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2010/11
Cultivos celulares
Mercedes Palmero
Dpto. ptica, farmacologa, y anatoma
rea de Farmacologa
F. Ciencias
Cultivos celulares
Introduccin
El medio de cultivo
ACC. 2010/11
INTRODUCCIN
INTRODUCCION
ACC. 2010/11
INTRODUCCION
Cmo crecen
Qu necesitan para crecer
Cmo/Cuando dejan de crecer
INTRODUCCION
Ventajas in vitro
Desventajas in vitro
Esterilidad estricta
Caracterizacin y homogeneidad
Cantidad y costo
de las muestras
Econmico
Inestabilidad
Validacin del modelo in vitro
Motivaciones ticas
ACC. 2010/11
ACC. 2010/11
Crecimiento en suspensin
Independiente de anclaje
Crecimiento en monocapa
Dependiente de anclaje
Vidrio
Plstico desechable
Membranas plsticas porosas
Microsoportes
Superficies tratadas
- medio de crecimiento de otros cultivos
Matrices tridimensionales
Sustratos no adherentes
Interfases liquida-gel, lquido-lquido
Haces microcapilares permeables
- gelatina
- poli-D-lisina
Recipientes
Placas de Petri
Frascos de Roux
Multiplacas
Roller bottles
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Oxigeno
Dioxido de carbono
H2O + CO2
H2CO3
H- + HCO3-
Condiciones fisiolgicas
Composicin del medio = Nutrientes
Aminocidos (glutamina)
Vitaminas (grupo B)
Minerales
Carbohidratos (glucosa)
Composicin
Lote
Coste
Dependencia del suministro
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Si se reemplaza el Suero
+ factores de adhesin
+ inhibidores de proteasas
+ hormonas
+ factores de crecimiento
+ nutrientes
+ protenas y poliamidas
3. R.P.M.I. 1640.
Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas.
9. Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares con suplementos
protenicos.
10. Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de
cromosomopatas
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Crecimiento en MONOCAPA
Crecimiento en SUSPENSIN
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ESTRS
Cambio morfolgico
Perdida de polaridad
Alteracin protenas de membrana
Sobrevivir
Reparacin
Adaptacin
Crecer
Expresin funcin
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N de clulas
Fase
estacionaria
Fase
exponencial
(log)
Fase
de declive
Muerte celular > divisin celular
Crecimiento exponencial
Fase de quietud
(lag)
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Periodo de
adaptacin al medio
Das en cultivo
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CARACTERISTICAS DE LAS
CELULAS EN CULTIVO
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Confluencia
Digestin enzimtica
Subcultivo
Listo para experimento
LINEAS CELULARES
Subcultivos..
LC FINITA
LC CONTNUA
LC TRANSFORMADA
LC NEOPLSICA
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Origen
Biopsia
Animales grandes (matadero)
Animales pequeos
a) rgano o tejido no patolgico o Tumor
b) Tejido embrionario o adulto
c) Especie
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3. Digestin enzimticqa
b) Clulas organizadas en un tejido slido
separarlas del tejido
purificar las que interesan
+ TRIPSINA
Digestin tejido
15-60 min
Enzimas Proteolticos:
Tripsina
Dispasa
Colagenasa
Pronasa
Elastasa
Hialuronidasa
Lavados x 3: PBS,
: 250-300 xg, 5-10 min
Sb
Sb
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Fibroblastos
Msculo liso humano
EPR humano
CGR bovino
EPR bovino
Disociacin celular
Subcultivo
Enzimticos
Mecnicos
Qumicos
Mtodos qumicos
Mtodos Enzimaticos
+ Proteasas
+ EDTA
Mtodos Mecnicos
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Inhibidores tripsina
Adicin de SFB
Lavados
Contar
Dividir en diferentes recipientes
TRIPSINIZAR
Contar
Sembrar en placas para experimento
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ASEPSIA
rea de trabajo
- Alejada de zona de paso
- Habitculo aislado:
- Aire filtrado:
- Equipo de filtracin
- Regulador de temperatura
* Equipo de esterilizacin
* Incubadores
* Otros instrumentos
* Instrumentos pticos
Cabinas de flujo laminar Horizontal
Vertical
OBJETIVO
- Proteccin personal manipulador
- Proteccin cultivo, experimento..
- Proteccin del medio ambiente
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Equipo de esterilizacin
Autoclave
Esterilizacin por calor tanto de slidos como de lquidos.
Se realiza a 121C, 1 atmsfera de sobrepresin
(t>20 min.)
Equipos de filtracin
- Fuente de vaco conectada a un kitasato dotado de una unidad de
filtracin (esterilizada por autoclavado)
- Bomba peristltica que fuerza el flujo de solucin a travs de una
unidad de filtracin hermtica.
En ambos casos la esterilizacin se produce al atravesar la solucin
un filtro de poro 0.22 m.
Mechero Bunsen
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Instrumentos pticos
MO de contraste de fases
Otros instrumentos
Contador electrnico de clulas
Centrfugas
Equipo de purificacin e agua
Balanzas
pHmetro
Pipeteadores
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CULTIVOS CELULARES
reas de investigacin
Actividad intracelular
Flujo intracelular
Ecologa celular
Interacciones celulares
Animales transgnicos
Fusin celular
Citotoxicidad
Virologa
Cncer
Inmunolgica
Ingeniera de protenas
Interaccin y sealizacin celular
Diagnostico
Trasplantes rganos y/o tejidos
Industriales
Agronmicas
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