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CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

Professeur Jean-Louis CUQ

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LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE
TABLE DES MATIERES
I. HISTORIQUE

II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

III. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES

1. Selon la nature des phases

2. Selon la nature des phnomnes mis en jeu
3. Selon la technique mise en jeu
IV. THEORIE DE BASE - GRANDEURS FONDAMENTALES
Coefficient de distribution
1. Grandeurs de rtention
tR, VR, k'
2. Slectivit d'une colonne
3. Efficacit d'une colonne N, HEPT,
Equations de Van Deempter , Knox, Giddings, Nef
4. Rsolution Rs
5. Temps d'analyse Nef / tR
6. Elution linaire
7. Perte de charge P
V. OPTIMISATION DES CONDITIONS D'UNE ANALYSE
1. Optimisation de la rsolution
1) Action sur
2) Action sur k'
3) Action sur l'efficacit
1. Influence de la vitesse de la phase mobile
2. Influence du diamtre des particules
3. Influence de la colonne (longueur et diamtre)
4. Influence de l'injection (position, volume, injecteur)
2. Optimisation du temps d'analyse
1) Optimisation de NeF/tR
2) Pression et temps d'analyse
3. Optimisation de la perte de charge
4. Conclusion
5. Dtermination graphique

6
7
9
10
12
12
12
13
14
14

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22
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VI. DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE

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1. La chromatographie d'adsorption
1) Thermodynamique de l'adsorption
2) Adsorbants utiliss en CLS

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26
28

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1. Adsorbants de type I - silice ou alumine

2. Adsorbants de type III - Phases greffes polaires
3. Adsorbants de type IV - Phases greffes apolaires
a) mcanisme de rtention
b) influence de la phase mobile
- lution en mode isocratique
- lution en mode gradient
c) augmentation de k' (fixation covalente, appariement d'ions)
2. La chromatographie de partage
1) Phases stationnaires
2) Phase mobile
3. La chromatographie d'change d'ions
1) Principaux types de groupements fonctionnels
2) Principaux types de matrice
3) Influence du pH de la phase mobile
4) Influence du type et de la concentration en contre ion
5) Effet de la temprature et de solvants organiques
6) Analyse avec suppresseur de phase
4. La chromatographie d'exclusion
5. La chromatographie chirale
6. La chromatographie d'affinit
VII. EQUIPEMENTS UTILISES EN CHROMATOGRAPHIE
1. Dispositifs dobtention de gradients
2. Les pompes
3. Les injecteurs
4. La colonne
5. Les particules support de phase stationnaire
6. La nature des phases stationnaires
7. Les connexions
8. Les dtecteurs
VIII. QUANTIFICATION
1. Mesure de laire par triangulation ou au moyen dintgrateurs
2. Mesure des coefficients de rponse
3. Influence des conditions opratoires sur lanalyse quantitative

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32
33
35
39
43
46
48
48
50
51
51
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52
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60
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63
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67
67
69
69
70
76
76
77
78

IX. TRANSPOSITION COLONNE - COUCHE MINCE

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X. COMPARAISON CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE CHROMATOGRAPHIE GAZ

79

XI. EXERCICES ET CORRIGES

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I. HISTORIQUE
La chromatographie est une science trs ancienne.
Ainsi on trouve la premire rfrence d'un processus chromatographique dans l'Ancien Testament qui fait
mention de proprits adsorptives de certaine varit de bois pour adoucir de l'eau amre. Ce sont les
tanins hydrophobes qui constituaient une phase stationnaire apolaire (chromatographie dadsorption)
Aristote dcrit les proprits que possdent certaines terres pour purifier l'eau de mer. Les phnomnes
mis en jeu relvent ici de lchange dions.
Au XVIme sicle, le strasbourgeois BRUNSWIG purifiait de l'thanol en faisant passer la vapeur
travers une ponge imprgne d'huile d'olive et ralisait une exprience de chromatographie gaz-liquide
400 ans avant la "dcouverte" de cette technique.
Toutefois, ce n'est qu'au dbut du XXme sicle, plus prcisment le 21 mars 1903, que naquit la
chromatographie. Ce jour-l TSWETT, botaniste d'origine russe, prsenta Varsovie son premier article
sur une nouvelle sorte de phnomne d'adsorption et son application l'analyse biochimique. Il y dcrivait
la formation de zone colores lors de l'lution par l'ther de ptrole de pigments vgtaux dans une
colonne remplie de carbonate de calcium.
L'origine du mot chromatographie vient peut-tre de cette sparation de composs colors puisque
CHROMA () en grec, signifie couleur.
Puis les travaux de TSWETT tombrent dans l'oubli pendant une vingtaine d'annes et il faudra attendre
1931 la publication de KUHN et LEDERER sur la sparation des isomres du carotne et de la
xanthophylle pour assister au dveloppement de la chromatographie en tant qu'outil analytique.
A partir de cette date, la chromatographie prit son vritable essor
- 1934, premier livre de ZECHMEISTER et CHOLNOKY, qui par son succs, contribua vulgariser la
chromatographie.
- 1938, KUHN reut le Prix Nobel.
Livre La chromatographie en phase mince par IZMAILOV et SCHRAIBER
Chromatographie d'change d'ions sur zolithes.
- 1941, La chromatographie de partage, MARTIN-SYNGE
- 1944, La chromatographie sur papier, CONSDEN-GORDON, MARTIN
- 1948, Prix Nobel TISELIUS (premier dtecteur optique par mesure du changement d'indice de
rfraction, premier systme de gradient d'lution)
- 1952, Prix Nobel MARTIN et SYNGE
MOORE et STEIN Chromatographie d'change ionique (Prix Nobel)
- 1959, Chromatographie sur gel (PORATH, FLODIN)
- 1969, Avnement de la chromatographie liquide moderne (HPLC, FPLC)

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II. PRINCIPE DE LA CHROMATOGRAPHIE

Il s'agit de la ralisation d'un tri entre les diffrentes espces molculaires d'un mlange.
On va ainsi forcer toutes les molcules effectuer un parcours commun parsem d'obstacles : certaines
espces le franchiront aisment d'autres auront plus de difficults. A l'arrive, il y aura chelonnement.
Pour entraner les molcules il faut les vhiculer dans un fluide : la phase mobile qui peut tre soit un
liquide soit un gaz.
L'obstacle franchir, qui ne doit pas tre entran par la phase mobile, doit tre fixe et produire des effets
reproductibles : il constitue la phase stationnaire. Cette phase stationnaire, le plus souvent emprisonne
dans une colonne, peut tre un solide ou un liquide immobilis sur un solide.
La sparation idale est schmatise sur la Figure 1.
application

dveloppement

rponse

temps
Figure 1. Sparation chromatographique idale

Les facteurs qui contrlent la sparation sont surtout d'ordre thermodynamique: la rtention de
l'chantillon sur la colonne est donc contrle thermodynamiquement. Il est ncessaire quil y ait
interaction entre lanalyte et la phase stationnaire. En pratique la sparation idale n'est pas ralisable.
Ainsi il se produit un largissement des bandes en raison surtout des phnomnes de diffusion. Les
facteurs qui contrlent la diffusion sont surtout de nature cintique et peuvent tre considrs
indpendamment des facteurs thermodynamiques qui influencent la rtention (figure 2).
application

dveloppement

rponse

temps
Figure 2. Sparation chromatographique relle (non idale)

On peut classer les mthodes chromatographiques de trois manires:

- selon la nature des phases
- selon la nature des phnomnes mis en jeu dans la sparation
- selon la technologie mise en oeuvre.

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III. CLASSIFICATION DES METHODES CHROMATOGRAPHIQUES

III.1. Classification selon la nature des phases
Selon la nature de la phase mobile on distingue:
- la chromatographie en phase liquide
- la chromatographie en phase gazeuse
- la chromatographie en phase supercritique

CPL
CPG
CPS

Selon la nature de la phase stationnaire on distingue:

- la chromatographie gaz / solide
- la chromatographie gaz / liquide
- la chromatographie liquide / solide
- la chromatographie liquide / liquide

CGS
CGL
CLS
CLL

La chromatographie en phase supercritique est une chromatographie dans laquelle la phase mobile est un
gaz comprim ( sa temprature et sa pression critique) ou une phase liquide / vapeur de mme densit
(au-del de la temprature critique, le gaz ne peut tre liqufi quelle que soit sa pression). Avec cette
phase mobile, le plus souvent lanhydride carbonique, la dure de lanalyse est de 5 10 fois plus courte
quavec les phases mobiles liquides. De viscosit trs faible, cette phase mobile permet un couplage facile
avec des dtecteurs comme le spectromtre de masse ou le dtecteur par mesure de la diffusion de la
lumire.
III.2. Classification selon la nature des phnomnes mis en jeu
Cette classification repose sur la nature de la phase stationnaire et son interaction avec les molcules
sparer.
On distingue ainsi:
III.2.1. La chromatographie d'adsorption
C'est la mthode la plus ancienne et "encore" la mieux connue. La sparation entre les molcules est
fonde sur le processus rpt d'adsorption et dsorption par la phase stationnaire. Dans les premires
tudes les phases stationnaires modles dtudes taient la silice et la cellulose. En consquence, les
phnomnes tudis correspondaient essentiellement des interactions de type liaison hydrogne. Dautres
phases ont t utilises depuis avec des mcanismes dchange impliquant des liaisons Van der Waals,
hydrogne et des interactions hydrophobes (cf chapitre VI).
Il s'agit de chromatographie liquide-solide (CLS)
III.2.1. La chromatographie de partage
La sparation est fonde sur les diffrences de solubilit des molcules sparer entre phase mobile et
phase stationnaire liquide (phase qui imprgne ou qui est greffe sur un solide).
Il s'agit alors de chromatographie liquide-liquide (CLL).
On multiplie ici les partages entre phases de la mme faon que si l'on disposait de plusieurs milliers
d'ampoules dcanter contenant deux solvants non miscibles.
III.2.3. La chromatographie d'change d'ions
La phase stationnaire est un solide la surface duquel se trouvent des groupements ioniss : changeur
d'ions. Un solut ionis de charge oppose se trouvera d'autant plus retenu que sa charge (oppose celle

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de la phase stationnaire) sera plus forte. Cest la loi de COULOMB qui rgit ces changes de forte nergie
(40 80 kJ.mole-1) :
q . q'
1
F=
.
2
. 0
d
La phase stationnaire solide est gnralement poreuse et renferme dans ses pores une phase liquide qui
peut jouer un rle trs important dans les sparations. On peut ainsi parler pour ce type de
chromatographie de CLS mais aussi de CLL.
III.2.4. La chromatographie d'exclusion encore qualifie de chromatographie de permation ou de
filtration sur gel
La phase stationnaire est un solide poreux dont la dimension des pores est voisine de celle des molcules
sparer : celles qui sont trop volumineuses pour pntrer dans les pores sont exclues de la phase
stationnaire et sont lues les premires.
Ici encore on peut parler indiffremment de CLS ou de CLL.
III.2.5. La chromatographie d'affinit
Trs utilise par les biochimistes, elle consiste fixer par exemple une enzyme sur la phase stationnaire de
faon complexer slectivement les substrats correspondants (ou vice versa). Il sagit l dune association
entre une molcule polyfonctionnelle et une phase stationnaire comportant des sites striquement dfinis et
de capacit dchange multiple. Il sagit souvent dun systme coopratif dinteractions diffrentes
(ioniques, hydrophobe, Van der Waals, hydrogne), liaisons parfaitement positionnes dans lespace.
Il est bon de rappeler quil ne peut pas exister de phase stationnaire inerte . Quelle que soit sa structure
elle sera toujours capable de donner des interactions dun type donn. Dans la mesure o le systme
requiert un niveau dinteraction le plus faible possible, cest par les choix judicieux des phases mobiles et
stationnaires quil sera possible dy parvenir.
III.2. Classification selon la technique mise en jeu
Selon la technologie mise en jeu on distingue:
- la chromatographie sur colonne
- la chromatographie de surface (chromatographie sur papier ou chromatographie sur couche
mince).
IV. THEORIE DE BASE - GRANDEURS FONDAMENTALES
En chromatographie en phase liquide, les sparations sont bases sur la diffrence de distribution des
espces entre deux phases non miscibles l'une stationnaire (particules solides imprgnes ou non d'un
liquide), l'autre mobile (liquide).
Pour un systme chromatographique donn, le coefficient de distribution K (ou coefficient de partage)
est dfini par:

K =

Cs
Cm

Cs : concentration du solut dans la phase stationnaire

Cm : concentration du solut dans la phase mobile.

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Si les molcules d'un mlange ont des affinits diffrentes pour chacune des deux phases, il apparat des
diffrences entre deux vitesses de migration d'o possibilit de sparation. La migration sera d'autant plus
lente que l'affinit de la molcule pour la phase stationnaire sera grande.
Rappelons que la solubilit dun analyte dans une phase mobile donne passe dabord par la possibilit
dtablissement dchanges (liaisons). Sans change il ny a pas de solubilit possible et deux phases
apparaissent.
Une bonne sparation en chromatographie liquide implique :
1. que les divers constituants du mlange soient retenus sur la colonne, donc prsentent une
affinit pour la phase stationnaire suffisante pour qu'ils apparaissent dans l'effluent aprs un volume
suprieur au volume interstitiel de la colonne
2. que les diffrents pics soient bien spars, ce qui pour deux pics successifs dpend de la
distance sparant les sommets et leur largeur.
3. que l'analyse soit aussi rapide que possible.
IV.1. GRANDEURS DE RETENTION
Si la quantit inject est petite on obtient pour chaque compos lu un pic symtrique et gaussien (figure
3). On dfinit ainsi les paramtres suivants :
IV.1.1. Le temps de rtention (tR)
C'est le temps d'lution au maximum du pic mesur partir de l'injection.
Un chromatogramme type est schmatis, avec les paramtres principaux dvaluation, sur la figure 3.

volume mort

0,5 h

O,607 h

0
VM

point mort

injection

O,607
0,5

largeur du pic
la base

volume de rtention
ou temps de rtention
temps de rtention rduit
ou temps de rtention rduit

figure 3. Principaux paramtres dun chromatogramme

IV.1.2. Le volume de rtention (VR)
Connaissant le dbit D de la phase mobile, suppos maintenu constant, on dfinit le volume de rtention
VR = tR . D = tR . v. s
v : vitesse linaire de la phase mobile
s = s'.
avec
s' : section de la colonne

VM = to . D
s : section rduite de la colonne
et
= VM / VT (porosit)

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VR reprsente, l'talement prs, le volume de phase mobile ncessaire pour luer chaque compos.
VM est le volume de phase mobile dans la colonne.
tR et VR sont des grandeurs caractristiques d'un compos (pour une colonne donne, un luant donn et
des conditions exprimentales fixes) qui servent l'analyse qualitative d'un mlange.
Les espces non retenues par la phase stationnaire apparaissent dans l'effluent aprs le temps to
correspondant l'coulement du volume interstitiel de la colonne ou volume de phase mobile VM contenu
dans la colonne.
Le volume de rtention VR est reli directement au coefficient de distribution K par la relation:
VR = VM + K VS
VS : volume de la phase stationnaire (ou masse ou surface spcifique selon les units de K)
Cette relation ne s'applique que dans le cas d'lution linaire c'est--dire quand K varie linairement avec
la concentration du compos dans chaque phase.
IV.1.3. Le facteur de capacit k' (ou facteur de rtention)
Pour s'affranchir des paramtres gomtriques de la colonne, on utilise, pour caractriser la rtention d'un
compos le facteur de capacit. En effet si K varie non linairement avec la concentration en compos
dans chaque phase, un pic asymtrique se produit et VR varie avec la concentration du compos.
Si on considre une petite section de bandes de longueur dx le rapport des quantits du compos dans les
deux phases de cette section est le facteur de capacit de la colonne k'.

concentration

dx
phase mobile
phase stationnaire
support de phase
distance x
q
k' = q s = Cs .As .dx = Cs .Vs = K Vs
CM .AM .dx CM .VM
M
VM
AS et AM surface des sections de la phase stationnaire et de la phase mobile.
k' est le paramtre le plus important en chromatographie liquide.
De l'quation VR = VM + K VS

Vs = VR - VM
K
d'o :

on tire

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k' = K .

VR - VM VR - VM tR - t0
=
=
K . VM
VM
t0

Le temps et le volume de rtention sont lis au facteur de capacit par les relations :

tR = to (1 + k')

VR = VM (1 + k')

IV.2. SELECTIVITE DUNE COLONNE

Pour caractriser la distance sparant les sommets de deux pics on utilise le facteur de slectivit :
=

k' =

tR2 - t0
tR1 - t0

Il sagit du rapport des temps de rtention rduits

tR - t0
V
soit tR - t0 = k'. t0 et k' = K . s
t0
VM
=

k' 2
K
= 2
k' 1
K1

to et VM ne dpendent que de la colonne

Le facteur de slectivit mesure la diffrence de distribution thermodynamique des deux composs. On
dmontre que si (Go) = G2 - G1 (diffrence des nergies libres de distribution des deux
composs) on a :
(
G) = - RT ln
IV.3. EFFICACITE DUNE COLONNE. Nombre de plateaux thoriques et de plateaux efficaces
L'efficacit d'une colonne chromatographique, dont dpend l'talement des pics, est mesure, pour chaque
compos, par le nombre de plateaux thoriques N de la colonne.
Cette thorie est ne de la recherche d'un modle statique permettant de dcrire le fonctionnement d'une
colonne chromatographique comme celui d'une colonne distiller.
Au lieu de considrer le dplacement rel, continu de la phase mobile, on admet que celle-ci progresse par
sauts successifs et se met en quilibre avec la phase stationnaire entre deux transferts, ce qui permet de
dcouper fictivement la colonne en un certain nombre de zones dans lesquelles les quilibres sont raliss
et que l'on appelle plateaux thoriques. On peut ainsi calculer le profil de rpartition des espces, de
proche en proche, aprs chaque transfert et dans chaque plateau.
Une colonne est alors dite comporter N plateaux thoriques si, dans des conditions donnes, elle a la
mme efficacit qu'une colonne fictive de N plateaux thoriques.
La thorie des plateaux tablit qu'aprs un certain parcours dans la colonne, les pics d'lution peuvent tre
assimils des courbes de Gauss dont l'cart type (exprim en unit de temps) est li au nombre de
plateaux thoriques parcourus par la relation :
N = tR

Les caractristiques gomtriques de la courbe de Gauss (figure 3) permettent de calculer, pour un solut
donn, N partir du chromatogramme.

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N = 16. tR

= 5,54. tR

largeur du pic la base: distance entre les points d'intersection des tangentes au point d'inflexion avec la
ligne de base et largeur du pic mi-hauteur.
Pour comparer entre elles des colonnes de diffrentes longueurs on dfinit la hauteur quivalente un
plateau thorique.
HEPT = L
N

L longueur de la colonne.

En HPLC les HEPT sont comprises entre 0,001 et 1 mm.

Dans la thorie des plateaux, la HEPT (= L . 2 / t2R) dduite de la variance n'apparat que comme une
mesure globale de l'influence de tous les paramtres exprimentaux. Divers modles ont t labors pour
prciser les divers paramtres intervenant dans l'largissement des pics.
Ainsi l'talement d'une bande de solut a trois origines :
- la dispersion par diffusion axiale
- l'existence de chemins multiples dus au remplissage (htrognit d'coulement)
- la rsistance au transfert de masse dans chacune des 2 phases.
largeur initiale
de bande

diffusion axiale
talement

Htrognit d'coulement

rsistance au transfert de masse

dans la phase mobile

dans la phase stationnaire

talement

talement

talement

Principales origines de ltalement dun pic danalyte en CSL

Ainsi la HEPT totale est la somme de termes dans lesquels les variances seront gales la variance totale.
HEP T =

HEP T i

Ainsi la thorie cintique conduit l'quation de VAN DEEMTER

HEP T = X +

Y
+ Z. v
v

v vitesse rduite = vitesse linaire de la phase mobile.

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X est l'influence de la diffusion turbulente due aux htrognits dans l'coulement. Il existe plusieurs
chemins possibles pour la phase mobile. Cet effet sera d'autant moins prononc que les particules seront de
mme forme (sphrique) et de mme dimension (do la ncessit dutiliser de telles phases).
Y / v est l'influence de la dispersion des molcules par diffusion longitudinale; Y / v est proportionnel au
coefficient de diffusion du solut dans la phase mobile DM.
facteur de tortuosit (> 1)
Y = 2 DM
Y / v diminue quand v augmente. Comme DM est faible en milieu liquide, Y / v est gnralement
ngligeable.

Zv est l'influence de la rsistance au transfert de masse. Z peut tre diminu en rduisant les distances
parcourir par le solut dans chaque phase (diminution du diamtre des particules).
Cette approche est surtout utilise en chromatographie phase vapeur.
En chromatographie liquide on utilise souvent l'quation de KNOX
HEP T = X. v

Y
v'

+ Z. v '

v' vitesse rduite

v'=

DM
dp

v . dp
DM

coefficient de diffusion du solut dans la phase mobile

diamtre des particules
HEPT' = H

dp

L'quation de GIDDINGS, base sur les thories du cheminement alatoire conduit une expression
analogue pour la HEPT.
HEPT = X +

Y
+ Z.v +
v

1
1

+1Z .v
M

Au concept du nombre de plateaux thoriques, on peut associer la notion de plateaux efficaces :

N ef =

k'
1 + k'

.N

N ef =

soit

16. t R- t 0

N ef =

soit encore

5,54 t R - t 0

Ce nombre de plateaux efficaces permet d'apprcier de manire plus concrte la vritable efficacit de
sparation de la colonne. En effet, si k' est petit, la sparation peut tre impossible mme avec N grand.
La capacit de pics dune colonne est dfinie par :

n=1+

N . ln t
16
t

N : nombre de plateaux thoriques

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t et t temps de rtention du premier et du dernier pic du chromatogramme.

Il est ncessaire que n soit suprieur au nombre de coposs pour que la rsolution soit correcte. HERMAN
(1985) a montr quavec n = 60 on a 90 % de probabilit de sparer 9 composs.
IV. 4. RESOLUTION

La rsolution Rs entre deux pics est dfinie par la relation :

t R1 - t R2

Rs = 2 .

1 + 2

t R2- t

R1

Plus Rs est grand, meilleure est la sparation.

La sparation est complte quand Rs = 1
(2 % de recouvrement des 2 pics)
En supposant 2 = 1, on a :
Rs =

k' 2
- 1
1
.
.
.
4

1 + k' 2

N2

IV.5. TEMPS D'ANALYSE. (Nombre de plateaux efficaces par unit de temps)

t R = ( 1 + k' ) .

L
v

v vitesse linaire de la phase mobile. Comme HEPT = L / N

t R = N .( 1 + k' ) .
2

N ef =

et

to = L / v

HEPT
v

k'
.N
1 + k'

do ( division )
N ef
tR

v
.
HEPT

k'

1 + k'

IV.6. ELUTION LINEAIRE

Dans le cas d'une lution linaire, le coefficient de distribution varie linairement avec la quantit injecte.
A une temprature donne, la courbe CS en fonction de CM est l'isotherme d'adsorption. Cet isotherme
peut tre linaire, concave ou convexe (figure 4).
En gnral en chromatographie liquide la sensibilit des dtecteurs est suffisante pour permettre l'injection
de faibles quantits et l'on se trouve dans la partie linaire de l'isotherme. La pente est gale
CS = K . CM

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au coefficient de distribution K.

isotherme

C
rponse du
dtecteur

t
t

isotherme

rponse du
dtecteur

CM

quantit injecte

rponse du
dtecteur

CM

isotherme

quantit injecte

quantit injecte

Figure 4. Influence de la forme de l'isotherme d'adsorption sur la gomtrie du pic et sur le temps de
rtention.
IV.7. PERTE DE CHARGE DANS UNE COLONNE

Lv
Ko

P =
o

dp
K =
.
180

L
v
K
dp

1 -

(Loi de DARCY)

avec

perte de charge (en barye = 10-6 bars)

viscosit (poise)
longueur de la colonne (cm)
vitesse de la phase mobile (cm.s-1)
constante de permabilit (cm2)
diamtre des particules (cm)
porosit interstitielle (volume interstitiel de la colonne/volume total).

VERILLON et al., International Laboratory, July 1992, 29-35 proposent la loi suivante :

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P = 400 .

F.L .
d2p . d2c

avec P en MPa
F dbit en ml.min-1
L longueur de la colonne en cm
viscosit en cP
dp diamtre des particules en m et

dc diamtre de la colonne en mm

V. OPTIMISATION DES CONDITIONS D'UNE ANALYSE

L'idal est d'obtenir une rsolution leve en un temps trs court.
On peut envisager d'augmenter la longueur de la colonne (la vitesse d'analyse va augmenter ainsi que la
perte de charge).
On peut diminuer le diamtre des particules (HEPT diminue, mais la perte de charge augmente).
On peut augmenter la vitesse de la phase mobile (HEPT augmente, la pression aussi).
V.1. OPTIMISATION DE LA RESOLUTION
Il faut augmenter Rs
Rs =

k' 2
- 1
1
.
.
.
4

1 + k' 2

N2
ou

Rs =

1
- 1
1
.
Nef 2
4

Rs doit tre > 1

V.1.1. Action sur la slectivit
=

tR2 - t0
tR1 - t0

La rsolution augmente quand augmente.

La sparation n'est possible que si 1.
Le nombre de plateaux efficace (Nef) ncessaires pour obtenir une rsolution donne en fonction de
diminue trs vite quand > 1 (tableau 1).
Cette forte influence de justifie l'utilisation de phases stationnaires ayant des groupements fonctionnels
adquats.
La slectivit peut tre modifie :
- en changeant la nature et la composition de la phase mobile ce qui induit des effets secondaires (pH ionisation etc...)
- en changeant la nature de la phase stationnaire
- en modifiant la temprature.

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Tableau 1. Variation du nombre de plateaux efficaces en fonction de pour obtenir Rs = 1 ou Rs = 1,5

Nef

RS = 1

RS = 1,5

1,01

160 000

360 000

1,05

6 800

15 700

1,10

1940

4 360

1,15

940

2 110

1,20

575

1 300

1,25

400

900

V.1.2. Action sur le facteur de capacit k' (nature de phase stationnaire surtout)
Si k' = 0 les deux soluts sont lus simultanment et aprs coulement du volume interstitiel.
La rsolution augmente quand k' augmente , mais de moins en moins vite car k' tend rapidement vers
1.
k'+1
Le temps d'analyse augmente beaucoup plus rapidement que k' car on a :
t R2 = 1 + k' 2 .

L
v

L longueur de la colonne et v vitesse linaire rduite.

(si k' augmente de 5 10, Rs augmente de 9 %, le temps d'analyse de 80 %).
V.1.3. Action sur l'efficacit
Doubler N multiplie Rs par 1,41. Il n'y a pas de limite l'accroissement de Rs avec N. Si on augmente N
en doublant la longueur de la colonne, on double tR car tR = L / v .(1+k'). Il faut diminuer HEPT.
V.1.3.1. Influence de la vitesse de la phase mobile sur HEPT
L'quation de VAN DEEMTER (ou de KNOX) permet de suivre les variations de HEPT en fonction de la
vitesse linaire de la phase mobile.
HEPT
CPG

CPL

v
Cependant, dans un certain domaine de vitesse de la phase mobile, la HEPT dtermine
exprimentalement vrifie la relation de SNYDER.

HEPT = Avn

page 16

r Jean-Louis CUQ -

n gnralement compris entre 0,2 et 0,7. A constante pour une colonne donne; v : vitesse linaire
rduite de la phase mobile; n : coefficient fonction de la sparation tudie.
140

dp = 12 m
dp = 5 m

HEPT (m)

120

100

80

60

40

20

10

15

20

25

30

35

40

45

vitesse linaire (cm/min)

On peut accrotre l'efficacit d'une colonne en diminuant v. Cependant en-dessous de 3 ml.min-1 HEPT
passe par un minimum puis croit en raison de la diffusion longitudinale.
V.1.3.2. Influence du diamtre des particules sur HEPT
La rsistance au transfert de masse constitue le facteur limitatif la cintique des changes et pour
augmenter celle-ci il faut diminuer au maximum la distance que doit parcourir le solut entre les diffrents
sites, ce qui est possible en diminuant la taille des particules.
Empiriquement il a t dmontr que

HEPT = B . dp
dp diamtre des particules; B et b constantes pour une colonne donne. Les valeurs de sont sensiblement
constantes et voisines de 1,6 1,8.
HEPT
(mm)

5
2
1
0,5
0,1
0

10

20

diamtre des
particules (m)

La figure ci-dessus illustre le gain d'efficacit quand on passe d'une silice avec dp = 20 mm dp = 3 mm.
Le remplissage des colonnes avec des phases stationnaires de fine granulomtrie entrane une

page 17

r Jean-Louis CUQ -

augmentation importante de l'efficacit, donc de la rsolution . Un compromis doit cependant tre ralis
car si dp diminue, la perte de charge augmente de faon inversement proportionnelle dp2
P =

. L . v . 1 8 0 . 1 -
2

dp .

et des difficults de remplissage apparaissent. Lexemple de sparation chromatographique de

phnothiazines obtenu pour deux dp est donn ci-dessous.

1
1

A
2

10

t R (min)

currentpoint
S

Cl

CH 3

10

Cl

(min)

(CH 2 )3

CH3

Cl

(CH 2 )3

(CH 2)3
N

CH 3

(CH 2)3

O
CH 3

N
CH 3

driv 1

CH 3

currentpoint

driv 2

driv 3

Figure 4. Comparaison des chromatogrammes de 3 phnothiazines (k'1 = 3 ; k'2 = 6,5 ; k'3 = 15) en
fonction du diamtre des particules d'un gel de silice. Colonne de 25 cm L et 2,1 mm de , v = 0,7 cm.s-1,
dtection 254 nm. Phase mobile : actate d'thyle / mthanol / thylamine 33 % (80/20/0,25).
A

dp = 40 mm,

P = 3 bars

dp = 10 mm,

P = 35 bars

V.1.3.3. Influence des caractristiques de la colonne

a) Influence de la longueur de la colonne
Dans des conditions idales de remplissage de la colonne, la HEPT est indpendante de la longueur de la
colonne et l'efficacit de la colonne est proportionnelle sa longueur HEPT = L / N. En ralit, selon dp, le
remplissage de la colonne n'est pas idal et HEPT varie (Tableau 2 pour la phnothiazine 1).
Rappelons que la perte de charge est proportionnelle la longueur de la colonne.

page 18

r Jean-Louis CUQ -

tableau 2. Variation de la HEPT pour la phnothiazine I en fonction de la longueur de la colonne (L) et de

dp et en fonction du diamtre de la colonne.
diamtre de la
colonne 21 mm

HEPT (mm)

L (cm)

silice dp 10
m

15
25
50
100

0,33
0,34
0,5
0,6 3,3

silice dp 10
m

4,1
4,0
3,4
4,5

colonne L = 15 cm
silice dp 10 m

diamtre de la
colonne
(mm)

6,36
4,3
2,1

HEPT
(mm)

0,17
0,17
0,33

Le modle de colonne le plus utilis a 25 cm de longueur et 4,6 mm de diamtre.

Ces colonnes sont en acier inoxydable. Remplies dune phase stationnaire avec des particules sphriques
de 5 m de diamtre, elles permettent, selon la nature de la phase stationnaire, de raliser la plupart des
sparations attendues dans les sciences des aliments. Des colonnes de 3 cm x 4,6 mm permettent des
analyses de mlanges simples en routine.
Dans le plupart des analyses une pr-colonne qui ne diffre de la colonne analytique que par sa trs
faible longueur (par exemple 1 2 cm pour une colonne de 25 cm) permet de protger la colonne et den
augmenter la dure de fonctionnement.
b) influence du diamtre
D'une faon gnrale les colonnes de faible diamtre (< 5 mm) sont plus efficaces, la diffrence tant
d'autant plus grande que dp est petit (tableau 2). Le phnomne est d un remplissage plus homogne des
colonnes de faible diamtre par rapport celui des colonnes de trs faible diamtre (cf IV-7).
Les colonnes Microbore ont des diamtres internes de 1 2,1 mm. Leur mauvais succs rsulte surtout de
la gnralisation dquipement adapts aux colonnes de 4,6 mm de diamtre. Le passage dune colonne de
4,6 mm 1 mm se traduit par une diminution de dbit dun facteur 21. Il faut alors disposer de pompes
capables de dlivrer avec constance des dbits de lordre de 30 50 L.min-1. Si un systme dlution par
gradient est utilis il faut alors disposer de pompes capables de dlivrer les phases mobiles avec des dbits
contrls de quelques L.min-1.pour la pompe qui dlivre les plus petits dbits de phase mobile.
Il existe des colonnes capillaires dont le diamtre varie entre 10 et 300 m. Elles sont remplies avec des
particules de 0,2 0,5 m de diamtre.
Par exemple une colonne de 192 mm x 0,3 mm permet la sparation de 5 protines en 30 secondes avec un
dbit de 1,2 mL.min-1 ce qui reprsente une vitesse linaire de phase mobile de 128 cm.min-1. La pression
atteinte nest que de 24 bar.
De tels systmes qualifis de nano-chromatographiques.
Dupont de Nemours propose de telles colonnes qui posent actuellement des problmes dutilisation du fait
de la difficult trouver les pompes et les connexions ncessaires leur utilisation mais aussi en raison du
manque de sensibilit de la plupart des dtecteurs. En effet les quantits danalytes sont trs faibles et
souvent en dessous du seuil de sensibilit des appareils actuels.

page 19

r Jean-Louis CUQ -

V.1.3.4. Influence de l'injection

L'injection en chromatographie en phase liquide est une opration dlicate actuellement automatise .
a) Influence de la position de l'injection.
La position de l'injection par rapport au niveau de la phase stationnaire revt une grande importance
(figure 5). L'efficacit passe par un maximum quand l'injection est effectue quelques mm en-dessous du
niveau suprieur de la phase stationnaire.
b) Influence du volume inject.
Le volume inject doit tre de quelques ml; s'il augmente, l'efficacit de la colonne diminue (figure 5).

5 cm

type IV

injection
cte 0
15 mm

injection
type I
type II
type III

8 mm

disque
poreux

volume
(l)

1
silice
dp = 5 m
10
4,8 mm

HEPT
(m)
type
I
II
III
IV

36
83
37
58

I
II
III

43
95
45

IV

64

Figure 5. Influence du mode et du volume d'injection sur la HEPT (phnothiazine) v = 0,25 cm.s-1
De plus l'injection de grands volumes entrane souvent des dformations des pics. Il apparat des
paulements ou des ddoublements qui indiquent alors une injection en deux temps.
L'injection doit tre rapide et continue avec ou sans interruption de l'coulement de la phase liquide.
En rsum, il est prfrable d'injecter 2 l d'une solution 10-3 M plutt que 20 l dune solution 10-4 M.
c) Influence du type d'injecteur
.
Il existe deux types d'injection (figure 6) :
- l'injection par seringue qui ne se rencontre pratiquement pas en HPLC.
Il est impossible d'emprisonner le volume inject dans le disque poreux situ sur la tte de colonne, et de
ce fait, il se produit une dilution importante du volume inject dans l'luant, ce qui entrane une efficacit
plus faible qu'avec l'injection par seringue.
- l'injection par vanne (boucle d'chantillonnage). Ce type d'injection qui est celui retenu dans les
systmes automatiss, ne permet pas d'atteindre l'efficacit maximale.

page 20

r Jean-Louis CUQ -

disque
d'tanchit

v
a
fritt
colonne

colonne

pompe

remplissage
Injection par seringue

colonne

1/3 de tour

pompe

injection

Vanne boucle interne

Vanne boucle externe

pompe

pompe
colonne

colonne

boucle externe
qualibre

remplissage

1/6 de tour

boucle externe
qualibre

injection

Figure 6. Systmes d'injection de l'chantillon analyser en CPL

V.2. OPTIMISATION DU TEMPS D'ANALYSE

Il est important, pour des raisons pratiques, que la dure de l'analyse soit la plus courte possible (environ
10 min). Pour une rsolution donne, il faut donc dterminer les conditions conduisant au temps d'analyse
minimum.
V.2.1. Optimisation du nombre de plateaux efficaces par seconde
A rsolution et slectivit donnes, le nombre de plateaux efficaces ncessaires la sparation est fix et
donn par :
Rs =

1 - 1
.
.

N ef

Dans ce cas, le temps d'analyse sera d'autant plus court que le nombre de plateaux efficaces par seconde
sera plus grand.

page 21

r Jean-Louis CUQ -

2
N ef
= v . k'
tr
HEPT 1 + k'

a) Effet du terme en k' (figure 7)

k'

(1 + k' ) 3
0,15

0,10

0,05

Figure 7. Variation de

10

15

k'

k'2
en fonction de k
3
(1+k)

k'2
en fonction de k' montrent que la courbe passe par un
3
(1+k')
maximum pour k' = 2 si HEPT est indpendant de k'.
Les variations de

b) Effet du terme

v / HEPT

Les deux variables ne sont pas indpendantes HEPT = Avn et HEPT = B dp

En combinant les deux relations on peut crire :
HEPT = KH . dp . vn
avec ~ 1,8
n
n-1
v =v.v
0,3 < n < 0,7
1-n
n
v
v
1
= v
=
HEPT
HEPT K H. d2p
K H . d2p
do
On peut augmenter ce rapport :
- en augmentant v (puisque n < 1)
- en diminuant le diamtre des particules.
La perte de charge va cependant augmenterdans ces conditions.
V.2.2. Pression et temps d'analyse
* tR = L (1+ k')
v

HEPT = L
N

tR = N (1 + k') HEPT avec ** HEPT = KH dp vn

v

page 22

r Jean-Louis CUQ -

La perte de charge est donne par la loi de DARCY

d2p
Lv
3
P =
K =
.
K
180 (1 - )2
180 (1 - )2
P = J v.l. . avec J =
d2p
3
En combinant *, ** et *** on obtient :
a . ( .J )b . N a . dc
KH
p
tR =
(1 + k')
Pb
2
1 + n

a=

b=

1 - n
1 + n

c= -

1 - n
1 + n

2 -

en prenant n = 0,5 et b = 1,8

KH1,33. (.J)0,33 . N 1,33 . dp1,73
________________________________

tR =

( 1 + k' )

P0,33

A KH, J, N et k' constants, on peut donc diminuer tR en diminuant dp ou en augmentant P. La figure 8

montrent les variations de tR en fonction de P pour divers dp.
Ainsi pour une pression de 70 atm, le passage de dp 40 5 mm permet de rduire le temps d'analyse de
7h30 10 min.
t

(sec)

10

5
10 h

10

10

10

1h

30 min

10 min

5 min
1 min

10

100

1000

10000

= 40

p
p
p

= 20 m
= 10 m
= 5 m
pression (bars)

Figure 8. Variation du temps d'analyse en fonction de la pression diffrentes granulomtries

= 1,8 cp ; = 1,05 ; Rs = 1 ; N = 28 250 ; n = 0,6.
V.3. OPTIMISATION DE LA PERTE DE CHARGE
Il est important de rduire les pertes de charge car travailler sous haute pression est toujours synonyme de
difficults techniques.
Pour maintenir RS et tR constants il faut que :
1 - le volume de la phase stationnaire reste constant

page 23

r Jean-Louis CUQ -

2 - le nombre total de plateaux thoriques reste constant quels que soient le dbit ou la longueur de la
colonne
3 - le nombre de plateaux efficaces par unit de temps soit constant.
= 1,8

HEPT = KH.dp vn
N=

L
= const ant e
HEPT

t R = N ( 1 + k' ) .

et
tR=

n compris entre 0,3 et 0,7

L
. 1 + k'
v

do

HEPT
v

k' est constant pour un compos donn avec phases stationnaire et mobile donnes.
Il faut donc que L / v = constante
Si on divise dp par 2, HEPT est divis par 2.
Pour que tR reste constant il faut diviser L et v par 2 ce qui entrane que HEPT est divis par 2n. Il faut
donc nouveau divisier L et v par 2 n et ainsi de suite.
On obtient une srie convergente dont la somme des termes est :

21-n
Ainsi avec = 1,8 et n = 0,5 diviser dp par 2 permet de diviser L et v par 23.6 soit environ 12.
Si dp est divis par 2
Lv . 180 (1-)2
P = _______________
2

dp .

P est divis par

23,6 . 23,6
________
22

soit par 37

En divisant par 2, on obtient une sparation identique quant sa dure et sa rsolution avec une
colonne 12 fois plus courte et un dbit 12 fois plus faible ce qui ncessite une P 37 fois plus faible.
Plus la colonne sera courte et plus son diamtre sera grand car Vs = Cte.
Il faut signaler deux limites ces diminutions de L, v et dp
1 - il est impossible d'augmenter beaucoup le diamtre des colonnes sans entraner des perturbations
notables dans l'coulement de la phase mobile.
2 - il est peu probable que l'on puisse diminuer le diamtre des particules en dessous de 1 m.
V.4 . CONCLUSION
L'optimisation d'une analyse par CPL est difficile en raison de multiples paramtres sur lesquels on peut
agir. En fait, dans la pratique, on s'efforcera d'abord de choisir les conditions chimiques de la sparation
(nature et composition chimique de la phase stationnaire, nature et composition chimique de l'luant,
modification ventuelle des produits sparer) pour que le facteur de slectivit ne soit pas trop proche de
1 et pour les facteurs de capacit soient compris entre 1 et 10.

page 24

r Jean-Louis CUQ -

Le choix de la colonne (limit par les fournisseurs) se limitera celles de faible longueur (25 cm) et de
4,8 mm de diamtre par exemple. Les particules devront avoir un dp de l'ordre de 5-10 m.
On veillera ce que l'injection soit la "moins mauvaise" possible.
V.5. DETERMINATION GRAPHIQUE DES PARAMETRESopt
Les principaux paramtres pour optimiser une analyse sont indiqus sur la figure 9 pour une viscosit de la
phase mobile faible et gale 0,44 cP. Il existe de tels diagrammes pour des phases mobiles de viscosits
autres.
L ( cm)
1000
300
100

1000
P ( bar)
300
100
30
10
3

N
1000000

30
10

100000

= 0,44 cp

10000

1000
1

20

30

100

30

( m)

t R (sec)
10000
3000
1000
300
100

10

10

5
(sec

-1

5000

10

500

20

100

0,5

50

20

0,1

100

v ( cm. sec

200

-1
)

HEPT ( m)
0,2

Nef / t

figure 9. Dtermination graphique des paramtres optima en chromatographie en phase liquide

page 25

r Jean-Louis CUQ -

VI. DIFFERENTS TYPES DE CHROMATOGRAPHIE EN FONCTION DES PHENOMENES

MIS EN JEU
En chromatographie en phase liquide les principales interactions qui rgissent les mcanismes de rtention
et dlution de soluts sont, en fonction de lnergie mise en jeu, lies des liaisons chimiques:
- soit de Van der Waals (1 9 kJ.mole-1). Il sagit dinteractions dipolaires lies la prsence de diples
induits et instantans ou permanents dans la molcules. Ces interactions existent dans pratiquement tous
les systmes chromatographiques. Leur rle est souvent nglig en raison de leur faible nergie. Ces
interactions se produisent faible distance (0,3 0,6 nm) et diminuent dintensit quand la temprature
augmente.
- soit hydrophobes (4 12 kJ.mole-1). Dans ce cas, cest lattraction entre deux (ou plus) molcules deau
spares par une molcule ne donnant que peu ou dinteraction avec elles qui chasse cette molcule
currentpoint
H

molcule
apolaire

O
H

O
H

currentpoint
Dans ce cas, moins la molcule est polaire (incapable de donner des interactions avec leau) et plus forte
est la rpulsion. La chaleur augmente lagitation des molcules deau et augmente donc la force de
rpulsion.
Ces interactions se produisent entre 0,2 et 0,4 nm.
- soit hydrogne (8 40 kJ.mole-1). Il sagit dune interaction dans laquelle deux atomes lectrongatifs
dont lun est li un atome dhydrogne partagent ingalement cet atome. La distance de ces liaisons est
denviron 0,2 nm.
currentpoint
N

currentpoint
Ces interactions sont donnes par leau ; elles diminuent dintensit avec la temprature.
- soit polaires ionises (lectrostatiques ou de Coulomb, 40 85 kJ.mole-1). Ces interactions entre ions
dpendent, pour la plupart des groupes ionisables organiques, du pH. Ainsi par exemple les groupements
carboxyles ne sont ioniss significativement qu des pH > pKa.
Lintensit de ces liaisons de forte nergie diminue avec la temprature.
- soit covalentes (330 400 kJ.mole-1). Lnergie de ces liaisons est trs lev et leur rversibilit
ncessaire leur implication en chromatographie en phase liquide nest pas toujours accessible.
Les seules liaisons covalentes rversibles utilisables en chromatographie en phase liquide sont les liaisons
par pont disulfure. Ces liaisons sont peu sensibles aux variations de temprature dans des conditions de pH
ou de potentiel doxydorduction donnes.
Les diffrents systmes chromatographiques diffreront les uns des autres par la nature des interactions
chimiques changes entre solut, solvant et phase stationnaire. Pour quune phase stationnaire soit
utilisable il est donc ncessaire quelle donne une (ou plusieurs) interaction avec le solut (pour le retenir),
mais il est aussi ncessaire que le solvant constituant la phase mobile donne des interactions avec le solut
(pour lluer) et avec la phase stationnaire.

page 26

r Jean-Louis CUQ -

Il nexiste pas de phase stationnaire inerte et il faudra toujours se proccuper des interactions quelle
est susceptible de donner mme dans des chromatographies o elle nintervient en principe que par un
aspect strique .

VI.1. LA CHROMATOGRAPHIE D'ADSORPTION

La phase stationaire est un adsorbant et la sparation est fonde sur les diffrences d'adsorption des
molcules du mlange sur cette phase (CLS). Les premires sparations chromatographiques ont utilises
comme phases stationnaires principales soit la silice, soit la cellulose. Il en rsulte que tous les modles
raliss partir de ces phases reposaient sur un change analyte - phase mobile - phase stationnaire
essentiellement du type liaison hydrogne. Sans indication quant la nature de la phase stationnaire, toutes
les donnes qui seront inhrentes la chromatographie dadsorption seront donc fondes sur ce type
dchange.
C'est cette technique, couramment utilise qui offre les possibilits les plus vastes. Elle s'applique trs bien
aux composs organiques dont la masse molaire est comprise entre 200 et 1000, que ces composs soient
volatils ou non. Son domaine d'lection est la sparation de composs organiques renfermant des
groupements fonctionnels diffrents ainsi que celle de certains types d'isomres.
Elle s'applique mal la sparation de soluts trs peu polaires (par exemple ceux qui ne se diffrencient
que par la longueur de leur chane aliphatique).
VI.1.1. Thermodynamique de l'adsorption
SNYDER (Principles of Adsorption Chromatography, M. Dekker, NY, 1968) a trait ce sujet en dtail.
Le volume de rtention d'un solut est directement li la comptition entre les molcules de solvant M et
de solut S la surface de l'adsorbant a. On admet gnralement que cette surface est recouverte d'une
couche monomolculaire constitue par des molcules de la phase mobile M et de solut S.
L'quilibre d'adsorption et de dsorption peut s'crire :
currentpoint
S (M )
+
nM(a)
currentpoint
S(a)
solut
dans
phase
mobile

phase
mobile adsorbe

solut
adsorb

+nM(M)
phase
mobile "libre"

currentpoint

L'adsorption d'une molcule de solut S(M)

S(a) se traduit par le dpart de n molcules de
currentpointcurrentpoint
solvants de la surface de l'adsorbant nM(a)
currentpoint
nM(M).
L'nergie d'adsorption est donne par :
Ea = ES(a) + n EM(M) - ES(M) - n EM(a)
Les termes des nergies en solution sont faibles et on a :
Ea = ES(a) - n EM(a)
ES(a) est constante et ne dpend pas du solvant.
EM(a) dpend du solvant et du support mais pas de l'chantillon .

page 27

r Jean-Louis CUQ -

Une quation reliant le facteur de capacit k' du solut aux proprits de l'adsorbant a t propose
par SNYDER
VS
o
o
log k' = log V a + (S - . A S ) + log
VM
Va
:

:
S - AS
S
:
As

VS:
VM :

volume de phase mobile adsorbe par gramme d'adsorbant

activit de l'adsorbant (en gnral comprise entre 0,5 et 0,9)
est li aux proprits de l'luant et du solut.
nergie libre d'adsorption du solut par unit de surface d'adsorbant dans des
conditions d'activit standard (b = 1)
:
surface occupe sur l'adsorbant par une mole de solut
:
nergie libre d'adsorption des molcules de la phase mobile par unit de surface
d'adsorbant
volume phase stationnaire
volume phase mobile.
o

G
S = 2 , 3 RT

G : variation d'nergie libre d'adsorption

R
:
constante des gaz parfaits
T
:
temprature absolue (Kelvin)
Cette loi peut se simplifier de la faon suivante:

log k' = A -

.B

A et B = constantes

Il apparat alors que plus la valeur de o augmente et plus le log de k diminue et inversement. Il sagit
donc l dun paramtre trs important dans ce type de chromatographie : il permet de matriser tR
SNYDER a dcrit une srie luotropique (force luante d'un solvant) partir des valeurs de l'nergie libre
d'adsorption e des molcules de solvant sur la surface de l'adsorbant (tableau 3).
Tableau 3. Srie luotropique pour l'alumine. Pour la silice, les valeurs sont multiplier par 0,77.
o
n-pentane
isooctane
n-heptane
cyclohexane
cyclopentane
sulfure de carbone
CCl4
chlorure d'amyle
ther isopropylique
tolune
chlorobenzne

O
0,01
0,01
0,04
0,05
0,15
0,18
0,26
0,28
0,29
0,30

o
benzne
bromure d'thyle
ther thylique
chloroforme
chlorure de mthylne
ttrahydrofurane
mthyl thylctone
actone
dioxane
actate d'thyle
alcool amylique

0,32
0,37
0,38
0,40
0,42
0,45
0,51
0,56
0,56
0,58
0,69

o
dimthylsulfoxyde
aniline
nitromthane
actonitrile
pyridine
alcool isopropylique
alcool thylique
alcool mthylique
thylne glycol
acide actique

0,62
0,62
0,64
0,65
0,71
0,82
0,88
0,95
1,11
grand

page 28

r Jean-Louis CUQ -

Si o augmente, log k diminue et la rtention diminue

(avec ce type de chromatographie dadsorption phase stationnaire polaire)
VI.1.2. Adsorbants utiliss en CLS
Le processus de l'adsorption est complexe et les forces mises en jeu qui dpendent du solut, du solvant et
de l'adsorbant sont nombreuses (forces de dispersion de London, forces lectrostatiques, forces de liaisons
hydrogne etc...). Il devient alors impossible de prciser la part relative de ces diffrentes forces
d'adsorption car pratiquement on n'observe que leur rsultante.
Par ailleurs, du fait de la prsence d'eau (mme l'tat de traces) dans les phases stationnaire et mobile il
est galement impossible de prciser la part de la chromatographie de partage ct de la chromatographie
d'adsorption.
Malgr ces nombreuses interactions, les prvisions en chromatographie liquide d'adsorption sont
relativement simples (particulirement quand des adsorbants polaires o les liaisons hydrogne constituent
les forces dominantes sont utiliss : silice ou alumine ou cellulose).
SNYDER distingue ainsi 4 types d'adsorbants
I
II
III
IV

inorganiques polaires
inorganiques apolaires
greffs polaires
greffs apolaires

silice, alumine
graphite, charbon
aminopropyl (NH2), cyanopropyl (CN)
C18 - C8

VI.1.2.1. Adsorbant de type I - Silice ou Alumine

Les sites actifs sur lesquels s'adsorbent les molcules de soluts sont, pour la silice, des groupes silanol*.
Ces groupes sont de trois types :
H

Si

Si

Si

Si

Si

ssilanol isols

silanols liaison hydrogne

OH

HO
Si

silanols gminaux

- H2 O
O
isol

Si

siloxane
Si
liaison hydrogne

Pour des pH suprieurs 8 la silice nest pas stable et se dissout. Toutes les phases qui utiliseront une
base silice seront donc limites au niveau du pH de leur phase mobile 8.
En prsence d'eau, la plupart de ces groupes sont associs cette molcule. Cette eau doit tre limine par
chaufface prolong 150C. Un chauffage temprature suprieure 200C se traduit partir des silanols
liaison hydrogne, par la formation de siloxane dont le caractre apolaire est important.

page 29

r Jean-Louis CUQ -

OH

O Si

O
O

Si

Si

Si

Si

OH

Si
O

OH

+ :NR3

Si O

Si O

Si

OH

Si

Si

Si

Si

OH

OH

:NR3

O
OH

Si

OH

OH

L'exprience montre que la silice convient bien la sparation de soluts qui sont des bases au sens de
Brnsted (exemple : amines qui se fixent nanmoins de faon souvent de faon irrversible) ; on dit que
cet adsorbant a un caractre acide.
Le gel de silice est prpar par prcipitation acide de silicate de sodium : il se produit une polymrisation
de lacide silicique form en un rseau appel hydrogel. En solution dilue un gel faible ou un prcipit
est obtenu tandis quen milieu concentr lhydrogel est ferme. Le schage de ce dernier conduit un
xrogel (photographie b obtenue par microscopie lectronique balayage).

Les gels de silice prsentent une structure poreuse.

KIRKLAND J.J. (LC.GC, 1996, 14, (6), 486-500) a obtenu la glification
de silicates solubles par cohalescence avec formation de structures de
type sil-gel (photographie a obtenue par microscopie lectronique
balayage). Les subparticules de ce gel sont homognes; la porosit est de
50%; le gel a une surface de 150 m2 / g et les pores ont 10 nm de
diamtre. Relativement stables aux pH levs.

Le xrogel b est spongieux; sa porosit est de 70% et sa surface de 300

m2 / g. Les pores ont un diamtre de 10 nm
Quand la surface est compltement hydroxyle, le gel de silice a une
densit de groupements silanols de 8 mole / m2. Ces silanols sont
localiss pour la plupart dans des micropores de 1 nm de diamtre ce qui
ne les rend accessibles qu des analytes de faibles dimensions
molculaires.

La silice peut tre utilise en milieux aqueux et non aqueux.

page 30

r Jean-Louis CUQ -

Inversement, l'alumine convient bien pour la sparation de soluts acides (phnols, acides carboxyliques) ;
cet adsorbant est dit basique.
Al

Al
O

Al

O
Al

O
OH

O
O

Al

O-

Al

OH

Al

O-

O
O

Al

OH

Al

Al

a) Influence des groupements fonctionnels du solut

Avec ces adsorbants de type I, les molcules polaires sont toujours plus adsorbes que les molcules non
polaires.
amides > amines > acides carboxyliques >alcools > ctones > esters > composs nitrs > thers >
hydrocarbures aromatiques > hydrocarbures non saturs > hydrocarbures saturs.

b) Influence de la force d'lution du solvant

La force lutive d'un solvant est caractrise par (tableau 3). Une augmentation de 0,05 de la force
lutive diminue environ de moiti la valeur du facteur de capacit k'.
En pratique, on recherche une valeur de force lutive qui donne une rtention convenable.

c) Diffrents types de support

Deux paramtres caractrisent ce type de phase stationnaire :
- la granulomtrie. Ainsi de 60 m pour dp pour la chromatographie liquide/solide classique, on est pass
des valeurs de dp comprises entre 1 et 10 m.
- la forme. Les grains de silice avaient l'origine une structure irrgulire. Actuellement ces grains sont le
plus souvent sphriques.
Il existe des grains constitus par un noyau compact ( 30 m) recouverts d'une fine pellicule poreuse (1
m) : ce sont les supports pelliculaires.
Gnralits sur les phases greffes sur les particules de silice.

Ces phases reposent sur ltablissement dune liaison silylther. Elle est obtenue par raction de la silice
avec des drivs du type monochlorodimthylsilane ou trichlorosilane pour les plus importants.
CH 3

CH 3
Si

Cl

Si

Si

Si
CH 3

CH 3
monochlorodimthylsilane

Si

O
H

Si

Si

Cl
+

Cl

Si

Si

Cl
H

trichlorosilane

Si

Cl
R

page 31

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La liaison Si - O - Si nest pas stable pour des pH infrieurs 2. La plage dutilisation des phases
greffes stend donc de pH 2 pH 8. Nanmoins de nombreux travaux ont t raliss pour largir cette
gamme. Par exemple la substitution des groupements mthyls par des groupes plus volumineux (propyls
par exemple) minimise les possibilits dhydrolyse et permet donc dlargir la gamme dutilisation
possible de ces phases stationnaires.
CH3

CH2
CH2

CH3
Si

Si

Si

CH3
Si

OH
O

Si
Si

Si

CH3
Si

Si

CH2 CH
2

CH3
Si

CH3
CH2
CH2
O

Si

CH2

OH

Si

silice greffe avec du chlorodimthyloctadcyl silane

OH

CH2

CH3

silice greffe avec du chlorodipropyloctadcylsilane

IV.1.2.2. Adsorbant de type III. Phases greffes polaires

Les principaux groupes fonctionnels des phases greffes polaires sont indiqus dans le tableau 4. Ces
phases sont classes en fonction de leur polarit.
analyse de :

- faiblement polaires (glycophase ou diolphase dimthylamino)

- moyennement polaires

(cyano)

- fortement polaires

(amino, diamino)

composs carbonyls
phnols , amines , esters
oses, osides, peptides, nuclotides

Un exemple de chromatrogramme doses obtenu sur une silice greffe NH2 est donn sur la figure 10.
3

2
1

5
4

t
0

10

20

(min)

Figure 10. Sparation fructose (1), glucose (2), saccharose (3), maltose (4) et lactose (5) sur Si greffe
NH2. dp = 10 mm. Colonne L = 30 cm, = 3,9 mm. Eluant actonitrile/eau (80/20). Dbit 2 ml/min.
Dtection rfractomtrique.

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Tableau 4.

Groupes fonctionnels de phases polaires greffes et applications principales

Type de phase

Applications

Structure du greffon
CH2 OH

glycophase (Diol)

Si O Si

(CH2 )3

amino

Si O Si

(CH2 )3 NH 2

O CH2

CH
OH

glucides (oses), vitamines,

isomres D-L, peptides,
alcools, nuclosides, etc...

CH3
(CH2 )3 N

quinones, flavones, amines,

peptides, protines,etc...

cf diol

dimthylamino

Si O Si

diamino

Si O Si

(CH2 )3

NH (CH2 )2

cyano

Si O Si

(CH2 )2

CH3
NH 2

cf amino
lipides, strodes, pesticides,
phnols, amines, esters, etc..

VI.1.2.3. Adsorbant de type IV. Phases greffes apolaires

Les phases greffes apolaires reprsentent les phases stationnaires les plus utilises en HPLC. Ces phases
(qualifies de rverses ou d'inverses) sont prpares partir de silice par formation dune liaison
thersilyl (cf gnralits sur les phases greffes)
La longueur du greffon alkyle R sil sgit dune chane aliphatique ou la nature mme de cette chane
(groupements phnyl, etc) sert caractriser la phase.
RP 8 implique
R = (CH2)7 - CH3
(octyl)
RP18 implique
R = (CH2)17 - CH3
(octadcyl)
.
Les phases RP 8 et RP 18 sont les plus rpandues et les plus utilises.

Les applications possibles de ce type de phases stationnaires sont trs nombreuses:

RP 8

RP 18

substances lipophiles ou moyennement polaires

Bien adaptable la chromatographie par appariemment d'ions
Substances polyaromatiques, antibiotiques, vitamines hydrosolubles, acides et
esters organiques, hydrocarbures, corticostrodes, barbituriques, phospholipides, etc...
Substances lipophiles, acides amins, etc..

En ralisant une surface hydrophobe on inverse totalement la nature des interactions fournies par la silice.
L'eau n'a pas d'affinit pour le greffon hydrophobe et la force luante des solvants est exactement l'inverse
de celle qui est observe sur supports polaires d'o le terme reversed phase (RP) appliqu ce genre de
support.
Les soluts les plus polaires seront les moins retenus, les soluts apolaires seront retenus dautant
plus fortement que leur hydrophobicit est leve.

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r Jean-Louis CUQ -

La rtention des composs apolaires croit avec la longueur du greffon et avec le taux de greffage de la
surface (surface coverage). La taille des particules n'a pas d'effet sur la rtention exprime par le facteur de
capacit k', les effets de la taille ne concernant que la pression et la HEPT.
a) mcanisme de rtention
Malgr tous les travaux qui lui sont consacrs, il existe encore beaucoup de flou dans son interprtation.
Dans la thorie solvophobique, ce sont les interactions apolaires dans un solvant polaire qui sont dcrites.
On peut schmatiser les forces mises en jeu, forces dont la rsultante est la force de liaison entre le solut
et la phase greffe (figure 11).
zone hydrophile

1 forces de Van der Waals entre solut

et phase stationnaire
2 forces lies l'hydrophobicit
3 interactions hydrophobes entre
molcules de soluts
4 interactions polaires entre
molcules de soluts et entre molcules
de soluts et l'eau

eau
particule
de
silice

greffon
apolaire

1
2

zone hydrophobe
du solut

Figure 11. Reprsentation schmatique des interactions mises en jeu dans la chromatographie en phase inverse.
Le coefficient de distribution (ou coefficient de partage) est : K = CS / CM
La variation d'nergie libre DG de la liaison du solut la phase greffe est gale :
G = - RT Ln K
Le facteur de capacit k' est gal : k' = K .VS / VM
o
VS
G
ln k' = ln
VM
RT
Avec VS volume du solut dans la phase stationnaire et VM volume du solut dans la phase mobile.
Pour un luant donn et une phase stationnaire greffe donne, on constate que le facteur de capacit k'
augmente avec l'hydrophobicit du solut. Ainsi les variations de log k' en fonction du nombre de
groupements mthylne (CH2) dune famille de composs organiques donns sont linaires (figure 12, a ).
log k'

ln k'

acides

c
2

acides amins

0
-1

amines

0
-2
0

n CH

60

100

140
surface molculaire
o
apolaire (A )2

figure12. Variations du logarithme du facteur de capacit en fonction

a. du nombre de CH2 d'alkyl benznes (n = 0 = benzne). Phase stationnaire greffe en C8.
mthanol / eau : a = 1/0, b = 9/1, c = 8/2, d = 6 / 4
b. de la surface molculaire apolaire

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r Jean-Louis CUQ -

Pour des composs biologiques (amines, acides carboxyliques, acides amins), on observe galement une
relation linaire entre ln k' et la surface apolaire de la molcule (figure 12,b). Plus l'ionisation
augmente et plus le facteur de capacit diminue. Pour les acides monoprotons, le facteur de capacit est
gal :
Ka
k' 0 + k' -1
+
+
H
H COO
k' =
avec K a =
COOH
Ka
1 +
+
H

currentpoint
pour lquilibre
COOH
currentpoint
COO- + H+
k'o facteur de capacit de la forme non protone (COOH), k'-1 facteur de capacit pour la forme
dprotone (COO-), Ka constante de dissociation de l'acide et H+concentration en proton.
Le facteur de capacit sera donc le plus lev pour ces acides carboxyliques quand les conditions de pH
empcheront lionisation de la fonction acide cest dire pour des valeurs de pH infrieures au pKa de
lacide. Gnralement on ajoute la phase mobile un acide fort dilu (acide phosphorique par exemple)
pour atteindre ces valeurs de pH qui doivent nanmoins rester suprieures 2 pour viter lhydrolyse de la
liaisons silylther.
Pour les bases faibles, on a une expression similaire (amine par ex.). Il faut remarquer ici que les valeurs
des pKa de ces bases sont souvent suprieurs la limite de stabilit pH des silices. De fait il nest pas
dexemple danalyse des pH suprieur 12.
currentpoint
NH3+
currentpoint
NH2 + H+

k' 0 + k' 1
k' =
1 +

( KH )
a
+

( KH )
a
+

avec K a =

NH 2
+

NH 3

avec Ka constante de dissociation de la forme protone, k'1 facteur de capacit pour la forme protone
(NH3+).
Les variations de k' pour quelques acides carboxyliques sont indiques sur la figure 13.
k'
15

currentpoint

OCH 3

OH

1
5

acide benzoque

COOH

10

COOH

COOH

pH
2

CH2

OH
OH

a.homovanillique

a.salicylique

OH
CH 2

COOH

a.3,4-dihydroxyphnylactique

currentpoint

Figure 13. Variations du facteur de capacit pour quelques acides mono protons en fonction du pH
(chromatographie en phase inverse C8) 1 acide benzoque; 2 acide homovanillique; 3 acide salicylique; 4
acide 3,4 - dihydroxyphnylactique.

page 35

r Jean-Louis CUQ -

L'effet de la temprature sur le facteur de capacit peut tre tudi partir de la loi de VAN'T HOFF
(effet de la temprature sur la constante d'quilibre)
o
o
d ln K H
H
soit ln K =
+ cte
=
dt
2
RT
RT
Ici on aura:
o
o
VS
H
S
ln k' =
+
+ ln
RT
R
VM

H variation d'enthalpie

S variation d'entropie.

et

Si on porte ln k' en fonction 1 / T, Ho correspondra la pente de la droite.

Ce type de reprsentation est indiqu sur la figure 14 pour quelques acides aromatiques. On constate que
quand la temprature augmente k' diminue.
ln k'
2

currentpoint

2,3

OH

2
3
1

-2,3

2,9

3,1

3,2

3,3

CH2

COOH

CH2

COOH

OH
1

OH

3
10 / T

OH
OH

OH
CH COOH

1
currentpo

Figure 15. Variations en ln k' en fonction de 103/T (Van't Hoff) pour quelques acides armatiques en
chromatographie en phase inverse (C8). Eluant tampon phosphate 50 mM pH2 (
), et mme tampon
additionn de 5 % d'actonitrile (1, 2, 3)
1 = acide dihydroxymandlique
2 = acide hydroxyphnylactique
3 = acide dihydroxyphnylactique.
b) influence de la phase mobile
L'eau constitue la base de toute phase mobile en chromatographie liquide sur phases greffes apolaires.
Elution en mode isocratique

Dans ce type dlution, la composition de la phase mobile reste constante tout au long de lanalyse
chromatographique. On utilise gnralement soit un mlange binaire type eau / mthanol, eau / actonitrile
ou eau / ttrahydrofurane, soit un mlange ternaire eau / actonitrile / mthanol. Ce type dlution est
applicable des analytes dont les valeurs de k ne sont pas trop diffrentes.
On constate gnralement une variation linaire du log k' en fonction du pourcentage d'eau dans la phase
mobile (figure 15) (voir aussi figure 12).

page 36

r Jean-Louis CUQ -

log k'

nitrobenzne

1
tolune
0

phnol
aniline

-1

20

40

% d'eau

Figure 15. Variations du log k' en fonction de la teneur en eau du mlange mthanol / eau en
chromatographie en phase inverse.
La phase stationnaire subit des changements de structure selon la nature de la phase mobile. Il nest pas
actuellement possible de prvoir de tels changements et seule lexprimentation permet den dterminer
les effets. Ainsi l'ordre d'lution de composs benzniques varie avec l'luant (Tableau 5 et figure 16).
Tableau 5. Ordre d'lution de drivs benzniques en fonction de la nature de l'luant. Chromatographie en
phase inverse (C18).
MeOH/eau 50/50

ACN/eau 30/70

THF/eau 25/75

- CONH2
- CH2OH
- OH
- CHO
- CH2-CH2 OH
- CN
- COCH3
- NO2
-H
- OCH3
- COOCH3
- CH3
- Cl
- COOCH2CH3

- CONH2
- CH2OH
- OH
- CH2 -CH2OH
- CHO
- COCH3
- CN
- NO2
- COOCH3
-H
- OCH3
- COOCH2CH3
- CH3
- Cl

- CONH2
- CH2OH
- CH2-CH2OH
- CHO
- COCH3
- OH
- CN
- COOCH3
- NO2
- OCH3
-H
- COOCH2CH3
- CH3
- Cl

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r Jean-Louis CUQ -

absorbance
254 nm

currentpoint

1
0,5

NH 2

CH 2OH

CH 2 CH 2 OH

CH 2

OH

OCH 3

OCH 3

CH 2 CH 3

CH 3

4
0

10

temps de rtention
(min)

NO 2

currentpoint

Figure 16. Chromatogramme en phase inverse C18 (dp = 10 m), colonne 250 x 4 mm. Solvant
CH3CN/eau 49/5, (v/v). Dbit 1,2 ml.min-1, P 60 bars.
Par ailleurs, SHOEMAKERS et al. (1978, J. Chromatography) ont montr que le facteur de capacit tait
reli la concentration en solvant organique par la relation:
ln k = A 2 + B + C
avec fraction de solvant organique dans la phase mobile.
Mais cest SNYDER et al. (1979, J. Chromatography) puis CSOKAN P. et al. (LC-GC, 1993, 6, n 6,
361-369) qui ont montr que la valeur du facteur de capacit dans une phase mobile compose deau et de
solvant B tait gale :

log k = log keau + S .

avec k facteur de capacit, keau facteur de capacit avec 100 % deau, S constante pour chaque analyte
avec des valeurs typiques de 4 pour les petites molcules (poids molculaire infrieur 1000) et le
pourcentage de solvant B. Cette quation peut tre valide par deux ou trois chromatogrammes.
L'interaction de Van der Waals varie avec la surface de contact entre la partie apolaire du solut et la phase
stationnaire greffe. Ainsi, les phases greffes possdent une capacit de reconnaissance suivant la forme
de la molcule. Il sera ainsi possible de sparer certains isomres de position, par contre la sparation des
isomres gomtriques (cis/trans) ou optiques (D/L) est plus difficile (cf phases greffes chirales.)
currentpoint
CH3

CH CH 2

CH

CH3

COO

NH 3+
COO

CH3

(CH2)3

CH

leucine

NH 3+

CH3

CH 2
CH
CH3

CH

COO
NH3+

isoleucine

norleucine
currentpoint

page 38

r Jean-Louis CUQ -

Les rtentions sont lies aux solubilits dans la phase mobile. Si l'on ajoute un sel neutre, l'activit de l'eau
diminue et log k' = f ([sel]) est linairement dcroissant.
En conclusion on peut dire que plus le solut sera soluble dans la phase mobile, moins il sera retenu.
Elution en mode gradient
En mode gradient, le facteur de capacit moyen k* est analogue au k en mode isocratique. Les mmes
modifications du chromatogramme apparaissent pour k* comme pour k. Par exemple la rtention reste
toujours plus grande avec des valeurs leves de ces deux paramtres.
Le mode gradient permet llution de composs dont les k* sont trs diffrents (pente de variation du
solvant leve) ou au contraire de composs dont les k* sont trs voisins (pente de variation nulle :
isocratique). Si tous ces composs sont prsents dans lchantillon analyser, il est clair quil faudra faire
varier dans le temps la concentration en solvant de faon diffrente, do la ncessit dutiliser un systme
dlution gradient. Dans ce dernier cas, les meilleurs rsultats sont obtenus pour des valeurs de k*
comprises entre 2 et 10. Il faut donc adopter une phase mobile dont la composition permettra dobtenir la
valeur dsire de k*.
En mode isocratique k nest pas affect par des variations de longueur, de diamtre, de dbit, et par la
taille des particules, ce qui permet des changements dchelle relativement simples.
En mode gradient, k* est modifi par de tels changements et le changement dchelle reste toujours
dlicat.
Cest SNYDER et al. (Practical HPLC Method development, 2nd Edition, Wiley Interscience, New York,
USA, 1997) qui dcrit le plus en dtail les paramtres prendre en considration dans ces systmes
dlution.
Le facteur de capacit moyen en mode gradient est gal :
k* =

t G . D . 100
VM . S .

avec S =

d(log k)
d

avec tG le temps dans le systme gradient, D le dbit, VM le volume de phase mobile dans la colonne, S
constante pour chaque analyte avec des valeurs typiques de 4 pour les petites molcules (poids molculaire
infrieur 1000), DF est la modification de la fraction volumique de B (0 100).
En mode gradient on a donc :
k* . VM . S .
tG =
D . 100
Pour k* dsir de 5 et une valeur moyenne de S gale 4, cette quation devient :

tG =

20 . VM .
D . 100

VM est gal VM = . VT . Avec voisin de 0,5 on a alors :

2
L . . dC .
2
VM =
0,5 . L .d C
4
(L longueur de la colonne, dC diamtre interne, porosit interstitielle, VM volume de phase mobile).
Ainsi avec une colonne de 15 cm x 0,46 cm : VM est environ de 1,6 mL.
Avec un gradient de 5 100 % de solvant B ( = 95) et D = 1,5 mL.min-1 tG est gal 20 min.
Dans le systme considr, lanalyste obtiendra donc un chromatogramme satisfaisant en ralisant un
gradient en 20 minutes, la fraction de B passant alors linairement de 5 100 % dans la phase mobile.

page 39

r Jean-Louis CUQ -

Les appareils modernes proposent des systmes grs par microordinateurs qui permettent de raliser des
gradients par mlange de deux solvants. Le plus souvent les gradients raliss sont linaires, cest dire
que les variations de B dans la phase mobile en fonction du temps sont linaires. Certaines appareils
permettent des gradients curvilignes ou complexes et il existe mme des systmes qui autorisent la mise en
place de gradients par mlange ternaire (3 solvants) voire quaternaire. Dans ces cas seule
lexprimentation et le savoir faire de lanalyste peuvent rpondre un besoin analytique : les
paramtres prendre en considration restent cependant trs nombreux et il devient souvent illusoire de
matriser toutes les inconnues introduites dans ces conditions.
c) Augmentation de k' par modification du solut
a) fixation sur un solut polaire d'un compos apolaire par liaison covalente
Cette mthode est de plus en plus largement utilise pour sparer les acides amins par chromatographie
en phase greffe apolaire.
Il existe aujourdhui de nombreuses ractions chimiques de modification/dtection des acides amins. La
plupart de ces ractions ont les particularits suivantes: elles sont rapides, stoechiomtriques, et donnent
des drivs dont certains sont trs stables et de dtection facile. La sensibilit de dtection a t multiplie
par un facteur 1000 en comparaison avec la dtection ninhydrine, par lutilisation de produits donnant
avec les acides amins des drivs fluorescents.
1) Raction avec l O-phtaldialdhyde (OPA)
LOPA ragit froid, en prsence de mercaptothanol et en milieu alcalin avec les acides amins pour
donner des drivs isoindoliques fluorescents ( ex = 340 nm , m = 455 nm ).

currentpoint
CHO

CHO

S CH2 CH2OH

HS CH2 CH2 OH
NH2

N CH COOH

CH COOH

+ 2H 2O

currentpoint

La proline et lhydroxyproline ne donnant pas directement la raction, il est ncessaire, pour pouvoir les
dtecter, de traiter au pralable les hydrolysats par de lhypochlorite de sodium. La stabilit de certains
drivs isoindoliques forms nest pas trs grande, ce qui implique donc une analyse extemporane.
2) Raction avec la fluorescamine ( 4-phnylspiro ( furan-2(3H),1-phatal)-3,34 dione ).
La raction se fait temprature ambiante et est complte entre pH 7 et 9 en environ 1 seconde ( ex = 390
nm
et m = 475 nm ).
currentpoint
COOH

R
O
O
O
O

NH2

CH
R

COOH

CH
N
OH O
COOH

+ H 2O

currentpoint

Il sagit dune raction trs sensible (seuil de dtection voisin de la pmole) qui permet des dosages de
quantits dacides amins de lordre de 0,1 nmole. La fluorescamine ne ragit pas non plus avec les amines
secondaires comme la proline ou ses driv. Pour raliser le dosage de ces acides amins il faut donc les
transformer en amines primaires par traitement lhypochlorite ou la N-chlorosuccinimide .

page 40

r Jean-Louis CUQ -

3) Raction avec le chlorure de dansyle

Ce ractif permet dobtenir des drivs sulfamides trs fluorescent .
currentpoint
CH3

N
CH3

NH2

CH

COOH

CH3

+ H Cl

N
CH3
SO 2 NH

SO2 Cl

CH COOH

currentpoint

Il existe actuellement beaucoup dautres mthodes de dtection fluorimtrique des acides amins (FMOC
etc.). Il sagit toujours de mthodes trs performantes dont le choix est fonction de paramtres comme la
stabilit des drivs forms, la simplicit de mise en oeuvre, le cot etc. Il faut signaler que tous les
drivs dcrits (OPA, fluorescamine, dansyl ) absorbent dans lUV, ce qui permet leur dtection et leur
dosage avec une sensibilit moindre que par la mthode fluorimtrique.
4) Raction au phnylisothiocyanate ( PITC )
Le phnyl isothiocyante ragit avec les acides amins pour former des drivs facilement dtectables dans
lUV. Les phnylthiocarbamyl (PTC) sont transformables en drivs phnylthiohydantone (PTH ) en
milieu chlorhydrique en prsence de mthylnitrosamine.

N C S

NH2

CH

OH

H Cl , CH 3NO 2

NH

COOH

NH

CH R
COOH

NH

+H O
2

5) Raction avec le 9,fluornylmthyl-chloroformate (FMOC-HCl)

currentpoint
+ NH 2 - R
CH2 O

pH 8 , 60C
5 min
CH2 O

C Cl

C
O

NH

currentpoint

6) Raction avec le chlorure de Dabsyl

currentpoint

NH 2 -R

CH3
N
CH3

N
N

SO2Cl

pH 9
70C 10 min

CH3
N
CH3

N
N

SO2 NH R

currentpoint

Les drivs obtenus ont des facteurs de capacit beaucoup plus importants que l'acide amin de dpart. Il
est ainsi possible de raliser leur sparation par HPLC en phase inverse (figure 17).
De plus ces drivs sont dtectables par fluorescence ou par absorption UV, ce qui facilite le dosage. La
limite de dtection atteint respectivement 10-13 et 5.10-12 g.
Les avantages et inconvnients des principales mthodes de drivation des acides amins sont indiques
dans le Tableau de synthse ci-dessous

page 41

r Jean-Louis CUQ -

mode de drivation
PITC
OPA

dabsyl
amines 2aires
oui
sensibilit
5 pmoles UV
stabilit
bonne
interfrence du ractif oui
automatisable
moyen

oui
5 pmoles UV
moyenne
oui
mauvais

FMOC

non
oui
150 fmoles Fluo 100fmoles Fluo
mauvaise
bonne
non
oui
oui
moyen

Il existe des possibilits de combinaisons de certaines de ces mthodes. Ainsi la combinaison OPA FMOC permet dobtenir aprs chromatographie en phase inverse et par mesure de labsorbance 338 nm
tous les acides amins avec des NH2 primaires jusqu llution de la lysine puis, par lecture 262 nm
llution et la dtection de la proline et de lOH-proline (GODEL H. et al, 1992, 5, LC-GC, 44-49 ).
14
8
1

3
2

11

16
15

12

17

13

10

18

A
5

10

6
4
1

23
22

temps de rtention
(min)

20

12
10

13
19 14

20 11

17

21

16

15

temps de rtention (min)

10

Figure 17 : Chromatogramme en phase inverse (C18) des drivs dacides amins

A ractif OPA - drivs isoindoliques ; dtecteur fluorimtrique
B drivs PTH
1.Asp, 2.Glu, 3.Asn, 4.Ser, 5.Gln, 6.His, 7.Gly, 8.Thr, 9.Arg, 10.Ala, 11.acide -butyrique, 12.Tyr, 13.Met,
14.Val, 15.Phe, 16.Ile, 17.Leu, 18.Lys, 19.Pro, 20.Trp, 21.NorLeu, 22.acide cystique, 23.CH3Cys

page 42

r Jean-Louis CUQ -

b) Fixation sur un solut ionique d'un compos apolaire par liaison ionique : Appariement d'ions
Le but de cette mthode est de lier, par formation dune paire dion, une molcule polaire ionise (acide,
base par exemple) qui nest donc pas directement analysable en HPLC-RP, un ion de charge oppose
mais porteur dun groupement apolaire qui permet lanalyse dans ces conditions.
+
analytite
ractif formeur de paire d'ions
+ currentpoint
(A+)M + (B-)M
currentpoint
(A+ B-) s
A+M solut ionique (ion)
B-M ou (B+) solut ionique apolaire
(contre-ion) htarion
+
(A B ) paire d'ion
+ AB s
K AB =
+
A M B M
La paire d'ion forme peut possder un facteur de capacit autorisant une bonne sparation
chromatographique sur phase stationnaire greffe apolaire. k' sera d'autant plus grand, que l'hydrophobicit
du contre ion sera grande.Les principaux ractifs formeurs de"paire d'ions" sont indiqus dans le tableau 6.
Tableau 6. Principaux ractifs formeurs de paires d'ions
(B+)
(B-)
bromure d'hexadcyltrimthyl-ammonium

1 heptane sulfonate

(Na+)

bromure de ttrabutylammonium

1 hexane sulfonate

(Na+)

bromure de ttradcyltrimthyl ammonium 1 octane sulfonate

(Na+)

bromure de ttramthyl ammonium

1 pentane sulfonate

(Na+)

bromure de ttrapropyl ammonium

Dodcyl sulfate de sodium

(Na+)

Naphtalne sulfonate

On peut par exemple obtenir des sparations d'acides organiques (figure 18) ou d'amines (figure 19).
2
1

10

20

(minutes)

Figure 18. Chromatographie par appariement d'ions en phase inverse d'acides organiques (RP2) Phase
mobile 0,03 M ttrabutylammonium pH 7,4.

1 = acide 4-aminobenzoque ; 2 = acide 3-aminobenzoque ; 3 = acide 4-hydroxybenzoque ; 4 = acide 3hydroxybenzoque ; 5 = acide benzne sulfonique ; 6 = acide benzoque ; 7 = acide tolune 4-sulfonique.

page 43

20

3-M-tyrm

Tyrm

Isopron

3-H-tyrm

DOPA+NM
MN

N.Syn
Syn

NE

DOPAC
SH/AA

DHMA
VMA
MGA

r Jean-Louis CUQ -

40

t (minutes)
R

Figure 19. Sparation isochratique de catcholamines par chromatographie par appariement d'ions en
phase inverse. Le contre-ion est le SDS.
L'ion d'appariemment (hetrion : ion compagnon) se trouve dans la phase aqueuse une concentration
beaucoup plus leve que celle du solut A+. Le coefficient de distribution du solut est :
[A+B-]s
_______ = KAB [B-]M
Ks =

[A+]M
Le facteur de capacit est proportionnel Ks en chromatographie de phases inverses et 1/ KS en
chromatographie dite normale, k' sera proportionnel la concentration de l'agent d'appariement dans le
premier cas, et son inverse dans le second.

VI.2. LA CHROMATOGRAPHE DE PARTAGE

Dans cette technologie la phase stationnaire est un liquide qui imprgne un support en principe inerte ou
est greffe par liaison chimique covalente sur ce support. La sparation des soluts est fonde sur leur
partage entre cette phase stationnaire et la phase mobile liquide.
Le coefficient de distribution est appel coefficient de partage :
CS
VS
K=
et k' =
CM
VM
k' facteur de capacit
VS volume de phase stationnaire contenue dans la colonne
VM volume de phase mobile contenue dans la colonne
CM Cs : concentrations respectives du solut dans la phase mobile et dans la phase stationnaire.
Cette technique s'apparente l'extraction liquide/liquide base sur les diffrences de solubilits dans deux
phases non miscibles, mais ici une des deux phases est immobilise sur un solide dont les particules ont
des diamtres trs petits (dp) ; l'augmentation considrable de la surface de contact entre les deux phases
fait que l'on obtient des efficacits trs suprieures celles obtenues en extraction liquide/liquide classique
contre-courant.

page 44

r Jean-Louis CUQ -

Comme en extraction, il faut que la solubilit de l'une des deux phases dans l'autre soit aussi faible que
possible.
Dans la chromatographie de partage classique, on choisit une phase stationnaire polaire et une phase
mobile apolaire.
Dans la chromatographie de partage polarit de phases inverse, on choisit une phase stationnaire
apolaire et une phase mobile polaire.
La chromatographie de partage donne de trs bons rsultats pour la sparation de composs groupements
fonctionnels diffrents, de composs d'une srie homologue.
La chromatographie liquide-liquide classique (phase stationnaire polaire) est surtout utilise pour la
sparation de composs polaires, tandis que la chromatographie polarit de phase inverse est utilise
pour la sparation de composs apolaires (hydrocarbures longue chane).

VI.2.1. Phases stationnaires utilises en chromatographie liquide / liquide

a) Tous les supports utiliss en chromatographie solide-liquide peuvent tre utiliss condition
qu'ils soient rendus inertes.
On utilise soit :
des supports poreux tels que la silice sur laquelle la phase stationnaire liquide est une multicouche lie au
support par des liaisons hydrogne ou polaire aux groupements silanols. Il existe des supports pelliculaires
(poreux en surface).
des supports poreux apolaires tels que la silice dans laquelle les groupements silanol ont t transforms
en groupements trimthyl apolaires (ou hexamthyl) par raction avec le trimthylchlorosilane. Il s'agit ici
d'une chromatographie
currentpoint en phase inverse.
CH 3

Si
Si

OH

O
Si

CH 3

OH

Cl

Si

Si

CH 3

CH 3

Si

CH 3
CH 3
CH 3

O
Si

CH 3
CH 3 currentpoint

La phase stationnaire sera lie au support par des interactions hydrophobes.

b) La phase stationnaire
Elle doit tapisser de faon aussi uniforme que possible les parois des pores du support.
Cette phase doit tre trs peu miscible avec la phase mobile et sa viscosit doit tre la plus faible possible
pour que les phnomnes de transfert de masse et de diffusion soient facilits.
L'imprgnation peut tre ralise de plusieurs faons :
par vaporation du solvant : la phase stationnaire est dissoute dans un solvant appropri puis mlange
avec le support. Le solvant est ensuite limin par vaporation.
par filtration du solvant : dans ce cas le solvant de la phase stationnaire est limin par filtration.

page 45

r Jean-Louis CUQ -

par percolation : la phase stationnaire est "dissoute" dans un solvant volatil, puis on la fait percoler
travers la colonne ; on chasse le liquide interstitiel puis on vapore le solvant par un courant gazeux. En
faisant varier la concentration des solutions de phases stationnaires, on peut faire ainsi varier l'paisseur du
film sur le support.

VI.2.2. La phase mobile

Le choix de la phase mobile est empirique ; on se laisse guider par la notion de polarit que l'on peut
estimer par le paramtre de solubilit d'Hildebrand (tableau 7). Ce paramtre d rsulte de la combinaison
de trois principales interactions entre le solut et le solvant
Tableau 7. Classement des solvants selon le paramtre de solubilit d'Hildebrand (G = grand).
SOLVANT

Perfluoroalcanes
6
isooctane
7
n-Pentane
7,1
n-Hexane
7,3
n-Heptane
7,4
Ether dithylique
7,4
Cyclohexane
8,2
Ttrachlorure carb. 8,6
Tolune
8,9
Chloroforme
9,1
Ttrahydrofurane
9,1
Benzne
9,2
Actone
9,4
Propanol
10,2

p
6
7
7,1
7,3
7,4
6,7
8,2
8,6
8,9
8,1
7,6
9,2
6,8
7,2

o
0
0
0
0
0
2
0
0
0
3
4
0
5
2,5

a
1
0
0
0
0
2
0
0,5
0,5
0,5
3
0,5
2,5
4

d
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
4

SOLVANT
Pyridine
Ethanol
Actonitrile
Acide actique
Dimthylsulfox.
Mthanol
Ethanolamine
Ethylne glycol
Formamide
Eau

10,4
11,2
11,8
12,4
12,8
12,9
13,5
14,7
17,9
21

9
6,8
6,5
7
8,4
6,2
8,5
8
8,3
6,3

4
4
8

5 0
5 5
2,5 0

7,5
5
G
G
G
G

5
7,5
G
G
G
G

0
7,5
G
G
G
G

- interactions de dispersion (forces de London) mesures par p. Les solvants avec des p leves
donneront des interactions fortes avec des drivs polarisables (composs armatiques, composs
halogns ou soufrs de masse molaire leve).
- interactions diples-diples mesures par . Les solvants avec des leves donneront des interactions
fortes avec des soluts fort moment dipolaire (nitriles, sulfoxydes, amides, drivs nitrs).
- interactions hydrogne rsultant soit d'un pouvoir accepteur de proton mesur par p soit d'un pouvoir
donneur mesur par a . Les solvants de a lev donneront des liaisons hydrogne avec des soluts
donneurs (phnols, acides carboxyliques etc...) et les solvants de p lev avec les soluts accepteurs
(amines, sulfoxydes etc...).
Chacun des 4 paramtres (a , p, o, d,) pris isolment ne peut rendre compte de la polarit de tel ou tel
solvant envers un solut donn: c'est la combinaison () qui permet d'apprcier le mieux cette proprit.
On commence en gnral par choisir un solvant de telle sorte que les facteurs de capacit des divers
soluts soient compris entre 1,5 et 10. En CLL classique (phase stationnaire polaire) la force d'un solvant
augmente avec sa polarit et il suffit de diminuer d pour que les facteurs de capacit diminuent. C'est
l'inverse en CLL polarit de phase inverse.
Les couples phases stationnaire-phase mobile les plus employs en chromatographie liquide-liquide sont
indiqus dans le tableau 8.

page 46

r Jean-Louis CUQ -

Tableau 8. Quelques systmes utiliss en CLL

phases stationnaires

phases mobiles

Chromatographie liquide classique

'propionitrile
carbowax
trithylne glycol
thylne glycol
dimthylsulfoxyde
thylne diamine
eau
polyamide

pentane, hexane, isooctane

idem + 20 % de chloroforme, THF
actonitrile
ther di n-butylique
isooctane
hexane
n-butanol
hexane/mthanol

Chromatographie liquide polarit de phases inverse

cyanothylsilicone
dimthylpolysiloxane
heptane
polymre hydrocarbon
squalane

mthanol/eau
actonitrile/eau
mthanol/eau
mthanol/eau
actonitrile/eau

VI.3. LA CHROMATOGRAPHIE D'ECHANGE D'IONS

La phase stationnaire est un support insoluble contenant des groupements chargs. Ceux d'un certain signe
sont fixes car lis chimiquement, les autres de signe oppos sont mobiles. Ces derniers peuvent tre
changs rversiblement avec d'autres ions de mme charge sans aucun changement de la partie insoluble.
Les groupes ioniques fixes dterminent le type et la force de l'changeur. Le nombre et l'accessibilit
dterminent la capacit.
Pour des composs monovalents (ion du solut et contre-ion) le processus d'change peut tre simplement
dcrit par les quilibres suivants :
B+ Y- + X-

change d'anions
avec

+ -

K XY =

change de cations

KXY
currentpoint
currentpoint
B+ X- + Y-

B Y X

B X

+ -

A- M+ + NH+

on tire [ B+X-] que lon porte dans DX

KNM
currentpoint
currentpoint
A- NH+ + M+

KXY et KNM sont les constantes d'quilibre de la raction d'change. X- et NH+ sont les soluts
Y- et M+ sont les contre-ions. B+ et A- sont les groupements ioniss fixs sur la phase stationnaire.
Ka
currentpoint
Pour des acides on a
XH
currentpoint
H+ + X-

page 47

r Jean-Louis CUQ -

avec

H X
XH

Ka =

on tire [XH] que lon porte dans DX

currentpoint
currentpoint
N + H+
NH+

et pour les bases

Le coefficient de distribution D (rapport des concentrations du solut charg dans la phase stationnaire
sur la somme des concentrations du solut charg et non charg dans la phase mobile) sera gal :
change d'anions
+ -

DX =

B X
-

X + XH

change de cations
+ -

= K XY .

B Y
Y

+ -

DN =

1+

H
Ka

+ -

NH A

N + NH

= K NM .

MA
M

.
1+

1
Ka
H

D est proportionnel la constante d'qulibre de l'change (KXY, KNM) et au nombre de groupes ioniss de
la matrice ([B+Y-], [A-M+].
D est inversement proportionnel la concentration en contre-ion ([Y-], [M+]) dans la phase mobile.
D est fonction du pH et du pKa.
Le mcanisme d'lution est schmatis sur la figure 20.
-

--

-+

+
+

Echangeur d'anions
et contre-ions interchangeables

Echangeurs de cations
et contre-ions interchangeables

Figure 20 . Chromatographie d'change d'ions. Types d'changeurs et mcanisme de l'lution.

1. l'changeur d'ions est en quilibre aves les contre-ions (O). Les ions changer et sparer
pntrent dans l'changeur
2. les contre-ions ont t changs avec les ions sparer
3. on applique un gradient d'lution
4. la dsorption d'1 des constituants intervient
, il est lu
5. les ions restants sont changs et lus
6. l'changeur est rgnr.

page 48

r Jean-Louis CUQ -

VI.3.1. Principaux types de groupements fonctionnels

Les groupements les plus utiliss sont de type sulfonate (- SO3-), phosphonate
(- PO2-3) et carboxylate (- COO-) pour les changeurs de cations et de type ammonium quaternaire (- N+
R3), tertiaire (- N+HR2) ou secondaire (- N+H2R).
Les groupements de type sulfonate ou ammonium quaternaire sont des changeurs d'ions forts, les autres
des changeurs faibles. Ainsi la fraction charge d'changeurs de type sulfonate ou ammonium quaternaire
n'est pas influence dans une zone large de pH (figure 21) tandis que les changeurs faibles prsentent des
variations importantes de leurs ionisations entre pH 4 et 8.
fraction molaire
charge

A
0

pH
Figure 21. Variation de la charge de groupements fonctionnels utiliss en chromatographie
d'change ionique en fonction du pH
0

14

A changeur de cations fort B changeur de cations faible

C changeur d'anions faible

D changeur d'anions fort

Certains groupements possdent des proprits complexantes vis--vis de certains cations mtalliques
(phosphonate, aminodiactate).

VI.3.2. Principaux types de matrice

Il existe des matrices de type organique (polystyrne, mtacrylate, dextrane) cellulosique ou silice.
Les rsines de type polystyrne (BARNES N., Internat. Lab., oct 1993, 16, P4-P8) rsultent de la
polymrisation de vinylbenzne avec comme agent de pontage du divinylbenzne (4 8 %). Ces matrices
sont synthtises dans une phase apolaire solvante des monomres disperse sous forme dmulsion dont
la taille des particules disperses est parfaitement contrle.
A

CH CH2

CH

CH2

CH

CH2

CH CH2

CH CH2

n
CH CH2

CH CH2
styrne ou
vinylbenzne

CH

CH2

CH

CH2

CH CH2

CH CH2
divinylbenzne

Structure dune matrice de phase stationnaire de type polystyrne.

A = groupement fonctionnel ionisable (souvent SO3H).

page 49

r Jean-Louis CUQ -

Les matrices dont le support est la silice ont par exemple les structures suivantes :
Si
SI
Si

Si

OH CH
3
O Si CH2 CH2
CH 3
OH

SO3 H

OH

SI
Si

CH3

(CH2 )3 O CH2 CH CH2

NH 2
OH

Il existe des changeurs dions bras mobiles (J.Chromatogr., 1988, 443, 73-83) qui permettent une
sparation non dnaturante de macromolcules (protines, acides nucliques, particules virales etc) et qui
confrent la phase stationnaire une proprit exclusive dchangeur dions, les interactions hydrophobes,
hydrogne, - tant pratiquement ngligeables.
Les interactions entre une protine globulaire et cette phase ou une phase classique sont schmatises
sur la figure 22.

phase stationnaire
classique

protine
globulaire
pH > pHi

phase stationnaire bras

mobiles

figure 22 . Effets dune changeur danions classique et tentaculaire sur la conformation

dune protine globulaire .
Ces phases stationaires sont obtenues en utilisant des supports sphriques de silice ou polymriques
comportant de trs larges pores et de diamtre voisin de 5 m, particules la surface inactive. Les
changeurs danions de type dimthylaminothyle, faiblement basiques, ou les changeurs de cations de
type carboxyle ou sulfonate ont t lis au support par lintermdiaire de polymres linaires greffs. La
configuration flexible des groupes dchangeurs contribue alors diminuer le trajet et donc la diffusion du
solut mais aussi datteindre plus de groupements acides sur la molcule protique ou dacide nuclique ce
qui contribue augmenter la slectivit.
Un exemple de chromatogramme de protines sur changeurs de cations et danions bras mobiles ou
classique est schmatis sur la figure 24 .

page 50

r Jean-Louis CUQ -

B
C

30

60

absorbance 280 nm

absorbance 280 nm

B
A

60

D
C

30
temps de rtention (minutes)

60

absorbance 280 nm

absorbance 280 nm

30

30
temps de rtention (minutes)

60

figure 24 . Sparations de protines par change de cations.

A = chymotrypsinogne A, B = cytochrome C, C = lysozyme.

1 : changeur bras mobiles sur une phase de type gel porteuse de groupements carboxyles (colonne de 15
cm x 0,5 cm).
2 : changeur sulfon tentaculaire dp = 5 m, colonne de 5 cm x 0,5 cm, lution par gradient
(dihydrognophosphate de sodium 20 mM pH 6 avec Na Cl de 0 1 M en 60 min).
3 : changeur traditionnel de type TSK-CM. Pour 1 et 2 lution par gradient (tampon actate pH 5; 10 mM
avec Na Cl de 0 1 M en 100 min, dbit 1ml.min-1.
4 : sparation de conalbumine (D), ovalbumine (E), -lactoglobuline A ( F) et -lactoglobuline B (G) sur
changeur danions TMAE, colonne de 15 cm x 1 cm, lution par gradient (piprazine 20 mM pH 6 et Na
Cl de 0 O,3 M entre 10 et 45 min), dbit 1,2 ml.min-1.
VI.3.3. Influence du pH de la phase mobile
Il s'agit du paramtre principal de rtention .
Ainsi pour un acide
faible, une augmentation de pH se traduit
currentpoint
AH
currentpoint
A- + H+
par un dplacement de l'quilibre vers la gauche, l'acide AH tant peu (ou pas) retenu.
Avec les acides amins, on utilise une colonne changeuse de cations (polystyrne sulfon). On se place
initialement dans des conditions de pH (
2) pour lesquelles tous les acides amins sont sous la forme
+ NH3 - CH - COOH
R
Si on injecte sur la colonne des solutions tampon de pH croissant, les acides amins seront lus en
fonction de leur pHi. En effet, quand le pH de la phase mobile est gal au pHi l'acide amin se trouve sous
forme de switterion non charg, donc non retenu.
+ NH3 -CH - COOR
Avec les composs polyhydroxyls (oses, diholosides etc...) on ralise un complexe avec l'acide borique,
complexe charg ngativement.

page 51

r Jean-Louis CUQ -

H3BO3 +

C OH

OH

C H

C H

+
+ H
+ 3 H 2O

Ces complexes peuvent tre spars sur rsines changeuses d'anions (tampon borate avec gradient de pH
de 7 10).
VI.3.4. Influence du type et de la concentration en contre-ion

La constante d'quilibre de l'change reflte l'affinit du solut ionique ou du contre-ion pour l'changeur.
En gnral les changeurs d'ions ont une grande affinit pour :
- les ions possdant une forte charge
- les ions avec un petit volume d'hydratation.
Il est possible de classer les ions en fonctions de leur affinit pour l'changeur, donc de leur "force
d'lution".
Ainsi avec un changeur d'anions du type ammonium quaternaire on a :
citrate > ClO4- > SO24 > oxalate > I- > NO3- > Br- > SCN- > Cl- > formiate > actate >OH- > FAvec les rsines changeuses de cations de type sulfonate on a :
Ce3+ > Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Ca2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mn2+ > Ti+ > Ag+ > Cs+ > Rb+
> K+ > NH4+ > Na+ > H+ > Li+.
Quand le solut et le contre ion sont compltement chargs, la pente de la droite log D(N ou X) en fonction
de la concentration en contre-ion est en gnral gale a/b, avec a valence du solut, b valence du contre
ion.
Quand la concentration en contre-ion augmente (X-)
B+ Y- + X-

currentpoint
currentpoint
B+ X- + Y-

on dplace l'quilibre vers la droite.

VI.3.5. Effet de la temprature et de solvants organiques

Si on augmente la temprature de la colonne, la rtention du solut diminue. De plus la viscosit de la

phase mobile diminue ce qui permet d'augmenter le dbit.
L'addition de solvants organiques la phase aqueuse mobile affecte la rtention. En effet, les effets
secondaires de la matrice (adsorption hydrophobe dans le cas de polystyrne et permation) jouent un rle
prpondrant dans la distribution des ions et plus particulirement des ions organiques.

page 52

r Jean-Louis CUQ -

VI.3.6. Analyse par chromatographie dchange dion avec suppresseur de phase

(SAARI-NORDHAUS R., ANDERSON J.M., Intern. Lab., 1994, 18, P4)

Cette mthode est utilise pour supprimer la conductance apporte par lluant sous forme de contre-ion.
Les phases suppresseurs sont des matrices de type polystyrne et sont souvent prsentes sous forme de
fibres creuses.
Ces phases permettent le dosage danions avec une rsolution remarquable.
NaOH

F- Cl-

siemens

SO4 --

NaF ; NaCl , Na 2SO 4

dans Na OH
analyse en sortie
temps
got
H+
0,5

F-

temps

NaX

O2

H+

H2 O

SO4 --

HF , HCl , H2 SO4
dans H 2O

fibre creuse

anode

Cl-

H+ + X-

NaOH
Na+

HX

cathode

H2
OHH2 O

dtecteur

Cette mthode est utilisable pour analyser des anions ou des cations .

VI.4. LA CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION

VI.4.1. Principe

La chromatographie d'exclusion, ou gel filtration ou gel permation est fonde sur la rtention des
molcules de solut en fonction de leur taille en raison de leur pntration dans les pores, remplis de
solvant, d'une phase stationnaire approprie. Si on suppose que les molcules de solut ne prsentent
aucune affinit pour les parois de la phase stationnaire particulaire, les grosses molcules ne pourront pas
pntrer dans les pores ; elles migreront plus rapidement que les petites molcules qui peuvent, quant
elles, pntrer dans un plus grand nombre de pores (figure 25

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molcules de solut

Figure 25. Chromatographie d'exclusion. Schma de "trajet " d'un solut de masse molaire leve (S) et
d'un solut de masse molaire faible (s).
Les grosses molcules sont lus par un volume Vo de solvant qui correspond au volume entre les "grains"
de la phases stationaire. Les petites molcules pntrent dans le rseau du gel et sont lues par un volume
Vt gal au volume total de solvant contenu dans la colonne.
La sparation est donc fonde ici, non sur des interactions physicochimiques avec la phase stationnaire,
mais sur la dimension des molcules en solution. Le volume de rtention VR des molcules X est gal :
VR = Vo + K . F. Vi

Vo = volume total de la phase mobile ou volume mort , Vi = Vt - Vo - Vmatrice du gel

Vi = volume total de la phase stationnaire
F est la fraction du volume poreux de la phase stationnaire accessible aux molcules X.
F est compris entre 0 et 1.
K coefficient de distribution des molcules X K = Cs / C M, Cs et CM tant les concentrations respectives
de X dans la phase stationnaire et dans la phase mobile.
Les reprsentations de Vo, Vt et Vt - Vo sont schmatises sur la figure 26.

Vo

Vt-Vo

Vt

Figure 26. Diagramme reprsentatif de Vt et Vo

En chromatographie d'exclusion pure K est gal 1 et on a :

VR = Vo + F. Vi

Il y a 2 cas limites importants :

1) F = O. Les molcules sont totalement exclues de la phase stationnaire et on a VR = Vo. Toutes ces
molcules mergent ensemble de la colonne aprs le passage d'un volume de phase mobile gal au volume
interstitiel de la colonne.

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2) F = 1. Tous les pores de la phases stationnaire sont accessibles aux molcules considres et on a VR =
Vo + Vi.

Entre les deux limites, VR varie linairement en fonction de la fraction du volume poreux accessible.
Ainsi, chaque valeur de VR correspond thoriquement une taille de molcule elle-mme porportionnelle
la masse molaire (figure 27).

log (masse
molaire)

F = 0 (exclusion totale)
permation slective
F = 1 (permeation totale)

VR
Vo+Vi
Vo
Figure 27 : Relation entre la taille ou la masse molaire et le volume de rtention.
0

Si VR > Vt cela implique K > 1 : il se superpose alors un autre mcanisme de rtention (adsorption change d'ions). Quand K = 1, les isothermes sont des droites et les pics sont des courbes de Gauss
parfaites. Tous les constituants du mlange chromatographi sont lus dans un volume infrieur Vt.
VR = Vo + F V
VR - V0
F=
Vi
avec V = V - V - V
i

En pratique on remplace Vi par Vt - Vo ; on obtient alors :

K av =

matrice du gel

VR - V0
Vt - V0

Kav est la fraction du volume du gel stationnaire o diffuse une molcule donne.
Pour des composs de densit et de forme molculaire identiques, il existe une relation sigmodale entre
les valeurs de leur Kav et le logarithme de leur masse molaire. Ces courbes prsentent dans une partie
importante, une relation linaire entre Kav et log MM (figure 28); cette relation est du type :
Kav = A log (.M) + B

A et B sont des constantes, viscosit intrinsque (ml.g-1)

Kav
1

0,5

Log (poids molculaire)

Figure 28. Variation du Kav en fonction du logarithme de la masse molaire

A gel "grande" taille" de pores, faible rticulation B gel "moyenne" taille de pores, rticulation plus leve.

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Un exemple de courbe de calibration pour la chromatographie d'exclusion est donn sur la figure 29.

log MM
3

rythromycine
rserpine
palmitate de
vitamine A

actate de cholestrol
prednisone

2,5

probecenid

aspirine

propylparaben
mthylparaben

acide salicylique

2
0

10

VR (ml)

Figure 29. Courbe d'talonnage pour la chromatographie d'exclusion Colonne Styragel 100 A, 30 cm x 0,7
cm ; solvant THF 2 ml / min-1.
VI.4.2. Diffrents types de gel existent actuellement

On distingue les gels mous, semi-rigides et rigides. Seul ce dernier peut tre utilis avec des vitesses de
phase mobile leves (FPLC par ex.).
Certains gels sont rendus apolaires par modification des fonctions hydroxyliques. L'alcoylation des
polymres de dextrane conduit des gels stables en prsence de solvants organiques ce qui permet le
fractionnement des substances insolubles dans l'eau (LH). Ces gels sont vendus sous forme de grains secs
et doivent tre mis gonfler avant utilisation dans une colonne dans la phase mobile approprie en doivent
tre dgazs avant utilisation pour chasser les bulles dair qui pourraient rester prisonnires de la matrice.

a) Gels mous :
Ce sont des polymres faible taux de pontage pour lesquels le gonflement est important. Il s'agit le plus
souvent de dextrane rendu insoluble dans l'eau par raction l'pichlorhydrine (figure 30).
currentpoint
O

CH2

OH

OH

OH

CH 2

OH

H
OH

CH2

CH2
OH

H
O
H

CH2
H C OH
CH2
OH

H
OH

OH

OH

OH

OH

CH2

H
CH2

CH 2

H C

OH
OH

CH2

agent de pontage

CH CH 2 Cl
pichlorhydrine

CH 2

OH

H
O
H

OH

OH

Figure 30. Structure partielle dun gel de dextrane.

currentpoint

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r Jean-Louis CUQ -

La rsistance mcanique augmente avec le taux de rticulation tandis que le diamtre des pores diminue. Il
existe des gels dont le polymre est du polyacrylamide et des gels mixtes composs d'acrylamide et de
dextranes. L'agent de pontage est le N-N'-mthylne bisacrylamide (figure 31).
currentpoint

O
CH2

CH2 NH
O
NH
C
O C
CH CH2
CH
CH2

H
CH2

OH

CH
C

OH O
H
OH

NH

O
CH2
H

CH2 NH
C
O

OH O
H

OH
CH

CH2

CH2

CH2

CH CH2
OH
OH
O

H
OH
O

CH2

O
O

H
OH
O

CH2
H
OH

OH
H

O
H
OH

H
O

OH
OH

CH2

H O

O
CH

CH2

H
OH
O

H
CH2
O

currentpoint

Figure 31. Gel mixte dextrane-acrylamide

b) Gels semi-rigides
- Gels de polystyrne. Ce type de gel possde des proprits remarquables et ne gonfle pratiquement pas. Il
peut tre utilis dans la plupart des solvants sauf : l'eau, les alcools, l'actone, l'acide formique. Il est
utilisable en haute pression.
- Gel d'actate de polyvinyle.
- Gels mixtes (dextrane-acrylamide) taux de rticulation lev. Plus le taux de rticulation augmente et
plus la rsistance aux contraintes mcaniques augmentent : ces gels supportent des P relativement
leves.

c) Gels rigides
Ils sont constitus par des silices poreuses ou des verres poreux. Les colonnes HPLC du type TSK
correspondent des phases stationnaires de ce type (poreuses, mais rsistantes aux dformations
mcaniques et donc utilisables sous des dbits et pression levs).
Un chromatogramme de protines solubles de haricot est indiqu sur la figure 32. Ce type de
chromatographie (associ ou non des phnomnes dchanges dions) est qualifi de FPLC (Fast Protein
Liquid Chromatography).
absorbance 206 nm

0,5

10

20

t R (minutes)

figure 32 . FPL Chromatogramme par exclusion des protines de pois

page 57

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VI.4.3 Principales applications de ce type de chromatographie :

a) La sparation de groupes de molcules de masses molaires trs diffrentes

Le gel est choisi pour que les plus grosses molcules aient un Kav voisin de 1
- dessalage : les protines et les polypeptides peuvent tre dessals ou spars de substances de faibles
masses molaires avant concentration.
- extraction du phnol dans la prparation d'acides nucliques.
- interruption de ractions entre macromolcules et ractifs de faible masse molaire.
- extraction de produits, cofacteurs ou inhibiteurs d'enzymes

b) Dtermination de la masse molaire

c) Dtermination des constantes d'quilibre
Pour le dessalage ou la sparation de protines / petites molcules, la comparaison de diverses mthodes
est indique dans le tableau 9.
Tableau 9. Comparaison de mthodes de sparation protines / petites molcules
Critre

Filtration sur gel

Dialyse conventionnelle
en sacs de cellulose

Mthode
des fibres creuses

Simplicit

Facile

Facile

Facile

Efficacit du
dessalage

Approche habituellement 100 %

Peut atteindre 100 %

si le procd est
conduit son terme

Environ 95 %

Scurit

Absolument sr

Sacs de dialyse
susceptibles de se
fissurer ou de casser

Les fibres peuvent

fuir ou se casser

Cot

Faible

Faible

Cher

Dure

100 % de dessalage
obtenu en 15 minutes

Trs longue, le procd

peut prendre
plusieurs jours

95 % de dessalage
en 20 minutes au
mieux

Rendement des
protines

Habituellement proche
de 100 %

Adsorption gnante
pour de faibles
concentrations

Peut atteindre 70
% au moins pour
de faibles
concentrations

Rcupration des
petites molcules

Habituellement proche
de 100 %

Habituellement
impossible

Habituellement
impossible

Dilution

Dpend du volume et
de la concentration de
l'chantillon

Faible

Faible

Dure d'utilisation

Habituellement 1.000
utilisations au
minimum. Les colonnes
peuvent tre
frquemment tre utilises
1 2 ans sans qu'il soit
ncessaire de les refaire.

Une seule utilisation

Jusqu' 50
utilisations
mois.

ou 4

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VI.5. LA CHROMATOGRAPHIE CHIRALE

(ARMSTRONG D.W., Current issues in HPLC Technology, LC.GC International, april 1998, 22-31).
Cest W. PIRKLE (PIRKLE W.H. and HYUN M.H., J. Chromatography, 1985, 322, 309) qui est un des
principaux initiateurs des ces mthodes analytiques.
Traditionnellement cest la sparation des nantiomres qui est considre comme le problme le plus
difficile rsoudre en chromatographie. Avant 1980 aucune solution ntait disponible. Entre 1980 et
1990 de nombreuses mthodes ont t mises au point pour atteindre de tels objectifs.
Ce sont surtout les sparations des acides amins D et L qui ont suscit le plus de travaux. DAVANKOV
et al. (Advances in Chromatpgraphy, Giddings et al. Eds, M. Dekker, New York, 1983, vol 22, p 71) ont
ainsi propos une phase stationnaire avec de la L-proline greffe. En prsence de Cu2+ dans la phase
mobile, les interactions qui stablissent varient en fonction de lnantiomre.Il en est de mme avec des
phases stationnaires silice greffe C8 en prsence de compos amphipolaire C asymtrique.
O
N
O-

Cu2+
O-

Si O CH3
Si

NH 2
C

Si O

(CH2)7
(CH2)17

CH3

CH3
H

CH3

(CH2)7

NH

COO_

1/2 Cu++

Un exemple de sparation de D et L tyrosine et de D et L tryptophane est prsent ci-dessous.

TYR
= 1,34

TRP
=1,11

20

40 temps d'lution (min)

La phase mobile est constitue dun mlange

eau/mthanol (85/15) contenant 2 mM de
CuSO4. Le dbit est de 1 ml/ min. La colonne de
15 x 0,4 cm est remplie de particules de 5 m de
diamtre. La dtection est ralise 254 nm.

En dehors de cette mthode de sparation par change de ligand, des phases stationnaires chirales ont t
dveloppes comme par exemple les phases polythers (formule indique ci-dessous) ou encore les phases
qui contiennent des molcules complexes comme certains antibiotiques glycopeptidiques (ticoplanine par
exemple). Elles permettent entre autre la sparation des D et L acides amins.
O
O

O
O
O

H
N+

O-

C
H

H O

R
acide amin

ther chiral en couronne

page 59

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LIPKOWITZ K.B. (Intern. Lab., 1993, 15, 8-12) a propos une modlisation molculaire en
chromatographie chirale qui aboutit :
k = A + i bi. k avec A = constante, bi moindre carr des coefficients de rgression multiple.
Dans cette quation tous les changes phase stationnaire - analyte sont pris en considration. Selon les
conformation relatives des deux structures, la somme de ces changes sera variable en fonction des
possibilits striques dtablissement de liaisons et k sera diffrent selon la structure spatiale des analytes.
Avec des phases comportant des carbones asymtriques, il sera alors possible de sparer des analytes qui
sont des diastroisomres.
currentpoint
H

phase
chirale

C O
O

C
H

C
N

currentpoint

Les changes sont qualifis par PIRKLE de :

donneur dlectron : analyse de sulfoxydes, lactames etc
accepteur dlectron : analyse damines, alcools, acides amins thiols etc.
Le schma danalyse des composs isomres est le suivant :
isomres
stroisomres (conformation)

constitution

gomtriques

nantiomres
(diastroismres)

complexe avec un
phase stationnaire
phase stationnaire
driv chiral
achirale
chirale
Il existe une classification des phases chirales base sur les mcanismes impliqus dans la sparation des
nantiomres qui est la suivante :

type
1
2
3
4
5

description
Pirkle
polymres
hlicodaux
cavit

chimie
slecteurs chiraux varis
liaisons ioniques
celluloses et
drivs

mcanisme
liaisons H
interactions -
diple - diple
liaisons H
complexes d'inclusion

cyclodextrines
polymtacrylates
polyacrylamides

complexes
d'inclusion

SAH , SAB
glycoprotine

interactions multiples
hydrophobes

change de ligand
protines

page 60

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VI.5. LA CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE

C'est en 1910 qua t observe l'adsorption slective de l'amylase sur un amidon insoluble.
Cette technique, encore qualifie de bio-chromatographie ou encore de bio-reconnaissance, permet de
purifier presque toutes les molcules biologiques selon leur fonction ou leur structure chimique
individuelle. Il s'agit d'une chromatographie d'adsorption dans laquelle la molcule purifier est adsorbe
spcifiquement de faon rversible sur un ligand immobilis sur la phase stationnaire. Le facteur de
purification est trs lev car lnergie change est trs leve et rsulte de ltablissement de nombreuses
liaisons souvent de nature diffrente et coopratives.
De nombreuses sparations ont pu tre accomplies en une seule tape.
Elle est utilise pour :
- purifier des produits prsents dans ses mlanges biologiques
- purifier la forme active d'un produit de son driv inactif
- sparer des traces de molcules biologiques de grandes quantits d'impurets.
VI.5.1. Principe

Un ligant biospcifique est fix par liaison covalente une matrice (dextrane, agarose) sans perdre son
affinit pour le produit purifier.

Li

P
K=

A
Li
P
KD

A Li

Li-P
Li P

agent de pontage
ligand
produit purifier
constante de dissociation

Tout compos peut servir de ligand pour purifier les produits qui sont mme de se fixer sur lui :
enzyme

analogue de substrat, inhibiteur, cofacteur

anticorps

antigne, virus, bactrie, cellule

lectine

polyoside, glycoprotine, rcepteur de surface cellulaire

acide nuclique

squence complmentaire de bases, histone, acide nuclique, polymrase

hormone, vitamine :

rcepteur, protine porteuse

cellule

protine de surface.

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VI.5.2. Couplage et ligand

Il existe plusieurs mthodes de couplage. La plus utilise fait appel la carbodiimide

O
COOH

+ R1 N C N R2

NHR1

Li

O
C

O C

NH

Li

NR2

carbodiimide

matrice

NH2

Li = ligand

Il est possible de fixer sur la matrice des thiols (type glutathion -2-pyridyl disulfure)

R' SH

fixation

+ SH R

lution

R'

+ R SH

RSH peut tre une protine, un peptide etc.

Par cette mthode chromatographique, on peut par exemple purifier les immunoglobulines en utilisant la
protine A comme ligand.
Quelques enzymes et protines possdent une affinit pour un colorant bleu (bleu Cibacron F3GA) et
plus particulirement les kinases, les dshydrognases et les enzymes contenant des groupements adnyl
(620 sur 2000 enzymes).
O

NH2
SO2ONa

R1 = H ou SO2 ONa

R1
R2

R2 = SO2 ONa ou H

NH
O

NH

N
NH
SO 2ONa

N
N

matrice

Dans ce type de chromatographie, il y a reconnaissance et interactions souvent multiples (hydrogne,

hydrophobe, ionique, transferts de charge - ) entre deux molcules : le solut et la phase stationnaire.
Des essais de prparation de phase stationnaire par empreinte molculaire sont souvent couronns de
succs. Pour ce faire, la molcule sparer est complexe avec des monomres ractifs et le complexe
molcule-monomres est plac dans un milieu contenant un polymre que lon rticule alors. On
dbarrasse ensuite le polymre phase stationnaire de la molcule empreinte. Les monomres sont souvent
des composs vinyliques ou acryliques, des styrnes ou des silices tandis que lacrylate dimthylique de
lthylne glycol constitue la phase rticulante. Cette mthode permet par exemple la sparation des
racmiques dacides amins.

page 62

r Jean-Louis CUQ -

+ COO

CH2
H
COOH

CH

polymre

CH2
CH2

+ polymre

NH3+

H
COOH

D-phnylalanine

NH3+
COO-

empreinte de D-PHE

CH

CH2

extraction de la molcule
de D-PHE

D-PHE
CH2

polymre

H
NH3+

COOH

COO-

CH

CH2

CH2
H
NH3+

L-PHE

COO-

VII. EQUIPEMENTS UTILISES EN CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

Le schma gnral dun systme chromatographique en phase liquide est indiqu sur la figure 33. Ce
systme comprend :
- lluant qui peut constituer une phase mobile de composition constante (systme isocratique) ou variable
en fonction du temps (systme gradient )
- le systme de pompage pompe unique (systme isocratique ou gradient basse pression) ou multiple
(amortissement ou sytme gradient haute pression)
- un systme dinjection
- une colonne (thermostate ou non) prcde ou non dune pr-colonne
- ventuellement un racteur post-colonne
- un ou plusieurs dtecteurs avec enregistreur et intgrateur

page 63

r Jean-Louis CUQ -

PHASE
MOBILE

Dgazage par entrainement

l'hlium ou par ultra-sons

solvant : rservoir(s)

filtre 0,45 m
diffrence de
pression
hydrostatique
faible

systme de pompage

isochratique ou gradient
basse ou haute pression

injecteur

drivatisation pr-colonne
dispositif automatique
passeur automatique

pr-colonne
colonne

thermorgulation

phase
stationnaire
drivatisation postcolonne

collecteur
de
fractions

dtecteur(s)
traitement des
donnes

enregistreur
intgrateur

figure 33. Schma dun systme de chromatographie en phase liquide.

Un systme de chromatographie liquide doit satisfaire un certain nombre de contraintes dont deux sont
primordiales :
- l'lution travers des colonnes contenant des phases stationnaires de fine granulomtrie qui ncessite des
pressions leves
-lobtention dune bonne reproductibilit des temps de rtention qui ncessite un dbit de la phase mobile
constant.
VII.1. DISPOSITIFS D'OBTENTION DE GRADIENTS
Les plus anciens sont des rservoirs communicants. Actuellement les plus rpandus sont obtenus par des
systmes grs par microordinateurs et programmation.
Llution peut tre obtenue au moyen de dispositifs permettant de raliser des gradients basse pression de
polarit, de pH, de force ionique, de concentrations en divers composs (dispositifs chambres
communiquantes, figure 34)
7

C/Co

C/Co

1
1

4
3

0,5

Ve / Vt

figure 34 . Schma dun dispositif dlution par gradient chambres communicantes

page 64

r Jean-Louis CUQ -

Dans ces dispositifs, les variations de concentration C (par rapport la concentration initiale Co) dun
compos donn plac dans un des compartiments en fonction du volume lu (pomp) sont indiques sur
la figure 34.
A un volume dlution donn (ou un temps dlution donn) on peut, avec ces systmes, valuer
lachambre dont lincidence est dominante et celles intervenant un degr moindre dans llution. Ainsi,
au dbut de lanalyse cest la composition de la chambre n1 qui est dterminante tandis qu mi-analyse,
ce sont dans lordre les chambres n4, puis n3 et 5 et enfin n3 et 6 qui par leur composition
influenceront le plus llution.
En choisissant judicieusement la composition de ces chambres pour obtenir des variations de pH, force
ionique, concentration en mthanol et en thiodiglycol permettant la sparation (figure 35), il est possible
de raliser en quelques heures ou moins (avec des colonnes de particules de rsines changeuses de cations
de type polystyrne sulfon de 5 15 mm de diamtre et 5 50 cm de longueur, le plus souvent 50C et
avec des dbits de tampons citrates voisins de 1 ml.min-1 ) la sparation complte de tous les acides
amins .
+
Na (M)

pH

mthanol
(%)

pH

thiodiglycol
(%)

1,2

mthanol
10

+
Na

0,5

5
2,5
0,2

ARG

LYS

LEU
NorLEU
TYR
PHE

MET
LEU

SER
GLU
PRO
GLY
ALA
CYS VAL

ASP

THR

CYSSO3H

Ve /Vo 1

HIS

0,5

TRP

figure 32. Variations des paramtres de sparation des acides amins par chromatographie dchange
ionique (gradient).
Le chromatogramme obtenu est schmatis ci-aprs.
cysSO3 H

met O2
met O

asp

thr

ala

glu

met
val

ser
gly

pro

leu
ile

cys

lys

norleu
tyr

his

phe

arg

trp
NH4

temps d'lution

- Llution peut galement tre obtenue par des systmes trois luants (ou plus) dont les
mlanges, grs en fonction du temps par ordinateur, conduisent des gradients dlutions qui permettent

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r Jean-Louis CUQ -

des variations des paramtres de llution tels que le pH, la force ionique, la polarit (valeur de o, nature
des luants etc.) (figure 36 ).
Si le mlange est ralis avant le systme de pompage, le systme est qualifi de systme gradient basse
pression . Une seule pompe suffit alors llution, mais il est ncessaire de bien mlanger les diffrents
luants primaires dans des systmes dont le volume mort peut constituer un handicap.
Si le gradient dlution est ralis par autant de pompes quil y a dluants primaires (au maximum 3
actuellement), le systme est qualifi de gradient haute pression. Les dbits des diffrentes pompes sont
rgls lectroniquement de telle sorte que la somme de leurs dbits respectifs soit gale au dbit dlution
choisi.
A
B
C
A
B
tampons
d'lution

lectrovannes
mlangeur

SYSTEME
HAUTE
PRESSION

pompe

SYSTEME
BASSE
PRESSION

injecteur
boucle
exyterne

colonne
dtecteur

enregistreur

figure 36 . Schma des systmes basse et haute pression danalyse en HPLC

VII.1. LES POMPES
Il existe des pompes pression de gaz, mais les plus utilises sont les pompes lectriques de type seringue
(jusqu 20-50 bars) et surtout les pompes de type piston (figure 34). Cest avec ce dernier type de pompe
que des dbits constants trs faibles (0,1 mL.min-1 ) ou trs grands (plusieurs mL.min-1) sont accessibles
des pressions qui peuvent atteindre environ 500 bars.
Les pistons de ces pompes sont en saphir, en tantale ou en matriau rsistant et inaltrable, les pistons en
acier inoxydable tant relativement sensibles la corrosion. Il faut rappeler ici que les solutions salines
sont particulirement corrosives et quil est bon de rincer lensemble du systme pour viter ces
phnomnes. Par ailleurs si des sels sont prsents dans la ou les phases mobiles, lvaporation de ces
dernires conduit leur cristallisation ce qui est particulirement gnant quand ce phnomne se produit

page 66

r Jean-Louis CUQ -

dans des zones sensibles (cellules de dtection, vannes dinjection, etc) difficilement accessibles au
nettoyage.
sortie
piston
vannes billes
(saphir)

joint torique

partie
motorise

entre

Pompe de type seringue ( 50 500 ml dplacs)

ressort de rappel

came
excentrique

sortie
piston

joints
toriques

vannes
billes

entre
variation de la pression en sortie

Pompe piston unique

sortie

pompe A

pompe B

entre de la phase mobile

variations de P pour la pompe A

variations de P pour la pompe B

variation globale de P

Pompe 2 pistons opposs fonctionnant en opposition de phases

figure 37 . Schma de quelques pompes utilises en chromatographie en phase liquide

Il est important aujourdhui de choisir des pompes pouvant assurer des dbits de lordre de quelques L.
min-1 afin de pouvoir les utiliser avec les nouvelles colonnes (capillaires de moins de 0,5 mm de diamtre
et contenant des particules de phase stationnaire de 1 m de diamtre).

VII.3. LES INJECTEURS

Il faut absolument viter de dissoudre les soluts dans un solvant plus luant que la phase mobile. Il est
souhaitable de dissoudre les soluts dans le liquide vecteur.
Il existe deux types dinjection :
- par seringue
- par vanne (boucle dchantillonnage). Ce type dinjection automatisable ne permet pas datteindre
lefficacit maximale. Il existe des vannes boucles internes et des vannes boucles externes (cF V.1.3.4
figure 6).

page 67

r Jean-Louis CUQ -

Dans lanalyse des acides amins, il faut que la phase solvante de lhydrolysat contenant les acides amins
analyser ait un pH et une force ionique quivalents ceux du tampons dlution au temps 0 pour une
sparation par chromatographie dchange ionique mais aussi possde une polarit gale celle de la
phase mobile au temps 0 de lanalyse dans le cas dune sparation par chromatographie en phase inverse.
VII.4. LA COLONNE (cf chapitre V.1.3.2.)
Les frits limitant la colonne ont des porosits comprises entre 0,5 et 5 m. Linconvnient majeur des
frits de faible porosit est le colmatage qui se traduit par des augmentations importantes de pression.
Lutilisation de particules de 5 m requiert la prsence de frits de 0,5 m.
VII.5. LES PARTICULES SUPPORT DE PHASE STATIONNAIRE
Comme indiqu dans le tableau ci-aprs, la silice reste le matriau de base le plus utilis en HPLC. Ses
caractristiques sont largement dveloppes dans le chapitre VI.1.2.1.
matriau

utilisation
estime (%)

gel de silice

75

polymre organique
polymtacrylates
polystyrne-DVB
polythylne
glycol

20

alumine
autres
graphite, carbone
zirconium
hydroxyapatite

1
4

Le plus utilis des polymres organiques reste le polystyrne rticul avec du divinyl benzne. De
porosits variables, ils sont en gnral stables dans une gamme de pH comprise entre 1 et 14. Leurs
caractristiques principales sont indiques dans le chapitre VI.3.2.
Parmi les polymres commercialiss comme phase stationnaire on peut citer : les polystyrnes divinylbenzne, le polydivinylbenzne, les polymtacrylates, le polybutadine, le polyvinylpyrrolidone, le
polydextrane, la cellulose, le polyhydroxymtacrylate, lthylvinylbenzne, alcools polyvinyliques alkyls,
polyosides, polyhydroxythyl aspartamide, chlorure de polyvinyle, triactate de cellulose, mthylne bis
acrylamide, polythylne glycol, agarose rticul, etc..
Les matrices organiques sont moins utilises que la silice comme support de phase inverse. Nanmoins
elles permettent des sparations chromatographiqes dans des conditions de pH pour lesquelles la silice
nest pas utilisable.
La figure 22 schmatise des rsines de type polystyrne ou silice qui peuvent tre :

page 68

r Jean-Louis CUQ -

micropores

microporeuses

( trs rticules par le DVB ) ; ces rsines

ne gonflent pas , leur slectivit est leve
mais les transferts de masse y sont mauvais
(cintique lente)

macroporeuses

(peu rticules) ; ces rsines ont des

canalicules et une surface interne importante.
Une grosse molcule peut pntrer l'inrieur
(cintique moyenne)

macropores
1 m

pelliculaires

film changeur d'ions

L'paisseur de rsine sur la bille de verre

est de l'ordre de1 m (cintique d'change
trs rapide)

bille de verre :
particule de silice

microsphres
40 m

superficiellement poreuses
La rsine changeuse d'ions est fixe sur des
microsphres de silice , elles-mmes
fixes sur des billes de verre .
L'paisseur de la couche de rsine est
infrieure 1 m

figure 22. Diffrents type de particules de phase stationnaire en chromatographie liquide.

Les rsines pelliculaires ont une capacit d'change de 260 1000 fois plus faible que celle des rsines
poreuses. Par contre leurs HEPT sont environ 10 fois plus faibles.
La taille des pores des particules varie entre 4 et 300 nm. La plupart des colonnes proposes sont replies
de particules pour lesquelles la porosit est denviron 8-12 nm.
Les particules macroporeuses (perfusives) permettent des chromatographie prparatives ncessitant des
dbits levs avec peu de perte de charge. Leur efficacit est en gnral infrieure celle des particules
normales .
Actuellement la tendance est lutilisation de particules dont le diamtre est compris entre 3,5 et 5 m.
Ces supports permettent un bon compromis entre la facilit dusage et loptimisation de lanalyse (temps,
rsolution etc.). Il sagit le plus souvent de partcicules aux dimensions polydisperses. La distribution
gaussienne des diamtres prsente des carts-types relativement faibles comme schmatis sur la figure ciaprs :
nombre de
particules

4
5
6
diamtre en m
Distribution de diamtre de particules de silice avec une valeur moyenne de 5 m

page 69

r Jean-Louis CUQ -

VII.6. LA NATURE DE LA PHASE STATIONNAIRE

(cf chapitre VI.1)

Le gel de silice a t substitu, partir des annes 1975, par des gels greffs et depuis 1984 ce sont les
phases inverses qui dominent les applications de lHPLC. Plus de 95 % des analystes utilisent en HPLC,
au moins de temps en temps, des phases inverses.
Lutilisation relative en 1998 des diffrentes phases disponibles en HPLC est indique dans le tableau ciaprs :

mthode
chromatographique

Utilisateurs
relatifs (%)

phase inverse
50,4
C18
24
C8
15,9
phnyl
7,1
C4
2,3
C1-C2
1,1
phase normale
24,1
cyano
8,9
silice
8,5
amino
4,7
diol
2,0
change d'ions
14
anion
7,4
cation
6,6

mthode
Utilisateurs
chromatographique relatifs (%)
exclusion
6,7
phase aqueuse
non aqueuse
chirale

2,8

interaction
hydrophobe

1,1

affinit

0,6

partage

0,2

autres

0,3

3,5
3,2

Linfluence de la mthode de prparation des particules de silice influence de faon trs significative les
performances de la sparation
Le grains de silice greffs avec des C8 C18 possdent encore des silanols libres qui sont neutraliss
par raction avec du trimthylmonochlorosilane.
La longueur des chanes greffes aliphatiques (phase inverse) influence la stabilit : plus le nombre de CH2
du greffon est lev et plus la stabilit aux pH infrieurs 2 et suprieurs 8 augmente ( C30 > C22 > C18
> C12 > C8 > C6 > C4 > C2 > C1).
Le dopage de la silice par de laluminium qui ragit avec les silanols gminaux conduit une structure
pseudo-zolithique stable jusqu pH 10.

VII.7. LES CONNEXIONS

Les connexions injecteur-colonne-dtecteur constituent un volume mort qui en diluant les soluts dans la
phase mobile entranent une perte d'efficacit non ngligeable.
Pour ne pas perdre plus d'une fraction

1+

de l'efficacit il faut que :

r .l

2
24 . . D M. VR

.N.D

page 70

r Jean-Louis CUQ -

r et l : rayon intrieur et longueur du tube

DM : coefficient de diffusion du solut dans la phase mobile de dbit de l'luant.
Ainsi pour r = 0,2 mm l doit tre infrieur ou gal 320 mm et pour r = 0,5 mm l

8 mm.

Rappelons que la dispersion dans la colonne est gale :

2

tr

et que la largeur la base des pics est gale 4 .

TAYLOR a montr que la dispersion lie aux tubes de liaisons entre linjecteur, la pr-colonne, la colonne
et le dtecteur tait gale :
4
2
dt . l . D
= .
DM
A est une constante, dt le diamtre intrieur des tubes de liaison, l leur longueur, D le dbit de la phase
mobile et DM le coefficient de diffusion du solut dans la phase mobile.
La prsence de cavits ou de volumes morts divers contribue aussi la dispersion.

VII.8. LES DETECTEURS (tableau 10)

Il existe actuellement 3 types principaux de dtection :
- mise en vidence d'une proprit du solut directement ou aprs raction pr ou post-colonne avec un
compos rvlateur (spectrophotomtre UV/visible, fluorimtres),
- mise en vidence d'une modification de l'luant (conductimtre, rfractomtre),
- sparation du solut de l'luant (couplage chromatographie - spectromtrie).

VII.5.1. Critres de choix

Les paramtres les plus importants considrer sont :
1.le bruit donn en units de la mesure du dtecteur.
2.la sensibilit : concentration pour laquelle le rapport signal/bruit est gal 2.
3.la drive exprime en units de la mesure par unit de temps.
4.le domaine de linarit : domaine de concentration de rponse linaire du dtecteur.
5.le volume de la cellule qui peut tre considre comme une chambre de mlange.
6.la possibilit d'utiliser un gradient dlution.
Depuis 1971 lvolution de lemploi des divers dans les laboratoires a beaucoup volu comme le montre
le tableau 10a ci-aprs :

page 71

r Jean-Louis CUQ -

Tableau 10a. Evolution de lutilisation (en %) des dtecteurs en CLS

anne

type de dtecteur
UV-visible

fluor.

fixe var. Baret.

1991
1986
1981
1976
1971

63
69
66
73
61

10
21
25
48
46

43 10
43 5
41 24 15 -

Indice Electro Conduc- Spectro

rfract. chim. -timt. masse

12
10
12
7
1

4
5
9
13
34

7
8
6
3
-

4
3
2
1,5
2

Diffusion

8
1,5
1
0,3
-

4
2
-

Les principales caractristiques des dtecteurs sont indiques dans le tableau 10b.
Tableau 10b. Principaux dtecteurs utiliss en chromatographie liquide.
type

Universalit

Limite de
dtection

Destructeur

Identification
de composs

facilit d
utilisation

Remarques
et cot

Dtecteur UVvisible

+++

0,3 ng/ml

+++++

Le plus utilis
peu coteux

UV-visible
barettes diodes

+++

1 ng/ml

++

+++++

bande passante
assez coteux

5 pg/ ml

+/-

++

++++
ncessite
souvent une

Fluorimtre

drivatisation
Rfractomtre

+++++

0,7 mg/ml

++

Dtecteur
lectrochimique

++++

pg/ml

Dtecteur par
conductivit

slective
d'ions

0,1 ng/ml

++

limit aux ions

Spectromtre
de masse

++++++

ng /ml

+/-

trs cher

Diffusion de
lumire

++++++

1 ng glucose

+++++
+++

++++++
-

peu coteux
cellule lecture
dtecteur
davenir

dtecteur
davenir

VII.5.2. Dtecteurs par absorption UV/visible

C'est le dtecteur le plus utilis. Le faisceau de longueur donde donne traverse une cuve dans laquelle
circule l'effluent. Suivant la loi de BEER l'absorbance est dfinie par :
Io
A = log = . l . c
I
Io
intensit incidente
I
intensit mergeante

coefficient d'extinction molaire du solut

r Jean-Louis CUQ -

page 72

c
concentration
l
longueur du trajet optique
Le bruit est de l'ordre de 10-5 units d'absorbance, le domaine de linarit voisin de 104 et le temps de
rponse est de l'ordre de 0,5 seconde.
Il existe des dtecteurs barettes de diodes (35 100 diodes par barettes, 1 barette rfrence et 1 barette
dosage), diodes sensibles des longueurs d'onde dfinies, en gnral de 2 nm en 2 nm (parfois 10); ces
dtecteurs permettent de raliser des spectres d'absorption en des temps trs courts donc en cours de
chromatographie (BERTOLIN M., Intern. Labor., oct 1991,44-50). Les rsultats sont prsentes sur des
chromatogrammes en trois dimensions.

VII.5.3. Les fluorimtres

l
Certains soluts qui absorbent des photons h . C / ex , peuvent rmettre des photons dnergie h . C /
m
La longueur d'onde d'excitation ex est infrieure celle d'mission.
L'intensit de fluorescence F mise par une solution de concentration C irradie par une radiation
d'intensit Io est donne par :
F = Q K Io (1 - 10-cl)
K est le rendement de collecte de la fluorescence
Q fraction de radiation rmise.
La dtection trs slective et trs sensible ncessite parfois une drivatisation pralable.

VII.5.4 Dtecteur diffusion de lumire

(WYATT P.J., Intern. Labor., 1993 ; STOCKWELL P.B. et KING B.W., 1991)
Le solvant est nbulis par un courant de gaz inerte (azote) et vaporis une temprature infrieure ou
gale 180C. Le solut dont la tension de valeur est suprieure celle de lluant reste ltat de
brouillard et est amen par le gaz vecteur jusqu la chambre de dtection. La quantit de lumire diffuse
mesure par un photomultiplicateur plac 120 par rapport la lumire incidente est proportionnelle la
masse lue.
Il sagit dun excellent moyen de dtection quand la masse molculaire est suprieure 200 Da.

VII.5.5. Dtecteurs lectrochimiques

Un potentiostat impose l'lectrode de travail un potentiel fixe par rapport celui de l'lectrode de
rfrence tel que le solut dtecter soit oxyd ou rduit. Au cours du passage du solut dans la cellule, un
courant d'lectrode proportionnel sa concentration circule entre l'lectrode de travail et sa contre
lectrode.

VII.5.6. Dtecteurs rfractomtriques

On mesure en continu la diffrence d'indice de rfraction entre le solvant pur et l'effluent de la colonne.
Ces dtecteurs surtout utiliss pour les glucides sont de loin les moins sensibles. Il faut veiller ce que leur
cellule de mesure soit rince leau ou avec un solvant organique comme le mthanol aprs chaque srie
de mesures car si la phase mobile contient des sels, ceux-ci risquent de cristalliser dans le systme et leut
solubilisation est extrmement difficile.

r Jean-Louis CUQ -

page 73

VII.5.7. Couplage chromatographie liquide / spectromtrie de masse

Le couplage CL- SM permet dobtenir un systme analytique trs performant. Par chromatographie liquide
il est possible de sparer nimporte quelles molcules en choisissant judicieusement le systme et les
composs spars peuvent tre injects dans un spectromtre de masse qui donne des informations
immdiatres sur la masse molaire et la structure .

a) Principe
Le compos analyser est dabord vaporis basse pression. Ce transfert en phase gazeuse empche les
molcules de lchantillon de ragir avec les autres et facilite lionisation qui est ltape analytique
suivante. Le spectromtre dtermine la masse molculaire des composs en mesurant leurs rapports masse
/ charge ( m / z ). Lionisation de la molcule gnre des formes charges du compos qui sont diriges
vers une srie de champs magntiques ou lectrostatiques. Plusieurs mthodes ont t dveloppes pour
ioniser le compos spar par chromatographie liquide .
b) Mthodes dionisation
Lionisation des molcules peut tre obtenue par un faisceau dlectrons dirig dans la phase gazeuse.
Lnergie cintique de ces lectrons permet de rompre des liaisons covalentes intramolculaires. Les
fragments obtenus donnent des informations permettant de structurer la molcule. Un des dsavantages
de cette ionisation est que de nombreuses molcules ont des liaisons covalentes de faible nergie qui sont
rompues sans donner dions dtectables correspondants, ce qui empche alors de dtermijner la masse
molculaire.
Lionisation chimique est employe pour minimiser la fragmentation tout en produisant lion dtectable .
Le produit est ionis par transfert de proton partir de gaz (mthane) ionis par des lectrons acclrs , ce
gaz tant inject automatiquement linterface .
c) Linterface chromatographie liquide / spectromtrie de masse
Elle permet de transformer le liquide correspondant la phase mobile en un gaz dans un milieu pression
trs faible. De nombreuses interfaces ont t imagines (ceinture mobile, thermovaporisateur, injecteur
direct de liquide, transport par un faisceau de particules, bombardement atomique rapide et continu etc.).
Dans un thermovaporisateur la phase mobile contenant le solut analyser est chauffe dans le liquide
vaporisateur et ensuite vaporise dans la zone sous vide; il se forme un fin brouillard. Si la phase mobile
contient des ions NH4+, actate) , quelques microgouttes peuvent porter des charges. Sous vide solvant
svapore rapidement et les molcules de solut sont dsolvates et associes la charge. Le rsultat est
une molcule charge isole de la phase mobile.
Pour des soluts non ioniss le systme de vaporisation est associ un filament source dlectrons qui
dcharge des ions pour faciliter la formation dions ou encore une lectrode de fragmentation qui gnre
des fragments en augmentant la vitesse des collisions intermolculaires.
d) Diffrents types danalyseurs de masse
Ainsi ionises, les molcules sont diriges vers des zones champs lectrique et magntique. Il existe ce
niveau quatre types danalyseurs de masse:
- secteur magntique. Dans ce systme, pour un champ magntique donn et une vitesse donne de la
particule, seuls les ions molculaires dune masse et dune charge donnes peuvent passer dans le dtecteu
. Pour valuer la gamme de masses molculaires prsentes, lintensit du champ est modifie plusieurs fois
afin de dtecter tous les ions prsent . Ce dtecteur a une rsolution de 0,001 U de masse molculaire.
- lanalyseur quadrupole est bas sur linteraction de la molcule ionise avec un champ lectrique
oscillant. En faisant varier le potentiel appliqu aux lectrodes, seuls les ions dune masse donne oscillent
dans une direction stable et atteignent le dtecteur. Les autres molcules entrent en collision avec les
lectrodes et ne sont pas dtectes. Lanalyse des masses prsentes est obtenue en faisant varier le potentiel

page 74

r Jean-Louis CUQ -

appliqu aux lectrodes et en dterminant pour un potentiel donn les ions prsents. Avec ce systme le
balayage des masses est rapide (1 seconde) et ce systme est utilisable en couplage CPV ou CPL.
- lion trap analyseur utilise aussi des interactions dans un champ lectrique. Alors que dans lanalyseur
quadrupole lion avec une trajectoire stable est dirig vers le dtecteur, dans ce systme, ce sont les ions
stabiliss dans la cellule qui sont analyss.
- lanalyseur de temps de transfert mesure le temps ncessaire un ion pour atteindre le dtecteur (50
100 sec).
Un exemple de couplage chromatographie liquide / spectromtrie de masse est donn sur la figure 39.

absorbance 280 nm

colonne C18 , 10 cm L , 0,4 Di

luant tampon actate pH 4 0,01 M
/ mthanol ( 80 / 20 ; V/V )
dbit 0,8 ml / min

temps de rtention (minutes)

100

160

204

50

currentpoint
m/z

abondance relative (%)

0
32

50

N
H

NH2
CH2 CH CO NH

0
47

91

276

N
H

50

0
m/z

CH2 CH COOH
261

76

NH2

CH2
COOH

CH3
NH2
CH
CH2 CH CO NH
COOH

N
H

C
currentpoint

figure 39 . Couplage chromatographie liquide - spectromtrie de masse

VII.5.8. Les racteurs post-colonne

Une raction chimique peut tre ralise entre un chromophore et les soluts dtecter. Plusieurs types de
racteurs sont utiliss : capillaire, segmentation de flux
Pour lanalyse des acides amins le systme suivant est souvent utilis.

page 75

r Jean-Louis CUQ -

O
OH

+R

OH

NH2
CH
COOH

COOH
NH CH
R
O

ninhydrine

+ H2O

HO

NH2

+NH 3

compos violet
NH 3

OH
O

pourpre de Ruheman

+ ninhydrine

OH

OH
H

+CO

+ ninhydrine

O
hydrindantine

N CH2 R

N CHR

O
H O

COOH
N CH
R

+ H2O
O

+ R-CHO

OH

O
O

OH
NH2

Les acides amins lus individuellement sont soumis en continu une raction colore permettant leur
dosage. Il sagit le plus souvent dans la chromatographie dchange ionique de la raction la ninhydrine
qui est ralise pH 5,5 en prsence de mthylcellosolve, sous azote et chaud.
Parmi les nombreux drivs qui se forment certains sont violets, dautres jaunes ou encore rouges, leur
formation dpendant entre autre de la nature de lacide amin. La mesure de labsorbance plusieurs
longueurs donde (570 et 440 nm ) aide l identification des acides amins lus.
Le schma du racteur est indiqu sur la figure 40. Pour viter que des phnomnes de diffusion
nlargissent les pics, le flux est segment par de lazote.
bain d'huile

luat
ninhydrine
azote
sulfate d' hydrazine

3
5

rfrigrant

2
4

95C
bobines de mlange

pompe pristaltique

dtecteurs
colorimtriques
440 nm

570 nm

dgazeur

enregistreur
intgrateur

figure 40 . Dosage continu des acides amins par raction la ninhydrine

La pompe pristaltique est une pompe galets anime dun mouvement de rotation trs prcis. Les tubes
de pompe ont des diamtres internes parfaitement calibrs donc des dbits parfaitement contrls .

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r Jean-Louis CUQ -

galets

azote

tube de pompe

La ralisation de ractions chimiques en continu avec ce type de racteur repose sur le principe suivant : si
la raction en batch ncessite 3 ractifs A , B , C en quantits x , y et z, la raction en tube se fera avec
des tubes de pompes permettant des dbits de x , y et z ml.min-1 , avec x/x = y/y = z/z. Si la
raction ncessite un chauffage, une bobine est immerge dans un bain dhuile, sa longueur permettant de
contrler le temps de passage.
Aprs raction, le flux segment est dgaz par diffrence de dbits et un vent vertical, le dgazage tant
ncessaire la mesure de labsorbance. Les cuves des spectrophotomtres de mesure en continu ont des
trajets optiques compris entre 1 cm et 0,2 cm, leur volume tant compris entre 500 l et 5 l .

VIII. QUANTIFICATION
Aprs avoir obtenu des pics bien rsolus, il faut relier, pour chaque compos, le signal obtenu sur le
dtecteur sa concentration dans l'chantillon analys.
Sur le papier enregistreur on observe un pic gaussien (ou plus ou moins gaussien).
L'aire du pic est proportionnelle la quantit injecte.
A=
A
R

+
-

R . dt

aire du pic
rponse du dtecteur

mi = Ki Ai
mi
Ai
Ki

masse de solut dtect

aire de son pic
coefficient de rponse.

VIII.1. LA MESURE DE L'AIRE d'un pic peut s'effectuer :

1) par intgration lectronique
2) par pese du pic dcoup
3) par triangulation (figure 3, p 6)
A = h x x 1,066

avec h hauteur du pic

4) par mesure de la hauteur des pics

2
tR
N = 5,54

(mi = Ki Ai

mi = Ki.hi.i 1,066)

hauteur mi-hauteur

page 77

r Jean-Louis CUQ -

m=K. h.

2,35 . t R

. 1,066

Cette mthode n'est utilisable qu'avec tR et N-2 constants (dbit parfaitement constant). Cette mthode est
valable en chromatographie en phase gazeuse pour les pics troits.

VIII.2. MESURE DES COEFFICIENTS DE REPONSE Ki et de mi

Elle peut tre effectue
- par talonnage direct
- par mesure relative en rapportant la surface du pic du solut un compos de rfrence.
Ki n'est pas le coefficient de rponse du dtecteur mais celui de l'appareillage tout entier, colonne
comprise.
La dtermination des concentrations peut se faire :
a) par normalisation interne
On mesure la proportion relative des aires en admettant que l'on connat Ki.
La teneur d'un compos est
Ai . K i
m i (%) =
. 100
iAi . K i
b) par talonnage externe
Cette technique n'est valable qu'avec une excellente qualit d'injection
mref = K A ref
On injecte une masse mref de compos talon en solution (Vrf inject).
m rf
m rf =
Arf
On injecte un mme volume de solution contenant le compos (me) et on mesure me.
mi = K. Ai
soit
m rf
mi =
. Ai
Arf
c) par talonnage interne
On introduit dans le mlange analyser un compos (talon interne) qui n'interfre pas avec les
constituants du mlange et qui possde un k' voisin du ou de soluts doser. Avec cet talon interne on
connat
m ei
K ei =
Aei
Si on a introduit m'ei dans le mlange analyser on doit trouver l'analyse une aire gale A'ei = Kei/mei.
Si on trouve une aire diffrente (A"ei) c'est qu'il y a eu une perte (le plus souvent) de produit (par exemple
au cours de la prparation de la solution).
Cette "perte" est alors compense et on a :
m rf
A" ei
mi =
. Ai .
Arf
A' ei
La rptabilit est la mesure de l'intervalle dans lequel sont trouvs des rsultats obtenus par un mme
oprateur sur un mme appareil en oprant de faon identique.

page 78

r Jean-Louis CUQ -

La reproductibilit est la mesure de l'intervalle dans lequel sont trouvs des rsultats obtenus par des
oprateurs diffrents sur des appareils diffrents mais avec un mode opratoire identique.
La prcision caractrise par l'cart-type reprsente les carts par rapport la moyenne connue ou
inconnue.
La justesse est la valeur des carts entre la moyenne des mesures et la valeur relle.

VIII.3. INFLUENCE DES CONDITIONS OPERATOIRES SUR L'ANALYSE QUANTITATIVE

L'aire du pic A est gale
A=

R . dt

(R rponse du dtecteur)

A = K C.dt. La rponse du dtecteur est fonction de la concentration C du solut.

Si Q est le dbit de la phase mobile
m = CdV = CQ dt
Si le dbit de la phase mobile est constant on a :
m = Q . C dt or
A
A
C . dt =
m=Q
K
K
et
Toute variation du dbit entranera une variation de l'aire d'o la
ncessit de possder de trs bonnes pompes.

IX. TRANSPOSITION CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE EN COLONNE SUR COUCHE

MINCE
La chromatographie d'adsorption en colonne prsente certains avantages par rapport la chromatographie
d'adsorption sur couche mince :
- dure de sparation plus courte
- analyse quantitative prcise
- utilisable des fins prparatives
- automatisation aise.
La CCM est beaucoup plus facile mettre en oeuvre et peu coteuse. De plus, avec un mlange inconnu, il
est possible de pratiquer une sparation sur CCM avec rvlation universelle (carbonisation par chauffage
aprs pulvrisaton d'acide sulfurique). Les donnes bibliographiques sont trs nombreuses.
En CCM on caractrise la migration d'un solut par son RF

RF =

distance parcourue par le solut

distance parcourue par le front du solvant

Le facteur de capacit k' est

WS
k' = K
VM
WS
masse de phase stationnaire
volume de phase mobile
VM
K
coefficient de distribution
On a par ailleurs
v
v' =
1 + k'
v' vitesse linaire du solut

r Jean-Louis CUQ -

page 79

v vitesse linaire du front du solvant

Les distances parcourues sont proportionnelles leurs vitesses linaires d'o :
v'
1
1
RF = =
=
v
1 + k'
WS
1+K
VM
Si les phases mobiles et stationnaires en colonne et sur couche sont identiques K sera le mme dans les
deux cas.
Soit Ktr le coefficient de transposition
WS
colonne
VM
K tr =
WS
'
1
CCM
k cc = k tr(
- 1)
VM
RF
Pour des substances donnes il est alors possible, en connaissant leur RF sur couche mince de dterminer
leur temps de rtention sur colonne :
TR = to (1 + k'cc)

X. COMPARAISON AVEC LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

20 % environ des substances organiques connues sont justiciables de la CPG sans modification pralable
de l'chantillon. La CPG prsence des limitations dans trois cas :
- substances peu volatiles (mM > 300)
- substances sensibles une lvation mme modre de la temprature (la plupart des substances d'intrt
biologique)
- substances ionises.
La CPL est souvent plus efficace que la CPG pour 3 raisons :
- en CPG il n'existe que des interactions solut-phase stationnaire alors qu'en CPL il y a des interactions
additionnelles avec la phase mobile.
- les phases stationnaires sont plus varies en CPL (change d'ions, exclusion).
- la temprature est moins leve en CPL qu'en CPG. Or les interactions molculaires diminuent quand la
temprature augmente.
La CPL manque par contre de dtecteurs aussi universels que les dtecteurs catharomtre ou ionisation
de flamme. D'autre part l'appareillage est plus complexe donc plus onreux.
La CPG est une mthode simple, souvent plus rapide et plus sensible que la CPL. De ce fait, les deux
mthodes ne sont pas concurrentes mais complmentaires.

page 80

r Jean-Louis CUQ -

XI - EXERCICES - ANNALES DEXAMENS

Sujet n 1.
La sparation dacides gras est effectue sur une colonne de 15 cm de longueur et 4,6 cm de diamtre interne dont
la phase stationnaire est constitue de particules sphriques doctyl- silice de 4 m de diamtre. La phase mobile a
la composition suivante :

V/V =

1%

H3 PO4

CH3 CN

O
22

50

28

La colonne est rgule 35C et le dbit est de 1 ml.min-1. Le schma dun chromatogramme talon est donn sur
la figure 1 .
2

9
10

12
minutes

figure 1 . Schma du chromatogramme talon obtenu par injection de 10 l dune solution 0,1 mM dacides
gras dans la phase mobile

2 : acide linolnique
3: acide palmitolique
4: acide trans-hxadcnoque
5:
acide linolique
6:
acide trans-linolique

(C18:3,cis)
(C16:1,cis)
(C16:1,trans)
(C18:2,cis)
(C18:2,trans)

7:
8:
9:
10:

acide palmitique
acide olique
acide ladique
acide starique

(C16:O)
(C18:1,cis)
(C18:1,trans)
(C18:O)

1 - Quel sont le type et le principe de cette sparation ? Quel est le rle de lacide phosphorique dans la
phase mobile ? Pourquoi la sparation est-elle ralise 35C ? Expliquez lordre dlution des diffrents acides
gras ? Quel est le systme de dtection le mieux adapt ?
2 - La porosit interstitielle est gale 0,5 . Quel est le facteur de capacit de ces composs ?
3 - A quoi correspond le pic n 1 ?

4 - Comment diminueriez-vous la dure de lanalyse ? ( o = 0,45 et 0,65 respectivement pour le

ttrahydrofurane et pour lactonitrile). Quelles sont les limites vos propositions ?
5 - Quelle est la surface molculaire apolaire des acides gras de la srie C18 sachant que :
ln k = 0,04 Sapolaire - 2
avec Sapolaire en 10-20 m2 .
Interprtez les rsultats obtenus .
6 - Dans quelles conditions peut-on crire :
(t - t )
Rs = N 2 1
2 ( t 2 + t 1)
7 - Quelle est la perte de charge , la viscosit de phase mobile tant gale 1 cP
On donne
2

dp
.
K =
180
o

(1 - )

page 81

r Jean-Louis CUQ -

Corrig n 1
1 - Il sagit dune chromatographie solide-liquide en mode isochratique dont la phase stationnaire est greffe
apolaire ( C8) .
Lacide phosphorique permet datteindre un pH infrieur au pKa des acides gras sparer ; les groupements
carboxyliques sont alors sous la forme COOH ce qui permet la sparation sur la phase greffe apolaire en fonction
du caractre hydrophobe de ces acides gras .
La sparation est effectue 35 C dune part pour diminuer la viscosit apparente de la phase mobile et donc
diminuer la perte de charge et dautre part pour favoriser la solubilit de certains des acides gras tudis et agir sur
leur k.
Les acides gras saturs ( C:16 et C:18) sont spars en fonction du nombre de leur CH2 . Plus celui-ci est lev
et plus leur hydrophobicit est leve et donc leur k aussi . Pour un mme nombre nombre de CH2 et une mme
conformation ( cis par exemple) , le facteur de capacit est dautant plus grand que le degr dinsaturation est faible
. Pour un mme nombre de CH2 et un mme degr dinsaturation , k est plus lev pour la forme trans qui donne
une molcule avec une surface apolaire plus grande que lisomre cis .
Le systme le plus simple est la mesure de labsorbance 210 - 215 nm . La mesure de le diffusion de la
lumire est galement possible .
2 - Volume de la colonne Vt = L . section = 15 . 3,141. (0,46)2 / 4 = 2,49 cm3
VM = . Vt = 0,5 . 2,49 = 1,25 cm3
to = VM / D = 1,25 min
k =( tR - to) / to

acide linolnique (4,82 - 1,25) / 1,25 = 2,86

acide trans-hxa (6,35 - 1,25) / 1,25 = 4,08
acide trans-linol.
( 8 - 1,25 ) / 1,25 = 5,4
acide olique ( 10,47 - 1,25 ) / 1,25 = 7,38
acide starique ( 11,53 - 1,25 ) / 1,25 = 8,22

acide palmitolique (6 - 1,25 ) / 1,25 = 3,8

acide linolique ( 6,94 - 1,25) / 1,25 = 4,55
acide palmitique (9,53 - 1,25) / 1,25 = 6,62
acide ladique ( 11,18 - 1,25 ) / 1,25 = 7,94

3 - Le pic 1 correspond au pic dinjection

4 - Une diminution de la dure danalyse est possible en diminuant o (donc k) ; ceci est ralisable en
augmentant les proportions dactonitrile et surtout de ttrahydrofurane dans la phase mobile : risque de perte de
rsolution. La dure danalyse peut tre rduite en augmentant v : risque de voir P augmenter
5 - Calcul de la surface molculaire apolaire ( en 10-20 m2) des acides gras en C18 :
acide starique
lnk = 2,106
Sapol = 102,7
acide ladique
lnk = 2,072
Sapol = 101,8
acide olique
lnk = 1,998
Sapol = 100
acide trans-linolique
lnk = 1,686
Sapol = 92,2
acide linolique
lnk = 1,515
Sapol = 87,9
acide linolnique
lnk = 1,05
Sapol = 76,3
Les acides cis , cis-cis ou cis-cis-cis ont une structure replie qui leur confre une surface apolaire dautant
plus petite ( en donc un k bas) que le nombre de doubles liaisons est grand . Les isomres trans occupent un
volume plus grand que les isomres cis (voir Strutures des acides gras p2).Lhydrophobicit dune double liaison est
infrieure celle de la liaison .
6 - La rsolution est donne par :
2 ( t 2 - t 1)
Rs =
( 2 + 1)
On a :
2

N = 16 (

tR

)
2

Si les pics sont gaussiens et si on suppose que le nombre de plateaux thoriques est voisin
pour les divers composs analyss , on a alors :
4
=
. tR
N
ce qui permet dobtenir la relation propose .
7 - La perte de charge est gale :
P =

. L . v
K

K =
avec

dp
180

o
(1 - )

On a :
D
v=
.s
soit
v = (1/60) / 0,5. . (0,23)2 .
-1
v = 12 cm.min soit 0,2 cm.sec-1.

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r Jean-Louis CUQ -

Ko = (16.10-8 /180) . 0,5 =

4,44. 10-10

P = 10-2 . 15 . 0,2 / (4,44 . 10-10) = 3.10-2 / (4,44 . 10-10) = 0,675.10-8 baryes = 67,5 bars
Structures des acides gras analyss :

currentpoint
CH3

COOH

CH3

COOH

acide starique

acide ladique

COOH
acide olique

CH3

CH3

COOH

acide trans-linolique

COOH
acide cis-linolique
CH3
COOH
acide linolnique
CH3

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r Jean-Louis CUQ -

Sujet n 2.
La structure chimique dune phase stationnaire qualifie de phnyl-ure et utilise en chromatographie LS est la
suivante :
currentpoint
CH3

O
Si
O

H
CH 2

CH2

N
CH2

N
CH3

C
O

Le diamtre des particules qui constituent cette phase est de 3 m. La colonne qui les contient a une longueur et un
diamtre respectivement gaux 15 cm et 0,4 cm. Cette colonne est utilise dans un systme chromatographique
complet pour analyser des acides amins et dipeptides de synthse (MET, GLY et GLY-MET). Un
chromatogramme type obtenu est schmatis ci-dessous :

rponse du dtecteur
injection

10

temps de rtention (min)

1) Expliquez le rsultat obtenu .

2) Proposez , en les justifiant , une ventuelle prparation de lchantillon et une composition satisfaisante de
phase mobile permettant dobtenir un tel chromatogramme.
3) Quel est le systme de dtection le mieux adapt ?
4) Sachant que la porosit interstitielle est gale 0,5 quel est le dbit de la phase mobile ?
Le volume de phase mobile compris entre linjecteur et la colonne dune part et la colonne et le dtecteur dautre
part est gal 5,75 . 10-2 cm3.
5) Quelle est la perte de charge avec une phase mobile de = 1,24 cP ? On donne :
o

K =

dp
180

1 -
6) Quel est le facteur de capacit des acides amins et dipeptides analyss ?
7) Quelle est la rsolution entre les composs 2 et 3 et entre les composs 4 et 5 ? Discuter.

Corrig n 2
1 ) La phase stationnaire est une phase chirale (par la prsence dun C asymtrique) greffe en phase inverse. La
glycine ne possde pas de C asymtrique et est lue sous forme dun pic unique n1. La mthionine se prsente
sous forme de deux isomres L-MET et D-MET (ou S et R ; nantiomres) et le dIpeptide GLY-MET sous forme
de deux isomres : GLY-L-MET et GLY-D-MET (pics n 4 et 5 ou 5 et 4)
2) La prsence de deux fonctions (COO- et NH3+) ionisables nuit la sparation dans un systme en phase
inverse.
2-1. Il est possible de saffranchir de lventuel effet de ces groupements en formant par exemple des drivs
hydrophobes par condensation au niveau du NH3 ( raction avec par exemple l OPA ou la fluorescamine ou le PITC
etc.)
Dans ce systle de drivatisation prcolonne , la phase mobile sera tamponne ou acidifie un pH
infrieur au pKa des composs analyss soit aux environs de 2 par exemple . Le temps de rtention des composs

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r Jean-Louis CUQ -

sera dans ces conditions dautant plus lev que leur hydrophobicit sera grande et que le

o de la phase mobile
corrle au o .

sera lev . La proportion de mthanol ou de THF ou dactonitrile dans la phase mobile est
2-2. Il est possible denvisager le blocage des fonctions COOH par estrification par exemple .
2-3 . Il est aussi possible de proposer de tamponner la phase mobile pH = 5,90 , pH correspondants
sensiblement aux pHi des acides amins et peptides analyss . Dans ce cas il nest pas ncessaire de procder
une drivatisation pralable . La composition de la phase mobile est envisager comme dcrit en 2-1 .
3) Si une drivatisationpr-colonne par des drivs fluorescents comme lOPA a t ralise , la dtection
fluorimtrique simpose . En absence de drivatisation pr-colonne , une mesure de labsorbance 210 - 220 nm
est possible . La drivatisation post-colonne est aussi possible .
4) Le volume de la colonne est gal ( D2 / 4 ) . 15 = 1,885 cm3.
Le volume mort de la colonne est gal :

VM = VT . soit 0,9425 cm3.

Le volume mort total du systme est gal :
VM = 0,9425 + 0,0575 = 1 cm3.
A partir du chromatogramme on mesure to 2 min .
Comme VM = to . D , on a : D = 1 / 2 = 0,5 cm3. min-1 .
5) La loi de Darcy donne :
.L . v
P =
o
K
Ko = 4,445.10-10
v= D / .s
soit v = 0,5 / 0,5 . 0,125
v = 8 cm.min-1

soit

v = 0,133 cm . sec-1

P = 55,6 bars
6) Valeurs de k :
k = tR - to / to
tR pic n 1 = 5 min (GLY) soit k = 3/2 = 1,5
tR pic n2 ( L ou D-MET ) = 8 min soit k = 6/2 = 3
tR pic n2 ( D ou L-MET ) = 8 ,3 min soit k = 6,3/2 = 3,15
tR pic n2 ( L ou D-GLY-MET ) = 10 min soit k = 8/2 = 4
tR pic n2 ( Dou L-GLY-MET ) = 10,6 min soit k = 8,6/2 = 4,3
7) La rsolution est gale :
t R2 - t R1
Rs = 2 .

2 + 1

Entre 4 et 5 : Rs = 2 ( 0,6 ) / 0,8 = 1,5 : la rsolution est complte car > 1

Entre 3 et 2 : Rs = 2 ( 0,3 ) / 0,8 = 0,75 : la rsolution nest pas excellente comme le montre le schma

Sujet n3
1)- En CLS , quelles sont les phases stationnaire et mobile utilisables pour sparer la dimthylamine, la gramine et
lhordnine. Donner, en fonction du systme choisi , lordre dlution de ces trois composs .
2)- Quel est le type de dtecteur le mieux adapt aux systmes de phases choisis ?
3)- Si pour analyser ces composs on utilise , en systme isochratique , une phase mobile qui contient du
naphtalne sulfonate de sodium 0,03M , quelle phase stationnaire et quel dtecteur sont alors ncessaires ? Quel
doit tre le pH de la phase mobile ?
Avec ce systme VT = 2 mL , la porosit e = 0,5, le dbit de la phase mobile = 1 mL.min-1 .
4) Quel est le facteur de capacit des composs analyss pour lesquels les tR sont respectivement de 3 , 6 et 9
min ? Quelle est la slectivit de la colonne ?

Corrig n3
1) Il sagit damines R - NH2 sparables par :

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- change dions des pH < pKa : lution avec un gradient de pH , changeurs dions de type sulfonate :
lution du compos de pKa le plus faible vers celui du pKa le plus lev : gramine , hordnine , trimthylamine
- chromato hydrophobe sur C18 ou C 8 : lution en fonction de lhydrophobicit (mthylamine , hordnine ,
gramine ) avec une phase mobile do adapt pH voisin ou suprieur au pKa
- chromato par appariement dions ( avec un ractif paire dions du type sulfonate par exemple naphtalne
sulfonate ) : lution idem quavec C18 mais avec une phase mobile contenant le ractif paire dions pH < pKa
2) Sans paire dions le dtecteur le mieux adapt est le spectrophotomtre = 200 nm , deux des composs
cycliques absorbent aux environs de 260 - 280 nm
Avec la paire dions sulfonate naphtalne une dtection fluorimtrique est possible ( sensibilit accrue)
Diffusion de la lumire
Dtecteur lectrochimique
3) Voir rponse en 1 et 2
4) = VM / VT do VM = 1 ml
VM = to . D do to = 1 min

k' =

tR - to
to

k mthylamine = 3 - 1 / 1 = 2
k hordnine = 6 - 1 / 1 = 5
kgramine = 9 - 1 / 1 = 8
Slectivit entre mthylamine et hordnine :
= k2 / k1 = 2,5
Slectivit entre gramine et hordnine :
= k2 / k1 = 1,6
Slectivit entre mthylamine et gramine :
= k2 / k1 = 4

Sujet n4
Des colonnes chromatographiques rcentes sont proposes avec 0,1 cm de diamtre interne et 5 cm de longueur .
Ces colonnes sont garnies de particules sphriques de 0,8 m de diamtre et de porosit interstitielle gale 0,45 .
Ces particules sont constitues de propyl silice et la phase mobile contenant du 1-hexane sulfonate a une viscosit
gale 0,5 centipoise .
1) Quels sont les classes ou catgories de composs susceptibles dtre analyss au moyen de ce systme ?
2) Quels avantages et inconvnients prsente lutilisation de telles colonnes ?
3) Quel dbit de phase mobile doit-on fixer pour que la perte de charge soit gale 300 bars ?
4) Avec ce P , quel sera le to ?
5) Quel est la facteur de capacit dun compos lu 5 min ?
6) Quelle est la nombre de plateaux thoriques ?
On donne :
2

dp
Ko =
.
180
P =

(1 - )

Lv
ko

HEPT = B .d p avec = 1,6 et B = 1

Corrig n4

1) Appariement dions . Phase mobile B- , donc formation de paires dions avec les composs chargs + : il sagit en
sciences des aliments surtout damines qui pH < pKa sont charges 2) Avantages : temps danalyse trs court , HEPT trs petit , N trs grand , volume dchantillon faible , utilisation
dun faible volume de phase mobile

page 86

r Jean-Louis CUQ -

Inconvnients : systme dbit trs faible (nncessit de pompes de technologie avance ) , connexions ,
volumes morts , dtection trs difficile pour une masse trs faible de solut
3) dp = 0,8.10-4 cm , L = 5 cm , = 0,5 . 10-2 cP
-8

0,64.10
0,091
-11
ko =
.
= 1,065 10
180
0,303
v=

P . k o
. L

3.10 . 1,065.10

11

0,5.10 .5

v = 0,128 cm/ sec

D = v . s avec s = 0,785 . 10-3 cm2
D = 10-4 ml/sec = 6 l / min
4) to = L / v = 5 / 0,128 = 39 sec
5) tR = to ( 1 + k) 300 = 39 ( 1 + k ) do k = 6,7
6) HEPT = 1 ( 0,8 . 10-4)1,6 = 9.10-8 cm do N = L / HEPT = 5 / 9.10-8 = 5.107

Sujet n5
1) Des colonnes chromatographiques de 0,1 cm de diamtre interne et 10 cm de longueur sont actuellement
proposes garnies de particules sphriques de 1 m de diamtre et de porosit interstitielle gale 0,5. Ces
particules sont constitues de butyl silice et la phase mobile contenant du 1-hexane sulfonate a une viscosit gale
0,5 centipoise .Quels sont les classes ou catgories de composs susceptibles dtre analyss au moyen de ce
systme ?
2) Justifier le rle du pH .
3) Quels avantages et inconvnients prsente lutilisation de telles colonnes ?
4) Quel dbit de phase mobile doit-on fixer pour que la perte de charge soit gale 200 bars ?
5) Avec ce P , quel sera le to ?
6) Quel est la facteur de capacit dun compos lu 7 min ?
7) Quelle est la nombre de plateaux thoriques ?
On donne :
2

Ko =

dp
180

(1 - )

HEPT = B .d p avec = 1,6 et B = 1

Corrig n5
1) Appariement dions . Phase mobile B- , donc formation de paires dions avec les composs chargs + : il sagit en
sciences des aliments surtout damines qui pH < pKa sont charges +
2) Se placer dans des conditions dee pH pour lesquelles lappariement dion est possible , par ex un pH pour
lequel les amines sont charges + donc pH < pKa mais un pH > au pKa du sulfonate ( voisin de 1,5)
3) Avantages : temps danalyse trs court , HEPT trs petit , N trs grand , volume dchantillon faible , utilisation
dun faible volume de phase mobile
Inconvnients : systme dbit trs faible (nncessit de pompes de technologie avance ) , connexions ,
volumes morts , dtection trs difficile pour une masse trs faible de solut
4) dp = 10-4 cm , L = 10 cm , = 0,5 . 10-2 cP
-8 0,125
ko = 10 .
= 2,78. 10-11
180 0,25
P . Ko
v=
. L do :

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r Jean-Louis CUQ -

8
2,78 . 10-11
v = 2.10 .
10
0,5. 10-2

v = 0,111 cm / sec
D = v . s avec s = (0,785 . 10-3 ) . 0,5 cm2
D = 4,36.10-4 ml/sec = 26 l / min
5) to = L / v =10 / 0,111 = 90 sec
6) tR = to ( 1 + k)
420 = 90 ( 1 + k ) do k = 3,67
7) HEPT = 1 ( 10-4)1,6 = 4.10-7 cm

do N = L / HEPT = 10 / 4.10-7 = 2,5.107

Sujet n 6
De trs nombreux travaux de recherche ont t raliss pour prdire le temps de rtention de soluts au cours de
leur analyse par chromatographie liquide . Quels sont les principaux paramtres prendre en considration dans le
cas dune chromatographie dont la phase stationnaire est constitue de: 1) silice , 2) n-octadcyl silice .
Une des dfinitions de lhydrophobicit des soluts a t propose par De Waterbeemd :

log10 P =

S 1-octanol
Seau

( Si solubilit du solut dans le 1-octanol et leau) ; les valeurs de log P sont disponibles pour de trs nombreux
composs . En chromatographie en phase inverse on a :
log10 P = a log10 K + b
quation 1
( K coefficient de distribution) , a et b tant des constantes . Quelles relations peut-on crire entre log P et k dune
part ( k facteur de capacit) et logP et tR dautre part ?
Deux composs A et B ont des solubilits respectivement gales 4 et 3,5 moles.l-1 dans le 1-octanol et de 0,4 et
0,5 mole.l-1 dans leau . Dans lquation 1 les valeurs de a et b sont pour les deux composs respectivement de 15
et 2,5 . Avec une colonne de 4 mm de diamtre et de 10 cm de longueur dont la phase stationnaire une porosit
interstitielle de 0,5 ,un dbit de phase mobile de 1 ml.min-1 , quels sont les temps de rtention de A et B et quelle
est la slectivit de cette colonne .
Dans un systme isocratique phase mobile binaire ( eau : solvant organique ) avec une phase stationnaire du type
octyl-silice, on dmontre exprimentalement que :
log k = - S + log keau , quation dans laquelle k est le facteur de capacit , la fraction volumique du
solvant organique , S la variation de pente lie un changement de 1 % de la concentration du solvant organique
considr dans la phase mobile.Comment exploiteriez-vous cette quation ?

Corrig n 6

Le temps de rtention dun solut en CLS est essentiellement fonction de la colonne ( L, nature et proprits et
nature de la phase stationnaire ), de la phase mobile ( vitesse linaire , nature , temprature ), de la nature du
solut.
tR = ( 1 + k ) L / v , quation de Snyder log k = - a . o + b
Silice : chromato dadsorption de soluts
polaires ( k augmente avec la polarit du solut), tR dautant plus court que o est lev .
n-octadcyl silice : chromato en phase inverse : adsorption de composs apolaires (k augmente avec
lhydrophobicit du solut) , tR dautant plus court que o est faible .
log10 P = a log10 K + b
quation 1
log10 K = log10 k - log10 ( Vs / VM )
k = tR - to / to
Pour rpondre remplacer les symboles par leur dveloppement
A partir de lquation de De Waterbeemd :

log10 P =

S 1-octanol
Seau

pour A log10 P = 4 / 0,4 = 10

pour B log10 P = 3,5 / 0,5 = 7

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r Jean-Louis CUQ -

pour A 10 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,5

pour B 7 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,3
VT de la colonne D2 /4 . L
= 1,26 cm3 = VM / VT = 0,5
k = K .VM / Vs = K
pour A log10 K = 0,5 = log k soit k = 3,16
pour B log10 K = 0,3 = log k soit k = 2
= k2 / k1 = 3,16 / 2 = 1,58
VM = to . D do to = 0,63 . 1 = 0,63 min
tRA = to ( 1 + k ) = 0,63 ( 1 + 3,16 ) = 2,62 min
tRB = to ( 1 + k ) = 0,63 ( 1 + 3 ) = 1,89 min

donc VM = 0,5 VT = VS

Avec un systme isocratique phase mobile binaire (eau : solvant organique) et avec une phase stationnaire du
type octyl-silice, on peut choisir k en fonction du pourcentage de solvant organique dans la phase mobile.
log k = - S + log keau , quation dans laquelle k est le facteur de capacit, la fraction volumique du
solvant organique , S la variation de pente lie un changement de 1 % de la concentration du solvant organique
considr dans la phase mobile.Comment exploiteriez-vous cette quation ?

Sujet n 7
1 - De trs nombreux travaux de recherche sont raliss pour prdire le temps de rtention de soluts au cours de
leur analyse par chromatographie liquide. Quels sont les principaux paramtres prendre en considration dans le
cas dune chromatographie dont la phase stationnaire est constitue de: 1) silice, 2) n-octadcyl silice, 3)
polystyrne sulfon, 4) silice-srum albumine humaine.
2 - Une des dfinitions de lhydrophobicit des soluts propose par De Waterbeemd est :

log10 P =

S 1-octanol
Seau

( Si solubilit du solut dans le 1-octanol et leau); les valeurs de log P sont disponibles pour de trs nombreux
composs. En chromatographie en phase inverse on a :
log10 P = a log10 K + b
quation 1
( K coefficient de distribution), a et b tant des constantes. Quelles relations existe-t-il entre log P et k dune part (
k facteur de capacit) et logP et tR dautre part ?
3 - Deux composs A et B ont des solubilits respectivement gales 4 et 3,5 moles.l-1 dans le 1-octanol et de 0,4
et 0,5 mole.l-1 dans leau. Dans lquation 1 les valeurs de a et b sont pour les deux composs respectivement de
15 et 2,5 . Avec une colonne de 4 mm de diamtre et de 10 cm de longueur dont la phase stationnaire une
porosit interstitielle de 0,5 ,un dbit de phase mobile de 1 ml.min-1 , quels sont les temps de rtention de A et B et
quelle est la slectivit de cette colonne .
4 - La largeur la base du pic A est de 10 secondes. Quelle est la HEPT ?

Corrig n7

1) Le temps de rtention dun solut en CLS est essentiellement fonction de la colonne (L, nature et proprits et
nature de la phase stationnaire ), de la phase mobile (vitesse linaire, nature, temprature), de la nature du solut.
tR = ( 1 + k ) L / v , quation de Snyder log k = - a . o + b
Silice : chromato dadsorption de soluts polaires ( k diminue avec la polarit du solut), tR dautant plus
court que o est lev. Si t augmente k diminue.
n-octadcyl silice : chromato en phase inverse : adsorption de composs apolaires ( k augmente avec
lhydrophobicit du solut ) , tR dautant plus court que o est faible.
Polystyrnesulfon : change de cations. Deux paramtres importants : pH et .
Silice-SAB : chromato chirale.
2) log10 P = a log10 K + b
quation 1
log10 K = log10 k - log10 ( Vs / VM )
k = tR - to / to
Pour rpondre remplacer les symboles par leur dveloppement

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r Jean-Louis CUQ -

tR
V
-1 . M +b
t0
VS

log10 P = a log10

3) A partir de lquation de De Waterbeemd :

log10 P =

S 1-octanol
Seau

pour A log10 P = 4 / 0,4 = 10 et pour B log10 P = 3,5 / 0,5 = 7

pour A 10 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,5
pour B 7 = 15 . log10 K + 2,5 soit log10 K = 0,3
VT de la colonne D2 /4 . L
= 1,26 cm3 = VM / VT = 0,5
k = K .VS / VM = K
pour A log10 K = 0,5 = log k soit k = 3,16
pour B log10 K = 0,3 = log k soit k = 2
= k2 / k1 = 3,16 / 2 = 1,58

donc VM = 0,5 VT = VS

VM = to . D do to = 0,63 . 1 = 0,63 min

tRA = to ( 1 + k ) = 0,63 ( 1 + 3,16 ) = 2,62 min
tRB = to ( 1 + k ) = 0,63 ( 1 + 3 ) = 1,89 min
4) N = 16 ( tR / )2 et HEPT = L / N

HEPT =

10
t
16 . R

10
16 . 157
10

= 25 m

Sujet n 8
Des composs drivs du benzne sont analyss au moyen dun chromatographe haute performance quip dune
colonne C8 (porosit = 0,5 , dp = 5 m, 15 cm de longueur et 3,9 mm de diamtre interne); le dbit de la phase
mobile compose deau et disopropanol est de 1 mL.min-1. Ces drivs sont le nitrobenzne (NB), le 1,3dinitrobenzne (DNB), le 1,3,5-trinitrobenzne (TNB), le 3-nitrotolune (NT), le 2,4-dinitrotolune (DNT)et le 2,4,6trinitrotolune (TNT). Le chromatogramme obtenu est schmatis sur la figure 1.

rponse du dtecteur

TNB

DNB
TNT

NB
DNT

NT

10

temps (min)

20

figure 1 : chromatogramme de drivs de benzne (C8)

Expliquez le mcanisme de rtention et interprtez lordre dlution de ces divers composs. Quel type de dtecteur
est bien adapt ce systme ?
Si on reprsente le ln k en fonction du pourcentage disopropanol de la phase mobile on obtient pour le NB la droite
schmatise sur la figure 2.
Comment interprtez-vous cette droite ?
Quel est le pourcentage disopropanol de la phase mobile utilise ?

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r Jean-Louis CUQ -

3
ln k'
2

0
10

15

20

% isopropanol

figure 2. Variation du ln k en fonction du pourcentage disopropanol de la phase mobile pour NB

La loi

ln k = ln keau - S
dans laquelle k est le facteur de capacit dans la phase mobile considre, keau est le facteur de capacit avec
leau, S un paramtre de force du solvant et la fraction de ce solvant dans la phase mobile binaire, vous permetelle de contrler les temps de rtention des composs analyss.
Avec un pourcentage disopropanol de 18 % dans la phase mobile, les variations du ln k en fonction de 103 / T (T :
temprature absolue) sont indiques sur la figure 3.
3
ln k'
2

0
3,28

3,36

3,44

10 3 / T

figure 3. Variations du ln k en fonction de 103 / T pour le NB

Discutez ce rsultat. A quelle temprature est ralise la chromatographie ?
Quelle est la perte de charge en sachant que la viscosit de la phase mobile est de 1 cpoise ?

Corrig n8
Les drivs benzniques analyss ont la structure suivante :
(NO2 )

NO 2

(NO2 )

NB et (DNB et TNB)

CH3

(NO2 )

NO2

(NO 2 )

NT et (DNT et TNT)

Il sagit dune chromatographie en phase inverse. Plus le nombre de NO2 est lev, plus la polarit du compos
augmente et plus son temps de rtention est faible. Par la prsence du groupe mthyl, les drivs du tolune ont
une hydrophobicit plus leve que les drivs du benzne; leur temps de rtention, toutes conditions tant gales
par ailleurs, sont donc plus levs.
Le noyau benznique absorbe dans lUV 254 nm : dtection par spectrophotomtre UV.
Si le pourcentage disopropanol de la phase mobile augmente, o et lapolarit diminuent et donc le temps de
rtention diminue.
tR est li au facteur de capacit par
tR = t0 ( 1 + k) . Si k diminue, ln k diminue et tR galement.
VM = t0 . D = . VT do

t0 =

. VT 0,5 . 15 . 0,39 2 .
=
= 0,9 min
D
4.1

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Pour NB on a :

k' =

10 - 0,9
= 10,1
0,9

Par analyse graphique ln 10,1 = 2,32 soit % isopropanol 17,5 %

Cest la loi de Vant Hoff qui montre que la temprature affecte lenthalpie de liaison des analytes sur la phase
stationnaire :
0
0
V
ln k' = - H + S + ln avec = S
RT
R
VM

Pur 18 % disopropanol on a ln k = 2,3 soit 103/ T = 3,38

La temprature est de 23 C.
La perte de charge est :

P =

. L. v
K0

h = 0,01 poise , L = 15 cm, v = D / s et s = s .

v = 0,28 cm.sec-1
K0 = 0,07. 10-8
P = 60 bars

Sujet n 9
Lanalyse des oses prsents dans du jus dorange est ralise au moyen dun chromatographe haute performance
quip dune colonne de 15 cm de longueur , 0,39 cm de diamtre dont la phase stationnaire a une porosit de 0,5
et un dp de 5 m. Le dbit de la phase mobile compose dun mlange actonitrile / eau est de 1 mL.min-1 . La
viscosit de cette phase mobile est de 1 cpoise.
Le chromatogramme obtenu aprs injection de 100 L de jus est schmatis sur la figure 5 A.

S1 = 150
S2 = 150
S3 = 300

1 2

S1 = 300
S2 = 300

1 2

10

15
temps (min)

10
temps (min)

Figure 5 . Chromatogrammes de jus dorange (A) et de jus dorange trait linvertase (B). S est la surface relative
des pics. Les coefficients de rponse des composs 1 , 2 et 3 sont identiques.
Aprs action de linvertase sur le jus, le chromatogramme obtenu dans les mmes conditions analytiques est
reprsent sur la figure 5B. Interprtez le rsultat.
Quel est le mcanisme de rtention et quelle pourrait tre la nature de la phase stationnaire ?
Interprtez lordre dlution des composs 1 , 2 et 3.
Quel est le facteur de capacit du compos 3 ?
Les variations du Ln k du compos 3 en fonction du pourcentage dactonitrile sont schmatises sur la figure 6.
Comment interprtez-vous cette droite ? Quel est le pourcentage dactonitrile de la phase mobile utilise ?

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Ln k

3
2

1
0

25
50
75
% actonitrile dans la phase mobile

Figure 6. Variations du Ln k en fonction du % dactonitrile dans la phase mobile pour le compos 3

Comment procderiez-vous pour obtenir un temps de rtention de 10 min pour le compos 3 ?
Quelle est la perte de charge ?

Corrig n9
Linvertase hydrolyse le saccharose en glucose et fructose. Le pic 3 qui disparat correspond donc au saccharose et
les pics 2 et 3 qui augmentent au glucose et au fructose. Le jus dorange contient donc du glucose et du fructose en
quantits identiques et du saccharose en quantit double comme le montrent les surfaces des pics et leurs
variations (avec un coefficient de rponse identique pour les 3 oses).
La rtention se fait par liaison hydrogne : chromatographie dadsorption. En effet tR diminue avec la masse
molaire de lose et donc avec le nombre dOH susceptibles de donner une interaction hydrogne avec la phase
stationnaire. Il est donc normal que les hexoses soient lus avec des tR infrieurs au diholoside quest la
saccharose. Il pourrait sagir dune phase greffe polaire type NH2.
Calcul du k pour le compos 3 qui est le saccharose :
VM = t0 . D = . VT do

t0 =

. VT 0,5 . 15 . 0,39 2 .
=
= 0,9 min
D
4.1

tR est li au facteur de capacit par

tR = t0 ( 1 + k) .
Avec tR = 15 min pour le compos 3,
k = 15,7

En chromatographie dadsorption, k diminue avec laugmentation de o, cest dire avec la polarit de la phase
mobile. Donc si le % dactonitrile diminue, le % deau augmente et la polarit aussi
Si k diminue, ln k diminue et tR galement.
Si k = 15,7 , Ln k = 2,75 et le graphe donne un % dactonitrile voisin de 75 %.
Un tR de 10 min correspond un k de : 10 = 0,9 ( 1 + k) soit k = 10,1
et Ln k = 2,3. Par le graphe de la figure 6 il apparat alors quun pourcantage dactonitrile de 55 % dans la phase
mobile permet dobtenir ce temps de rtention.
La perte de charge est :

P =

. L. v
K0

h = 0,01 poise , L = 15 cm, v = D / s et s = s .

v = 0,28 cm.sec-1
K0 = 0,07. 10-8
P = 60 bars

Sujet n10
Un broyat de graines de soja pralablement dlipid par pression est trait par de lhexane au moyen dun soxhlet.
Le solvant est rcupr et soumis une vaporation sec sous vide partiel. Le rsidu est repris par un mlange
compos dactonitrile, de mthanol et dacide sulfurique 0,5 % (50/25/25 , V/V/V). Une partie aliquote est injecte
sur une colonne de 25 cm de longueur et 4,6 cm de diamtre interne dont la phase stationnaire est constitue de

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r Jean-Louis CUQ -

particules sphriques de dodcyl- silice de 5 m de diamtre. La phase mobile, dont le dbit est de 1 ml.min-1, a la
mme composition que celle du mlange ternaire dj dcrit.
Les schmas des chromatogrammes talon et dosage sont donns sur la figure 1.

dosage

6
2

talon

3 4 5

12
7

minutes

8 9 10

12 minutes

figure 1 . Schmas des chromatogrammes de lextrait et de ltalon obtenu par injection de 10 l dune solution 10
M dacidesgras dans la phase mobile
2:
3:
4:
5:
6:

acide linolnique
acide palmitolique
acide trans-hxadcnoque
acide linolique
acide trans-linolique

(C18:3,cis)
(C16:1,cis)
(C16:1,trans)
(C18:2,cis)
(C18:2,trans)

7:
8:
9:
10:

acide palmitique
acide olique
acide ladique
acide starique

(C16:O)
(C18:1,cis)
(C18:1,trans)
(C18:O)

1 - Expliquer la dmarche analytique. Lajout dun talon interne serait-il judicieux ; quelle molcule choisiriez-vous,
comment procderiez-vous et comment en tiendriez-vous compte dans la quantification.
2 - Quel est le principe de cette sparation ? Quel est le rle de lacide sulfurique dans la phase mobile ?
3 - Quel est le systme de dtection le mieux adapt ?
4 - La porosit interstitielle est gale 0,5. Quel est le facteur de capacit des composs majeurs spars partir
de lextrait ?
5 - Comment peut-on agir sur les temps de rtention ?
6 - Quelle est la perte de charge, la viscosit de phase mobile est gale 1,2 cP
7 - Quelle est la rsolution entre les acides palmitique et olique ?
8 - Quelle est la slectivit de la colonne pour ces deux composs ?

Sujet n 11

Le dosage de lacide ascorbique et de quelques uns de ses drivs prsents dans une prparation base dorange
est ralis de la faon suivante : 10 g de prparation sont mlangs 80 ml deau pralablement additionns avec
prcision de 2,5 mg dacide propionique ; le broyat est alors complt 100 ml. Aprs centrifugation 5000 g
pendant 10 min, le surnageant est pass sur une colonne de 5 cm de long et 1 cm de diamtre contenant des
particules sphriques (dp = 10 m) de silice greffe C18. Lluat est rcupr et 100 l sont injects sur une
colonne de 20 cm de longueur et 4,5 mm de diamtre contenant une phase stationnaire de type octadcyl silice
dont les particules sphriques ont un diamtre moyen de 5 m. La phase mobile, dun dbit gal 1 ml.min-1 est
compose dune solution aqueuse de bromure de ttrabutyl ammonium (0,2 %) et dun tampon phosphate 10 mM
pH 6,5. Labsorbance de lluat est mesure 210 nm.

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r Jean-Louis CUQ -

Le chromatogramme talon obtenu partir de solutions talons 0,025 g.l-1 et celui rsultant de lanalyse sont
schmatiss sur la figure 1 (avec dans tous les cas une boucle externe de 100 l).

1 2
talon

dosage

370

1000

320

350

740

1000

1000

1200

10

tR (min)

15

10

tR (min)

15

figure 1 : chromatogrammes talon et dosage. ( 1 : acide ascorbique, 2 : acide dhydroascorbique,

3 : acide dictogulonique , 4 : acide propionique ). Les surfaces des pics sont indiques en valeurs relatives.
1) Expliquez le principe de cette sparation chromatographique.
2) Pourquoi passer le surnageant sur la colonne de 5 cm de longueur (C18) avant analyse ?
3) Sachant que la porosit de la colonne analytique de 20 cm de longueur est de 0,5, quelle est la valeur de to.
4) Dans ce systme, quels sont le facteur de capacit et la HEPT de lacide ascorbique.
5) La capacit de pics de la colonne dfinie par HERMAN est gale :

n=1+

N . ln t
16
t

avec N nombre de plateaux thoriques, t et t les temps de rtention du premier et dernier pic du
chromatogramme.
Comment exploiter cette donne ?
6) Comment diminueriez-vous les temps de rtention pour acclrer lanalyse ?
7) Quelle sont les concentrations en acides ascorbique, dhydroascorbique et dictogulonique de la prparation
base dorange. Quel est le rle jou par lacide propionique ?

Corrig n 11

1) Sparation des acides organiques aprs appariement dions avec un ammonium apolaire. La paire dions
forme apolaire est spare par chromatographie en phase inverse. Le pH est ajust une valeur suprieure au
pKa de lacide et infrieure celui de lion dappariement.

HO

O
HO

H
CH2 OH

OH
Acide ascorbique
Le pK1 de l'hydroxyle en C 3 est gal 4,04 25C
RCOO-

ou RO-

COOH
OH H

N+ ((CH2)3 CH3)4

CH2 OH
OH
acide dictogulonique
RO- N+ ((CH2)3 CH3)4
paire dions apolaire

2) Le passage du surnageant sur C18 permet de retenir les composs apolaires qui pourraient gner dans la suite
du dosage.
3) Graphiquement to est voisin de 1,5 min

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r Jean-Louis CUQ -

Le volume de la colonne est gal Vt = L . r2 soit

20 . 3,14 . (0,45 / 2)2 = 3,18 cm3
VM = to.D = .Vt
do
to = .Vt / D = 0,5 . (3,18 / 1 ) = 1,6 min
4) tR = to ( 1 + k)
Pour lacide ascorbique tR = 6 min
do k = 2,75
Graphiquement on a = 1 min
N = 16 ( tR / )2 soit N = 16 ( 6 / 1 )2 soit N = 576
HEPT = L / N do HEPT = 20 / 576 = 0,035 cm
5) n = 96 et les pics sont bien spars. Cet indice permet destimer la capacit dune colonne en terme de nombre
de pics sparables avec une bonne rsolution.
6) La diminution des temps de rtention peut tre obtenue par une augmentation du dbit ou en diminuant le facteur
de capacit en choisissant un ractif paire dions moins apolaire (par exemple un sel dammonium de type
ttrapropyl ou ttramthyl).
7) Lacide propionique est un talon interne.Sa concentration initiale dans la prparation de fruit est de 2,5 mg / 100
ml. Ltalon analys directement a une concentration de 0,025 g.l-1 soit de 2,5 mg / 100 ml.
On devrait donc obtenir sur les chromatogrammes talons et dosage la mme surface pour lacide propionique. Or
pour ltalon on obtient une surface relative de 740 et pour le dosage de 370. Il faut donc corriger les rsultats par
un facteur de 740 / 370 = 2.
Pour lacide ascorbique : 0,025 . 2 = 0,050 g.l-1 de surnageant soit 5 mg / 100 ml ou 10 g de fruit
Pour lacide dhydroascorbique : (0,025 . 2). 320 / 1000 = 1,6 mg / 100 ml ou 10 g de fruit
Pour lacide dictogulonique : (0,025 . 2). 370 / 1200 = 1,54 mg / 100 ml ou 10 g de fruit

Sujet n 12

Une colonne chromatographique de 30 cm de longueur et 7,8 mm de diamtre interne contient une phase
stationnaire constitue de sphres de polystyrne rticule avec du divinylbenzne; leur diamtre est de 5 m et
leur porosit de 0,5. Elle est utilise avec une phase mobile compose dune solution aqueuse dacide
phosphorique 0,05 N dont le dbit est de 0,5 ml.min-1. La temprature est de 30C.
Les analyses de 10 l dun mlange dacides organiques en solution 0,5 g pour 100 ml, ou dun extrait de
pommes (20 g de pommes broys dans 80 ml deau et filtrs; on suppose que le volume final est de 100 ml) sont
schmatises sur la figure 1.

Absorbance 210 nm
1

4
extrait de
pomme

talon

10

15
tR (min)

10

15
tR (min)

Figure 1 : chromatogrammes talon et dosage. ( 1 : acide tartrique, 2 : acide malique, 3 : acide succinique , 4 : acide
fumarique ).
acide tartrique : COOH-CHOH-CHOH-COOH

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r Jean-Louis CUQ -

acide malique : COOH-CH2-CHOH-COOH

acide succinique : COOH-CH2-CH2-COOH
acide fumarique : COOH-CH=CH-COOH
1) Expliquez le principe de cette sparation chromatographique.
2) Quelle est la valeur de to.
3) Quels sont le facteur de capacit et la HEPT de lacide malique.
4) Quel serait leffet dune augmentation de la temprature de la colonne ?
5) Comment diminueriez-vous les temps de rtention pour acclrer lanalyse ?
6) Quelle est la concentration en acide malique de la pomme ?
7) Quelles autres mthodes de dosage chromatographique sont-elles utilisables pour ce dosage ?

Sujet n 13

Pour analyser les acides organiques contenus dans du jus de raisin muscat on utilise une colonne
chromatographique de 10 cm de longueur et 1 mm de diamtre interne. Elle contient une phase stationnaire
constitue de sphres de polystyrne rticule avec du divinylbenzne; leur diamtre est de 1 m et leur porosit de
0,64. Elle est utilise avec une phase mobile compose dune solution aqueuse dacide phosphorique 0,06 N dont
le dbit est de 25 L.min-1. La temprature est de 35C.
Les analyses de 5 L dun mlange dacides organiques en solution 0,4 g pour 100 mL, ou dun jus de raisin filtr
sur membrane 0,2 m et pralablement additionn de 0,4 g dacide fumarique pour 100 mL sont schmatises sur
la figure 1 (lacide fumarique est considr comme absent du jus de raisin).
Absorbance 210 nm

S=1500

5
jus de
raisin

600

4 t (min)
R

800

4 t (min)
R

Figure 1 : chromatogrammes talon et dosage (1 : acide tartrique; 2 : acide ascorbique; 3 : acide

malique ; 4 acide succinique ; 5 : acide fumarique).
acide tartrique : COOH-CHOH-CHOH-COOH
S = 1000 (exprime en unit arbitraire)
acide ascorbique : CO-COH=COH-CH-CHOH-CH2OH S = 1200
O
acide malique : COOH-CH2-CHOH-COOH
S = 1050
acide succinique : COOH-CH2-CH2-COOH
S = 1125
acide fumarique : COOH-CH=CH-COOH
S = 975
1) Expliquez le principe de cette sparation chromatographique.
2) Quelle est la valeur de to.
3) Quels sont le facteur de capacit et la HEPT des acides tartrique et ascorbique.
4) Quel serait leffet dune augmentation de la temprature de la colonne ?
5) Comment diminueriez-vous les temps de rtention pour acclrer lanalyse ?
6) Quelle est la concentration en acide tartrique du jus ? Quel est le rle de lacide fumarique ?
7) Quelles autres mthodes de dosage chromatographique sont-elles utilisables pour ce dosage ?

Corrig n 13

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r Jean-Louis CUQ -

1) Sparation des acides organiques par chromatographie en phase inverse. Le pH est ajust une valeur
infrieure aux pKa des acides organiques pour viter leur ionisation et donc une trop forte polarit. Les acides sont
spars en fonction de leur polarit : pour un mme nombre de carbone total (quatre par exemple) plus le nombre
de fonctions OH est lev et plus le facteur de capacit est faible.
2) Graphiquement to est voisin de 2 min
Le volume de la colonne est gal Vt = L . r2 soit
10 . 3,14 . (0,1 / 2)2 = 0,0785 cm3
VM = to.D = .Vt
do
to = .Vt / D = 0,64 . (0,0785 / 0,025 ) = 2 min
3) tR = to ( 1 + k)
Pour lacide tartrique tR = 3,5 min
do k = 0,75
Pour lacide ascorbique tR = 4 min
do k = 1
Graphiquement on a 0,35 min pour les deux acides
Pour lacide tartrique N = 16 (tR /)2 soit N = 16 (3,5 / 0,35)2 soit N = 1600
HEPT = L / N do HEPT = 10 / 1600 = 62,5 m
Pour lacide ascorbique N = 16 (tR /)2 soit N = 16 (4 / 0,35)2 soit N = 2090
HEPT = L / N do HEPT = 10 / 2090 = 48 m
4) Une augmentation de la temprature augmentera k donc le temps de rtention.
5) La diminution des temps de rtention peut tre obtenue par une augmentation du dbit ou en diminuant le facteur
de capacit (en abaissant le temprature ou en choisissant une phase mobile moins polaire (actonitrile ou
mthanol en proportion adapte avec leau acidule).
6) Lacide fumarique constitue un talon interne.
La concentration non corrige par cet talon interne est de :

concentration =

0,4 . S dosage 0,4. 1500

= 0,6 g. L-1
=
S talon
1000

Lacide fumarique est la mme concentration dans ltalon et lchantillon dos. Or la surface du pic dosage
montre quune perte est intervenue. La compensation de cette perte donne la concentration relle du jus de raisin :

concentration corrige =

0,4 . Sdosage S A fumarique talon 0,4. 1500 975

.
=
.
= 0,73 g.L-1
Stalon
Sac fumarique dosage
1000
800

7) Chromatographie dchange dions, par appariement dions ou encore CPG aprs drivatisation.