbonyl
stress enhances the expression of plasminogen activator inhibitor-1 in rat white
adipocytes via reactive oxygen species-dependent pathway. J Biol Chem, 2004.
vol.279(6): p. 4075-83.
290. Unoki, H., Bujo, H., Yamagishi, S., Takeuchi, M., Imaizumi, T., and Saito, Y.,
Advanced glycation end products attenuate cellular insulin sensitivity by increasing the
generation of intracellular reactive oxygen species in adipocytes. Diabetes Res Clin Pract,
2007. vol.76(2): p. 236-44.
291. Uribarri, J., Peppa, M., Cai, W., Goldberg, T., Lu, M., Baliga, S., Vassalotti, J.A., and
Vlassara, H., Dietary glycotoxins correlate with circulating advanced glycation end
product levels in renal failure patients. Am J Kidney Dis, 2003. vol.42(3): p. 532-8.
292. Van Campenhout, A., Van Campenhout, C., Lagrou, A.R., Moorkens, G., De Block, C.,
and Manuel-y-Keenoy, B., Iron-binding antioxidant capacity is impaired in diabetes
mellitus. Free Radic Biol Med, 2006. vol.40(10): p. 1749-55.
293. Vay, D., Vidali, M., Allochis, G., Cusaro, C., Rolla, R., Mottaran, E., Bellomo, G., and
Albano, E., Antibodies against advanced glycation end product Nepsilon(carboxymethyl)lysine in healthy controls and diabetic patients. Diabetologia, 2000.
vol.43(11): p. 1385-8.
294. Vetri, V. and Militello, V., Thermal induced conformational changes involved in the
aggregation pathways of beta-lactoglobulin. Biophys Chem, 2005. vol.113(1): p. 83-91.
295. Vignais, P.V., The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and
activation mechanism. Cell Mol Life Sci, 2002. vol.59(9): p. 1428-59.
296. Virella, G., Thorpe, S.R., Alderson, N.L., Stephan, E.M., Atchley, D., Wagner, F., and
Lopes-Virella, M.F., Autoimmune response to advanced glycosylation end-products of
human LDL. J Lipid Res, 2003. vol.44(3): p. 487-93.
297. Vitek, M.P., Bhattacharya, K., Glendening, J.M., Stopa, E., Vlassara, H., Bucala, R.,
Manogue, K., and Cerami, A., Advanced glycation end products contribute to
amyloidosis in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. vol.91(11): p. 476670.
298. Vlassara, H., Advanced glycation end-products and atherosclerosis. Ann Med, 1996.
vol.28(5): p. 419-26.
299. Vlassara, H., Brownlee, M., and Cerami, A., Nonenzymatic glycosylation of peripheral
nerve protein in diabetes mellitus. Proc Natl Acad Sci U S A, 1981. vol.78(8): p. 5190-2.
300. Voet, D. and Voet, J., Structure tridimensionnelles des protines, in Biochimie,
DeBoeck, Editor. 1998: Paris. p. 141-174.
301. Wa, C., Cerny, R.L., Clarke, W.A., and Hage, D.S., Characterization of glycation
adducts on human serum albumin by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry. Clin Chim Acta, 2007. vol.385(1-2): p. 48-60.
302. Waldmann, T.A., Albumin structure, function and uses, ed. e. Rothschild M. A. 1977,
New York: Pergamon Press. 255-273.

222

303. Walter, P.B., Fung, E.B., Killilea, D.W., Jiang, Q., Hudes, M., Madden, J., Porter, J.,
Evans, P., Vichinsky, E., and Harmatz, P., Oxidative stress and inflammation in ironoverloaded patients with beta-thalassaemia or sickle cell disease. Br J Haematol, 2006.
vol.135(2): p. 254-63.
304. Wang, L., Maji, S.K., Sawaya, M.R., Eisenberg, D., and Riek, R., Bacterial inclusion
bodies contain amyloid-like structure. PLoS Biol, 2008. vol.6(8): p. e195.
305. Wassef, H., Bernier, L., Davignon, J., and Cohn, J.S., Synthesis and secretion of apoC-I
and apoE during maturation of human SW872 liposarcoma cells. J Nutr, 2004.
vol.134(11): p. 2935-41.
306. Watanabe, H., Tanase, S., Nakajou, K., Maruyama, T., Kragh-Hansen, U., and Otagiri,
M., Role of arg-410 and tyr-411 in human serum albumin for ligand binding and esteraselike activity. Biochem J, 2000. vol.349 Pt 3: p. 813-9.
307. Waterlow, J.C., Kwashiorkor revisited: the pathogenesis of oedema in kwashiorkor and
its significance. Trans R Soc Trop Med Hyg, 1984. vol.78(4): p. 436-41.
308. Wautier, J.L., Zoukourian, C., Chappey, O., Wautier, M.P., Guillausseau, P.J., Cao, R.,
Hori, O., Stern, D., and Schmidt, A.M., Receptor-mediated endothelial cell dysfunction in
diabetic vasculopathy. Soluble receptor for advanced glycation end products blocks
hyperpermeability in diabetic rats. J Clin Invest, 1996. vol.97(1): p. 238-43.
309. Weatherall, D.J., Clegg, J.B., Higgs, D.R., and Wood, W.G., The hemoglobinopathies,
in In Metabolic and molecular bases of inherited disease, A.B. T C. Scriver, D. Valle,
and W. Sly, editors., Editor. 2001, McGraw-Hill: New York, New York, USA. p. 4571
4636.
310. Wei, Y., Chen, L., Chen, J., Ge, L., and He, R., Rapid glycation with D-ribose induces
globular amyloid-like aggregations of BSA with high cytotoxicity to SH-SY5Y cells.
BMC Cell Biol, 2009. vol.10(1): p. 10.
311. Wells-Knecht, K.J., Brinkmann, E., Wells-Knecht, M.C., Litchfield, J.E., Ahmed,
M.U., Reddy, S., Zyzak, D.V., Thorpe, S.R., and Baynes, J.W., New biomarkers of
Maillard reaction damage to proteins. Nephrol Dial Transplant, 1996. vol.11 Suppl 5: p.
41-7.
312. Williams, C.D., Introductory observations on kwashiorkor. West Afr Med J, 1958.
vol.7(1): p. 5-9.
313. Wolf, P., Alzheimer, Parkinson le rle essentiel de l'alimentation. 2007, Paris, France:
Grancher.
314. Wolff, S.P., Jiang, Z.Y., and Hunt, J.V., Protein glycation and oxidative stress in
diabetes mellitus and ageing. Free Radic Biol Med, 1991. vol.10(5): p. 339-52.
315. Wood, M., Plasma drug binding: implications for anesthesiologists. Anesth Analg,
1986. vol.65(7): p. 786-804.
316. Xu, H., Barnes, G.T., Yang, Q., Tan, G., Yang, D., Chou, C.J., Sole, J., Nichols, A.,
Ross, J.S., Tartaglia, L.A., and Chen, H., Chronic inflammation in fat plays a crucial role
in the development of obesity-related insulin resistance. J Clin Invest, 2003. vol.112(12):
p. 1821-30.
317. Yamauchi, R., Addition products of alpha-tocopherol with lipid-derived free radicals.
Vitam Horm, 2007. vol.76: p. 309-27.

223

318. Yan, S.D., Chen, X., Fu, J., Chen, M., Zhu, H., Roher, A., Slattery, T., Zhao, L.,
Nagashima, M., Morser, J., Migheli, A., Nawroth, P., Stern, D., and Schmidt, A.M.,
RAGE and amyloid-beta peptide neurotoxicity in Alzheimer's disease. Nature, 1996.
vol.382(6593): p. 685-91.
319. Yan, S.D., Schmidt, A.M., Anderson, G.M., Zhang, J., Brett, J., Zou, Y.S., Pinsky, D.,
and Stern, D., Enhanced cellular oxidant stress by the interaction of advanced glycation
end products with their receptors/binding proteins. J Biol Chem, 1994. vol.269(13): p.
9889-97.
320. Yang, S., Litchfield, J.E., and Baynes, J.W., AGE-breakers cleave model compounds,
but do not break Maillard crosslinks in skin and tail collagen from diabetic rats. Arch
Biochem Biophys, 2003. vol.412(1): p. 42-6.
321. Yu, P.H. and Zuo, D.M., Aminoguanidine inhibits semicarbazide-sensitive amine
oxidase activity: implications for advanced glycation and diabetic complications.
Diabetologia, 1997. vol.40(11): p. 1243-50.
322.
Zeng, J. and Davies, M.J., Evidence for the formation of adducts and S(carboxymethyl)cysteine on reaction of alpha-dicarbonyl compounds with thiol groups on
amino acids, peptides, and proteins. Chem Res Toxicol, 2005. vol.18(8): p. 1232-41.

224

225

226

ANNEXES

227

PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES LIES LAPROBLEMATIQUE:

ANNEXE 1:
Roche M., Rondeau P., Tarnus E., Rajan Singh N. and Bourdon E., The antioxidant
properties of serum albumin, Febs Letters 2008, 582, 1783-1787.

ANNEXE 2:
Roche M., Tarnus E., Rondeau P. and Bourdon E., Effects of nutritional antioxidants on
AAPH- or AGEs-induced oxidative stress in human SW872 liposarcoma cells, Cell Biol
Toxicol 2009 sous presse.

ANNEXE 3:
Tarnus E., Wassef H., Carmel JF., Rondeau P., Roche M., Davignon J., Bernier L.and
Bourdon E., Apolipoprotein E limits oxidative stress-induced cell dysfunctions in human
adipocytes, Febs Letters 2009 583, 2042-2048.

228

ANNEXE 1

The antioxidant properties of serum albumin


Roche M, Rondeau P, Singh NR, Tarnus E, Bourdon E.

FEBS Lett. 2008 Jun 11; 582(13):1783-7.

229

230

231

232

233

234

235

236

ANNEXE 2

Effects of nutritional antioxidants on AAPH- or AGEs-induced


oxidative stress in human SW872 liposarcoma cells
Roche M, Tarnus E, Rondeau P, Bourdon E.

Cell Biol Toxicol 2009 Jan 19

237

238

239

240

241

242

243

244

245

246

247

248

ANNEXE 3

Apoliprotein E limits oxidative stress-induced cell


dysfunctions in human adipocytes
Tarnus E, Wassef H, Carmel J-F, Rondeau P, Roche M,
Davignon J, Bernier L, Bourdon E.
FEBS Lett. 2009

249

250

251

252

253

254

255

256

257

258

ANNEXE 4
AUTRES PUBLICATIONS SCIENTIFIQUES :
Khodabux, K., LOmelette, M. S., Jhaumeer-Laulloo, S., Ramasami, P. and Rondeau P.,
Chemical and near-infrared determination of moisture, fat and protein in Tuna Fishes:
skipjack (Katsuwonus pelamis) and yellow fin (Thunnus albacare) from the Indian Ocean,
Food Chem. 2007, 102, 669-675.
Rondeau, P., Rouch, C. and Besnard, G., NADP-malate dehydrogenase gene evolution in
Andropogoneae (Poaceae): Gene duplication followed by a sub-functionalization, Ann. Bot.
London 2005, 96, 1307-1314.
Armenta S., Garrigues S., De la Guardia M., and Rondeau P., ATR-FTIR Analysis of the
Fermentation Process of Pine Apple, Anal. Chim. Acta 2005, 545, 99-106.
Rondeau, P., Djhurry, D., Sers, S. and Cadet, F., Study of the interaction between sucrose
and metal ions (Mg2+ and K+) and their simultaneous quantification in ternary mixture by
mid-infrared and 13C NMR spectroscopies, Appl. Spectrosc. 2004, 58, 816-822.
Rondeau, P., Sers, S., Djhurry, D. and Cadet, F., Sugar interaction with metals in aqueous
solution: indirect determination from infrared and direct from NMR spectroscopy, Appl.
Spectrosc. 2003, 57, 466-472.
Rondeau, P., Sers, S., Djhurry, D. and Cadet, F., Indirect metal ions (K+, Na+, Mg2+ and Ca2+
) quantification from infrared spectroscopy, Appl. Spectrosc. Rev. 2002, 37, 119-136.
Garneau, S., Rondeau, P. , Bazuin, G. and Ritcey, A., Stabilisation of spread monolayers of
an amine-functionalised biphenyl mesogen by association with a carboxymethyl cellulose salt,
Macromol. Chem. Phys. 2000, 201, 2535-2541.
Basque, P., de Gunzbourg, A., Rondeau, P. and Ritcey, A., Monolayers of cellulose ethers at
the air-water interface, Langmuir 1996, 12, 5614-5619.

259

260

261

262

263

264

265

266

267

268

ABSTRACT
Oxidative stress and glycation: structural and biological properties
relationship of albumin modified in vitro or in vivo in diabetes context

Numerous pathologies are strongly linked to structural and functional alteration of target
proteins. Aggregation, glycation and oxidative damages constitute modifications of proteins,
frequently observed in numerous states of disease. The biological activities of proteins and
their conformational modifications are strictly connected. Among proteins, albumin represents
the most abundant and the most important antioxidant in blood. This circulating protein can, in
particular, undergo increased glycoxidation in case of diabetes, which can lead to the formation
of Advanced Glycation Endproducts (AGEs), and so induce various deleterious effects on cells.
In this study, I focused on the impact of aggregation, glycation and oxidative modifications on
the structural, redox and antioxidant status of albumin and the effect of this altered protein on
various cell lines physiology.
I firstly investigated, using biochemical and biophysical techniques, the structural changes of
bovine serum albumin induced by glycation, aggregation and both processes simultaneously.
By this, I tried to elucidate the impact of these processes on the antioxidant properties of the
modified protein.
Secondly, I studied the oxidative activity of in vitro glycoxidized bovine serum albumin on
mature adipocyte by identifying, in particular, specifically adipocyte carbonylated protein
targets by using proteomic techniques.
Then, I compared the effect of in vitro glucose and methylglyoxal-induced oxidative
modifications on bovine serum albumin (BSA) and human serum albumin (HSA) protein
structures and on THP1 monocyte physiology.
At last, the best way to characterize the structural and functional modification of altered
albumin is to study this protein with suitable pathological condition, in vivo instead of using an
in vitro model. In this last part, I determined simultaneously the structure, the antioxydant
properties and redox status of human plasma and its corresponding albumin purified from a
panel of plasma, in order to confirm or invalidate predictions based on in vitro models.
These investigations confirm the importance of native structure on functional properties of the
most abundant and protective protein in the circulatory system and by the way to have a better
understanding of its involvement in several physiological disorders such as Diabetes.

Subject: Biochemistry and Cellular Biology


Key words: Albumin, Adipocytes, Monocytes, SW872 and THP1 cell lines, Glycation,
Oxidative stress, Diabetes.
Research group: EA2526 Laboratoire de Biochimie et Gntique Molculaire
15 avenue Ren Cassin BP 7151 97715 Saint Denis Messag Cedex 09 France

RESUME
Stress oxydant et glycation : relation structure et activits biologiques de
lalbumine in vitro et in vivo dans le cadre de la pathologie diabtique
La plupart des pathologies, quelles soient dorigine gntique ou non trouvent leur origine
dans laltration structural et/ou fonctionnelle de protines dintrt. Lagrgation, la glycation
et loxydation constituent les principaux types de modification protique frquemment
observes dans de nombreuses maladies tels que le diabte, lathrosclrose ou encore les
maladies neurodgnratives. Gnralement, laltration des activits biologiques de ces
protines est troitement corrle avec ses changements conformationnels et structuraux.
L'albumine reprsente la protine circulante la plus abondante et constitue le plus important
antioxydant du plasma sanguin susceptible dtre expose un stress glycoxydant accru, et
aboutir la formation de Produits Avancs de Glycation (AGEs) dont les effets peuvent tre
nfastes au niveau cellulaire et tissulaire.
Dans cette tude, je me suis intress leffet de trois types daltrations, que sont lagrgation,
la glycation et l'oxydation, sur la structure, le statut redox et lactivit antioxydante de
lalbumine ainsi que l'incidence de cette protine modifie sur la physiologie de diffrentes
lignes cellulaires.
Au cours de ce travail, jai abord les quatre points suivants :
1. Afin de mieux comprendre limpact de ces processus altratifs sur les proprits
antioxydantes de lalbumine, jai tudi, en utilisant des techniques de la Biochimie et de la
Biophysique, les modifications structurales de la protine soumise successivement la
glycation, lagrgation et aux deux processus simultanment.
2. Jai mis en vidence et identifi des cibles protiques sensibles loxydation au niveau
dadipocytes matures humains incubs en prsence dalbumine bovine glycoxyde in vitro.
3. Jai effectu une comparaison de laction diffrentielle des modles in vitro de dAGEs
prpars partir de lalbumine dorigine bovine ou humaine au niveau de monocytes THP1.
4. Enfin, afin de valider les caractristiques structurales et biologiques obtenues partir de nos
modles in vitro dAGEs drivs de lalbumine, jai tudi sur des modles purifis partir de
plasmas de sujets, ltat structural, redox et antioxydant de lalbumine altre in vivo.
Les rsultats obtenus lors de ce travail permettent de mettre en avant limportance de la
structure native de la plus abondante des protines circulantes sur lintgrit de ses fonctions
biologiques et en particulier sur son activit antioxydante. Egalement, cette tude apporte un
nouvel clairage sur limplication de lalbumine altre dans de nombreux dsordres
mtaboliques tels que le diabte.

Discipline: Biochimie et Biologie Cellulaire


Mots-cls: Srum albumine bovine, Srum albumine humaine, Adipocytes, Monocytes,
Cellules SW872 et THP1, Glycation, Diabte, Stress oxydant.
Laboratoire: EA2526 Laboratoire de Biochimie et Gntique Molculaire
15 avenue Ren Cassin BP 7151 97715 Saint Denis Messag Cedex 09 France

Vous aimerez peut-être aussi