"Analisa Kafein Dengan Alat HPLC"

JURNAL - KCKT
"Analisa Kafein Dengan Alat HPLC"
ABSTRAK
Penentuan kadar kafein dalam sampel kafein. Sampel di larutkan
dengan pelarut aquabidest, kemudian sampel di saring dengan pompa
vakum dengan menggunakan kertas saring khusus ( kertas saring 47 mm,
0,45 m ), hasil saringan dianalisa dengan alat HPLC ( High Performance
Liquid Chromatography ) dimana fasa geraknya adalah methanol :
aquabidest ( 30 mL : 70 mL ), menggunakan detektor S2500 UV dengan
panjang gelombang 272 nm, menggunakan kolom kromasil 100-5C 18,
dengan sistem pengaliran fasa geraknya adalah isokratik. Hasil percobaan
menunjukkan konsentrasi larutan contoh yaitu 5,088 ppm yang di injeksi
sebanyak 15 L dan memperoleh waktu retensi selama 1,000 menit
dengan AREA = 45003, AREA % = 24,33, HEIGHT = 8248, HEIGHT % =
72,45.

ABSTRACT
Determination of caffeine content in a sample of caffeine. Samples
dissolved in a solvent aquabidest, then samples were filtered with a
vacuum pump by using a special filter paper (filter paper 47 mm, 0.45
m), the filter was analyzed by instrument of HPLC (High Performance
Liquid Chromatography) in which the movement phase is methanol :
aquabidest (30 mL: 70 mL), using the S2500 UV detector with a
wavelength of 272 nm, using a column kromasil 100-5C18, the drainage
system is an isocratic phase motion. The experimental results showed the
concentration of sample solution is 5,088 ppm of the injection of 15 L
and obtained during the retention time 1,000 minutes with AREA =
45003, AREA% = 24,33, HEIGHT = 8248, HEIGHT = 72,45%.

BAB I
PENDAHULUAN
A .Latar Belakang

HPLC (High Performance Liquid Ch0-an oromatoggraphy) atau biasa juga

disebut dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dikembangkan
pada akhir tahun 1960-an dan awal tahun 1970-an, saat ini HPLC
merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis
bahan obat ,baik dalam bulk atau dalam sediaan farmasetik.
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas : wadah fase
gerak,pompa,alat untuk memasukkan sampel(tempat injeksi)
kolom,detector,wadah penampungbuangan fase gerak,dan suatu
computer atau integrator atau perekam. (http://en.wikipedia.org/wiki/
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT)
Kafeina atau populernya kafein ialah senyawa alkaloid xantina berbentuk
Kristal dan berasa pahit yang bekerja sebagai obat perasangsang
psikoaktif dan diuretic ringan.kafeina ditemukan oleh seorang kimiawan
jerman friedrich Ferdinand runge pada tahun 1819.Ia menciptakan istilah
kaffein untuk merujuk pada senyawa kimia pada kopi.
B.Rumusan Masalah

Peralatan yang digunakan untuk analisa contoh dalam bentuk bulk

atau sediaan farmasetik

Prinsip kerja dari HPLC

Sumber dari kafein

C. Tujuan
1..Untuk mengetahui cara menggunakan HPLC
2. Untuk dapat menentukan retention time,area,kadar area, height dan
kadar dari kafein.

BAB II
PEMBAHASAN
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid
Chromatography (HPLC) merupakan salah satu metode kimia dan
fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru yaitu suatu teknik
kromatografi dengan fasa gerak cairan dan fasa diam cairan atau padat.
Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan dengan metode lainnya
(Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan Sewell, 1982;
Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain:
Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
Mudah melaksanakannya
Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
Resolusi yang baik
Rapat digunakan bermacam-macam detektor

 Kolom dapat digunakan kembali

Mudah melakukan "sample recovery"
Metode HPLC dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dan
sekaliguskualitatif. Untuk analisa kualitatif dengan membandingkan
kromatogram sampel dengan kromatogram
baku pembanding berdasarkan waktu retensinya.
Sedangkan untuk analisa kuatitatif dapat digunakan dengan persamaan :
Cx = Ax / Ap X Cp
Keterangan :
A = Peak area = Luas puncak
C= Konsentrasi
X = sampel
P = pembanding
Atau jika ingin mendapatkan data yang lebih valid dapat pula ditentukan
dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.
1. JENIS HPLC
Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase
diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik
(jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya).
Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan
menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.
Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan
pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut;
dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:
1. Kromatografi Adsorbsi
Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi
adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase
diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi
ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat
gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada
silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat
secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor3).
2. Kromatografi fase terikat
Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi
secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk
memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti
dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang
paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan
kebanyakan pemisahannyaadalahfaseterbalik.
Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air
atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau
basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak

diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya

spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam
menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak
terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih
cepat
3. Kromatografi penukar ion
KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation
atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang
beredar di pasaran, meskipun demikian yang
palingluaspenggunaannyaadalahpolistirenresin.
Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan
media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut
campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi
penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar
garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar
garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan
oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak
untuk gugus penukar ion pada resin.
4.Kromatografi Pasangan ion
Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan
sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada
metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai
muatan yang berlawanan.
5. Kromatografi Eksklusi Ukuran
Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat
digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat
molekul > 2000 dalton.
Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat
porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau
berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh
lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang
ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini
disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi
lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan
dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan
fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.
6. Kromatografi Afinitas
Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi
yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang
hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait
dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai
(sebagaimana dalam interaksiantara antigen dan antibodi). Kromatografi
jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari
campuran yang sangat kompleks).
2. SISTEM PERALATAN HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak,

pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor,
wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair
seperti ini :
1. Wadah Fase gerak dan Fase gerak
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak.
Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter
pelarut(1).
Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat
bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan
resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan
pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk
fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase
terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
menurun dengan meningkatnyapolaritaspelarut.
Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk
menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase
gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan
komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan
mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap
selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak
berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada
kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan
resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai
kisaran polaritasyangluas4).
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase
terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran
air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak
yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut
hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarutpelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum
dibanding dengan fase terbalik.
2. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang
mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa
harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa
adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang
digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan
mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk
tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 20 mL/menit

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam
fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan
alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon
yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau
eksternal. Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat menyuntik
sampel
4. Kolom dan Fase diam
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam
untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor
mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom
konvensional, yakni:

Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).

Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom

mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel
terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan

kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara
kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan
divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena
adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara
kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagenreagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan
gugus-gugus fungsional yang lain.
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak
digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan
kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil
yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika
aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika
yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan
waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air
yang digunakan.
5.Detektor HPLC
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: oluter
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat
spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti oluter indeks bias dan oluter
spektrometri massa; dan golongan oluter yang spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti oluter UV-Vis, oluter
fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu oluter harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: (1)
mempunyai respon terhadap olute yang cepat dan reprodusibel; (2)
mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi olute pada
kadar yang sangat kecil; (3) stabil dalam pengopersiannya; (4)
mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita; (5) signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan
konsentrasi olute pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier); dan (6)
tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak2).
2. ELUSI GRADIEN
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak
selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah
mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat
pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu analisis dapat direduksi
b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien
dapat dipilih dengan cara trial and error.
1. DATA HANDLING
Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk
kromatogram pada rekorder. waktu retensi dan volume retensi dapat
diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan untuk mengidentifikasi secara
kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak
dan tinggi puncak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan
dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara kuantitatif.
2. FASA GERAK
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah
salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi
yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada
beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan defektor
4. Melarutkan sampel
5. Memiliki visikositas rendah
6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena

prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal
biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4)
merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk KCKT
yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat
diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi.
Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan
yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat
digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing)
juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap
udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2). (Rucker, G 1988)

Perangkat Alat HPLC Di Laboratorium Instrumen SMAK (Sekolah Menengah Analis

Kimia) Makassar

BAB III
METODE ANALISA
Alat dan Bahan
ALAT :
1. Gelas Piala 50 ml
2. Labu ukur 100 ml dan 50 ml.

3. Corong
4. Pengaduk
5. Mikroburet
6. Kertas Saring
7. Neraca Digital
8. HPLC
9. Pompa vakum
BAHAN :
1. Kafein
2. Aquabidestilata steril
CARA KERJA
A. Preparasi Sampel
- Ditimbang 0,0212 gram kafein
Tabel pengamatan :
Bobot sampel (kafein) = 0,0212 gram
Perhitungan :

Bobot kafein yang ditimbang untuk larutan induk 200 ppm

ppm =
200ppm =
= 20 mg = 0,02 g

Konsentrasi larutan stok sebenarnya

ppm =
=
= 212 ppm

Pengenceran untuk 5 ppm

V1C1 = V2C2
V1 . 212 ppm = 50 ml . 5ppm
V1

Konsentrasi larutan standar kafein sebenarnya

V1C1 = V2C2
1,20 ml. 212 ppm = 50 ml . C2
5,088 ppm = C2

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan

Dari hasil analisa kafein 5 ppm dengan alat HPLC dapat disimpulkan
bahwa :
Retention time : 1,000 menit
Area : 45003
Area% : 24,33 %
Height : 8248
Height % : 72,45 %