OBJETIVOS

Conocer y aplicar los fundamentos de la espectrofotometra para la

determinacin de concentraciones en soluciones.
Elaborar curva de calibracin
Enunciar la ley de Lambert Beer, comprender el significado de las
magnitudes que intervienen en ella e interpretar la naturaleza de las
desviaciones de esa ley

MARCO TEORICO
La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en
las investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un
instrumento que permite comparar la radiacin absorbida o
transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida
de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma
sustancia.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz
monocromtica a travs de una muestra y medir la cantidad de luz
que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador
realizar dos funciones:
1. Dar informacin sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente qu cantidad de la sustancia que nos
interesa est presente en la muestra

LEYES DE ABSORCION DE ENERGIA RADIANTE

Se refiere a las relaciones existentes entre la cantidad absorbente y
el grado con el que es absorbida la energa radiante. Hay dos
variables capaces de afectar al grado de absorcin: la concentracin
del absorbente y la longitud del trayecto que el rayo luminoso recorre
a travs de la solucin

LEY DE LAMBERT - BEER

Cuando una onda electromagntica de longitud de onda definida, incide sobre
una sustancia, la fraccin de la radiacin absorbida, ignorando las prdidas
debidas a reflexiones y disipacin, es una funcin de la concentracin de la
sustancia en la trayectoria de la luz y del espesor de la muestra.
Esta ley tambin es conocida como Ley de Beer o Ley de Beer-LambertBouguer. Se trata de una ecuacin matemtica que relaciona la absorcin de la
luz, con las propiedades del material que es atravesado por esta onda.

o
o
o
o
o
o
o

A: Absorbancia o densidad ptica.

IE: Intensidad de la luz emitida una vez atravesada la muestra.
I0: Intensidad de la luz incidente.
T: Transmitancia, cociente de intensidad emitida entre intensidad incidente.
K: Absortibidad del medio o coeficiente de absorcin.
B: Camino ptico o ancho de la celda.
C: Concentracin de la substancia absorbente.

Los espectrmetros dan la lectura directa de la absorbancia (A) o bien, el

porcentaje de transmitancia (% T).

TRANSMITANCIA
La transmitancia ptica se refiere a la cantidad de luz que atraviesa un cuerpo,
en una determinada longitud de onda. Cuando un haz de luz incide sobre un
cuerpo traslcido, una parte de esa luz es absorbida por el mismo, y otra
fraccin de ese haz de luz atravesar el cuerpo, segn su transmitancia. El valor
de la transmitancia ptica de un objeto se puede determinar segn la siguiente
expresin:
I es la cantidad de luz transmitida por la muestra e I0 es la cantidad total de luz
incidente

ABSORBANCIA
Cuando un haz de luz incide sobre un cuerpo traslcido, una parte de esta luz
es absorbida por el cuerpo, y el haz de luz restante atraviesa dicho cuerpo. A
mayor cantidad de luz absorbida, mayor ser la absorbancia del cuerpo, y menor
cantidad de luz ser transmitida por dicho cuerpo. Como se ve, la absorbancia y
la transmitancia son dos aspectos del mismo fenmeno. La absorbancia, a una
determinada longitud de onda lambda, se define como:

Donde I es la intensidad de la luz que pasa por la muestra (luz transmitida) y I0

es la intensidad de la luz incidente

PARTE EXPERIMENTAL
a) Elaboracin de una calibracin :
-

A partir de la solucin de azul de metileno ,preparar una dilucin de 10%

Luego

preparar

una batera de tubos

N TUBOS

SOLUCIN

10

AGUA
DESTILADA

10

Medir la intensidad de color de cada solucin

Tubo 1: 0
Tubo 2: 0.475
Tubo 3: 0.686
Tubo 4: 1.092
Tubo 5: 1.375
Tubo 6: 1.581

b) La muestra problema 2.810

c) Medir la longitud de la onda espectrofotmetro

CONCLUSIONES
Se ha llegado a la conclusin de que la espectrofotometra es un mtodo
analtico indirecto porque se basa en la medicin de la absorbancia o
transmitancia de las radiaciones; es de gran utilidad en la actualidad para la
identificacin de un analito en una muestra problema

CUESTIONARIO 3 - PRACTICA ESPECTROFOTOMTRICA

1. Que es un espectrofotmetro, haga un esquema indicando las partes externa
e internas de un espectrofotmetro de un solo haz y haga un cuadro
comparativo entre un espectrofotmetro de un solo haz y uno de doble haz?
Un espectrofotmetro es un instrumento usado en el anlisis qumico que
sirve para medir, en funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores
de una misma magnitud fotomtrica relativos a dos haces de radiaciones y la
concentracin o reacciones qumicas que se miden en una muestra.

CUADRO COMPARATIVO

E. DE UN HAZ

E. DE DOBLE HAZ

Consiste en una fuente de ctodo proviene de la fuente de ctodo hueco

se divide mediante un contador
hueco
reflejante y un divisor de haz

un contador o una
alimentacin de impulsos

fuente

Los dos haces se encuentran

de nuevamente en el mismo camino
ptico
mediante
un
espejo
semiplateado o recombinado antes de
entrar al monocromador

proveniente de la fuente pasa una mitad pasa a travs de la llama y

directamente a travs de todos los la otra es enviada por un paso ptico
componentes del instrumento hasta interno
llegar al detector

2. A que se llama coeficiente de extincin molar. Averige el coeficiente de

extincin molar de la hemoglobina y el beta caroteno.
El coeficiente de absorcin molar, coeficiente de extincin molar, o
absortividad molar, es una medida de la fuerza con una especie qumica
absorbe luz a una longitud de onda dada. Es una propiedad intrnseca de las
especies; la absorbancia real, Un, de una muestra depende de la longitud de
la trayectoria, l, y la concentracin, c, de las especies a travs de la ley de
Beer-Lambert.

COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR: BETA CAROTENO:

= 34.5 mg-1.ml.cm-1

COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR: HEMOGLOBINA

E = 2,805.10-2ml.mg-1cm

3. A que se llama espectro de absorcin y cual es su utilidad dentro del anlisis

qumico -bioqumico.
El espectro de absorcin de un material muestra la fraccin de la radiacin
electromagntica incidente que un material absorbe dentro de un rango de
frecuencias. De hecho, se emplea el espectro de absorcin para identificar
los elementos componentes de algunas muestras, como lquidos y gases;
ms all, se puede emplear para determinar la estructura de compuestos
orgnicos
UTILIDAD DEL ESPECTRO DE ABSORCION:
Espectroscopia de absorcin se emplea como una herramienta qumica
analtica para determinar la presencia de una sustancia particular en una
muestra y, en muchos casos, para cuantificar la cantidad de la sustancia
presente
4. Seale 3 causas experimentales y 3 causas qumicas que afectan la Ley de
Lambert y Beer
CAUSAS EXPERIMENTALES:

Las interacciones entre soluto y radiacin producidas por mecanismos

distintos a la absorcin producen una disminucin en la intensidad de
la luz que se puede confundir en la medicin pudiendo considerarse
como absorcin.
Falta de monocromatismo
Interacciones entre los solutos absorbentes.

CAUSAS QUIMICAS

Alteraciones del equilibrio de las reacciones que provocan una

alteracin de la concentracin del absorbente
La existencia de otros equilibrios qumicos, reacciones cido-base,
reacciones de precipitacin
Las reacciones de formacin de complejos pueden producir la
dispersin de la radiacin, tambin pueden modificar el color del
absorbente