PRACTICA No 6

BALANCE DE FERMENTACIN. PARTE 1

1. OBJETIVO
Realizar el balance xido-reduccin durante el proceso de fermentacin. Discutir y
evaluar el significado de dicho balance para la clula microbiana.
2. INTRODUCCIN
La palabra fermentacin proviene del latn que significa hervir. ste proceso se remonta
desde la prehistoria, adems de la produccin de alcohol o bebidas alcohlicas, la
palabra fermentacin se aplica a cualquier proceso en el cual los microorganismos
(bacterias, hongos, mohos, levaduras) actan sobre una gran variedad de sustancias para
conservar la carne, quesos, mantequilla, yogur, etc. Se utiliza asimismo en la
produccin de antibiticos, vitaminas y muchos materiales qumicos importantes para la
industria. El primer investigador que estudi este proceso fue L. J. Thenard en 1803en
donde observ que la fermentacin se deba a las levaduras. Ms tarde en 1878, Wilhem
Kuhne dio nombre de enzimas a los fermentos que catalizaban la reaccin.
Posteriormente en 1856 Louis Pasteur estudi la pasteurizacin de vinos y cervezas
como medio para evitar la descomposicin y en 1897 Hans y Edward Buchner
estudiaron la fermentacin de los carbohidratos en extractos libres de clulas. En
presencia de oxgeno, aumenta la respiracin y disminuye la fermentacin; sucediendo
lo contrario en procesos de anaerobiosis, a ste efecto se le llama Efecto Pasteur.
Cuando las levaduras actan para convertir los carbohidratos en etanol, usan
bsicamente las mismas reacciones de la gluclisis, la principal diferencia es el modo
como metabolizan el cido pirvico, al cual descarboxilan formando acetaldehdo y
requiriendo Mg+2 y pirofosfato de tiamina en la clula. Posteriormente el acetaldehdo
es reducido por una deshidrogenasa alcohlica que utiliza NADH + H+ como coenzima
formando etanol. Los balances estequiomtricos en procesos de fermentacin son
esenciales para su entendimiento y/o aplicacin. El clculo de flujos metablicos resulta
fundamental en los estudios cuantitativos en fisiologa celular
3. MATERIAL Y EQUIPO
Agitador mecnico
Balanza granataria
Bao mara
Bulbos y Pipetas Pasteur
Centrfuga clnica
Centrfuga refrigerada
Gradillas
Jeringas de 1 mililitro de aguja larga
Matraces para la fermentacin
Matraces volumtricos de 10 y 100 mililitros
Mecheros tipo Fisher
Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros
Probetas de 25 y 100 mililitros
Parafilm
Tapones de hule

Tubos de ensayo de 16 por 150 mm

Material biolgico: Levadura comercial (Saccharomyces cerevisiae)
4. REACTIVOS
cido tricloroactico al 10%
Agua destilada
Glucosa 2 M
Hidrxido de potasio al 10%
Cloruro de Bario al 5%
Regulador de fosfatos de 50 mM pH 6.8
Suspensin de levaduras al 30% v/v
5. DESARROLLO DE LA PRCTICA
OBTENCIN DE LA SUSPENSIN CELULAR.
1. Resuspender tres gramos de levadura en 10 mililitros de medio YPG e incubar 30
minutos a 28C.
2. Las clulas se lavan de 6 a 8 veces con agua destilada por centrifugacin y se
recupera el paquete celular que se resuspende en el regulador de fosfatos hasta
obtener una concentracin final del 30% v/v.
PROCESO DE FERMENTACIN.
1. En un matraz de 50 ml, se colocan 24 ml de suspensin celular y 12 ml de regulador
de fosfatos (vase la tabla indicada) y se realiza una conexin como se muestra en la
figura de abajo, los matraces deben estar conectados hermticamente durante 5
minutos a 32C.

Suspensin de
levadura

CONDICIN
48 ml de suspensin celular sin glucosa
48 ml de suspensin celular con Glucosa 2
M
48 ml de suspensin celular con Glucosa 2
M con 1 mililitro de solucin de cloruro de
mercurio 100 mM

Solucin de
Cloruro de
Bario

48 ml de suspensin celular con Glucosa 2

M con 1 mililitro de solucin de fluoruro de
sodio 100 mM
2. Despus de los cinco minutos de incubacin, se inyecta 12 mililitros de solucin de
glucosa 2 M y se incuban a la misma temperatura.
3. Despus de 30 minutos el proceso de fermentacin se detiene agregando a la mezcla
se mezcla 600 microlitros de cido tricloroactico concentrado y se contina la
incubacin 15 minutos ms.
4. Checar el pH de la solucin y si es necesario neutralice con KOH al 10% y se lleva
a un volumen final de 100 mililitros con agua destilada.
USE MATRACES VOLUMTRICOS O AFORADOS
A partir de sta mezcla de fermentacin recuperada (muestra fermentada) se determina
ETANOL Y GLUCOSA RESIDUAL de la siguiente prctica.
6. INFORME
Mencione otros tipos de fermentacin
Como realizara Usted un proceso fermentativo a nivel industrial
Cul es la enzima ausente en el ser humano que metaboliza el cido pirvico a acetaldehdo
7. BIBLIOGRAFA
J. Hicks, J. Bioqumica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. Mxico, D. F.
Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed.
Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214
Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism.
Academia Press London. pp. 72-74

PRACTICA No. 7
BALANCE DE FERMENTACIN. PARTE 2
1. OBJETIVO
Determinar la cuantificacin de etanol y bixido de carbono producidos en el proceso
cuantitativo de la fermentacin con los productos obtenidos de la sesin anterior

1. INTRODUCCIN
Dos productos resultantes en el proceso de la fermentacin son el alcohol etlico y el
bixido de carbono. La medicin del contenido de alcohol es de capital importancia en el
proceso de elaboracin de vinos debido fundamentalmente a dos motivos. Normalizar el
producto en cuanto a sus caractersticas y sus componentes indicada en la etiqueta y el
origen fiscal, ya que el vino, como toda bebida alcohlica, est sujeto a pago de impuesto y
por tanto el fabricante debe ser cuidadoso en el manejo de este componente para evitar
sufrir penalizaciones. Sin embargo, debe tenerse en consideracin que en elaboraciones
artesanales y principalmente en las caseras, la determinacin de alcohol resulta de menor
importancia que en las elaboraciones industriales y slo estar en funcin de la legislacin
establecida en cada pas.
Existe un buen nmero de metodologas diseadas para la medicin de alcohol (etanol) en
el vino tradicional y en el vino de frutas, pero la principal y ms universalmente extendida
es la tcnica densimtrica. sta se basa en la determinacin de la densidad de una solucin
hidroalcohlica obtenida previamente por destilacin del vino. La densidad puede ser
medida a travs de diversos instrumentos que el analista seleccionar segn su
conveniencia. Entre ellos estn el hidrmetro, alcoholmetro, picnmetro y el ebullmetro.
Hay otras metodologas para la determinacin de alcohol como la cromatografa gas
lquido, la enzimtica donde el etanol se puede oxidar a acetaldehdo por el NAD en
presencia de la enzima alcohol deshidrogenasa (ADH) para producir NADH. El NADH
producido se determina espectrofotomtricamente a 334, 340 o 360 nm dependiendo de la
concentracin de etanol. Otra metodologa es utilizando bicromato de potasio donde el
etanol lo reduce a acetaldehdo y posteriormente a cido actico reduciendo el cromo VI a
cromo III determinndolo espectrofotomtricamente. El bixido de carbono se puede
determinar volumtricamente y gravimtricamente usando reacciones de precipitacin a
carbonatos insolubles.

3. MATERIAL Y EQUIPO
Agitador mecnico
Balanza analtica
Balanza granataria
Bao mara
Bulbos y pipetas Pasteur
Bomba de vaco
Cajas Conway y placas de vidrio
Centrfuga clnica
Centrfuga refrigerada
Desecador

Embudos Buchner
Estufa de 60C
Espectrofotmetro y celdas para el mismo
Gradillas
Hielo picado
Matraces Erlenmeyer de 125 mililitros
Matraces kitasato de 500 mililitros
Matraces volumtricos de 10 y 100 mililitros
Mecheros tipo Fisher
Papel Whatman No. 1 Desecados
Pipetas de 1, 2.5 y 10 mililitros
Probetas de 25 y 100 mililitros
Tubos de ensayo de 16 por 150 mm
Vaselina slida neutra
4. REACTIVOS
cido tricloroactico al 10%
Agua destilada
Agua destilada libre de CO2
Antrona al 0.2% en H2SO4
Solucin saturada de Carbonato de potasio
Dicromato de potasio 14 mM en H2SO4 de 46-49%
Etanol absoluto
Etanol a una concentracin de 1500 microgramos por mililitro
Glucosa 100 miligramos/ mililitro
5. DESARROLLO DE LA PRCTICA
DETERMINACIN DE ETANOL
El etanol producido se cuantifica por el mtodo de Conway, como se indica a continuacin:
En cajas Conway (ver esquema correspondiente), se coloca una cantidad de vaselina slida
sobre el borde externo y 2 mililitros de solucin de K2Cr2O7 en la cmara central.
En la cmara externa se colocan alcuotas de la muestra y se completa a un mililitro con
agua destilada. Se adicionan 2 mililitros de carbonato de potasio saturado y se sella
inmediatamente la tapa.
Se mezcla con ligeros movimientos de inclinacin de la caja y se incuba a temperatura
ambiente durante 30 minutos.
Al trmino de la incubacin se recupera cuantitativamente el Dicromato de potasio y se
afora a 10 mililitros con agua destilada. Se lee absorbencia a 445 nm contra agua destilada.
Se realiza una curva de calibracin de 0 a 1500 microgramos de etanol.

Cmara central
(K2Cr2O7)
Vaselina

Cmara externa (Muestra, agua y

carbonato saturado)

VISTA
LATERAL
VISTA
FRONTAL

CMARA
CONWAY

DETERMINACIN DE GLUCOSA RESIDUAL

Una vez que se retiran las alcuotas para la cuantificacin de etanol, parte de la muestra se
centrfuga en tubos Eppendorf de 1.5 mililitros y se rescata el sobrenadante que debe ser
transparente. Despus de haber llevado a cabo la dilucin conveniente de cada
sobrenadante (segn la concentracin inicial de glucosa), se pasan diferentes alcuotas a
tubos de ensaye de 16 x 150 mm y se lleva a 1 mililitro con agua destilada. Los tubos se
sumergen en un bao de hielo hasta que adquieran la temperatura del bao y se les adiciona
2 mililitros del reactivo de Antrona fra despacio (Cuidado, puede proyectar la mezcla). Se
mantienen los tubos en hielo y para el desarrollo de la reaccin colorida, los tubos se
mezclas vigorosamente (Mucha precaucin) hasta obtener una solucin homognea y luego
se someten a calentamiento en un bao de agua a ebullicin durante 10 minutos. Se dejan
enfriar a temperatura ambiente y se lee la absorbancia a 620 nm contra un blanco de
reactivos.
Siguiendo el protocolo anterior, se efecta una curva de calibracin de 0 a 100
microgramos de glucosa, usando una solucin tipo de glucosa de 100 microgramos por
mililitro.
DETERMINACIN DE CO2 POR GRAVIMETRA
La solucin de cloruro de bario se filtra al vaco. Se hacen dos lavados de dicho matraz con
agua destilada libre de CO2 y se le agregan a la muestra transferida. El precipitado se lava
con acetona al 50% y luego con acetona pura. El papel con la muestra se deseca en una
estufa a 60C durante 20 a 24 horas y posteriormente se pesa.
6. RESULTADOS
CURVA TIPO ETANOL
Microgramos de Etanol
0 (1 ml de agua)

Absorbancia a 445
nm

150 (100 microlitros de

Etanol de 1500 +900
microlitros de agua)
300
600
900
1200
1500
DETERMINACIN DE ETANOL FORMADO EN LA FERMENTACIN
Muestras
Absorbancia a 445 nm
0.1 mililitros de muestra fermentada
0.5 mililitros de muestra fermentada
1 mililitro de muestra fermentada
Estos valores se obtienen al efectuar la lectura de absorbencia contra agua destilada.
CURVA TIPO DE GLUCOSA
Microgramos de glucosa
0
10
20
30
40
50
60
90

Absorbancia a 620 nm

DETERMINACIN DE GLUCOSA RESIDUAL DE LA FERMENTACIN

Muestras
Absorbancia a 620 nm
sobrenadante diluido 1:10
sobrenadante diluido 1:100
sobrenadante diluido 1:1000
sobrenadante diluido 1:10000
sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 1
sobrenadante diluido 1:1000 + Inhibidor 2
Los valores de absorbencia se obtienen al efectuar la lectura contra un blanco de reactivos.
DETERMINACIN DE CO2
Muestras
Papel filtro
Papel filtro + BaCl2
BaCl2 de fermentacin
Papel filtro testigo
Papel filtro + BaCl2 testigo

Peso en gramos (g)

BaCl2 testigo
Papel filtro + BaCl2 +
Inhibidor 1
BaCl2 Inhibidor 1
Papel filtro + BaCl2 + inhibidor
2
BaCl2 Inhibidor 2
7. CLCULOS
Calcule la cantidad de etanol formado en la fermentacin (en mg /10 mililitros de muestra)
Calcule la cantidad de azcar residual y de azcar fermentado (en mg / 10 mililitros de
muestra)
Calcule la cantidad de CO2 formado a partir del peso de BaCO3 obtenido (en miligramos)
Convierta a unidades molares los miligramos de glucosa fermentada y los miligramos de
productos formados
Haga el balance de carbonos y el balance xido-reduccin
8. INFORME
Discuta y evale el significado del balance de fermentacin que obtuvo en su equipo sobre
la base de los antecedentes

9. BIBLIOGRAFA
J. Hicks, J. Bioqumica Editorial McGraw-Hill Interamericana. 2001. Mxico, D. F.
Rose, A. H. 1976. Energy Yielding metabolism: Chemical Microbiology, 3a Ed.
Sutterworths. Boston. pp. 187-188 y 208-214
Sokatch, J. R. 1969. Fermentation of sugars. En: Bacterial physiology and metabolism.
Academia Press London. pp. 72-74.

PRACTICA No. 8
MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA
(GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 1
1. OBJETIVO
Determinar aminoazcares por el mtodo de Elson-Morgan y protenas por el mtodo de
Bradford para el clculo de la actividad especfica de la enzima GlcN-6-P sintasa.
2. INTRODUCCIN
La Glucosamina-6-fosfato sintasa (L-glutamina: D-fructosa-6-fosfato amidotransferasa; EC
2.6.1.16; GlcN-6-P sintasa) cataliza el primer paso de la biosntesis de hexosaminas,
convirtiendo la fructosa-6-fosfato a glucosamina-6-fosfato usando glutamina como donador
de amonio. En eucariotas hay tres reacciones que convierten glucosamina-6-fosfato a
uridina-5-difosfo-N-acetil-D-glucosamina, un precursor de biomacromolculas que
contienen aminoazcares en hongos, bacterias y mamferos tales como glicoprotenas y
quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa y la quitina sintasa catalizan el primer y ltimo
paso de las reacciones para la sntesis de quitina. La glucosamina-6-fosfato sintasa es una
enzima que se ha propuesto como blanco en la quimioterapia antifngica y como resultado
de stas investigaciones, numerosos inhibidores de la glucosamina-6-fosfato sintasa han
sido descritos. La actividad de la ruta de las hexosaminas incrementada es importante en los
hongos durante los cambios morfolgicos, en la sntesis de quitina y manoprotenas ambos
son esenciales como componentes en la pared celular del hongo y tambin involucra las
interacciones entre el hongo y su hospedero.
3. MATERIAL Y EQUIPO
Perlas de vidrio
Homogenizador MSK Braun
Centrfuga
Ultracentrfuga
Tubos para centrfuga
Bao metablico
Pipetas Pasteur
Micropipetas
Tubos de ensayo
Gradillas.
4. REACTIVOS
Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5
Anhdrido actico al 5% (prepararse en el instante)
Solucin saturada de bicarbonato de sodio
Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9
P-Dimetilaminobenzaldehdo (PDMB)
HCl 0.1 M
cido actico glacial
Levadura de panificacin
Reactivo de Bradford
Glucosamina 1 mg/ml

BSA 100 mg/ml (albmina srica bovina)

5. DESARROLLO
*Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es
la concentracin final en el regulador de fosfato
*Reactivo de Ehrlich: por cada tubo necesario para la reaccin lleva 25 microlitros de cido
clorhdrico, 3 mililitros de cido actico glacial y 0.03 gramos de PDMB.
PREPARACIN DE LA FRACCIN ENZIMTICA.
Se trabajar con tres cultivos de Saccharomyces cerevisiae con dos diferentes
concentraciones de rojo congo 0.001%, 0.01% y 0.1%, adems de un control (sin rojo
congo) un da antes de la prctica.
Filtrar por medio del equipo Millipore los medios de cultivo donde se encuentra el hongo y
recuperar las pastillas de cada matraz.
Colocar cada pastilla del hongo en un tubo de vidrio y agregar dos volmenes de perlas de
vidrio y un volumen determinado de regulador todo bajo condiciones de 4C (en hielo)
Homogenice por 20 minutos, 2 minutos homogenizando por 30 segundos de descanso.
Recupere el homogenado celular aspirando con una pipeta Pasteur y centrifugarlo a 10,000
rpm durante 10 minutos a 4C. Recupere el sobrenadante y mantngalo en hielo.
Medir la concentracin de protena y usar esta fraccin como fuente de enzima.
DETERMINACIN DE PROTENA POR EL MTODO DE BRADFORD
Microlitros de
Absorbencia a 595
Microlitros de agua
protena
nm
0
100
5
95
10
90
Reactivo de
25
75
Bradford 1
50
50
mililitro a todos los
tubos
75
25
100
0
Problema 1:10
Problema 1:100
Problema 1:1000

CURVA DE CALIBRACIN PARA EL MTODO DE ELSON-MORGAN

Tomar 300 microlitros de agua y agregue 50 microlitros de anhdrido actico al 5% y 50
microlitros de solucin saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar la
muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo.
Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y
hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo.
Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37C. Leer la
absorbencia de las muestras a 585 nm.

Microgramos de
Glucosamina-6
fosfato
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100

Absorbancia a 585 nm

6. RESULTADOS
Haga una grfica para protena y otra para la glucosamina de absorbencia contra
concentracin para determinarla en la muestra problema.
7. INFORME
Mencione otros mtodos para determinar protena
Mencione algunos inhibidores de la enzima Glucosamina-6-fosfato sintasa y quitina
sintasa.
8. BIBLIOGRAFA
J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham.
Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato
amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996,
p 2320-2327
Gonzlez-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagmez-Castro, Julio-Csar; Cano-Canchola,
C; Lpez-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical
characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target.
Medical Mycology. 2009, p 1-12

PRACTICA No. 9
MEDICION DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO SINTASA
(GlcN-6-P-sintasa) EN LEVADURAS. PARTE 2
1. OBJETIVO
Determinar la actividad cataltica de una enzima esencial en el metabolismo de eucariotas y
procariotas.
2. MATERIAL Y EQUIPO
Perlas de vidrio
Homogenizador MSK Braun
Centrfuga
Ultracentrfuga
Tubos para centrfuga
Bao metablico
Pipetas Pasteur
Micropipetas
Tubos de ensayo
Gradillas.
3. REACTIVOS
Regulador de fosfato de potasio 25 mM pH 6.5
Fructosa-6-fosfato 15 mM
L-Glutamina 10 mM
EDTA 1 mM
DTT 1 mM
Anhdrido actico al 5% (prepararse en el instante)
Solucin saturada de bicarbonato de sodio
Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9
P-Dimetilaminobenzaldehdo
HCl 0.1 M
cido actico glacial
Levadura de panificacin
Reactivo de Bradford
Glucosamina 1 mg/ml
BSA 100 mg/ml (albmina srica bovina)
4. DESARROLLO
Las concentraciones que se indican de fructosa-6-fosfato, L-Glutamina, EDTA y DTT es la
concentracin final en el regulador de fosfato
Reactivo de Ehrlich (p-dimetilaminobenzaldehdo al 1% en HCl 0.1 M en cido actico
glacial).

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSAMINA-6-FOSFATO

En un tubo coloque un mililitro de la mezcla de regulador de fosfato con las

concentraciones indicadas de fructosa-6-P, L-Glutamina, EDTA y DTT y la cantidad de
extracto que contenga una cantidad de protena de 0.15 a 1.5 mg /ml.
Prepare una adicional que no contenga glutamina, en su lugar agregue regulador de fosfato.
Una vez que agregue el extracto celular incube a 30C por 30 minutos y luego un minuto en
agua hirviendo para parar la reaccin. Enfriar a temperatura ambiente. Medir la cantidad de
Glucosamina-6-fosfato por el mtodo de Elson-Morgan.
MTODO DE ELSON-MORGAN
Tome 300 microlitros de la mezcla y agregue 50 microlitros de anhdrido actico al 5% y
50 microlitros de solucin saturada de bicarbonato de sodio e incubar 3 minutos. Calentar
la muestra durante tres minutos en agua hirviendo y posteriormente enfriar en hielo.
Mezclar las muestras acetiladas con 100 microlitros de Tetraborato de potasio 0.8 M pH 9 y
hervir durante tres minutos. Enfriar en hielo.
Agregar 3 mililitros de reactivo de Ehrlich. Incubar durante 20 minutos a 37C. Leer la
absorbancia de las muestras a 585 nm.
5. RESULTADOS
Consultar como se calcula la actividad especfica de la enzima y calclela para las muestras
problema.

6. BIBLIOGRAFA
J. Smith, Rachel; Milewsky, Slawomir; J. P. Brown, Alistair and W. Gooday, Graham.
Isolation and Charaterization of the GFA1 Gene encoding the glutamine: Fructosa-6-fosfato
amidotransferase of Candida albicans. Journal of Bacteriology, Vol. 178, No. 8. Apr. 1996,
p 2320-2327
Gonzlez-Ibarra, J; Milewsky, Slawomir; Villagmez-Castro, Julio-Csar; Cano-Canchola,
C; Lpez-Romero, E. Sporothrix schenckii: Purification and partial biochemical
characterization of the glucosamine-6-phosphate synthase, a potential antifungal target.
Medical Mycology. 2009, p 1-12.

PRACTICA No. 10
ACTIVIDAD PARCIAL DE ORNITINA DESCARBOXILASA EN
SEMILLAS
1. OBJETIVO
Determinar la actividad de ornitina descarboxilasa de manera parcial en
semillas de frijol germinado.
2. INTRODUCCIN
La Ornitina descarboxilasa (ODC, E.C. 4. 1. 1. 17) es una enzima
altamente regulada que cataliza el primer paso limitante para la
produccin de poliaminas, transformando la ornitina a putrescina y
posteriormente a espermidina y espermina. La ODC es una de las
enzimas ms reguladas en organismos eucariotas, es inducida por
diferentes activadores del crecimiento y suprimida por inhibidores
especficos o por mutaciones que inhiben el crecimiento celular y la
transformacin. Tambin puede ser inducida por otros estmulos, tales
como el tratamiento hipotnico o estmulos que inducen la diferenciacin
celular. La ODC es una enzima de alto recambio cuya vida media
usualmente est en el orden de entre algunos minutos a una hora. Este
recambio est sujeto a cambios marcados dependiendo de las
condiciones celulares, indicando que su degradacin tambin es
regulada. Tambin est regulada la ODC bajo control negativo por las
poliaminas, ya que si son agregadas exgenamente no solo inhiben la
sntesis de ODC sino que tambin provocan un rpido decaimiento en su
actividad. La degradacin de la ODC es acelerada por las poliaminas lo
cual es confirmado al seguir el decaimiento de la ODC marcada con
anticuerpos. Las poliaminas ejercen dos acciones de supresin en la
ODC, una sobre la sntesis de la ODC y la otra sobre la induccin de una
protena que posee un rpido recambio denominada antienzima, cuya
sntesis es inducida por una exposicin a un exceso de poliaminas y se
une a la ODC con gran afinidad inhibiendo su actividad. En forma
resumida, los tres mecanismos que modulan negativamente a la ODC
por las poliaminas son:
a) Supresin traduccional de la sntesis, b) aceleracin de su
degradacin y c) la induccin de la antienzima.
3. MATERIAL Y EQUIPO
Homogenizador Potter
Hielo picado
Pipetas Pasteur
Micropipetas
Matraces especiales
Tapas para los matraces especiales

Jeringa con aguja

Cuadros de papel filtro
Bao metablico
4. REACTIVOS
Regulador de Tris-HCl 100 mM pH 7.5 adicionado con EDTA 1 mM, DTT
2 mM y PLP 0.2 mM
Semillas de frijol sin germinar y germinadas
Hidrxido de potasio 5 M
cido clorhdrico 1 M
Agua destilada libre de CO2
Inhibidores 2 mM
Cloruro de bario al 5% en agua libre de CO2
5. DESARROLLO
SE USARAN SEMILLAS GERMINADAS Y SIN GERMINAR
Muela las semillas de una por una en un mortero congelado en
presencia de hielo y agregue un determinado volumen de regulador
compuesto de acuerdo a la cantidad de semillas que tenga.
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE ODC
La actividad de ODC de la muestra se determin midiendo la liberacin
de CO2 gravimtricamente usando solucin de cloruro de bario para su
cuantificacin. Se coloca en matraces Erlenmeyer especiales en su
compartimento exterior 200 microlitros de extracto de semilla y 100
microlitros de inhibidor (MGBG, Ornitina, Putrescina y DAB) a una
concentracin de 6 mM final (deje un matraz sin inhibidor como blanco)
y en el compartimiento interno se coloca un pedazo de papel filtro
(1x1.5 cm) impregnado con 45 microlitros de KOH 5M. Se tapa
inmediatamente y se deja incubando a 37C por 90 minutos. La reaccin
se detuvo inyectando a travs del tapn de hule 100 microlitros de HCl
1 M en el compartimento exterior. PRECAUCIN NO TOQUE EL PAPEL
FILTRO CON EL HCl. Se dejan incubando toda la noche para permitir que
el CO2 liberado reaccione con el KOH.
DETERMINACIN DE CO2 POR GRAVIMETRA
La muestra del vaso central que queda despus de la fermentacin se
transfiere cuantitativamente sobre 20 mililitros de BaCl2 al 5%,
contenidos en un matraz Erlenmeyer de 125 mililitros. Se hacen dos
lavados de dicho vaso central con agua destilada libre de CO2 y se le
agregan a la muestra transferida.
El precipitado de carbonato de bario que se forma por filtracin a travs
de papel filtro Whatman No. 1 de peso conocido. El precipitado se lava
con acetona al 50% y luego con acetona pura.

El papel con la muestra se deseca en una estufa a 60C durante 20 a 24

horas y posteriormente se pesa.
6. RESULTADOS
Determinacin de CO2
Muestras

Peso en
gramos (g)

Papel filtro
Papel filtro + BaCO3 blanco
Papel filtro + BaCO3 inhibidor
1
Papel filtro + BaCO3 inhibidor
2
Papel filtro + BaCO3 inhibidor
3
Papel filtro + BaCO3 inhibidor
4
7. INFORME
A que nivel afectan a la ODC los distintos inhibidores que us en la
prctica.
8. BIBLIOGRAFIA
Arteaga-Nieto, P; Lpez-Romero, E; Tern-Figueroa, Y; Cano-Canchola,
C; Luna-Arias, J. P.; Flores-Carren, A. Entamoeba histolytica:
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