UNIVERSIDAD BERNARDO O'HIGGINS

FACULTAD DE SALUD, DEPORTE Y RECREACIN

ESCUELA DE TECNOLOGA MDICA
GENTICA

EXTRACCIN DE ADN Y
ELECTROFORSIS

Integrantes: Alex Bernal Cerda

Catalina Cornejo Antillanca
Dayana Marilaf Flores
Carla Yaez Castillo
Seccin:

Seccin C1

Profesores: Jenniffer Angulo Trancoso

Gabriel Cunich Ansaldi
Fecha entrega: Jueves 08, Octubre, 2015

Introduccin

La molcula de ADN o acido desoxirribonucleico es quin guarda el cdigo gentico de

todos los organismos, ya sean eucariotas o procariotas. Para realizar un estudio adecuado de
ste, se requiere extraer y obtener un ADN puro y libre de contaminantes que interfieran
con su anlisis. (1) Para realizar extraccin de ADN suele utilizarse el de lisis alcalina, el
cual se basa en la desnaturalizacin y precipitacin selectiva del ADN cromosmico
dejando el DNA plasmidial intacto debido principalmente a su pequeo tamao y a su
naturaleza circular y generalmente superenrollada. (2)
La electroforesis en gel de agarosa, es la tcnica ms empleada que separa las molculas de
ADN segn su relacin de carga-masa. Al ADN previamente purificado se le aplica un
campo elctrico bajo el cual migrar siempre hacia al ctodo (por su carga negativa
atribuida a sus grupos fosfato). La migracin de este puede verse afectado por diversos
factores, como el tamao, conformacin del fragmento de DNA y pureza del mismo,
concentracin del gel de agarosa, tiempo de exposicin a los electrodos, etc. (3)
En este laboratorio se realizar la extraccin y purificacin de ADN, procedimientos de
suma importancia ya que son la primera etapa de la mayora de los estudios genticos.
Adems de realizar una electroforesis de ADN plasmidial para su posterior anlisis.

Objetivos
General: Procesar mediante diversas tcnicas molculas de ADN para su
posterior anlisis.
1. Purificar ADN plasmidial de Virus de Tumor Mamario Murino utilizando la tcnica
de lisis alcalina.
2. Realizar una electroforesis horizontal en gel de agarosa del ADN plasmidial
previamente purificado.
3. Analizar el ADN plasmidial de Virus de Tumor Mamario Murino y determinar su
tamao aproximado.

Procedimiento experimental
2

El primer da se hizo crecer 5 mL de clulas transformadas con virus del tumor mamario
murino (MMTV) en medio LB ms ampicilina por 17 horas a 37C en agitacin constante a
200 rpm.
El segundo da se centrifug (Arquimed, PLC-05) el cultivo de bacterias a 4.000 rpm por
15 minutos a temperatura ambiente. Se elimin el sobrenadante y se sec el pellet sobre
papel absorbente por 1 minuto dando golpes suaves. A sta se le agreg 250 L de Solucin
I (Glucosa/Tris/EDTA) y se resuspendi el pellet con la misma micropipeta p1000 L
(Prime pet), luego se traspas la solucin a un tubo eppendorf de 1,5 mL con micropipeta y
se agreg 250 L de Solucin II (NaOH/SDS) y se mezcl por inversin, se dej pasar 3
minutos y el contenido se torn transparente y viscoso. A este mismo tubo se le agreg 250
L de Solucin III (Acetato de Potasio 5m) y se mezcl hasta que se form un precipitado
blanco y se llev a la centrifuga por 10 minutos a 6.000 rpm a temperatura ambiente.
Al mismo tiempo, se agreg 700 L de Isopropanol fro tomado con micropipeta a un
nuevo tubo eppendorf de 1,5 mL y se sac el tubo que estaba en la centrifuga, se recuper
el sobrenadante de ADN plasmidial con micropipeta y se agreg al tubo eppendorf con 700
L de Isopropanol. Luego este ltimo se agit en un Vrtex (Bios Lab Chile, QL-901) por
15 segundos y se dej en el refrigerador (LG) a -18C por 10 minutos donde la muestra
precipit, se llev a la centrifuga a 6.000 rpm por 7 minutos a temperatura ambiente y se
elimino el sobrenadante con una micropipeta, luego se le agreg 200 L de Etanol al 75%
con la misma micropipeta y se centrifug a 6.000 rpm por 5 minutos a temperatura
ambiente. Se elimin el sobrenadante de impurezas con una micropipeta sin tocar el pellet
de ADN plasmidial y se sec en papel absorbente por 2 minutos hasta que el etanol se
evapor completamente. Luego se resuspendi el pellet en 30 L de agua libre de nucleasas
y se guardo en el refrigerador a -18C por 7 das.
A la semana siguiente, se prepar el gel de agarosa al 1% en un matraz Erlenmayer donde
se mezcl 0,31g de agarosa al 1% ms 31 mL de Buffer TAE 1X, para que la solucin se
disolviera hubo que se aplicar calor con una placa calefactora (Lab tech). Ms tarde se
trasvasij la agarosa a un tubo falcn de 50 mL y se aadi con una micropipeta 1 L de
SYBR-SAFE DNA ms 2 L de Bromuro de Etidio y se verti el gel en una cmara de
buffer TAE 1X, a la cual se le adhiri un peine para poder formar los pocillos en el cual se
depositaron las muestras. Se dej enfriar sin mover el contenido para que despus de un
tiempo a temperatura ambiente este se gelifique completamente y se sumerge dentro de la
cmara de electroforesis con buffert TAE 1X.
Luego en un tubo eppendorf limpio con una micropipeta se aadi 2 L de ADN plasmidial
aislado anteriormente y refrigerado por una semana ms 8 L de agua libre de nucleasas y
3 L de Buffer de carga 6X y se mezcl la solucin. A continuacin se centrifug durante 5
segundos para poder recoger todo el volumen de la muestra incluyendo pequeas gotas que
haban quedado repartidas en el tubo.
Se deposit la muestra en un pocillo de gel de agarosa correspondiente al carril N 4 con
una micropipeta muy cuidadosamente en la cama de electroforesis horizontal (C.B.S
Scientific, MGU-102T). Ms tarde se cerr la cubeta de electroforesis y se coloc los
3

electrodos de tal forma que el polo negativo qued al lado de los pocillos y el polo positivo
en el extremo opuesto del gel, y se aplic una corriente elctrica continua de 120 voltios
durante 20 minutos. Despus de haber transcurrido 20 minutos se pudo visualizar el ADN
con ayuda de un transluminador de luz ultravioleta de onda corta (luz UV). Finalmente se
fotografi para poder observar los resultados.

Resultados
Figura 1: Precipitado de ADN Plasmidial. Obtenido como
resultado de la extraccin y purificacin de ADN plasmidial
mediante el mtodo de lisis alcalina. Se observa un diminuto
"botn" de ADN en el fondo del tubo eppendorf de 1,5 mL.

Figura 1
Figura 2: Electroforesis horizontal. Migracin del ADN
en gel de agarosa hacia el ctodo.
Segn carril se puede observar (de izquierda a derecha):

Figura 2
4.
5.
6.
7.
8.

1. Carril vaco.
2. Corresponde a un estndar o patrn de peso molecular.
3. HCB. Presenta 2 isoformas, y un "smear o chorreo" de
ARN.
4.

MMTV. Nuestra muestra. Se observan 2 isoformas adems de un smear de ARN.

HVI-1. Se observan 2 isoformas adems de un smear de ARN.
HCB. Se observan 2 isoformas adems de un smear de ARN.
MMTV. nico donde se observan 3 isoformas adems de un smear de ARN.
EMCV. Se observan 2 isoformas adems de un smear de ARN.

Todas las bandas de los carriles presentan una pigmentacin similar brillante y anaranjada
al ser observada mediante luz ultravioleta (UV), adems de observarse aparentemente
similar peso molecular. En todas las bandas de DNA hubo migracin hacia al ctodo.
En el carril N 4 se puede observar 2 isoformas correspondientes a: enrollada y
superenrollada.

Discusin
El arn es altamente sensible a la degradacin, se degrado el arn pero de todas maneras
quedaron nucletidos que pueden emitir fluorescencia y eso queda abajo de la muestra. Si
4

se hubiera querido eliminar la muestra, se ocupa RNasa para catalizar la hidrlisis de ARN
en componentes ms pequeos o se trata con fenol cloroformo. Observamos 3 bandas (3
isoformas) pero para slo haber obtenido una banda unica para haber obtenido el tamao
por ejemplo, se hubiera tenido que cortar el plasmidio con una enzima restriccin , que
reconoce una secuencia especfica y corta el adn por ambos lados y el plasmidio se abre,
queda lineal y al resolverlo en el gel de agarosa se observara una banda nica y ahi se
podria decir que en realidad el plasmidio recorri entre 6500 y 7000 y se puede acortar el
rango pero no lo hicimos por tiempo y tampoco era el objetivo del prctico.

Conclusin

Se puede obtener baja cantidad de ADN plasmidial al ser ste de tamao pequeo.

Con la electroforesis se logra estimar la concentracin de DNA mediante un anlisis

comparativo con patrones de concentracin previamente conocida.
La electroforesis depende directamente del campo elctrico y la masa de la muestra,
ya que este mtodo logra separar molculas o fragmentos de molculas de cidos
nucleicos segn su carga y su peso molecular.
La agarosa funciona como un filtro en donde los fragmentos de ADN de menor
tamao migran ms rpidamente hacia el nodo mientras que aquellos de mayor
tamao lo hacen ms lento.
Las tcnicas utilizadas deben realizarse siempre con la mayor precaucin posible
para evitar daar o contaminar la muestra, pero adems para asegurar la proteccin
del examinador ya que varias de estas muestras resultan potencialmente dainas
para quien las emplea.

Bibliografa

1. Karp, G. Biologa Celular y Molecular. (2014). Editorial Interamericana Mc GrawHill. 6 Edicin. Barcelona, Espaa. Pginas 389 390.
2. Pierce, B. Gentica. (2010). Editorial Mdica Panamericana. 3 Edicin. Madrid,
Espaa. Pginas 201 204.
3. Lodish, H., Berk, A. et al. Biologa Celular y Molecular. (2006). Editorial Mdica
Panamericana. 5 Edicin. Madrid, Espaa. Pginas 86 88.
4. Melana, S., Picconi, M. et al. (2002). Deteccin de secuencias homlogas al Gen
Env del Virus del Tumor Mamario Murino (MMTV) en Cncer de mama de
pacientes argentinas. Revista Medicina. volumen 62, nmero 4. Pginas 323 324.