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UNIVERSIDAD

CENTRAL
DEL ECUADOR

Facultad de Ciencias
Qumicas

Biologa
Molecular
Carrera
de: Bioqumica
Clnica
TEMA:
Tcnica
molecular:
FISH
REALIZADO
POR:
Jeanneth
Vsconez
FECHA:
2015 Julio 26

ANLISIS BIBLIOGRFICO DE LA TCNICA


DE HIBRIDACIN IN VITRO
FLUORESCENCIA (FISH)
ABSTRACT

INTRODUCCIN

Resea histrica:
La tcnica de FISH se basa en una hibridacin in situ, mtodo
desarrollado en 1969 por Gall y Pardue y de forma independiente por
Jonh a la par en el tiempo; probaron la tcnica sobre ovocitos de
Xenopus laevis, generando hibridaciones en el RNA o bien en el DNA,
y como mtodo de marcaje utilizaron radioistopos (tritio) para
autoradiografa, en vez de la fluorescencia que se utiliza en la tcnica
en cuestin actualmente. (Stock & Ramos-Cerillo, n.d.)
La prueba de FISH va surgiendo posteriormente al desarrollo de esta
tcnica de hibridacin que tuvo ms auge alrededor de los aos 80s
donde ya an se usaba autoradiografa para detectar la secuencia
investigada sobre una visualizacin de los cromosomas marcados,
especficamente en 1981 (Hu et al., 2014) se detect en cromosomas
en metafase el gen de la insulina y en 1985 logr sintetizar los
oligonucletidos ya marcados qumicamente para la deteccin. Al
surgir el mtodo de la fluorescencia para el marcaje, se fue
disminuyendo el tiempo de la prueba y ampliando la tcnica hacia
distintos sistemas de deteccin. (Markey, Ruezinsky, Tyagi, & Batish,
2014)

Definicin:
La tcnica de hibridacin in situ (FISH: Fish in situ hibridation) es una
tcnica molecular que permite la deteccin de secuencias genticas
de cidos nucleicos especficas en las distintas bandas existentes de
los cromosomas, permitiendo observar de forma directa, mediante un
microscopio, la localizacin de dichas secuencias detectadas.
Se dice que es una tcnica citogentica que forma una especie de
mapa
en
los
cromosomas,
por
medio
de
hibridaciones
complementarias fluorescentes. (Q. Wang et al., 2015)
Esta tcnica ha desplazado a muchas otras con la funcin similar de
deteccin de la secuencia gentica, debido a que presenta una gran
facilidad para la identificacin de la secuencia, as como el empleo de
una menor cantidad de tiempo, ya que es ms veloz. (Liu, Bi, Gu, Li, &
Zhou, 2012)

Fundamento:
La tcnica FISH es basada en la estructura de doble cadena del ADN,
aprovechando el hecho de que las bases nitrogenadas del ADN son
complementarias: adenina - timina y citosina - guanina.
La tcnica de FISH consiste en disear una sonda 1, que es
complementaria a una regin especfica de la cadena de ADN que se
desee analizar, esta sonda se marca con una sustancia fluorescente
(un fluorocromo) y se aade a la muestra que contiene el material
gentico objeto de estudio. (Halder, Jain, Chaudhary, Gupta, & Kabra,
2013)
Mediante calor el ADN se desnaturaliza, separndose las dos
cadenas, y la secuencia gnica en el ADN en estudio que es
complementaria a la de la sonda fluorescente se une (hibrida) con
esta y queda marcada con una seal fluorescente que puede
visualizarse en un microscopio de fluorescencia. (Strepparava, Wahli,
Segner, Polli, & Petrini, 2012)
La resolucin de las tcnicas de citogentica molecular se define
como el tamao mnimo que debe tener una alteracin para ser
detectada y se mide en nucletidos o pares de bases. Este proceso se
evidencia en a imagen 1.
El cromosoma que contenga la secuencia target u objetivo del
anlisis, se pintar a manera de bandas fluorescentes que se
evidencian en un microscopio de fluorescencia como se indic
previamente, en la Imagen 2 se muestran un ejemplo de
cromosomas marcados con la sonda de hibridacin aplicada.
Adems el protocolo a seguir cuando se presenta una muestra a
analizar mediante hibridacin in situ con fluorescencia se muestra en
la Imagen 3, donde se evidencia paso a paso el proceso a seguir
desde la preparacin de la muestra hasta su observacin en el
microscopio respectivo.

Sondas para el FISH:

Actualmente hay muchas alternativas para elegir la sonda a utilizar,


variando principalmente los mtodos de marcaje y deteccin, entonces las
sondas pueden ser de ADN o de ARN (ya sea de cadena doble o sencilla) u
oligonucletidos,(Chen et al., 2011) todas estas deben ser marcados con:
1

Sonda: pequeo fragmento de ADN, raramente de ARN, que est compuesto por
10 a 100 pb complementarias a un segmento de la cadena molde que se desea
detectar. (K. Wang, Zhang, Jiang, & Zhang, 2013)

a. Marcas radioactivas o haptenos


b. Marcajes directos e indirectos(Martinez et al., 2013)

Imagen 1: Metodologa tcnica FISH (Unique, 2013)

Imagen 2. Parte de un cariotipo enlazado a una tcnica FISH con fluorescencia roja.
(Q. Wang et al., 2015).

Imagen 3. Protocolo de aplicacin de la tcnica FISH a partir de una muestra


especfica. (Cdb, Gmp, This, To, & Pbs, n.d.)

Su eleccin depende de lo que se requiera tener al momento de realizar la


hibridacin:
a. Sensibilidad: Depende del fcil acceso que tenga la sonda marcada,
la cantidad y tipo de marca en la sonda y el mtodo de deteccin.
b. Resolucin: Puede variar en los sitios especficos de una clula, lo
cual depende de la sonda marcada y del mtodo de deteccin.

c. Especificidad: Depende de la selectividad del lavado y de secuencias


similares que interfieran en el pegado de la sonda.
d. Conveniencia y seguridad: Las marcas no radioactivas son ms
estables, seguras y rpidas. (Stock & Ramos-Cerillo, n.d.)
La preparacin de la sonda entonces estar en funcin del diseo que se
desea de la misma:

Sondas de cadena sencilla: Se debe usar la secuencia reversa


complementaria. Se pueden sintetizar por transcripcin para generar
mRNA, mientras que si se desea de ADN se sintetiza mediante una
duplicacin de segmento deseado y la amplificacin del mismo.
Sondas con oligos marcados: Se agregar cada oligonucletido para
lo cual es importante recordar que la secuencia anti-sentido es la
hebra complementaria reversa de la cadena lder y debe ser leda de
5 a 3.
Sondas de cadena doble: Pueden ser preparadas usando tcnicas de
amplificacin como PCR, en las cuales el nucletido marcado es
incorporado. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de usar.
(Martnez & Otero, 2013)

Otra caracterstica a considerar es el tamao de la sonda, teniendo en


cuenta que mientras ms larga sea esta, ms especificidad habr en el
proceso de hibridacin, adems las sondas largas pueden emitir una seal
ms fuerte al poseer mayor nmero de nucletidos marcados dentro de ella,
sin embargo, las sondas que son demasiado largas dan seales dbiles,
debido a que la sonda penetra menos eficientemente en la muestra.
(Martnez-Fernndez, Snchez-Izquierdo, & Martnez-Fras, 2010)
Otro aspecto importante es la capacidad de las estructuras del genoma para
detectar las sondas marcadas en las distintas fases de divisin celular, lo
ms usado es en metafase, entonces se puede tener:

Sondas que identifican una estructura especfica del cromosoma.


(sondas para identificar un cromosoma en concreto).
Sondas que hibridan con mltiples secuencias del cromosoma.
(sondas de pintado cromosmico).
Sondas que hibridan con una secuencia nica del ADN. (sondas para
detectar reordenamientos y mutaciones estructurales en los genes de
regiones cromosmicas concretas). (HErnndez & Martinez, 2015)
Tipos:

Existen varios tipos de FISH, que se basan principalmente en la muestra y


su preparacin, sobre la cual se aplicar la hibridacin.
o

FISH en metafase: Cuando las clulas estn en metafase, sus


cromosomas se encuentran condensados a modo de

preparacin para la divisin celular, se utiliza para detectar


micro-delecciones especficas, translocaciones o inserciones.
(Giorgi et al., 2013). Esta se puede observar en la imagen 4.
FISH en interfase: Tiene la ventaja de que no es necesario
cultivar previamente las clulas durante diversos das antes de
poder analizar los cromosomas, en esta fase la cromatina est
en torno a 10 000 veces menos condensada que en metafase,
lo que permite una mayor resolucin; se emplea para la
deteccin de aneuploidias o grandes delecciones, duplicaciones
en clulas fetales o tumorales. (Barrio-Caballero, 2013)
FISH en hebra: Se aplica sobre hebras de ADN
desproteinizadas2, esta tcnica permite detectar pequeas
reorganizaciones porque admite una mayor resolucin. (Giorgi
et al., 2013)
FISH inverso: Se usa mucho para determinar la procedencia de
un cromosoma marcador, se caracteriza por marcar el propio
ADN problema y convertirlo en una nueva sonda, luego se
aade a un cromosoma sin anomalas y si al final existe
complementariedad en las secuencias, se puede determinar
que ese cromosoma marcador procede del cromosoma con el
que hibrida. (HErnndez & Martinez, 2015)
FISH en chip: Se usa ms en muestras de sangre, se introduce
la muestra en el chip por capilaridad, se procede a digerir las
clulas y desnaturalizar el ADN con calor, luego se introducen
las sondas y se dejan hibridar con el ADN diana. Esta tcnica
posee muchas ventajas, el uso de menos cantidad de reactivos
y meno tiempo de anlisis, su alta sensibilidad y su menor
costo en comparacin con la tcnica convencional de FISH.
(Herrera, 2007)
FISH multicolor: Es una adaptacin del FISH que permite la
visualizacin de los 23 pares de cromosomas a la vez, teidos
con diferentes sondas fluorescentes. (HErnndez & Martinez,
2015)

Desproteinizada: cadena de ADN a la cual se le ha separado de sus histonas, que


son las protenas que le proveen la compactacin necesaria para la formacin de la
cromatina.

Imagen 4. Tcnica FISH en cromosomas en metafase, preparados para la


divisin celular. (Giorgi et al., 2013)

Aplicacin:

La tcnica de FISH tiene numerosas aplicaciones actuales como son:


o Identificacin de cromosomas especficos.
o Estudio del origen y la estructura de los genomas hbridos
o Comparacin de regiones homlogas para la deteccin de
anomalas
o Estudio del comportamiento de los cromosomas
o Localizacin de secuencias especficas y su ubicacin dentro de
los cromosomas.
o Posee numerosas aplicaciones en el diagnstico clnico y en la
investigacin bsica y aplicada (Herrera, 2007)
Especficamente se puede tener algunos ejemplos de estas aplicaciones
como son: la deteccin de enfermedades como la leucemia mieloide y
linfoblstica, ya sean agudas o crnicas; linfomas, mieloma mltiple,
neoplasias, malformaciones genticas y trastornos metablicos tambin de
origen gentico. (Lpez-Durn, Campo-Trapero, Cano-Snchez, Dez-Prez, &
Bascones-Martnez, 2010)
Adems es muy usado para detectar delecciones, duplicaciones e
inserciones que no pueden ser visibles con la investigacin simple al
microscpio. (Unique, 2013)
Algunas ejemplos de estas aplicaciones se muestran en la imagen 5.

Imagen 5. A) Localizacin de sondas de ADN repetitivo sobre cromosomas en


metafase. B) Localizacin de secuencias de ADN sobre cromosomas metafsicos. C)
Ubicacin de secuencias telomricas y centromricas. D y E) Discriminacin del
origen parental de los cromosomas en dos hbridos inter-especficos diferentes. F)
Fibras extendidas de ADN. (Herrera, 2007)

Ventajas y Desventajas:
Presenta numerosas ventajas, pero tambin desventajas que se
exponen en la tabla 1.
Ventajas

Desventajas

FISH

Generalmente no requiere
clulas en divisin, aunque
hay ciertos tipos que s lo
requieren.
Elevada rapidez.
Puede
analizar
grandes
cantidades de clulas.
Elevada
sensibilidad
y
especificidad.
Muestras
pueden
ser
almacenadas
en
parafina
congeladas sin problema.
Ciertos tipos de FISH como el
multicolor
y
el
inverso
permiten obtener informacin
de todos los cromosomas
siendo tiles para analizar
cariotipos complejos.

La eleccin y diseo de las


sondas puede ser complicado
y difcil de conseguir.
Solo puede estudiar unas
pocas alteraciones a la vez.

Tabla 1. Principales ventajas y desventajas de la tcnica FISH.(HErnndez &


Martinez, 2015)

CONCLUSIN
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