Determinacion de Proteinas Por Bradford

Laboratorio Enzimologa
Prctica No. 2.- Determinacin de protenas mediante la tcnica

de Bradford.
Universidad Autnoma de Ciudad Jurez.
Instituto de ciencias biomdicas.
Lic. Qumico Farmacutico Bilogo.
Introduccin.
contenido de nitrgeno o el mtodo de
La cuantificacin de protenas es una parte
Biuret que se basa en la reaccin de las
esencial de cualquier trabajo de laboratorio

que involucre extraccin, purificacin o
protenas con sulfato de cobre que absorbe
anlisis de protenas. La cuantificacin de
la luz a una determinada longitud de onda,
protenas es a veces necesaria para el
ente otros mtodos (Santiago, S., 2005).
aislamiento, separacin
y anlisis por
Un mtodo rpido y preciso para la
cromatografa o tcnicas inmunoqumicas y
estimacin de la concentracin de las
electroforticas.
la
protenas es un ensayo originalmente
precisin requerida y del porcentaje de
descrito por Bradford, este mtodo se basa
pureza de la protena de inters, diferentes
en la unin de un tinte a la protena. Este
mtodos sern apropiados para determinar
mtodo cuenta con un alto coeficiente de
la concentracin de la protena (Hayworth,
extincin molar, lo que se traduce en que la
D., 2010).
sustancia absorbe la luz de una forma muy
En
general
Dependiendo
para
de
la cuantificacin de
eficiente a la longitud de onda adecuada
protenas se pueden emplear numerosos
(Walker, J., 2002).
mtodos.
la
Debido a que las protenas difieren en su
seleccin del mtodo debe ser cuidadosa
composicin de aminocidos cada una
ya que en muchas ocasiones la presencia
responde de manera diferente a cada tipo
de sustancias que interfieren
genera un
de mtodo de cuantificacin. Para lograr
ruido al momento de la cuantificacin. Entre
una alta eficiencia en la estimacin de la
los distintos mtodos se pueden nombrar
concentracin total de alguna protena en
los siguientes: mtodos espectromtricos,
muestras desconocidas es esencial incluir
mtodos qumicos como la tcnica de
una curva de calibracin la cual indicar en
Kjeldahl mediante el cual se determina el
cierto
Es
necesario
decir
que
margen
concentracin a
de
correlacin
partir de
esta
una
curva
fabricada
de
solucin con una concentracin de 4
concentraciones conocidas (Hayworth, D.,
mg/mL. Una vez hechas las soluciones de
2010).
la curva de calibracin se tom de cada
Objetivo.
una 100 L y se le adicion 1 mL de
Realizar y comprender el fundamento de
reactivo de Bradford y se incubo por 5
una tcnica de cuantificacin de protenas
minutos a temperatura ambiente, este
(Bradford) y calcular la concentracin de
ltimo proceso se repiti solo que en lugar
una muestra problema.
de los 100 L de solucin, se aadi esta
Metodologa.
cantidad de agua destilada, esto para usar
Se inici el procedimiento con la realizacin
como blanco. Despus se ley en el
de
espectrofotmetro a una absorbancia de
una
partir
curva
de
de
estndares
calibracin
concentraciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL
595 nm.
en 1 mL, esta curva fue a partir de una

Resultados.
A continuacin se muestra la tabla No. 1 en la cual se observan los resultados obtenidos, los
cuales incluyen la absorbancia dada en cada concentracin de la muestra, as como su
promedio.
En la grfica No. 1 se muestra la curva de calibracin con los promedios de absorbancia
obtenidos por cada equipo, adems muestra el coeficiente de correlacin y la ecuacin de la
recta con la cual se obtuvo la concentracin de la muestra problema.
Concentracin
(mg/mL)
Equipo
No. 1
Equipo
No. 2
Equipo
Equipo No. 4
No. 3
Absorbancia a 595 nm.
0.19
0.1
0.41
0.2
1.019
0.971
0.386
0.53
0.7265
0.3
1.026
0.756
0.756
0.847
0.84625
0.4
1.444
0.987
0.833
1.002
1.0665
Tabla No. 1.- Resultados en absorbancia de la curva de calibracin.
Promedio
0.3
Grfica No. 1.- Curva de calibracin, ecuacin de la recta, y coeficiente de correlacin.
La ecuacin obtenida de la grfica No. 1 se
dicen que el colorante libre puede existir en
despej para obtener:
4 diferentes formas inicas cuyos pKa son
x=
y0.13
2.4193
1.15, 1.82 y 12.4. De las tres formas

cargadas del colorante se encuentran las
En esta ecuacin se sustituye Y por la

absorbancia de la muestra problema que
en este caso fue:
-
catinicas que son de color rojo y verde las

cuales absorben a una longitud de onda de
470
Muestra problema No. 1 = 0.769.

Muestra problema No. 2 = 0.212.
650
nm
respectivamente.
En
contraste la forma anicnica es el azul, el

cual se une a la protena, este azul absorbe
Y se obtuvo una concentracin de:

-
Concentracin real de problema No.
1 = 0.264125 mg/mL.
Concentracin real de problema No.
a 595 nm, con lo cual se entiende que se

cuantifica el azul de este colorante. El
colorante
aparece
cuando
se
una
residuos de arginina y lisina en la protena,
2 = 0.03389 mg/mL.
Discusin.
esta unin es un enlace inico o salino,
Los resultados de la curva de calibracin
dado
muestran mucha variacin, es por eso que
aminocidos cargados de forma positiva
se decidi sacar un promedio y graficar a
(cationes) y el colorante est cargado de
partir de este. Los dos datos faltantes en la
forma negativa (anin).
concentracin de 0.1 de los equipos 2 y 3
Adems Stephenson menciona que la
reflejan la variacin de los datos, estos
intensidad
de
absorcin
resultados
contenido
de
aminocidos
pueden
deberse
ciertos
que
la
arginina
lisina
depende
bsicos
son
del
y
factores sin embargo los dems datos
aromticos. Las interferencias o no existen
demuestran que la mencionada variacin
o son mnimas por cationes tanto sodio
no fue causada solo por algn factor si no
como potasio y carbohidratos como la
que
que
sacarosa. Otras sustancias que interfieren
congeniaron para que estos resultados se
en el ensayo son los agentes fuertemente
dieran de esta manera.
alcalinos (fcilmente solucionable con la
Segn Kruger, N. (2002) la reaccin para el
utilizacin
ensayo de Bradford se da entre el colorante
componentes encontrados que dan una
Coomasie
protena.
excesiva interferencia en el color del
Menciona tambin que diversos estudios
ensayo, son altas concentraciones de
fueron
varios
Blue
factores
g250
la
los
de
buffers).
Los
nicos
detergentes como el SDS, Triton X-100,
conclusin de que el mtodo de Bradford
etc.
es un mtodo muy recomendable para la
Conclusin.
cuantificacin de protenas, siempre y
Se cumpli con los objetivos propuestos
cuando se lleve de una manera correcta.
para la prctica dado que se logr realizar
Bibliografa.
la tcnica de cuantificacin de Bradford y
Hayworth,
adems mediante la realizacin de este
methods.
reporte se logr comprender el fundamento
assays
de esta tcnica. Adems mediante los
D.
(2010).
Overview
methods.
Assays
of
protein
U.S.:
Thermo
Scientific Pierce.
Santiago, S. (2005). Separacin y
datos obtenidos en la prctica se logr
determinacin
calcular la concentracin de una muestra
Contribucin a la determinacin de
problema
de
la fraccin de metales traza ligados
calibracin. Debido a los resultados tan
a las protenas similares a las
variables obtenidos se puede decir que la
metaloprotenas en muestras de
manera en que se aplic el mtodo no es
mejilln. Espaa: Universidad de
buena,
partir
pero
de
dada
una
la
curva
investigacin
de
protenas.
Santiago de Compostela.
Walker, J. (2002). The
protein
bibliogrfica que indica que el mtodo tiene
quantitation. The protein protocols
un alto coeficiente de extincin lo cual es
handbook. New Yersey: University of
imprescindible
para
aumentar
la
sensibilidad en la medicin de protenas y
preparation
que la unin colorante-protena es un

proceso muy rpido, dos minutos,
tiempo
relativamente
largo,
una
hora,
(2002).
for
protein
protein concentration by colorimetric

assay.
que no requiere un tiempo crtico para el
biology and biotechnology.
reproducible
se
puede
llegar
la
assays.
Kingdon: University of Oxford.

Stephenson, F. (2008). Measuring
haciendo de este un proceso muy rpido, y

ensayo, adems de que es un mtodo muy
Sample
Protein methods overview. United
y el
complejo permanece estable durante un
Hertfordshire.
Kruger,
N.
Calculation
for
molecular

Determinacion de Proteinas Por Bradford

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Prctica No. 2.- Determinacin de protenas mediante la tcnica

contenido de nitrgeno o el mtodo de

La cuantificacin de protenas es una parte

Biuret que se basa en la reaccin de las

esencial de cualquier trabajo de laboratorio

protenas con sulfato de cobre que absorbe

anlisis de protenas. La cuantificacin de

la luz a una determinada longitud de onda,

protenas es a veces necesaria para el

ente otros mtodos (Santiago, S., 2005).

Un mtodo rpido y preciso para la

cromatografa o tcnicas inmunoqumicas y

estimacin de la concentracin de las

protenas es un ensayo originalmente

precisin requerida y del porcentaje de

descrito por Bradford, este mtodo se basa

pureza de la protena de inters, diferentes

en la unin de un tinte a la protena. Este

mtodos sern apropiados para determinar

mtodo cuenta con un alto coeficiente de

la concentracin de la protena (Hayworth,

extincin molar, lo que se traduce en que la

sustancia absorbe la luz de una forma muy

eficiente a la longitud de onda adecuada

protenas se pueden emplear numerosos

(Walker, J., 2002).

Debido a que las protenas difieren en su

seleccin del mtodo debe ser cuidadosa

composicin de aminocidos cada una

ya que en muchas ocasiones la presencia

responde de manera diferente a cada tipo

de sustancias que interfieren

de mtodo de cuantificacin. Para lograr

ruido al momento de la cuantificacin. Entre

una alta eficiencia en la estimacin de la

los distintos mtodos se pueden nombrar

concentracin total de alguna protena en

los siguientes: mtodos espectromtricos,

muestras desconocidas es esencial incluir

mtodos qumicos como la tcnica de

una curva de calibracin la cual indicar en

Kjeldahl mediante el cual se determina el

solucin con una concentracin de 4

concentraciones conocidas (Hayworth, D.,

mg/mL. Una vez hechas las soluciones de

la curva de calibracin se tom de cada

una 100 L y se le adicion 1 mL de

Realizar y comprender el fundamento de

reactivo de Bradford y se incubo por 5

una tcnica de cuantificacin de protenas

minutos a temperatura ambiente, este

(Bradford) y calcular la concentracin de

ltimo proceso se repiti solo que en lugar

una muestra problema.

de los 100 L de solucin, se aadi esta

cantidad de agua destilada, esto para usar

Se inici el procedimiento con la realizacin

como blanco. Despus se ley en el

espectrofotmetro a una absorbancia de

concentraciones de 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 mg/mL

en 1 mL, esta curva fue a partir de una

Tabla No. 1.- Resultados en absorbancia de la curva de calibracin.