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Obtencin de un clon estable de una lnea celular hibridoma

para la produccin de un anticuerpo anti-idiotpico
Yadira Vicente Ariasa, Julio Csar Dustet Mendozab
a

Departamento de Cultivo celular, ANTYTER. Centro de Inmunologa Molecular, Cuba.

Facultad de Ingeniera Qumica. CUJAE, Cuba.
e-mail: jcdm@quimica.cujae.edu.cu
b

Informacin del artculo

Recibido
16 de marzo de 2015
Aceptado
21 de abril de 2015
Publicado
30 de junio de 2015

Palabras clave
anticuerpo monoclonal
cultivo celular
seleccin de clones

Keywords
monoclonal antibody
cellular culture
clone selection

RESUMEN
Uno de los criterios ms importantes para la fabricacin exitosa de un
anticuerpo monoclonal teraputico es desarrollar una lnea celular que
mantenga estabilidad de la expresin en un gran nmero de generaciones.
En este trabajo se investig la estabilidad de una lnea celular hibridoma que
expresa el anticuerpo monoclonal murino anti-idiotpico usando como criterio
que no exista una disminucin de la concentracin de anticuerpo mayor que
un 40%. Los resultados mostraron que la lnea celular presenta una
inestabilidad gradual y que en 120 das no se pierde completamente la
expresin. La reduccin de los ttulos de anticuerpos correlacion con la
aparicin de una poblacin secundaria menos productora (contenido de
anticuerpo intracelular), detectada con el anlisis por citometra de flujo. A
partir de estas clulas cultivadas en un biorreactor se realiz un clonaje por
dilucin limitante para la generacin y seleccin de un clon estable y
productor. En el proceso de seleccin se cheque la homogeneidad de la
poblacin celular y el desempeo de los parmetros de crecimiento y
produccin. El clon 2B9 mostr los mejores resultados en los estudios
cinticos en frascos agitados, alcanzando concentraciones de clulas vivas
6
superiores a 2,5 x10 cl/mL y ttulos de AcM de 20 mg/L, siendo superior en
1,7 veces respecto al clon 2G9. Se obtuvieron evidencias de buen
desempeo en cuanto a crecimiento y produccin en un biorreactor de 30 L.
ABSTRACT
One of the most important criteria for the successful manufacture of a
therapeutic monoclonal antibody is to develop a mammalian cell line that
maintains the stability of expression in a large number of generations.
Therefore in this study, the stability of a hybridoma cell line expressing the
murine anti- idiotype monoclonal antibody was investigated. The selected
criterion was that antibody concentration must not decrease more than 40%.
The results have shown that the cell line exhibits a gradual instability and
expression was not completely lost within 120 days. The reduction of antibody
titles was correlated with the appearance of a secondary population less
producer, detected by a flow cytometry analysis for the content of intracellular
antibody. From these cells, cultured in a bioreactor, a cloning was performed
by limiting dilution and selection for the generation of a stable producer clone.
In the selection process the homogeneity of the cell population and
performance of growth parameters and production were checked. The clone
2B9 showed the best results in kinetic studies in shake flasks, reaching living
6
cells concentrations higher than 2.5 x10 cells / mL and mAb titles 20 mg/L,
which is 1.7 times higher in comparison to 2G9. Evidence of good
performance was obtained in growth and production at 30 L biorreactor.

Revista Bioprocesos, Vol.1, No.2, Junio, 2015

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INTRODUCCIN
Uno de los aspectos ms importantes para la
obtencin exitosa de una protena teraputica es lograr
que la clula recombinante sea capaz de mantener los
niveles de expresin de manera estable [1]. La
estabilidad en la expresin tiene especial significado
cuando se trata de producciones a gran escala y en
sistemas continuos. Para procesos continuos,
usualmente de extensa duracin (ms de un mes), es
adicionalmente importante tener en cuenta la variacin
que la inestabilidad de la lnea puede introducir en la
produccin, independientemente de que las propias
condiciones del cultivo pueden incidir en el nivel de
expresin de la protena de inters a obtener [2, 3]. Es
por eso que la determinacin de la estabilidad de una
lnea celular que se vaya a utilizar en procesos
industriales reviste gran importancia desde los puntos
de vistas de la consistencia, la robustez y el impacto
sobre los costos del proceso. En funcin del tipo de
biorreactor a emplear o modo de cultivo, una lnea
ser adecuada si produce establemente durante el
tiempo que dicho proceso requiere [4].
En este trabajo se emple un anticuerpo murino
usado para la obtencin de una vacuna recombinante
con resultados muy favorables durante los ensayos
clnicos realizados [5].
Los problemas con la estabilidad en la produccin de
protenas pueden impactar en la productividad
obtenida
despus
de
acumular
numerosas
poblaciones requeridas para la generacin del banco
de trabajo de clulas y para la expansin del cultivo
hasta la escala de produccin industrial [6]. La prdida
en la estabilidad de la produccin de la protena de
inters puede comprometer la aprobacin del uso
clnico del producto desde el punto de vista regulatorio
y en el peor de los casos podra resultar en el rechazo
de una lnea celular particular despus de meses de
trabajo [7].
Para conocer la estabilidad se ha usado
ampliamente la medicin de la concentracin
intracelular de inmunoglobulinas u otras protenas a
travs de la citometra de flujo (FACS). [8-11]. En
clulas de hibridomas generalmente se aplican
repetidos clonajes peridicos durante la etapa de
generacin de la lnea celular para evitar una posible
inestabilidad en la expresin y obtener clones con
estabilidad mejorada [12].
Entre los mtodos tradicionales de seleccin de
clones se puede encontrar el clonaje por dilucin
limitante (CDL). Una de sus desventajas es que se
requiere mucho tiempo (meses) para finalmente
obtener un nmero de clones con niveles de
produccin y estabilidad deseados. Entre las ventajas
de este mtodo est que no requiere un equipamiento
complejo y por lo general este es de bajo costo y sus
resultados son muy confiables, por lo que sigue
teniendo gran uso en el campo de la ingeniera celular

[13, 14]. En la actualidad con el empleo de la

citometra de flujo se aceleran los procesos de
seleccin por CDL y estos pueden tener hasta cinco
veces ms velocidad de produccin especfica que
cuando se seleccionan por clonaje por dilucin
limitante [15]. La citometra de flujo ofrece la
posibilidad de definir fsicamente subpoblaciones
separadas [16].
El presente trabajo tiene como objetivo obtener una
lnea celular estable en la produccin del AcM murino
que permita la obtencin del producto en un proceso
reproducible. Para ello se determinaron los parmetros
cinticos y la distribucin de poblaciones de la lnea
celular hibridoma en cultivos por lotes y continuos; se
seleccion un clon productor y estable para la
produccin del AcM murino. Adems se demostr la
estabilidad del clon seleccionado y la reproducibilidad
de los resultados del proceso de fermentacin en
biorreactores a escala piloto.
MATERIALES Y MTODOS
La lnea celular empleada fue un hibridoma murino,
obtenido en el CIM para la produccin de un
anticuerpo monoclonal anti-idiotpico.
El medio de cultivo utilizado fue una mezcla de dos
medios libres de suero y de componentes derivados
de origen animal.
2.1 Estudio de estabilidad
Se parti de un mpula de clulas del Banco Celular
Maestro del hibridoma murino. Luego de la
descongelacin, las clulas crecieron y se mantuvieron
en cultivo semicontinuo en frascos agitados durante 52
pases consecutivos (120 d). Se tomaron muestras
para el conteo celular y para la posterior determinacin
de los parmetros del crecimiento y produccin.
Adems se fijaron clulas para analizar las muestras
por citometra de flujo. La temperatura de incubacin
para todos los casos fue 37 C. Todos los ensayos se
realizaron por duplicado.
Para considerar a la cepa en estudio como estable
se tom como criterio el empleado por Lonza Biologics
[12, 17], segn los cuales el porcentaje de expresin
con respecto al inicio no debe de ser inferior a 60 %,
durante 40 generaciones, respectivamente.
% =

100 (ec.1)

2.2 Condiciones de cultivo a escala de laboratorio

El mantenimiento de las clulas en el cultivo
semicontinuo, as como en los cultivos por lote se
realiz en frascos agitados de 250 mL. En todos los
casos la concentracin celular de siembra y el ajuste
de la concentracin clulas por pase fue
6
0,310 cl/mL.
2.3 Condiciones de cultivo a escala de banco
Para el estudio y caracterizacin de la estabilidad de
la lnea celular operando en modo continuo se utiliz

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un biorreactor de tipo tanque agitado (Infors) de 10 L

de volumen de trabajo y agitado por propela marina.
Est equipado con una unidad de control Infors HT
para pH (7 0,5), temperatura (37,0 1,0) C y
concentracin de oxgeno (50% 30). La velocidad de
-1
agitacin fue de 150 min y la de aireacin 0,02 vvm.
2.4 Clonaje por dilucin limitante y seleccin de
clones
Se realizaron dos experimentos para la obtencin del
clon estable y productor. Se utilizaron clulas de la
lnea hibridoma cultivadas en el biorreactor de 10 L
durante 30 d. Se utiliz el mtodo de CDL, realizado
en placas de cultivo de 96 pozos.
Experimento 1: Seleccin de un medio para el clonaje
libre de suero. Para elegir la composicin del medio de
clonaje se realiz un diseo experimental de cribado,
4-1
factorial 2 . Los factores y niveles estudiados fueron:
glucosa: 30 50 mmol/L; insulina: 0,5-1 mg/L; suero: 0
1 % y medio metabolizado: 0 30 %. La variable
respuesta en el experimento fue la eficiencia de
clonaje (E) expresada en (%). Los resultados se
procesaron utilizando el programa Statgraphics
Centurin XV.
=

(96)

100

(ec.2)

Experimento 2: Obtencin de un clon estable y

productor en medio libre de suero. A partir de clulas
cultivadas en el biorreactor y un medio libre de suero
(determinada su composicin en el experimento
anterior) se procedi a la realizacin de un clonaje en
cuatro placas de cultivo de 96 pozos. Se parti de la
lnea celular hibridoma, inestable, que tena 45 d en
cultivo y de ellas aproximadamente 30 d de
fermentacin. Los clones que tuvieron una
concentracin de anticuerpo mayor que 15g/mL se
expandieron en una placa de 24 pozos por duplicado.
En esta placa, cuando los clones alcanzaron una
6
concentracin de clulas superior a 10 cl/mL se les
realizaron los ensayos de citometra de flujo y ELISA.

Los clones seleccionados por estos dos criterios se

continuaron expandiendo en frascos de cultivo para la
realizacin de estudios cinticos.
2.5 Procesamiento de las muestras
La concentracin de clulas y la viabilidad celular se
determinaron por conteo celular utilizando una cmara
de Neubauer y aplicando el mtodo de exclusin con
el colorante tripn azul.
La determinacin de la concentracin de anticuerpo
se realiz por el mtodo inmunoenzimtico ELISA,
segn se describe en [31].
La determinacin del contenido de IgG intracelular
se realiz por citometra de flujo empleando un
citmetro de flujo FACScan. El procesamiento de los
datos se realiz empleando el programa FlowJo,
versin 7.2.2. Se requiri de un pre-tratamiento a la
muestra con el objetivo de permeabilizar la membrana
de las clulas, obtenidas en las diferentes etapas del
cultivo continuo y semicontinuo. En todos los casos la
viabilidad celular fue superior al 90%. Para realizar la
lectura de las muestras, estas se lavaron con PBS 1X
y luego se les aadi un reactivo anti-IgG murino
conjugado con un compuesto fluorforo (FITC).
Adems en el ensayo se utiliz un control negativo,
clulas que no secretan anticuerpos. Este
procedimiento est descrito de forma ms detallada
[32].
RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1 Caracterizacin de la lnea celular 1E10/TA
3.1.1 Determinacin de los parmetros cinticos en
cultivo por lote
Los parmetros se muestran en la Tabla 1. Los
resultados de Xv mx , mx y t d son similares a los
obtenidos por Vctores en el 2009, excepto para los
valores relacionados con la produccin de anticuerpo
que son inferiores; esto puede estar relacionado con la
variacin de la calidad del medio de cultivo y el error
que introduce la tcnica ELISA.
o

-1

Tabla 1. Parmetros obtenidos a partir del cultivo por lote en frascos agitados a 37 C, 100 min , pH 7,1. La
concentracin de anticuerpo es al final de la fase exponencial.
Xv mx

mx.

c (AcM)

qp

td

( 10 cl/mL)

(h )

(g/mL)

( 10 g/cl h)

(h)

3,61 0,28

0,035 0,004

28,50 0,90

2,45 0,006

19,8 0,8

-1

-7

Leyenda:
Xv mx: Concentracin celular mxima. mx: Velocidad especfica de crecimiento mxima. c(AcM): Concentracin de anticuerpo.
q p: Velocidad especfica de produccin . t d: Tiempo de duplicacin de las clulas.

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3.1.2 Estabilidad de la expresin del anticuerpo en cultivos semicontinuos.

En la Figura 1 se muestran el comportamiento de la concentracin de clulas vivas y la viabilidad celular con
respecto al nmero de pases en los cultivos semicontinuos.

Figura 1. Comportamiento del crecimiento y la viabilidad celular del cultivo durante el estudio de estabilidad de la
o
-1
lnea celular hibridoma a 37 C, 100 min , pH 7,1.
Se observa en la Figura 1 que la concentracin de la
poblacin celular es relativamente constante a lo largo
de 52 pases. La poblacin con dos y 52 pases alcanz
una concentracin de clulas vivas mximas de
6
2,5610 cl/mL y un tiempo de duplicacin que est
en el intervalo entre 24 y 32 h. Se aplic la prueba
estadstica de Kruskal-Wallis la cual arroj que no
existen diferencias estadsticamente significativas
entre las medianas de las concentraciones mximas
de clulas vivas de todos los pases realizados al
cultivo con un nivel de confianza del 95,0 %.
En el caso de la viabilidad correspondiente a cada
pase se observ que para casi todos los casos es alta,
superior a 90%. La sostenibilidad de este parmetro
por encima de 80 % la mayor parte del tiempo de las
cinticas es un indicador de que la salud de la
poblacin celular no se afect por el incremento del
nmero de generaciones.

En la Figura 2 se muestra el comportamiento de la

velocidad especfica de crecimiento durante el estudio
de estabilidad de la lnea celular hibridoma.
Existe una variacin de la durante el estudio. Se
-1
observa un valor inicial de inferior a 0,022 h , luego
existe un incremento con valores de muy similares
-1,
entre s con un valor promedio de 0,036 h parecidos
a los valores tpicos obtenidos para esta lnea celular
-1
(0,035 0,004 h , Tabla 3.1). Se aplic la prueba
estadstica de Kruskal-Wallis para conocer si existen
diferencias estadsticamente significativas entre las
velocidades especficas de crecimiento. Se obtuvo
como resultado que no existe una diferencia
estadsticamente significativa entre las medianas de
las velocidades especficas mximas de crecimiento
con un nivel de confianza del 95,0 %. La mediana de
-1
es 0,033 h .

Figura 2. Comportamiento de la velocidad especfica de crecimiento durante el estudio de estabilidad de la lnea

o
-1
celular hibridoma a 37 C, 100 min , pH 7,1.

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En la Figura 3 se presentan los resultados del comportamiento de la concentracin de anticuerpo en el cultivo y de la

velocidad especfica de produccin(qp) con respecto al nmero de pases realizados.

Figura 3. Comportamiento de la velocidad especfica de produccin (qp) y la concentracin de anticuerpo monoclonal

o
-1
(c(AcM)) durante el estudio a largo trmino de la lnea celular hibridoma a 37 C, 100 min , pH 7,1.
Se observa que existe una disminucin tanto de la
velocidad especfica de produccin (qp) como de la
concentracin de anticuerpo durante todo el estudio,
presentando una prdida de expresin de un 74% a
los 52 pases respecto al inicio. Para ambas variables
ocurre una disminucin brusca al inicio del cultivo y se
ven mayores diferencias entre los pases 2, 12, y 22.
Sin embargo, existe poca variacin de ambos
parmetros entre los 22 y 52 pases. Por otra parte se
tiene que la qp obtenida a los 52 pases es 3,8 veces
inferior a la obtenida a los 2 pases del cultivo.
Heller-Harrison y colaboradores (2009) plantean que
la inestabilidad gradual es aquella en la que se
produce una lenta disminucin de la expresin del
producto durante los meses de cultivo de la lnea
celular. Segn este criterio y los resultados obtenidos
la lnea celular hibridoma presenta una inestabilidad
gradual. En este caso existe una prdida de la
expresin de producto de un 50% dentro de los
primeros 22 pases (50 d en cultivo) y con el trascurso
del tiempo contina disminuyendo; a los 52 pases
consecutivos (120 d) no se ha perdido por completo la
capacidad de expresin del anticuerpo.

La prdida de la produccin de anticuerpos

especficos en hibridomas a menudo se ha atribuido a
la aparicin de poblaciones no productoras que tienen
una ligera ventaja en el crecimiento sobre el resto de
la poblacin. Sin embargo, en la mayora de los casos,
las poblaciones no productoras, despus de un
tiempo, dejan de aumentar y se logra un equilibrio
entre las dos poblaciones existentes [20].
Para conocer cmo es el compotamiento de la
poblacin en la lnea celular se realiz un seguimiento
durante el cultivo a largo trmino (LTC) por FACS; los
resultados se muestran en la Figura 4.
En estos histogramas se pueden distinguir dos
poblaciones: clulas no productoras de AcM (NP),
clulas productoras de AcM (PP). Dentro de la PP se
encuentran aquellas clulas con bajo contenido de
AcM intracelular (BP) y clulas de alto contenido de
AcM intracelular (AP). Est descrito por Coco-Martin
(1991) que para lneas inestables, estos histogramas
se caracterizan por presentar heterogeneidad
poblacional, lo que representa ms de un pico en la
distribucin poblacional. El pico negro representa el
control negativo del experimento.

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Figura 4. Histogramas de la distribucin de clulas en cuanto a su intensidad de fluorescencia (FL1) medidas durante
el estudio a largo trmino en cultivos semicontinuos en frascos agitados.
Al observar los histogramas se aprecia la existencia
de una poblacin heterognea que con el aumento del
nmero de pases experiment tres cambios
importantes: (1) la disminucin del tamao y la
intensidad del pico principal, (2) la disminucin del
tamao y la intensidad del pico secundario, (3) el pico
secundario se hace ms heterogneo. En el caso de
las clulas con dos pases, el 96,72% 1,24 es PP;
presenta dos picos similares en cuanto a porcentaje de
PP, uno que se corresponde con la poblacin AP (a la
derecha) debido a mayores valores de intensidad de
fluorescencia (FL1-H) al que se llamar pico principal y
otro pico que representa la poblacin BP (a la
izquierda) con menores valores de intensidad de
fluorescencia, el cual se nombrar pico secundario. La
intensidad de fluorescencia est relacionada
proporcionalmente con la concentracin de anticuerpo,
esto quiere decir que mayores valores de intensidad
media de fluorescencia (IMF) (determinada por la
mediana del rea bajo la curva) representan mayores
valores de concentracin de anticuerpo. A los 12 y 42
pases, se observan mayores diferencias entre los

tamaos de los dos picos; a los 42 pases la mayor

cantidad de clulas se encuentra en la subpoblacin
BP que tiene pequeos valores de IMF.
Luego a los 52 pases solamente el 38,38% 3,83 de
las clulas producen anticuerpo, el pico principal es
muy pequeo y representa muy poco del total de PP.
El tamao de los picos est determinado por el
nmero de clulas de esta poblacin. En la Tabla 2 se
muestra un resumen de los parmetros obtenidos por
el programa de anlisis de los datos de la citometra
de flujo.
Se aprecia en la Tabla 2 que, ocurre una disminicin
de la poblacin de clulas productoras durante los 52
pases de 2,52 veces. Las clulas con dos pases
presentan una subpoblacin BP con una IMF de 13,98
3,60, que tiene 4,7 veces menos intensidad de
fluorescencia que la subpoblacin AP. A los 52 pases
existen menores diferencias entre la IMF de las
subpoblaciones. Mientras que las relaciones de qp y
c(AcM) entre los 2 y 52 pases se comportan de forma
similar, existiendo una disminucin de 3,8 veces.

Tabla 2. Resumen de parmetros determinados por ELISA y FACS durante el estudio de estabilidad de la lnea
hibridoma en cultivos semicontinuos.
Muestra
%PP
IMF PP
IMF BP
c(AcM) (g/mL)
qp (g/cl h)
2 pases
12 pases
42 pases
52 pases
2 pases/52 pases

96,722,14
70,230,16
72,450,05
38,381,47
2,52

65,410,32
33,190,04
23,240,05
49,761,81
1,31

13,983,60
9,860,11
8,100,62
11,570,47
1,20

25,700,04
15,500,08
9,300,21
6,700,52
3,83

2,46E-07
1,62E-07
9,71E-08
6,43E-08
3,84

Leyenda:
%PP: Porcentaje de clulas productoras en la poblacin. IMF PP: Intensidad media de fluorescencia de la poblacin productora.
IMF BP: Intensidad media de fluorescencia de la poblacin bajo productora. c(AcM):Concentracin de anticuerpo. qp: Velocidad
especfica de produccin.

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3.1.3 Determinacin de parmetros cinticos y la

distribucin de poblaciones en cultivos continuos
El modo de cultivo continuo permite establecer
estados estacionarios y es una herramienta muy
poderosa para la caracterizacin celular. No obstante,
la concentracin celular que se alcanza no es mucho
6
mayor que 210 cl/mL, por lo que es de esperar que
en este modo de operacin la productividad sea baja.
Se estudi qu le ocurre a las clulas que estn
dentro del biorreactor en cultivo continuo en diferentes
estados estacionarios. Adems se utiliz la citometra
de flujo para comprender el comportamiento de la
poblacin celular as como su distribucin respecto a
la intensidad media de fluorescencia. La Figura 5
ofrece una visin general del comportamiento del
cultivo para una corrida realizada en modo de
operacin continuo. En esta figura se representan las
curva de concentracin de clulas y de la viabilidad.

La disminucin de la produccin por clones

inestables como la observada en este estudio se debe
a la aparicin de una poblacin con un nivel de
secrecin muy bajo (BP) la que aumenta su proporcin
en el cultivo a lo largo del tiempo. En la literatura se ha
informado la ocurrencia de una o dos subpoblaciones
que disminuyen su intensidad de fluorescencia
progresivamente [21, 22]. Otros reportan que sin variar
sustancialmente los valores de fluorescencia
disminuye la proporcin de PP/BP a lo largo del tiempo
[23]. Esto va unido a un ligero decrecimiento de la
intensidad de fluorescencia de ambas subpoblaciones,
lo que es indicativo de que las clulas de mayor
capacidad de secrecin dentro de la poblacin
productora pasan a ser no productoras. La aparicin
de poblaciones no productoras se atribuye a la prdida
de cromosomas, mutacin, o reordenamiento de
genes asociados con la sntesis y regulacin de la
proteina de inters [24].

Figura 5. Comportamiento de la concentracin de clulas vivas y la viabilidad celular durante el cultivo continuo de la
-1
lnea 1E10/TA en el biorreactor de 10 L. Las velocidades de dilucin en d se indican en el grfico, y los cambios en
la dilucin se marcan con lneas discontinuas.
Se observa que el cultivo continuo comienza a partir
de los 5 d y que la concentracin de clulas viables
6
alcanz valores entre 1,5 - 2,5 10 cl/mL. Se
lograron diferentes estados estacionarios, a las
-1
velocidades de dilucin de 0,25, 0,5, 0,6 y 0,7 d .
Estos estados estacionarios se definieron a partir de

comprobar que la desviacin estndar de Xv fuese

menor que su promedio, al menos en un orden de
magnitud. Durante todo el cultivo se obtienen valores
de viabilidad celular por encima de 85%. El
comportamiento de la concentracin de anticuerpo se
puede apreciar en la Figura 6.

60
c(AcM) (ug/mL)

50

Cultivo continuo

Cultivo por lote

40
30
20

0,25

0,5

0,6

0,7

10
0
0

10

15

20

25

30

Tiempo (das)

Figura 6. Comportamiento de la concentracin de anticuerpo monoclonal durante el cultivo continuo de la lnea

-1
1E10/TA en el biorreactor de 10 L. Las velocidades de dilucin en d se indica en el grfico, y los cambios en la
dilucin se marcan con lneas discontinuas.

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Se aprecia que al inicio del cultivo continuo contina

aumentando la concentracin de anticuerpo hasta los
9 d donde alcanza su valor mximo (54,71 g/mL) con
-1
una velocidad de dilucin de 0,25 d . Luego comienza
a disminuir. A partir de los 20 d de fermentacin se

estabilizan los valores de concentracin de anticuerpo

alrededor de 5 g/mL. Las flechas en azul en la Figura
6 indican los das que se tom muestras para fijar
clulas para analizar por citometra de flujo; los
resultados se muestran en la Figura 7 y en la Tabla 3.

Tabla 3. Parmetros de la poblacin intracelular de las clulas durante una fermentacin medidos por la tcnica de
citometra de flujo y concentracion de AcM determinado por ELISA.
Muestra
%PP
IMF
c(AcM) (g/mL)
Clulas para inculo
Clulas del fermentador da 1
Clulas del fermentador da 15
Clulas del fermentador da 20

91,800,26
75,997,50
50,001,11
43,900,56

56,090,20
30,734,12
17,720,12
15,410,32

35,16
4,01
21,97
4,36

Leyenda:
%PP: Porcentaje de clulas productoras en la poblacin. IMF: Intensidad media de fluorescencia. c(AcM):Concentracin de
anticuerpo.

Los resultados de citometra describen el fenmeno

observado en el fermentador en cuanto a la
concentracin de anticuerpo. Las clulas con que se
realiz el inculo, tienen una concentracin de
anticuerpo de 35 g/mL. Con un da en el biorreactor
es lgico que el valor de concentracin de anticuerpo
sea pequeo porque existe pequea cantidad de
clulas vivas; mientras, el porcentaje de PP es de
75,99 7,50; esto reafirma la capacidad que tienen las
clulas con ese tiempo en cultivo se continuar

sintetizando anticuerpo. Luego al final de la corrida

(20 d), el valor de concentracin de anticuerpo es de
4,36 g/mL donde solamente el 43,90% 0,56 de la
poblacin es productora de anticuerpo y la IMF es 3,6
veces inferior a la que presentan las clulas del
inculo. Estos resultados confirman los obtenidos por
otros autores [25], que plantean que la disminucin de
la produccin de anticuerpo est directamente
relacionada con el bajo contenido de anticuerpo
intracelular.

Figura 7. Histogramas de la distribucin de clulas de 1E10/TA con respecto a la intensidad de fluorescencia (FL1)
medidas en diferentes tiempos del cultivo continuo en el biorreactor de 10 L.

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En los histogramas se pudo observar que la

distribucin de las poblaciones en cultivo continuo
coincide con los resultados obtenidos en los estudios
semicontinuo: la existencia de una poblacin
heterogrnea donde con el transcurso del tiempo en
cultivo disminuye la PP. Las clulas utilizadas para
inocular el fermentador tienen 6 pases; presentan una
poblacin bimodal en la cual el 91,80% 0,26
representa PP. El hecho de que las clulas tengan un
da de residencia en el biorreactor hace que cambie el
perfil y se observa en la Figura 7 que disminuye la
intensidad de fluorescescia y aumenta la proporcin de
clulas en el pico secundario. A los 15 d de cultivo en
el biorreactor cuando la velocidad de dilucin es
-1
0,6 d , la PP es aproximadamente la mitad respecto al
valor de las clulas utilizadas para el inculo y se
observa una mayor heterogeneidad. A los 20 d de
cultivo en el biorreactor donde la velocidad de dilucin
-1
es 0,7 d el perfil es muy similar al anterior, lo cual
corrobora lo observado en la Figura 6 de la tendencia
a estabilizar la concentracin de anticuerpo durante el
tiempo. La disminucin de la produccin en clones
inestables como el 1E10/TA se debe a la aparicin de
poblaciones con un nivel de secrecin muy bajo (NP),

las que aumentan su proporcin en el cultivo a lo largo

del tiempo.
La produccin a gran escala de anticuerpo a partir
del cultivo de clulas de hibridomas se realiza en
modo continuo. Debido a los altos tiempos en cultivos
de estos sistemas existe una gran probabilidad de
modificaciones de las clulas. Estas variaciones
dependen de condiciones ambientales, tales como el
pH, temperatura, oxgeno disuelto (DO), o limitacin de
nutrientes, que pueden dar lugar a clulas con
diferentes
caractersticas
fenotpicas.
Las
caractersticas pueden influir en la formacin del
anticuerpo, as como en la formacin de variantes
idiotpicas o la produccin incompleta de las cadenas
pesada o ligera [26].
3.2 Obtencin de clones productores y estables
3.2.1 Clonaje a partir de clulas en el biorreactor y
seleccin de clones
Para la formulacin del medio se utiliz un diseo de
4-1
experimentos 2 cuyas caractersticas se describen
en Materiales y mtodos. En la Figura 8 se pueden
observar los efectos de los suplementos utilizados y
sus combinaciones.

Diagrama de Pareto Estandarizada para E

C:Glucosa
B:MM
AC+BD
AB+CD
A:Suero
AD+BC
D:Insulina

+
-

20

40
Efecto estandarizado

60

80

Figura 8. Diagrama de Pareto de los efectos individuales y sus interacciones sobre la variable respuesta Eficiencia de
clonaje (E).
Se observa que la glucosa, el medio metabolizado,
el suero y algunas de las interacciones tienen efectos
significativos. En el caso de las interacciones existe
una que incluye la insulina, aunque es la que menor
efecto tiene y no resulta significativa en el diseo.
Adems en la figura se diferencian cules factores
tienen efectos positivos y negativos para lograr mayor
E. La glucosa y el medio metabolizado son los factores
que ms influyen en la eficiencia de clonaje. El
estadstico de Durbin-Watson igual a 2,80 (valor-P =
0,86 > 0,05) prueba la aleatoriedad de los residuos
con un 95,0% de nivel de confianza. La Tabla 4
muestra la combinacin de los niveles de los factores,
que maximiza E para un valor de 15,75%.

Tabla 4. Resultados de la optimizacin de la Eficiencia

de clonaje.
Factor
Bajo
Alto
ptimo
Suero
0,0
1,0
0,0
MM
0,0
30,0
30,0
Glucosa
30,0
50,0
50,0
Insulina

0,5

1,0

0,5

A partir del anlisis del diseo experimental aplicado

se concluye que es posible emplear un medio
fortificado libre de suero para la seleccin de clones
mediante clonaje por dilucin limitante basado en: la
utilizacin de glucosa, medio metabolizado, e insulina
como componentes.

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Estos resultados pueden ser comparados con los

alcanzados por Dhulipala (2011), el cual en trabajos
similares de seleccin de medios libres de suero
obtuvo valores similares de eficiencia de clonaje para
la lnea CHO productora de eritropoyetina humana
recombinante.
Es importante sealar que tradicionalmente estos
procesos de clonajes se realizan en medios
suplementados con suero y, luego del proceso de
seleccin la lnea se adapta a medio libre de suero, lo
cual es una desventaja en el desarrollo de la lnea. Por
lo general, durante la adaptacin ocurre una

disminucin de la productividad. Por otra parte, los

requisitos regulatorios cada vez ms exigentes, debido
a los riesgos del trabajo con sueros, aconsejan la
utilizacin de medio libres de protenas [14].
A partir de los resultados anteriores, se tom la
mejor condicin del diseo experimental (P2) y se
realiz una segunda etapa de clonaje utilizando
clulas cultivadas en el biorreactor.
A continuacin se muestra en la Figura 9 los
resultados del clonaje en medio libre de suero
realizado en cuatro placas de cultivo de 96 pozos.

Eficiencia de clonaje (%)

12,00
10,00
8,00
6,00
4,00
2,00
,00
P1

P2

P3

P4

Figura 9. Eficiencia de clonaje obtenida en la segunda etapa de clonaje por dilucin limitante utilizando un medio
fortificado libre de suero.
Se observa que la placa en la que se obtuvo mayor
eficiencia de clonaje fue la dos (10,41 %). Estos
valores son inferiores a los esperados segn los
resultados del experimento anterior. Los resultados
obtenidos son comparables con los informados en la
literatura para CDL en medios libres de suero los que
se encuentran entre 5 y 35 % de eficiencia de clonaje
[14].
El primer criterio para reducir el nmero de
candidatos fue el resultado de la concentracin de

anticuerpo a partir del sobrenadante de la placa de 96

pozos. De los 26 clones seleccionados se desecharon
aquellos con una concentracin inferior a 10 g/mL (3
clones).
El segundo criterio fue la medicin por FACS del
contenido de IgG intracelular a los 23 clones
seleccionados. En la Figura 10 se muestran los
resultados.

Figura 10. Porcentaje de poblacin productora (PP) de los clones obtenidos en la segunda ronda de clonaje a partir
de clulas cultivadas en el biorreactor.
Como se observa, los clones que presentan un valor
de poblacin productora (PP) superior a 50% son 2B9,
2G9, 4C6. A pesar de que los clones 1E9, 1G12 y 4C5
tienen menores valores de PP se les continu
realizando anlisis para tener ms elementos al decidir

desecharlos. A travs de la distribucin de poblaciones

por citometra de flujo se evalu su grado de
homogeneidad. Los resultados se muestran en la
Figura 11.

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Figura 11. Distribucin de la poblacin relativa al contenido intracelular de anticuerpo monoclonal mostrado en forma
de histogramas de los clones seleccionados.
El clon 2G9 presenta una poblacin bimodal, por lo
cual es de sospechar una posible inestabilidad
relacionada con el aumento de la subpoblacin no
productora con el tiempo y las condiciones de cultivo.
Pero si no existe un incremento en la proporcin de
esta subpoblacin no productora, no se afectara la
productividad total del cultivo, ya que tiene bajos
valores de intensidades de fluorescencia (FL1) por lo
que su influencia en la velocidad especfica de
produccin sera despreciable [27].
Como criterio de seleccin para reducir el nmero de
clones a ser evaluados en frascos agitados se tom la
concentracin mxima de anticuerpo acumulada
durante 7 d y el porcentaje de poblacin productora
(PP) en placas de 24 pozos. Los resultados se
muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Parmetros de los clones obtenidos en placas
0
de 24 pozos cultivados a 37 C.
Clon
c(AcM) (g/mL) PP (%)
4C6
5,40 1,19
54,32 0,24
2B9
25,70 0,58
87,98 0,67
1E9
8,25 0,94
47,87 1,48
2G9
18,13 1,39
72,51 1,32
1G12
6,68 0,49
37,71 0,56
Leyenda:
c(AcM):Concentracin de anticuerpo. PP (%): Porcentaje de
clulas productoras en la poblacin.

Los resultados de concentracin de anticuerpo son

similares a los obtenidos por citometra de flujo en
cuanto a porcentaje de PP. Los clones 2B9 y 2G9
resultan tener mayor concentracin de anticuerpo con
valores de 25 g/mL y 18 g/mL respectivamente,
mientras que los porcentajes de PP para dichos clones
resultan ser los mayores valores, pero no los
esperados (> 95%).
3.3 Desempeo del clon seleccionado en
biorreactores de tanque agitado
Dado que los resultados obtenidos a escala de
laboratorio en frascos agitados fueron satisfactorios,
es importante para la eleccin de un clon particular su
evaluacin bajo condiciones lo ms cercanas posible a
las del proceso de produccin, por lo que se procedi
a cultivar este clon de clulas en biorreactores
agitados de 30L. Se inici la operacin con un cultivo
por lote, una vez alcanzada la concentracin celular de
6
3-4 10 cl/mL se inici el cultivo continuo con
retencin a partir de los 4 d con una velocidad de
-1
dilucin de 0,25 d , alcanzndose concentraciones
6
mximas de clulas vivas alrededor de 610 cl/mL.
Luego a los 11 d se pas a operar en cultivo continuo
sin retencin hasta el final de la fermentacin. La
Figura 12 ofrece una visin general del
comportamiento del cultivo en cuanto a crecimiento y
viabilidad en las dos corridas realizadas a escala
piloto.

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Figura 12. Perfiles de concentracin de clulas vivas y viabilidad celular del clon 2B9 obtenida en dos corridas de
fermentacin realizadas a escala piloto.
En el cultivo por lote se alcanza una concentracin
6
de clulas vivas de 3,4 10 cl/mL, luego en la
6
perfusin se alcanzan valores de 6 10 cl/mL y en el
6
cultivo continuo un valor promedio de 2,5 10 cl/mL.

La viabilidad se encuentra por encima de 80% hasta

los 15 d.
En la Figura 13 se muestran los resultados de qp
para el clon 2B9 en dos corridas de fermentacin en el
biorreactor de 41 L.

Figura 13. Comportamiento de la velocidad especfica de produccin (qp) del clon 2B9 en un biorreactor de 41 L. Las
lneas discontinuas verticales rojas delimitan las etapas de cultivo: I Cultivo por lote, II Cultivo continuo con perfusin y
III Cultivo continuo.
La figura anterior muestra que no existe una
tendencia sostenida en la velocidad especfica de
produccin durante las tres etapas de cultivo, por lo
que no se manifiesta ningn fenmeno de
inestabilidad. Este resultado es positivo y como
inform Legman [30] es posible re-seleccionar lneas
celulares, en este caso a partir de una lnea celular
inestable, sin que el nuevo clon muestre cambios
fenotpicos durante el cultivo celular.
CONCLUSIONES
1. La concentracin de clulas vivas, la velocidad
especfica de crecimiento y la viabilidad celular no se
afectan por la inestabilidad a la secrecin de
anticuerpos por el hibridoma murino.

2. La lnea celular hibridoma mostr una

inestabilidad gradual en la secrecin de anticuerpo
monoclonal en cultivos semicontinuos y continuos.
Esta inestabilidad es debido a la aparicin de
subpoblaciones no productoras que aumentan su
proporcin a 2,5 veces en un tiempo de 120 d.
3. Durante 52 pases del cultivo semicontinuo se
pierde un 74% de la expresin de anticuerpo respecto
al inicio.
4. Fue posible obtener clones en un medio
fortificado, sin suero, con una eficiencia de clonaje de
10,41%.
5. Fueron seleccionados dos clones que tienen
similar comportamiento en cuanto a crecimiento
celular.

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6. Los dos clones caracterizados a escala de

laboratorio muestran una produccin estable de
anticuerpo durante 120 d.
7. Se obtuvo buen desempeo del clon 2B9 a escala
piloto logrndose una concentracin celular mxima
6
igual a 6 10 cl/mL, una productividad especfica de
-8
9,88 10 g/cl h con una distribucin homognea de
la poblacin celular.
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Kruif J, Kramer A, Nijhuis R. (2010). Generation of
Stable Cell Clones Expressing Mixtures of Human
Antibodies. Biotechnology and Bioengineering, Vol.
106, No. 5,
2. Barnes L, Dickson A, (2006). Mammalian cell
factories for efficient and stable protein expression.
Current Opinion in Biotech. 17: 381-386.
3. Surez J M. (2007). Obtencin de una cepa
industrial para la produccin de Eritropoyetina humana
recombinante a partir de biorreactores de tanque
agitado. Tesis de Maestra en Ingeniera de los
Procesos Biotecnolgicos, Facultad de Ingeniera
Qumica. Instituto Superior Politcnico Jos Antonio
Echeverra. Habana. Cuba.
4. Kaneko Y, Sato R, and Aoyagi H. (2010).
Evaluation of Chinese hamster ovary cell stability
during repeated batch culture for large-scale antibody
production. Journal of Bioscience and Bioengineering.
VOL. 109 No. 3, 274280.
5. Alfonso, S., Daz, R. M., de la Torre, A.,
Santiesteban, E., Aguirre, F., Prez, K., Rodrguez, J.
L., Barroso M del C., Hernndez, A. M., Toledo, D.,
Gabri, M. R., Alonso, D. F., Viada, C., Gmez, R. E.,
Suarez, E., Vzquez, A. M., Prez, R. y Macas, A. E.
(2007). 1E10 anti-idiotype vaccine in non-small cell
lung cancer: experience in stage IIIb/IV patients.
Cancer Biol Ther 6 (12): 1847-1852.
6. Shukla, A. A., Hubbard, B., Tressel, T., Guhan, S.
y Low, D. (2007). Downstream processing of
monoclonal
antibodies--application
of
platform
approaches. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed
Life Sci 848(1): 28-39.
7. Barnes L., Bentley C., Dickson A. (2003). Stability
of Protein Production From Recombinant Mammalian
Cells. Biotechnology and Bioengineering, vol. 81, no.
6, march 20.
8. Chuck AS, Palsson BO. (1992). Population
balance between producing and nonproducing
hybridoma clones is very sensitive to serum level, state
of inoculum, and medium composition. Biotechnol
Bioeng 39: 354360.
9. Kim S., Kim N., Ryu C., Honk H., Lee G. (1998).
Characterization of chimeric antibody producing CHO
cell in the course of dihidrofolate reductase-mediated
gene amplification and their stability in absence of
selective presure. Biotechnol. Bioeng. 58. 1: 73-84.
10. Bae, S.W., Hong, H. J., Lee, G. M. (1995).
Stability of transfectomas producing chimeric antibody

against the pre-S2 surface antigen of hepatitis B virus

during a long-term culture. Biotechnol. Bioeng. 47:
243-251.
11. Lee M. S, Lee G. M. (1998) Hyperosmotic
pressure enhances immunoglobulin transcription rates
growth, metabolism, and antibody production.
Biotechnol. Bioeng. 39: 418-431.
12. Bohm E, Voglauer R, Steinfellner W, Kunert R,
Borth N, Katinger H. (2004). Screening for Improved
Cell Performance: Selection of Subclones with Altered
Production Kinetics or Improved Stability by Cell
O
Sorting. Biotechnology and Bioengineering, vol. 88, N .
6.
13. Kondragunta B, Drew J, Brorson K. (2010).
Advances in Clone Selection Using High-Throughput
Bioreactors. Biotechnol. Prog, Vol. 26, No. 4, 10951103.
14. Dhulipala P, Liu M, Beatty S, Sabourin M, Piras G,
Barrett S, Hassett R, and Gorfien S. (2011). Differential
Cell Culture Media for Single-Cell Cloning. BioProcess
International 9 (11), 44-51.
15. Schlatter S, Bailey JE, Fussenegger M. (2001).
Novel surface tagging technology for selection of
complex proliferation-controlled mammalian cell
phenotypes. Biotechnol Bioeng. 5; 75(5):597-606.
16. Picot J, Guerin C, Le Van Kim C. (2012). Flow
cytometry: retrospective, fundamentals and recent
instrumentation Cytotechnology 64:109130.
17. Porter A Jand Racher A J. (2010). Strategies for
Selecting Recombinant CHO Cell Lines for cGMP
Manufacturing: Improving the Efficiency of Cell Line
Generation. Biotechnol.Prog, Vol. 26, No. 5: 14551464.
18. Victores S. (2009). Establecimiento de un proceso
de cultivo en biorreactor de Tanque Agitado para la
obtencin del Anticuerpo Monoclonal1E10. Tesis de
maestria .CUJAE. C. Habana. Cuba.
19. Heller-Harrison R A., Crowe K, Cooley C, Hone M,
McCarthy K, Leonard M. (2009). Managing Cell Line
Instability and Its Impact during Cell Line Development.
BioPharm International Supplements.
20. Barnes
L.,
Bentley
C.,
Dickson
A.
(2001).Characterization of the stability of recombinant
protein production in the GS-NS0 expression system.
BiotechnolBioeng. May 20; 73(4):261-70.
21. Li F, Vijayasankaran N. (2010). Cell culture
processes for monoclonal antibody production.
MAbsvol 2(5), 466-477.
22. Kim S., Kim N., Ryu C., Honk H., Lee G. (1998).
Characterization of chimericantibody producing CHO
cell in the course of dihidrofolate reductase
mediatedgene amplification and their stability in
absence of selective presure. Biotechnol.Bioeng. 58. 1:
73-84.
23. Lee GM, Varma A, Palsson BO. 1991. Application
of population balance model to the loss of hybridoma
antibody productivity. BiotechnolProgr 7:7275.

13/14
Revista Bioprocesos, Vol.1, No.2, Junio, 2015

24. Dorai H, Corisdeo S, Ellis D, Kinney C, Chomo M,

Hawley-Nelson P, Moore G, Betenbaugh MJ, Ganguly
S. 2011. Early prediction of instability of Chinese
hamster ovary cell lines expression recombinant
antibodies and antibody-fusion proteins. Biotechnol
Bioeng 109:10161030.
25. Ozturk SS, Palsson BO. 1990. Loss of antibody
productivity during long term cultivation of a hybridoma
cell line in low serum and serum-free media.
Hybridoma 9:167175.
26. Coco-Martin JM, Oberink JW, Brunink F, van der
Velden-de Groot TAM, Beuvery EC. 1992. Instability of
a hybridoma cell line in a homogeneous continuous
perfusion culture system. Hybridoma 11:653665.
27. Boggiano T. (2002). Estabilidad de los clones
secretores de R3h, recuperacinde la capacidad
productiva. Tesis para optar por el grado de maestro
en ciencias biotecnolgicas.

28. Chen F,Fan L, Wang J, Zhou Y, Ye Z, Zhao L,

Tan W L. (2012). Insight into the roles of hypoxanthine
and thydimineon cultivating antibody-producing CHO
cells: cell growth, antibody production and long-term
stability. Appl Microbiol Biotechnol 93:169178.
29. Coco-Martin JM. (2008). A Review of Therapeutic
Protein Expression by Mammalian Cells. BioProcess
International. Supplement.
30. Legmann R and Benoit B. (2011). A Strategy for
Clone Selection under Different Production Conditions.
Biotechnol.Prog., Vol. 27, No. 3
31. Victores S. (2009). Establecimiento de un proceso
de cultivo en biorreactor de Tanque Agitado para la
obtencin del Anticuerpo Monoclonal1E10. Tesis de
maestria .CUJAE. C. Habana. Cuba.
32. Boggiano T. (2002). Estabilidad de los clones
secretores de R3h, recuperacin de la capacidad
productiva. Tesis para optar por el grado de maestro
en ciencias biotecnolgicas.

14/14
Revista Bioprocesos, Vol.1, No.2, Junio, 2015