INTRODUCCIN

Una sonda es un reactivo biolgico constituido por un fragmento de ADN que posee
una secuencia de bases complementaria a la del genoma de un microorganismo. Las
sondas gnicas son molculas de ADN sealadas con un marcador que tienen el poder
de reconocer genes en los cromosomas y establecer si dichos genes son normales o
portadores de alteraciones.

Las ventajas de las tcnicas moleculares han sido ampliamente publicitadas en

los ltimos 7 aos, lo que sin duda ha aumentado la presin en los laboratorios
clnicos para comenzar a usarlas en una amplia variedad de enfermedades
infecciosas, genticas, oncolgicas y neurolgicas.
Usando las nuevas tcnicas de la ingeniera gentica, es posible localizar y
analizar un gen entre miles, utilizando el PCR o construyendo y usando sondas
genticas. Estos hechos han convertido a las tcnicas de gentica molecular y
biotecnologa en herramientas fundamentales para la deteccin y tratamiento
de estas enfermedades no slo en la especie humana, sino en el mundo de la
veterinaria.
Hasta hace algunos aos, slo se poda saber que un individuo haba heredado
tal o cul enfermedad gentica, cuando los sntomas se hacan evidentes y slo
poda darse una estimacin de la probabilidad de que sus hijos heredaran un
desorden en particular. Usando las nuevas tcnicas de la ingeniera gentica,
es posible localizar y analizar un gen entre miles, utilizando la Reaccin en
Cadena de la Polimerasa (PCR, del ingls Polimerase Chain Reaction) o
construyendo
y
usando
sondas
genticas.
Las sondas pueden ser usadas para detectar microorganismo directamente de
una muestra clnica (secreciones bronquiales, orina, etctera) o para confirmar
la identificacin de un cultivo que por otros mtodos tarda varios das
(Legionella pneumophila, Chlamydia trachomatis, etctera). Adems, las
sondas pueden ser usadas para hibridacin in situ para evaluar la respuesta del
husped a un agente infeccioso en particular y tambin para determinar la
extensin de la infeccin mediante el estudio de muestras de tejidos de varios
rganos. Muchos de ellos han sido desarrollados por varios fabricantes y slo
se diferencian en la secuencia a la cual est dirigida la sonda.
El diagnstico mediante el empleo de sondas gnicas puede utilizarse tambin despus
del nacimiento, por ejemplo, para precisar la naturaleza y amplitud de una alteracin
gentica; o para el caso de parejas procedentes de familias "de riesgo" en particular
para las mujeres que deseen saber si son "portadoras " de un determinado precursor
de enfermedad.

OBJETIVOS

Conceptualizar de manera clara las sondas gnicas.

Identificar los tipos de sondas gnicas.
Describir el desarrollo de la obtencin de sondas gnicas.
Identificar su utilidad.

SONDAS GNICAS COMERCIALES

I.- Definicin
La sonda es una copia fiel de un gen o de un fragmento de ARN o ADN y se unir
exclusivamente esa secuencia de la que es copia. Esto es lo que se llama especificidad
de la sonda.
Es decir, Sonda es una secuencia (fragmento) de ADN monocatenario marcada con
algn isotopo radiactivo o mediante mtodos no radiactivos (como fluorescencia); que se
usa para detectar fragmentos de ADN o ARN con homologa secuencial en la paridad de
bases nitrogenadas especficas (Guanina con Citosina y Adenina con Timina).
Las sondas de cDNA se obtienen a partir de la copia de un mRNA y, por tanto,
corresponden a secuencias codificantes de un gen. Las sondas RNA son copias del RNA
y se obtienen in vitro, mediante la sntesis de una cadena complementaria utilizando una
RNA-polimerasa.
El uso y aplicacin de las sondas gnicas est basado en la aplicacin de la tcnica
citogentica de Hibridacin in situ por fluorescencia (cuyas siglas en ingls la denominan
FISH).
Una vez que la sonda se une a la secuencia diana se detecta y cuantifica. La deteccin
solo es posible si la sonda se ha marcado con un grupo detectable. Dependiendo del
nmero de estos grupos incorporados y de la seal que emitan la sonda puede tener
diferente sensibilidad.
II.- TIPOS DE SONDAS
A) Segn el tamao: Se escogen en funcin de la secuencia diana (ADN o ARN) y se
tienen en cuenta la longitud y el tipo de secuencia diana as como el medio de
marcaje y deteccin.
1. Sondas grandes: secuencias de ADN bicatenario de una longitud de 1-4 kb.
Pueden ser genmicas, secuencias con intrones y exones, o de ADNc, sin
intrones, obtenidas a partir de la transcripcin inversa del ARNm.
2. Sondas pequeas: son secuencias monocatenarias de 15-50 nucletidos.
Reciben el nombre de oligonucletidos sintticos. Son de ADN.
3. Sondas intermedias: son de ARN.
B) Tipo de sonda y mtodo de sntesis: Distintos tipos de sondas de cidos
nucleicos pueden ser utilizadas para la hibridacin in situ:
1. Sondas de DNA doble cadena. Pueden ser preparadas utilizando tcnicas

como nick translation, random priming o PCR, en las cuales el nucletido

marcado es incorporado. PCR y random priming proporcionan una buena
actividad especfica. Estas sondas pueden ser desnaturalizadas antes de
usar. Cuando se usan para detectar una cadena simple como mRNA, estas
son menos sensibles debido a que la concentracin de la sonda marcada es
reducida
2. Sondas de DNA de cadena simple (largas). Pueden ser preparadas
utilizando primer extensin en templados de cadena simple o por PCR con
un nucletido marcado. ste ltimo es el ms usado porque es ms fcil de
llevar a cabo y las marcas pueden sintetizarse con poca cantidad de material.
El PCR permite una gran flexibilidad en la eleccin de las secuencias
marcadas por el uso de primers. Estas marcas han sido ampliamente usadas.
3. Oligonucletidos (entre 20 y 40 bases). Son marcados incorporando
oligonucletidos modificados durante la sntesis qumica o adicionando una
cola marcada. Una de las desventajas es que algunos oligonucletidos
marcados no se incorporan y por tanto la sensibilidad disminuye.
4. Sondas de RNA de cadena sencilla. Pueden ser sintetizadas por el uso de una
RNA polimerasa (SP6, T7 o T3 RNA polimerasa). La secuencia de la
sonda es clonada en un vector que flanquear dos sitios distintos de
iniciacin.
La cadena de RNA antisentido (sonda) es sintetizada en direccin opuesta al
gen endgeno. Se recomienda linearizar la sonda de RNA con enzimas que
dejen el extremo 5 cohesivo, porque se ha reportado, que el extremo 3 romo
promueve la sntesis de transcritos anormales.
III.- MARCAJE DE SONDAS.
Sitios de marcaje o modificacin:
Para detectar hibridacin hay que usar sondas marcadas o modificadas y para ello se
marcan los nucletidos sin que se vea disminuida la capacidad de apareamiento entre
bases complementarias. La 2-amino-adenina se incorpora en sondas pequeas y forma 3
puentes de H con su complementaria, la timina. La caseina sustituye a la guanina en el
ARN rico en GC y solo forma 2 puentes de H con la citosina. Si se aaden istopos
radiactivos las propiedades del marcaje no se ven modificadas.
Posibles sitios de marcaje de las bases:
Adenina: Citosina: Uracilo: Guanina: Timina:
Existen dos alternativas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda: el
marcaje radioactivo que es detectado por autorradiografa, o por haptenos (no radioactivo)
el cual es detectado directa o indirectamente por inmunocitoqumica.

Isotpicos

radioactividad

No isotpicos

no radioactivos

Sistemas

directos
Indirectos

Los sistemas isotpicos ofrecen una alta sensibilidad, particularmente con tritio, as
como alta resolucin. Por otro lado el empleo de radioistopos requieren licencia
especial. El mtodo de deteccin (autorradiografa) requiere un tiempo de
exposicin de semanas.
Con el uso de sondas radioactivas es posible hacer un mtodo cuantitativo.
El marcaje de la sonda se puede dar de 2 formas:
Marcaje radiactivo
Se puede marcar radiactivamente la sonda utilizado nucletidos que tengan alguno de sus
tomos con un istopo radiactivo, normalmente 32P, pero tambin es frecuente el uso de
tritio. Este tipo de marcaje es apreciable mediante autorradiografa. El uso de este tipo de
marcaje va a asociado con los peligros que trae el uso de elementos radiactivos, as como
tambin por ser un agente mutagnico este podra llegar a modificar la ultra estructura del
ADN de muestra, razn por la que se desarrolla otro mtodo que es el marcaje
inmunolgico.
Algunos istopos han sido usados para marcajes radiocativos en la hibridacin in situ,
que difieren en cuanto a la resolucin de la seal, la velocidad en obtencin de
resultados y la estabilidad de la sonda.
a)

b)

c)

d)

3
H - proporciona una seal
exposiciones autorradiogrficas.

nivel

subcelular

pero

requiere

largas

35
S proporciona resolucin de un dimetro celular, con tiempos de
exposicin de una semana. Agentes reductores como el ditiotreitol (DTT)
35
pueden ser incluidos en la solucin que contenga S para proteger al azufre de la
oxidacin. La vida media de este istopo es de 87 das y la marca debe ser usada
en un mes aproximadamente.
32

35
P da una resolucin menor que el S y adems proporciona una baja
eficiencia en la autorradiografa, ofrece una pequea ventaja en cuanto a la
velocidad de obtencin de resultados. Posee una vida media de 14 das.

33
35
P da una resolucin similar a S, pero ste tiene una vida media ms corta
(25 das) y el costo es mayor.

Marcaje no radioactivo

Las sondas se marcan utilizando nucletidos que llevan unida una molcula
(digoxigenina), a la solucin se le aaden anticuerpos especficos que se unen a
esa molcula; y estos anticuerpos llevan asociado un compuesto luminiscente o
fluorescente (como fluorforos o fluorocromos: fluorescena, rodamina) que deja
impronta fotogrfica.
Existen dos tipos de sistemas no isotpicos para la prueba de hibridacin: directo e
indirecto.
El mtodo directo, la molcula detectable (reportera) es enlazada
directamente al cido nucleico y este hbrido puede ser visualizado en
el microscopio inmediatamente despus de la reaccin de hibridacin. El
paso limitante en ste mtodo es que el hbrido subsista a las condiciones de
lavado. Lo ms importante, adems, es que la molcula reportera no
interfiera con la hibridacin.
Los mtodos indirectos, requieren una marca que contenga la molcula
reportera, introducida qumica o enzimticamente, que pueda ser detectada
por afinidad citoqumica. En este mtodo al igual que el anterior, el marcaje
no debe interferir con la hibridacin, ya que la molcula reportera debe estar
accesible a los anticuerpos que la detecten.

IV.- VENTAJAS DE LAS SONDAS GENTICAS

Las ventajas de estas tcnicas son que nos permiten investigar directamente al
microorganismo, sin necesidad de que se encuentre viable, ni de que est en cultivo puro.
Hoy en da se utiliza para identificar microorganismos no cultivables, de lento crecimiento
o difcil y de identificacin compleja. Es posible utilizarlo en cualquier tiempo de muestra
biolgica y permite la identificacin de genes no expresados fenotpicamente. Son
tcnicas muy vlidas, pues el ADN es muy estable.

Los inconvenientes ms importantes son que se necesitan un nmero mnimo de copias

del fragmento de cido nucleico problema que se quiere detectar, por eso en las muestras
con escasos nmero de unidades infecciosas se obtiene una baja sensibilidad. En
ocasiones este problema se resuelve detectando ARN en vez de ADN, pues el primero
suele estar en mayor cantidad.

Otra forma de intentar resolver este problema consiste en aumentar en vitro el nmero de
copias mediante tcnicas de amplificacin.

Actualmente disponemos de sondas (Gen-Probe, Syngene) para identificacin de M.

tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. Entre las principales
ventajas de las sondas genticas hay que destacar la sencillez de su manipulacin, que
permite su adaptacin a cualquier laboratorio. El principal inconveniente es su coste. Es
una tecnologa muy utilizada en la actualidad en laboratorios nivel II.

SONDAS GNICAS COMERCIALES

Sondas Gnicas
Se obtienen y basan su elaboracin a partir de la gran cantidad de secuencias de ADN
repetitivo (intergnico: disperso o yuxtapuesto en tndem) encontradas en y alrededor
del centrmero de cromosomas especficos. En la actualidad son usadas para el
diagnstico rpido.

Tipos de sondas utilizadas en FISH convencional:

En la actualidad hay un gran nmero de sondas comerciales disponibles, ofreciendo
todas ellas un resultado rpido y fiable en la caracterizacin de determinadas anomalas
cromosmicas.
Se distinguen 4 tipos de sondas, en funcin de las estructuras que son capaces de
detectar en el ncleo celular o en metafase.

Sondas locus especfico:

Estas sondas hibridan con una secuencia nica de ADN, son especficas para un
locus determinado. Se conocen como sondas LSI (locus specific identifier). EN
funcin de su diana, tienen un tamao de 1-10 kb (plmidos) o son vectores ms
largos 80kb - 1Mb (Bacterial artificial chromosomes BACs, Yeast artificial
chromosomes-YACs)
Las sondas de secuencia nica permiten detectar reordenamientos estructurales
de genes o de regiones cromosmicas concretas e identificar delecciones y
duplicaciones submicroscpicas de hasta 3 Mb: No obstante, su aplicacin
requiere conocer a priori la regin que se desea estudiar.

Sondas centromricas:
Identifican los centrmeros, los cuales a pesar de ser prcticamente idnticos para
todos los cromosomas, se distinguen en 2-3% de su secuencia, lo que permite que
la mayor parte de los centrmeros individuales puedan ser distinguidos a
excepcin de los centrmeros de los cromosomas 13 y 21, y de los centrmeros
de los cromosomas 14 y 22.
Permiten detectar cromosomas concretos e identificar alteraciones de tipo
numricos, especialmente monosomas, trisomas y otras aneuploidas en
metafases y tambin en ncleos interfsicos. Se conocer como sondas CEP
(chromosome enumeration probe)

Sondas subtelomricas:
Son sondas de ADN que identifican regiones cromosmicas prximas a los
telmeros, que contienen secuencias nicas que son especficas para cada
cromosoma. Poseen una alta resolucin que vara segn la medida de la sonda
utilizada (30-100 Kb). Han demostrado ser una herramienta muy til para la
deteccin de muchas anomalas cromosmicas que implican las regiones
telomricas. Dicha identificacin es importante dado que estas regiones
subtelomricas contienen gran cantidad de genes.

Sondas de pintado cromosmico:

Con la sonda de pintado cromosmico simple correspondiente a un determinado
cromosoma se consigue pintar slo los cromosomas homlogos correspondientes,
permitiendo as detectar de forma rpida, alteraciones numricas y estructurales
intercromosmicas que afectan a ese cromosoma especfico.
Son sondas complejas de ADN, generadas a partir de cromosomas
microdiseccionados que se amplifican por DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotide
Primer-Polimerase Chain Reaction), se marcan e hibridan con mltiples
secuencias del cromosoma, con excepcin de las regiones centromricas y
telomricas. As, tras la hibridacin aparece pintado uniformemente todo el
cromosoma. Estas sondas, tambin conocidas como sondas WCP (whole
chromosome painting) sirven fundamentalmente para detectar traslocaciones
difciles de identificar con las tcnicas de citogentica convenciones, as como
para identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma

derivativo o en pequeos marcadores supernumerarios. Si bien se pueden utilizar

en interfase, se aconseja su uso sobre metafase.
Los principales inconvenientes de la utilizacin de estas sondas son la no
deteccin de inversiones paracentromricas y su baja resolucin, que impide
detectar pequeas delecciones, duplicaciones y traslocaciones ( 2-3 Mb)
Con el pintado cromosmico mltiple se consigue pintar de forma simultnea todos
los cromosomas pero en metafases independientes. Esta variante de FISH se
realiza utilizando el Kit comercial Chromoprobe-M Multiprobe System, (CytoCell
Ltd, UK).

OTRAS SONDAS
Sondas BCR/ABL:
Especificaciones de la sonda:
BCR (22q11.23) verde
ABL (9q34) rojo.
La presencia del cromosoma Filadelfia (Ph') tiene una importante repercusin diagnstica
y pronstica en una serie de enfermedades hematolgicas. Esta anomala es
caracterstica de la leucemia mieloide crnica (LMC), esta anormalidad afecta a los
cromosomas 9 y 22.
El defecto gentico del cromosoma Filadelfia consiste en un fenmeno conocido como
translocacin. Partes de dos cromosomas, el 9 y el 22 (translocacin 9-22), intercambian
sus posiciones. El resultado es que parte del gen de regin de fractura (BCR, Breakpoint
Cluster Region, en ingls) del cromosoma 22 (regin q11) se fusiona con parte del gen
ABL del cromosoma 9 (regin q34). El gen ABL toma su nombre de Abelson, el nombre
de un virus causante de leucemias precursor de una protena similar a la que produce
este gen.
El resultado de esta translocacin es la produccin de una protena de peso p210 o p185
(p es una medida de peso para protenas celulares en unidades de masa atmica).
Puesto que el cdigo del gen ABL es capaz de aadir grupos fosfatados a residuos de
tirosina (mediante la enzima Tirosinquinasa), la fusin de los genes BCR-ABL tambin es
una enzima Tirosincinasa (Aunque la regin BCR del gen es tambin una enzima
serina/treonina protena-kinasa, la funcin de la tirosina kinasa es muy relevante para la
terapia de esta enfermedad).
La protena resultante de la fusin BCR-ABL interacta con la subunidad receptora
Interleuquina 3beta(c). La transcripcin del BCR-ABL permanece activa continuamente,
sin necesidad de ser activado por otras protenas mensajeras. En cambio, el BCR-ABL
activa un nmero de protenas y enzimas controladoras del ciclo de divisin celular.
Adems, inhibe la reparacin del ADN, causando la inestabilidad del genoma y siendo una
potencial causante de la temida crisis en cadena de la leucemia mieloide crnica, con
una alta tasa de mortalidad.
El cromosoma Filadelfia se designa como cromosoma Ph (o Ph'), y la translocacin que lo
causa se expresa como t (9;22)(q34;q11).

Actualmente se realiza esta tcnica en el Laboratorio de Gentica del instituto de

Enfermedades Neoplsicas para 2 tipos de leucemias:
Leucemia Mieloide Crnica para la deteccin de la fusin gnica BCR-ABL
Leucemia Mieloide Aguda tipo M2 para la deteccin de la fusin gnica AML-ETO y
para el cncer de mama para la deteccin de la amplificacin del gen Her-2 neu ETO
AML / ETO AML AML / ETO Sonda AML / ETO ETO ML Citogentica Molecular
Sondas Unilocus:
Son especficas para un locus particular. Se utilizan con xito en la identificacin de
minsculas delecciones y duplicaciones submicroscpicas.
Pintar cromosomas:
Consiste en la mezcla de sondas de diferentes partes de un cromosoma en particular.
Cuando esta mezcla de sondas se usa en una hibridacin, el cromosoma entero fluorece,
por lo que decimos que est pintado. Pintar cromosomas es muy til para caracterizar
reordenamientos complejos, tales como translocaciones sutiles, y para identificar el origen
de material adicional de un cromosoma, como pequeos marcadores de supernumerarios
o anillos.
Pintar a la inversa:
En este procedimiento una porcin de material cromosmico no identificado, pequeos
marcadores supernumerarios o anillos, se usa para pintar por hibridacin una metafase
normal. El cromosoma no identificado se obtiene por separacin de clulas activadas por
fluorescencia, el cual es amplificado utilizando la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) para preparar dicha pintura. El origen del segmento no identificado se obtiene
mediante la identificacin del cromosoma sobre el cual se hibrida.
Cariotipo de espectro multicolor:
El ltimo logro de la tecnologa FISH es utilizar todas las sondas cromosmicas para
obtener un cariotipo humano multicolor, en el cual cada par de homlogos cromosmicos
puede ser identificado en base a su color. Para un cromosoma completo cada sonda se
prepara de tal forma que, cuando se une a un marcador fluorescente, da una seal
espectral diferente, que se analiza con un programa de ordenador. Este abordaje es
extremadamente til para detectar sutiles reordenamientos cromosmicos o
constitucionales en pacientes con anomalas adquiridas, como el cncer, o del desarrollo.

HIBRIDACIN GENMICA COMPARATIVA (CGH)

La CGH (del ingls comparative genomic hybridization) es una ventajosa modificacin del
mtodo de pintar a la inversa, de gran utilidad en gentica del cncer para detectar
regiones de prdidas allicas y amplificacin gnica. El ADN experimental o tumoral se
pinta de color verde y rojo el ADN control. Las dos muestras se mezclan e hibridan sobre
metafase normal. Si la muestra experimental contiene ms ADN de una regin
cromosmica en particular que la muestra control, la regin se identificar por el

incremento de fluorescencia verde sobre la roja. De forma anloga, una deleccin en la

muestra experimental mostrar una reduccin en la proporcin verde sobre rojo.
Sondas PML/RARA
Las sondas satlites consisten en secuencias especficas generadas de satlites DNA
altamente repetitivo, localizados en regiones centromricas, pericentromricas o
heterocromticas de cada cromosoma.
Estas sondas permiten una rpida identificacin y enumeracin de cada uno de los
cromosomas, tanto en interfase como en metafase.
Tambin se ofrecen sondas satlite doblemente marcadas para X e Y, cada una de ellas
marcada con rojo o verde respectivamente.

AQUARIUS HEMATOLOGY PROBES

Referencia: LPH
FISH Lquida desrdenes Hematolgicos.
FISH especficas para anomalas relacionadas con problemas hematolgicos:
13q14,3 Delection Probe (D13S39, D13S25)
MYH11 (16p13,1) Breackpoint Probe.
PML/RARa Translocation Probe
AQUARIUS PAINTING PROBES
Referencia: LPP
FISH marcaje cromosomas completos.
Marcaje mediante sondas que hibridan a lo largo de cada cromosoma completo para
identificacin de cada uno de ellos y deteccin de traslocaciones.
Cada una de las sondas est disponible marcada en verde y en rojo para la mejor
combinacin y estudio.
AQUARIUS SUBTELOMERIC PROBES
Referencia: LPT
FISH Liquida Regiones Subtelomricas
Reestructuraciones cromosmicas relacionadas con los extremos de los cromosomas son
causa importante de enfermedades genticas. La regin cercana a los telmeros es
enormemente rica en genes.
Estas anomalas de las regiones subtelomricas estn ntimamente ligadas a retrasos
mentales y anomalas congnitas.

AQUARIUS MICRODELECTION PROBES

FISH Liquida Microdelecciones

Los sndromes de microdelecciones son un grupo heterogneo de desrdenes genticos
causados por la deleccin de regiones especficas de DNA cromosmico, causando
haploinsuficiencias de genes importantes.
Estas delecciones son difciles de detectar utilizando tcnicas tradicionales de
citogentica.
La Fluorescencia In Situ (FISH) puede resolver la deteccin de estas delecciones
submicroscpicas a un lmite aproximado de 3 Mb de resolucin y por lo que se ha
convertido en el mtodo de eleccin para el diagnstico de estas enfermedades.
Las diferentes sondas de microdelecciones son las siguientes:

DiGeorge/VCFSTUPLE1
DiGeorge/VCFSN25
Prader-Willi/Angelman
Angelman(UBE3A/D15S10)
Smith-Magenis/Miller-Dieker/ILS
Williams-Beuren
Wolf-Hirschhorn

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA
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Mxico.

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