UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD DE ING. GEOGRAFICA, AMBIENTAL Y

ECOTURISMO
ESCUELA
PRUEBA
DEDE ING. AMBIENTAL
MICRONUCLEOS EN
PECES CEBRA

PROFESOR:
BLGO. ALVAREZ ALVAREZ,
Felix
CURSO:
TOXICOLOGIA
AO/SECCION:
3er - TA
INTEGRANTES:
ALMONACID SARA, Ral
VILA ARAUCO, ngel
PEREYRA BORDA, Mary
ZIGA BUSTILLOS, Juver

PRUEBA DE MICRONUCLEOS EN PECES CEBRA

CONTENIDO
I. INTRODUCCIN................................................................................................ 1
II. OBJETIVOS....................................................................................................... 1
III. GENERALIDADES............................................................................................ 1
3.1. PEZ CEBRA................................................................................................ 1
3.1.1. Descripcin......................................................................................... 1
3.1.2. Dimencines....................................................................................... 1
3.1.3. Diferencias sexuales...........................................................................1
3.1.4. Comportamiento................................................................................. 1
3.1.5. Ambiente y cuidado............................................................................ 1
3.1.6. Alimentacin....................................................................................... 1
3.1.7. Reproduccin...................................................................................... 1
3.2. MICRONUCLEOS........................................................................................ 1
3.2.1. Descripcin......................................................................................... 1
3.2.2. Mtodo de medida de inestabilidad gentica: ensayo de
microncleos................................................................................................ 1
IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS...................................................................1
4.1. MATERIALES.............................................................................................. 1
4.1.1. Lminas porta y cubreobjetos.............................................................1
4.1.2. Tijera................................................................................................... 1
4.1.3. Pipetas pasteur................................................................................... 1
4.1.4. Cmara para lminas portaobjetos.....................................................1
4.1.5. Peces cebra........................................................................................ 1
4.1.6. Microscopio......................................................................................... 1
4.1.7. Giemsa al 10%.................................................................................... 1
4.2. PROCEDIMIENTO....................................................................................... 1
V. RESULTADOS................................................................................................... 1
VI. DISCUSIN DE RESULTADOS..........................................................................1
VII. CONCLUSIONES............................................................................................. 1
VIII. BIBLIOGRAFA............................................................................................... 1

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I. INTRODUCCIN
Los peces pueden actuar como organismos centinela para inferir el nivel de
exposicin de poblaciones humanas a sustancias qumicas txicas presentes en
los ecosistemas acuticos. En este sentido, la realizacin de bioensayos para
determinar los efectos de sustancias contaminantes de origen antropognico o
industrial, empleando peces como bioindicadores, proporciona informacin
sobre los efectos de contaminantes qumicos en ambientes acuticos,
permitiendo un mejor monitoreo de las condiciones ambientales.
Los microncleos son fragmentos o cromosomas completos que quedan fuera
del ncleo durante la mitosis; mediante su estudio se pueden evaluar los
efectos de genotxicos ambientales y ocupacionales. Esta prueba es
ampliamente utilizada y es una alternativa eficaz, sencilla y econmica para
detectar la perdida de material gentico.
En el siguiente informe describir los procedimientos llevados a cabo en una
prueba de microncleos en los glbulos rojos del pez cebra, expuestos a etanol
al 99%, as como la interpretacin de los resultados encontrados.

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II. OBJETIVOS

Evaluar el efecto genotxico inducido por el etanol utilizando al pez

cebra como biomonitor

Identificar y cuantificar los tipos de microncleos encontrados en la

muestra.

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III. GENERALIDADES
III.1. PEZ CEBRA
Nombre cientfico: Danio Rerio

III.1.1. Descripcin
Pertenece a la familia ciprnidos. Distribucin geogrfica Pakistn,
regiones orientales de la India. Su hbitat natural ros de las montaas,
aguas estancadas, canales y campos de arroz. Forma del cuerpo
pequeo, esbelto muy comprimido lateralmente, tiene dos pares de
barbillones. Dorso de color entre verde oliva y pardusco, flancos de color
azul brillante con cuatro estras longitudinales de un esplndido color
dorado, el vientre es de color blanco amarillento. Estriaciones de color
azul dorado tambin en la aleta anal, la aleta dorsal es de color amarillo
en la base. El ris de color rojo dorado, el oprculo azulado con manchas
y estras doradas.

III.1.2. Dimencines
Tiene de 5 a 6 cm.

III.1.3. Diferencias sexuales

Las hembras son ms grandes que los machos y de color ms plateado.
Estos peces con buenos cuidados pueden llegar a vivir entre 3-5 aos.

III.1.4. Comportamiento
Es un pez vivaz y pacfico. Se mantiene en cardmenes, por lo que es
recomendable mantener entre 6-10 individuos. Son grandes nadadores,
suelen permanecer en las capas medias y superiores del agua. La
mayor preocupacin, que pueden saltar, por lo tanto hay que cubrir con
una tapa de cristal. Forman parejas estables.

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III.1.5. Ambiente y cuidado

Pez Cebra uno de los peces ms comunes en los acuarios comunitarios.
Este es un pez muy conmovedor y sin pretensiones que
vive
cmodamente en los bancos de varios individuos. Pez Cebra macho
constantemente jugando
persiguen unos a otros, movindose
rpidamente en el acuario. Debido a que estos peces se mueven sin
cesar el acuario debe ser elegido ligeramente alargado. Y tambin es
mejor plantar en los bordes muchas plantas.
Debido a la densa
vegetacin del acuario debe estar equipado con una buena iluminacin,
dispuestos si es posible a la luz solar. Temperatura 18-25C, no soportan
bien las temperaturas superiores, pH de 7-7,5, dureza entre 5-15dGH.
Fondo: arena silcea, requiere sustitucin del agua semanal de 10-15%,
oxigenacin intensa.

III.1.6. Alimentacin
Especie omnvora, no muy voraz. Acepta todo tipo de alimentos sin
ningn problema en escamas o granulado. Antes de procrear es
recomendable suministrar un alimento vivo de pequeo tamao.

III.1.7. Reproduccin
A la madurez sexual Pez Cebra llega a los 3-6 meses, teniendo en
cuenta la esperanza de vida de estos peces de 3-5 aos. Pez Cebra son
capaces de reproducirse en cualquier poca del ao. Para empezar
durante unos das las hembras y los machos se colocan en grandes
acuarios (10 litros) con la temperatura del agua de 20 C, preparados
especialmente para el desove y se alimentan en abundancia con larvas
de mosquito rojo rico en nutrientes o daphnia vivo. Disposicin para
hembras en desove se determina por la forma del abdomen, durante la
maduracin de los huevos, se convierte en mucho ms gruesa, no slo
en la parte delantera, pero tambin en la parte de la aleta anal. Slo
para el desove debe elegir pequeos recipientes con fondo de cristal
transparente (por ejemplo, frascos de vidrio o acuarios 3-10 litros). La
arena en el fondo no es necesaria, para poder observar mejor el
desarrollo de los huevos. En la parte inferior del acuario se coloca
musgo, presionado cuidadosamente con piedras. El nivel del agua en el
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rea de desove debe ser de al menos 5-8 cm por encima del musgo. Es
mejor poner el acuario cerca de una ventana, donde llega bien la luz
natural. Productores (generalmente 2-3 machos y una hembra) se
colocan en el rea de desove a la tarde. La temperatura del agua no
debe ser demasiado baja. Durante la noche los peces se acostumbran, y
a la maana siguiente, cuando el desove est bien iluminada, y las
plantas comenzarn a producir activamente el oxgeno, para iniciar el
desove. Los peces estn empezando a moverse muy rpido. Los machos
persiguen a la hembra, tratando de pegarle en el abdomen, batiendo los
huevos y el esperma a la liberacin. Todo el proceso por lo general toma
alrededor de una hora. El nmero de huevos desovados de una hembra
depende del tamao y el grado de disposicin a desovar, y es de hasta
400 huevos. Despus deben trasplantar a los padres, ya que pueden
comer a los huevos. Los huevos generalmente maduran pasados los 3036 horas a 26-28 C, a temperaturas ms bajas, la maduracin puede
durar hasta 7 das. Los alevines unos das se aferran a las plantas o las
paredes del acuario, y luego poco a poco comienzan a nadar. En los
primeros das los alevines se alimentan con infusorias y luego a
medida que crecen, pueden trasladarse a otro acuario ms amplio. La
temperatura ptima del agua para el buen desarrollo de los jvenes
Peces Cebra es de 26 27 C, con abundante comida. En estas
condiciones los peces alcanzan la madurez sexual a los 2,5-3 meses.

III.2. MICRONUCLEOS
III.2.1. Descripcin
Los microncleos son cuerpos citoplasmticos de naturaleza nuclear, se
corresponden con material gentico no incorporado correctamente a las
clulas hijas durante la divisin celular, reflejan aberraciones
cromosmicas y se originan por roturas cromosmicas, por errores
durante la replicacin y posterior divisin celular del ADN y/o por la
exposicin a agentes genotxicas. Existen factores capaces de influir o
modificar el nmero de microncleos presentes en una clula (edad,

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gnero, vitaminas, tratamientos mdicos, exposicin diaria a agentes

genotxicos, etc.).
El ensayo citogentico para la deteccin de microncleos (CBMN:
cytokinesis-block micronucleus) se basa en la utilizacin de un agente
qumico, denominado citocalasina-B capaz de impedir la citocinesis
permitiendo la divisin nuclear proporcionando a las clulas un aspecto
de clulas binucleadas monodivididas. El recuento de microncleos se
realiza sobre 1.000 clulas binucleadas y la muestra de partida puede
variar aunque lo ptimo es el uso de linfocitos aislados de sangre
perifrica.
El ensayo de microncleos est considerado como un ensayo prctico,
universalmente validado y accesible tecnolgicamente, til para evaluar
la inestabilidad gentica inducida por agentes genotxicos.

III.2.2. Mtodo de medida de inestabilidad gentica: ensayo de

microncleos
Durante la divisin celular el material gentico (ADN) contenido en el
ncleo celular se replica y divide equitativamente dando lugar a dos
clulas hijas idnticas; este proceso puede producirse de manera
errnea debido a errores durante la replicacin y posterior divisin del
ADN, a roturas cromosmicas y al efecto de la radiacin y de sustancias
genotxicas, producindose prdida cromosmica y haciendo que el
reparto del material gentico no sea equitativo. Cuando esto ocurre, el
material gentico que se desprende y que, por tanto, queda excluido y
no se incorpora correctamente al ncleo de la clula hija, origina un
nuevo ncleo de menor tamao que el primario denominado microncleo (MN), visible fcilmente al microscopio ptico7. El material
gentico desprendido puede derivar de cromosomas enteros o, ms
frecuentemente, de fragmentos cromosmicos acntricos que quedan
excluidos de los ncleos de las nuevas clulas durante anafase mittica.
El uso de la tcnica de recuento de Manganeso, por ejemplo, como
medida de dao cromosmico sobre cultivos de linfocitos humanos, fue
propuesta por primera vez por Countryman y Heddle en 1976, cuyo
nico requisito era la eleccin de tipos celulares con gran actividad
mittica8. Ms tarde, en 1985, el ensayo de genotoxicidad fue mejorado
por Fenech y Morley, consiguiendo frenar el proceso de divisin celular
cuando la clula slo hubiese sufrido una divisin mittica, para ello
desarrollaron la tcnica del bloqueo de la citocinesis (CBMN: cytokinesisblock micronucleus) cuyo fundamento es la utilizacin de un agente
qumico denominado citocalasina-B cuya funcin es impedir la citocinesis
celular

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IV. MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

IV.1. MATERIALES
IV.1.1. Lminas porta y cubreobjetos
Estos dos objetos se utilizaron para poner la muestra de sangre del pez
raya y as poder llevarlo al microscopio.

IV.1.2. Tijera
Este material nos sirvi para decapitar al pez raya y as poder obtener su
sangre.

IV.1.3. Pipetas pasteur

Con este objeto echamos la giemsa hacia las lminas portaobjetos.
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IV.1.4. Cmara para lminas portaobjetos

Es donde se colocaron las lminas portaobjetos para que puedan estar
refrigeradas en etanol.

IV.1.5. Peces cebra

De ellos se obtendr la sangre para hacer la prueba de micro ncleos.

IV.1.6. Microscopio
Observacin del estado del nucleo del pez cebra.

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IV.1.7. Giemsa al 10%

Utilizado como colorante para poder pintar el ncleo y ser observado.

IV.2. PROCEDIMIENTO
De los peces cebras que se tenan como muestra, se escogi uno para
que le corten la
cabeza y as poder obtener su sangre arterial.

Ya con el pez decapitado se procedi a hacer el frotis en la lmina

portaobjetos para obtener la muestra de sangre.

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Luego se hace un frotis con un ngulo aproximado de 60 con otra lamina

portaobjetos. Esperar unos 15min para que la muestra se impregne.

Pasado ya el tiempo, la muestra es llevada a una cubeta que contiene

etanol, la muestra se deja ah por 8min refrigerada.

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Ya transcurrido el tiempo se saca la muestra y se deja secar al ambiente;

luego que ya seco se echa el Giemsa.

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Ya cuando tomo el color la muestra se lleva al microscopio para su

observacin.

V. RESULTADOS
Como resultado, tenemos microncleos del tipo II, los cuales se caracterizan
por una deformacin del ncleo, ms no de una fragmentacin.

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VI. DISCUSIN DE RESULTADOS

Las investigaciones relacionadas con el tema de la genotoxicidad adquieren
cada vez mayor importancia a nivel local, nacional y mundial, debido al
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creciente deterioro del ambiente al que se encuentra expuesto por las

diferentes actividades del hombre moderno (Thomann, 1982). El uso de los
ensayos de genotoxicidad en el pez Cebra propuesto en esta investigacin,
constituye el primer paso que asegure la toma de medidas de bioseguridad
apropiadas, y permita realizar los anlisis y la gestin de riesgos a priori en el
componente biolgico ante un determinado contaminante del agua (Agencia
AUPEC, 1998; Acta Toxicolgica Argentina, 2007; ACGIH. 2010).
En el ao 2012 por Resolucin Ministerial N 225-2012- MINAM el Ministerio del
Ambiente aprob el nuevo Plan de Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y
Lmites Mximos Permisibles (LMP) para el perodo 2012-2013 para el Per,
donde se realiza una corporacin o revisin de nuevos ECA priorizados para
agua en lo que respecta a los aceites y grasas, cianuro, cloruros, nitratos,
nitritos, nitrgeno amoniacal, slidos totales en suspensin, sulfatos, sulfuros,
fosfatos, fosforo total, antimonio, arsnico, cadmio, manganeso, mercurio,
nquel, termotolerantes y organolpticos. As mismo, incorpora como novedad
a la norma, la elaboracin del ECA para agua subterrnea que antes solo
exista para aguas superficiales.
Para los LMP relacionados al agua, en el sector minero se deber hacer una
revisin del LMP de las emisiones de las actividades mineras y metalrgicas.
Para el sector industrial se deber elaborar los LMP de los efluentes y
emisiones para industria petroqumica intermedia y avanzada; para la industria
de la imprenta, para las actividades del subsector industria y para la industria
siderrgica. Para el sector agricultura se deber elaborar los LMP de los efluentes de las actividades agroindustriales, tales como camales y plantas de
beneficio.
Y para el sector vivienda se ha incorporado la elaboracin de LMP de efluentes
de plantas desalinizadoras. De este modo, actualmente la legislacin y
normatividad peruana actual estn siendo revisadas y actualizadas en sus
Estndares de Calidad Ambiental (ECA) y sus Lmites Mximos Permisibles
(LMP) para que estn acorde a los estndares internacionales y se evale
primero la seguridad biolgica de todo tipo de producto potencialmente
peligroso.
Por lo expuesto, la implementacin de la nueva normatividad apunta a muy
corto plazo al uso de nuevos bioindicadores ambientales, tanto en animales
como en plantas, para la determinacin de los contaminantes del agua en
territorio peruano los cuales sern utilizados como una nueva herramienta de
biomonitoreo para complementar los nuevos ECAs y LMPs a implementarse
transversalmente en los estudios de impacto ambiental en diferentes sectores
de inters.

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Estos bioindicadores debern ser elegidos por su rpida reproduccin en

pequeos espacios que permita tener grandes stock de organismos para
diversos ensayos y repeticiones, y que no representen varias semanas o meses
de anlisis, que sean econmicos en su crianza, y que se posea un amplio
conocimiento de su biologa para su facilidad de manejo laboratorial y ser
adaptables a diversos laboratorios para lograr su replicacin. A nivel de
bioensayos laboratoriales en el Per, se ha recomendado el uso de los
siguientes organismos invertebrados: los crustceos Artemia sp. y Daphnia
magna, el insecto Chironomus calligraphus y el anlido Paragrellus redivivus. Y
el uso de los siguientes organismos vertebrados: el pez Cebra (Danio rerio), la
trucha Arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y el ratn (Mus musculus). Y en vegetales el uso de la cebolla (Allium cepa), la haba (Phaseolus sp.) y la microalga
Chrollela sp.
La aplicacin del ensayo de microncleos est siendo utilizada para el
monitoreo de la contaminacin de los ambientes acuticos junto con un
biocontrol para la deteccin de la genotoxicidad. Teniendo como material
biolgico a los eritrocitos nucleados (presencia de ADN nuclear) de la sangre
perifrica del pez Cebra (Danio rerio) se detect el dao celular en forma
directa por microscopia permitiendo evaluar rpidamente (24 a 72 horas) los
efectos nocivos de un contaminante acucola de inters que otros ensayos no
pueden hacerlo. Es un primer paso para alertar con el tiempo el padecer
mutaciones,
alteraciones
cromosmicas,
desarrollar
malformaciones
embrionarias o fetales y causar finalmente la mortalidad en un ambiente
acutico contaminado con metales pesados.

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VII. CONCLUSIONES
Al realizar el ensayo en peces cebra sometidos al etanol al 99% se pudo
observar que los glbulos rojos sufren daos considerables, puesto que al
observar al microscopio con un aumento de 400X se logra diferenciar glbulos
rojos con microncleos de diferentes tipos.
El ensayo de microncleos es una alternativa al test de aberraciones
cromosmicas convencional, en el que se analizan las alteraciones presentes
en metafases mitticas y permite detectar aberraciones cromosmicas que
responden a alteraciones de tipo estructural (efecto clastognico) o
alteraciones numricas (efecto aneugnico) del agente en estudio.
Adems, con el ensayo de microncleos se consigue:
a) Reducir la dificultad a la hora de realizar el recuento.
b) Mejorar la sensibilidad del ensayo, ya que los MN slo se cuentan en
clulas que han completado una divisin nuclear.
c) Incrementar la potencia estadstica de los estudios al analizar miles de
clulas en lugar de cientos de ellas.
d) Reducir el coste del ensayo.
El ensayo de microncleos es, por tanto, un ensayo prctico, universalmente
validado y accesible tecnolgicamente, til para evaluar la inestabilidad
gentica inducida por agentes genotxicos.

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VIII. BIBLIOGRAFA

Albert, L.A. (1997). Introduccin a la toxicologa ambiental. Centro

Panamericano de Ecologa Humana y Salud, Divisin de Salud y
Ambiente, Organizacin Panamericana de la Salud, Organizacin Mundial
de la Salud y Secretara de Ecologa. Metepec, Mxico

Bez Ramrez, O.A. y F. Prieto Garca. (2004). Bioacumulacin y daos

genotxicos en pez cebra (Danio rerio) por arsnico en aguas de
Zimapn, Hidalgo, Mxico. Ensayos en cortos plazos. Revista AquaTIC,
21:62-70. Disponible en URL: http://www.revistaaquatic.com

Salas, H., Lobos, J., Dos Santos, J., De Ferncola, N. (2001). Seccin 1
Perspectiva. En Organizacin Panamericana de la Salud (Ed.), Manual de
evaluacin y manejo de sustancias txicas en aguas superficiales. Lima:
Centro Panamericano de Ingeniera Sanitaria y Ciencias del Ambiente.

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