TRABAJO EN EXTENSO

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CARACTERIZACIÓN DE LAS LIPOPROTEÍNAS DE ALTA DENSIDAD (HDL)

DURANTE LA HIPERTRIGLICERIDEMIA POSPANDRIAL EN RATAS WISTAR

Mónica Isabel Meneses Medina1. Luz María Holguín Sánche2, Oscar Pérez Méndez3. 1Centro
Universitario de Ciencias de la Salud. Universidad de Guadalajara. mimm2404@hotmail.com
2
Facultad de Medicina Universidad Autónoma de Chihuahua viento82@hotmail.com 3Instituto
Nacional de Cardiología Ignacio Chávez

INTRODUCCIÓN

Las HDL (Lipoproteínas de Alta Densidad) son una familia heterogénea de

partículas que se pueden agrupar en cinco subclases: HDL2b, HDL2a, HDL3a,
HDL3b y HDL3c, en orden decreciente de tamaño. Todas ellas difieren en tamaño,
densidad y composición química. La velocidad de síntesis, el catabolismo de las
partículas y la acción de las enzimas y proteínas de transporte que las remodelan
determinan la heterogeneidad de las HDL.
Las HDL están constituidas por lípidos antipáticos (Foslípidos y Colesterol Libre),
lípidos no polares (Triglicéridos y Ésteres de colesterol) y por proteínas llamadas
apolipoproteínas (apo). La proporción proteica de las HDL es del 55 a 60% de su
masa seca, siendo la más abundante la apo A-I. Ésta lipoproteína además de su
función estructural es indispensable para el eflujo del colesterol de las células
periféricas. En las HDL los lípidos antipáticos se organizan en una monocapa en la
superficie del complejo. Las apo garantizan la estabilidad de ésta monocapa. Los
lípidos no polares, al ser insolubles en medio acuoso, se sitúan en el interior de las
lipoproteínas.
Las HDL2 son ricas en lípidos hidrofóbicos, mientras que las HDL3 están formadas
principalmente por fosfolípidos y proteínas.
Los bajos niveles de colesterol HDL correlacionan con un riesgo elevado de
desarrollar Enfermedad Ateroesclerosa Coronaria (EAC). Las HDL podrían conferir
bajo riesgo cardiovascular debido a:

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- Transporte Reverso del Colesterol: la disminución de las HDL afectan el

transporte reverso del colesterol, que es la vía metabólica responsable de la
remoción del colesterol excedente de las células periféricas y su transporte hacia
el hígado para reciclarlo o eliminarlo.
- Propiedades antiinflamatorias, antioxidativas, antiagregatorias, anticoagulantes y
profibrinolíticas tanto in vitro como in vivo.
- Estudios epidemiológicos han mostrado que un aumento en las concentraciones
de HDL se correlacionan con un menor riesgo cardiovascular en prevención
secundaria.
En la práctica clínica la concentración plasmática de las partículas HDL se estima
por la medición del colesterol contenido en estas lipoproteínas. Se consideran un
factor de riesgo de ateroesclerosis niveles de C-HDL por debajo de 40mg/dl. Éste
método no garantiza una medida precisa de la cantidad de partículas HDL, pues
pueden existir pocas partículas HDL en circulación, pero se puede sobreestimar su
número si éstas están enriquecidas en ésteres del colesterol. Esta medición de c-
HDL plasmático sería normal no por ser suficientes partículas, si no por tener
mucho colesterol cada una. El riesgo cardiovascular de una paciente así estaría
incrementado por la alteración en la composición química de sus HDL, las cuales
serían no funcionales.
Todo parece indicar que elevar las concentraciones de las HDL a través de
medidas higiénicas como el ejercicio, la pérdida de peso y eliminar el hábito
tabaquico reducirán el riesgo coronario. Cuando éstas medidas fallen la
intervención farmacológica debe ser considerada. Como las diferentes subclases
de las HDL no poseen las mismas propiedades antiaterogénicas, las
intervenciones tanto higiénicas como terapéuticas se deberán enfocar en el futuro
a incrementar la funcionalidad de las HDL, más que a incremento en la
concentración de colesterol HDL.

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JUSTIFICACIÓN

La cuantificación de los valores de colesterol HDL junto con la de LDL, Colesterol

Total y Triglicéridos forman parte del conocido Perfil de Lípidos . La mayor parte
de los médicos al evaluar a un paciente con obesidad o DM recurre a ésta prueba
de laboratorio para observar si el paciente presenta alguna alteración lipídica. Los
términos Colesterol Bueno y Colesterol Malo son utilizados por gran parte de la
población tanto con educación medica como sin ésta. La razón de esta
denominación es que hoy en día se sabe que el colesterol HDL tiene ciertas
propiedades cardioprotectoras y por tanto se supone que concentraciones altas de
HDL conllevan bajo riesgo cardiovascular.
De manera extraña en estudios realizados en nuestro laboratorio encontramos
pacientes con niveles extremadamente bajos de HDL y un riesgo cardiovascular
disminuido.
Recientes estudios sugieren que las propiedades antiaterosclerosas de las HDL
no solo está en relación a su concentración, sino también a otras características
como su tamaño y composición química.
Ciertas evidencias en animales experimentales e in vitro, sugieren que las
partículas HDL con mayor capacidad antianterogénica son las HDL3c en
comparación con las HDL2. Paradójicamente, pacientes tanto adultos como
pediátricos con Síndrome de Resistencia a la Insulina, con Diabetes Mellitus (DM)
o que ya desarrollaron enfermedad aterosclerosa coronaria (EAC) presentan
concentraciones elevadas de HDL3b y HDL3a, y una disminución significativa de
las HDL2, asociadas a una elevada concentración de triglicéridos (TG) séricos.
Por lo tanto, es posible que las HDL3 de los pacientes con EAC sean
estructuralmente diferentes a los modelos que apoyan su papel antiaterogénico.

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Dentro de los factores que se han propuesto como determinantes para la

disfunción antiaterosclerosa de las HLD3c en la EAC y DM2, es su contenido de
triglicéridos, a mayor contenido menor actividad antiateroesclerosa. Sin embargo,
esta propuesta no ha sido aún comprobada.
Hace algún tiempo se propuso que el pospandrio contribuía a enriquecer las HDL
con triglicéridos, sin embargo esta popuesta aún no ha sido comprobada. Si la
propuesta anterior resultara positiva, establecer modelos que generen in vivo HDL
enriquecidas en triglicéridos, y sin otra alteración estructural, permitirá comenzar a
explorar el papel específico que tienen estos lípidos en la función de las HDL.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Como se ha mencionado previamente los niveles altos de Colesterol HDL en

plasma en la actualidad son vinculados con bajo riesgo cardiovascular, pero
existen personas con estas característica que terminan desarrollando EAC. De las
subclases de HDL, las HDL3 parecen conferir mayor capacidad antiaterogénica.
Los pacientes con DM, una población muy susceptible a desarrollar EAC, poseen
concentraciones altas de éste tipo de HDL y además de TG.
Las HDL3 de los sujetos con alto riesgo de EAC podrían encontrarse enriquecidas
con triglicéridos y debido a esto presentar disminución en su funcionalidad. Para
comprobarlo requerimos establecer si el pospandrio contribuye a enriquecer las
HDL con TG.

OBJETIVOS

Objetivo General

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Establecer si la hipertrigliceridemia pospandrial en Ratas Wistar Macho permite

lograr un enriquecimiento de TG en las HDL y comenzar a explorar las
propiedades antiaterogénicas de estas lipoproteínas en tales condiciones.

Objetivos Particulares
1. Establecer si la administración de una carga oral de Leche Condesada
permite elevar los TG pospandriales en Ratas Wistar Macho.
2. Identificar el pico de TG máximo y obtener HDL en éste momento para
observar si existe un cambio en tamaño y/o composición química de éstas.
3. Explorar las propiedades antiaterogénicas de las HDL enriquecidas en TG.

MATERIALES Y MÉTODOS

Población
Ratas Wistar macho mantenidas desde su nacimiento en condiciones de bioterio,
con peso entre 270 a 320gr, ayuno de aproximadamente 12 horas antes de la
extracción de sangre y acceso ilimitado a agua.
Para generar la hipertrilgiceridemia se administró Leche Condesada con un
contenido de triglicéridos de 5.4 g/100ml vía oral mediante sonda esofágica.
Como Anestésico Fenobarbital 0.1ml/100gr de peso Intraperitoneal.
Como Anticoagulante Heparina en los casos en que se extrajo sangre de la aorta
abdominal.

Procedimientos

Extracción de sangre por la cola

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Se anestesió a la rata y se le indujo hipertrigliceridemia cuando se requirió.

Obtuvimos sangre por punción de la vena caudal de la rata y obtuvimos
aproximadamente 300 l de sangre en cada toma.
Realizamos extracción de sangre con éste procedimiento cuando necesitábamos
varias muestras de sangre en poca cantidad de la misma rata.

Extracción de sangre por la aorta abdominal

Se anestesió a la rata y se le indujo hipertrigliceridemia cuando se requirió.
Realizamos un corte con tijeras de los músculos abdominales de la rata hasta que
llegamos a la cavidad abdominal. Localizamos la aorta abdominal por su pulso.
Con una jeringa previamente heparinizada obtuvimos aproximadamente 9ml de
sangre directamente de la aorta. Al terminar el procedimiento el animal fue
sacrificado. Realizamos extracción de sangre con éste procedimiento cuando
necesitábamos sólo una muestra de sangre de la rata.

Técnicas

Cuantificación de Triglicéridos
Del plasma de las muestras de sangre obtenidas cuantificamos TG mediante un
método enzimático-colorimétrico comercial. El fundamento del método es el que
sigue:
Los triglicéridos presentes en la muestra originan, según las reacciones acopladas
descritas a continuación, un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometría.

Triglicéridos + H2O lipasa Glicerol + ácidos grasos

Glicerol + ATP glicerol quinasa Glicerol 3 P + ADP
Glicerol 3 P + O2 G-3-P-oxidasa Dihidroxiacetona P +H2O2

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Peroxidasa
2 H2 O 2 + 4 aminoantipirina + 4 clorofenol Quinoamiona + 4 H2O

La finalidad de ésta técnica fue identificar el pico máximo de TG después de recibir

leche condensada y el momento en que estos regresaban a valores básales.

Ultracentrifugación Secuencial para aislar HDL

Para separar las HDL del plasma obtenido seguimos la secuencia de pasos que
se muestran en la Figura 1.
ApoB
Sol. KBR Se desecha
2.3h 100 000rpm
1.063 Medir Volumen HDL
3H
200 l
Muestra 100 000rpm
10º C Albúmina
800 l HDL 10º C
Agregar KBR 1.21 lo que
falte para 1ml
HDL
Conservar

Medir Volumen HDL

3H Albúmina
100 000rpm Agua
Desecho
10º C Agregar KBR 1.25 Desecho

HDL
Conservar
HDL

Albúmina
Agua
Desecho
Desecho
Diálisis con TBE

Figura 1. Aislamiento de HDL.

De acuerdo a la cantidad de plasma que se tiene se agrega KBr para llevarlo a

una densidad de 1.063. En seguida se separan 800 l del plasma en tubos
Ependoff y se agregan 200 l de KBr densidad 1.063 con una micropipeta de
forma lenta para que el KBr flote sobre el plasma. Se centrifugan 2.3h a
100000rpm a 10º C. En la solución que resulta se pueden distinguir 2 fases, una
de color naranja y una transparente. Se retira la fase naranja teniendo cuidado de
llevarse muy poco de la transparente. La fase naranja está integrada por
lipoproteínas que contienen apoB, es decir, LDL, IDL y VLDL. Ésta fase se
desecha. Se prosigue a medir el volumen total de lo que quedo en los tubos
Ependoff, se agrega KBr para llevar a una densidad de 1.21. Separamos de nuevo
800 l en tubos Ependoff y agregamos 200 l de KBr densidad 1.21.

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Centrifugamos a 100000rpm, 3h a 10º C. Se obtiene una solución en la cual se

pueden distinguir 2 fases, la primera verde o transparente, y la segunda
transparente. Separamos la fase Verde con muy poca de la transparente y la
colocamos en nuevos tubos Ependoff a los cuales les agregamos KBr densidad
1.25 hasta completar 1ml. La fase verde contiene HDL y la transparente albúmina
y otras proteínas. Centrifugamos a 100000rpm, 3h a 10ª 10o C. Obtenemos una
solución con 2 fases. Separamos la primera fase teniendo cuidado de no llevarnos
nada de lo que esta debajo de ésta, la colocamos en nuevos tubos Ependoff. Lo
colocado en el tubo son HDL, lo que queda debajo de las HDL es agua y
albúmina. Las HDL obtenidas se dializan con TBE para retirar el KBr.

Determinación de la Composición Química en HDL

Determinamos la concentración en mg/dl de Colesterol total (CT), Colesterol Libre
(CL), Fosfolípidos (PLP) y Triglicéridos (TG) en las HDL realizando una curva
patrón colorimétrica utilizando un lector de ELISA. Las diluciones que utilizamos
para realizar la curva fueron 0.1, 0.2, 0.3 y 0.4 del patrón. Las concentraciones de
los patrones fueron 100, 177, 193 y 300mg/dl para CL, TG, CT y PLP
respectivamente.
La finalidad de ésta técnica fue buscar si se presentaba algún cambio en la
composición química de las HDL antes y después de haber recibido la carga oral
de leche condensada en los diferentes tiempos.
Metodología
Previamente anestesiadas a un grupo de 4 ratas Wistar macho le tomamos
muestra de sangre basal de la cola. Después administramos una carga de leche
condesada de 2ml vía oral y tomamos muestra a los 15, 45, 60, 90 y 120 minutos.
Al tomar la última muestra de sangre sacrificamos a estos animales. Separamos
los plasmas de las muestras y medimos la concentración de triglicéridos mediante

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espectrofotometría. Este procedimiento nos mostró el momento en que los TG se

encontraron en su pico máximo (45 minutos) y aquel en el que regresaron a
valores basales (120 minutos).

Grupo Tiempo
1 Basal
2 45 minutos
3 120 minutos
Posteriormente formamos 3 grupos de 2 ratas cada uno y los distribuimos de la
siguiente manera:

El grupo 1 no recibió tratamiento alguno. Los grupos 2 y 3 recibieron vía oral 2 ml

de leche condesada y transcurridos 45 y 120 minutos respectivamente se les tomó
su muestra de sangre. Obtuvimos la muestra de sangre de los 3 grupos de la aorta
abdominal. Los grupos 2 y 3 fueron anestesiados antes de recibir su tratamiento
mientras que el grupo 1 antes de obtener su muestra de sangre. Separamos los
plasmas de estas muestras, aislamos HDL y determinamos su composición
química.

RESULTADOS

Cuantificación de TG
Después de administrar la carga oral de leche condensada y al cuantificar los TG
en los diferentes tiempos en que se tomo la muestra encontramos el pico de TG a
los 45 minutos. Además observamos que a los 120 minutos los TG habían
regresado casi a valores normales. En el gráfico 1 se muestra el pico de TG.

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Grafico 1. Pico máximo de 200

180

Concentranción TG (mg/ dl)

TG. El pico de TG se
160
observa a los 45 minutos
140 Rata 1
después de recibir la carga
120
de leche. Rata 2
100
Rata 1 - 17
80
60 Rata 2 - 17
40
20
0
0 50 100 150
Tiempo (min)

Composición Química de HDL

Al haber observado que el pico máximo de TG lo encontramos a los 45 minutos y
que a los 120 minutos los TG séricos regresaban casi a valores básales decidimos
tomar muestra de sangre en éstos tiempos y además en tiempo basal (0 minutos),
aislamos HDL y determinamos la composición química de éstas.

La tabla 1 muestra el promedio de los porcentajes de Colesterol Libre (%CL),

Colesterol Esterificado (%CE), Fosfolípidos (%PLP), Triglicéridos (%TG) y
Proteínas, basales y a los 45 y 120 minutos Pospandriales.

Tabla 1. Composición Química de HDL Basa y Pospandrial.

Tiempo %CL %CE %PLP %TG %Proteínas

Basal 3.14617179 31.0164667 17.5041302 0.55256788 47.7806634
45 min 3.84779518 26.5673509 28.4298629 0.50766081 40.6473302
120 min 4.13276563 28.7377272 18.5808595 0.73685686 47.8117908
El grafico 2 muestra que el porcentaje de %CL se incremento conforme transcurrió
el tiempo de administración de leche condensada con respecto a los valores
básales.

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4.5

%de Colesterol Total

4
3.5
3
2.5 %CL
2
1.5
1
0.5
0

Basal 45 min 120 min

Tiempo

Grafico 2. Porcentaje de Colesterol Libre.

Como se muestra en el Grafico 3 el %CE disminuyo después de 45 minutos de
haber recibido la carga oral de leche condensada, incrementándose ligeramente a
los 120 minutos pero sin llegar a los valores básales.
% de Colest erol Est erif icado

32

30

28 %CE

26

24
Basal 45 min 120 min

Tiempo

Grafico 3. Porcentaje de Colesterol Esterificado.

El %PLP se incremento a los 45 minutos pospandriales y regreso a valores casi
básales a los 120 minutos, ver Gráfico 4.

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30

%de Fosfolípidos
20
%PLP
10

Basal 45 min 120 min

Tiempo

Grafico 4. Porcentaje de Fosfolípidos.

En el grafico 5 se observa que el %TG, con respecto a valores básales, se
incremento transcurridos 120 minutos pospandriales aunque de manera poco
significativa.

0.8
%de Triglicéridos

0.6

0.4 %TG
0.2

Basal 45 min 120 min

Tiempo

Grafico 5. Porcentaje de Triglicéridos.

Después de 120 minutos de haber administrado la carga oral de leche
condensada el % de proteínas regreso a valores basales, mientras que a los 45
minutos el porcentaje disminuyó. Ver grafico 6.

50
48
Grafico 6. Porcentaje de Proteínas.
%de Proteínas

46
44
%Pr ot eínas
42
40
38
36
Basal 45 min 120 min

Tiempo
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En el grafico 7 puede observarse que la Composición Química de las HDL no

mostró grandes cambios. Los cambios más significativos se presentaron en los
PLP a los 45 minutos pospandriales. El porcentaje de TG se incremento 0.19%
después de 120 minutos de haber administrado la carga oral de Leche
Condensada con respecto a los valores básales.

Composición Química HDL Basal Composición Química HDL 45 min Pospandr iales

3.85

3.15 26.57
40.65

31.02
47.78

0.51
28.43
0.55 17.50

Composición Química HDL 120 min Pospandriales

4.13
%CL
28.74 %CE
47.81
%PLP

%TG

18.58 %Prot eínas

0.74

Grafico 7. Composición Química de HDL Basal y después de 45 y 120 minutos

pospandriales.

Aunque se presentan cambios pospandriales en la composición química de las

HDL éstos no tienen significancia estadística como lo muestra la Tabla 2.

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Tabla 2. Prueba T de Student para la diferencia entre la Composición Química Basal de una
HDL y Pospandrial.

Tiempo %CL %CE %PLP %TG %Proteínas

Prueba T Basal Vs 120 min 0.15426646 0.7125639 0.91909231 0.54492088 0.99689528
Prueba T Basal Vs 45 min 0.26433505 0.44541872 0.25209378 0.9189147 0.36466647

DISCUSIÓN
Los resultados mostraron que en las Ratas Macho Wistar con ayuno de
aproximadamente 12 horas después de recibir una carga oral de 2ml leche
condensada el pico sérico máximo de TG se encuentra a los 45 minutos, y que a
los 120 minutos regresa a valores próximos a los básales.

Al aislar HDL del plasma obtenido a los 45 y 120 minutos después de recibir la
carga oral de leche condesada encontramos que la composición química de éstas
se ve modificada conforme trascurre el tiempo. Los PLP y las Proteínas son los
componentes de las HDL que se ven modificados en mayor medida, aunque éstas
modificaciones no tienen significancia estadística.

Enfocándonos al objetivo de éste trabajo, aunque encontramos un aumento en el

%TG a los 120 minutos pospandriales, ésta modificación no tiene significancia
estadística. Éste hecho nos indica que la inducción de hipertrigliceridemia
pospandrial en Ratas Wistar Macho no induce enriquecimiento de las HDL con TG
como había sido planteado hace algún tiempo por algunos investigadores.
Además, los datos obtenidos de este trabajo indican que el pospandrio no parece
afectar la función de las HDL.

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CONCLUSIONES
El pospandrio en Ratas Wistar Macho con 2 ml de leche condensada vía oral no
induce enriquecimiento de HDL con triglicéridos ni afecta la función de estas.

Bibliografía
1. Pérez Méndez, O. Lipoproteínas de alta densidad (HDL). ¿Un objetivo
terapéutico en la prevención de la ateroesclerosis? . Archivos de
Cardiología de México. Num. 1. 2004. Vol. 74:53 67.
2. Pérez Méndez, O y cols. Abnormal HDL subclases distribution in
overweight children with insulin resistance or type 2 diabetes mellitus .
Clinica Chimica Acta. 2007. 376: 17 22.
3. Pérez Méndez, O y cols. Metabolism of apolipoproteins AI and AII in
subjects carrying similar ApoI mutations, apoAI Milano and ApoAI Paris.
Atheroesclerosis. 1999. 148:317 325.
4. Patsch, JR. Triglyceride-rich lipoproteins and atherosclerosis .
Atheroesclerosis. 1994. Suppl:S23-6.

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