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ACC.

2010/11

AVANCES EN CULTIVOS CELULARES. MASTER BIOMEDICINA. CURSO 2010/11

Cultivos celulares

Mercedes Palmero
Dpto. ptica, farmacologa, y anatoma
rea de Farmacologa
F. Ciencias

Cultivos celulares

Introduccin
El medio de cultivo

Comportamiento de las clulas en cultivo


Caractersticas de las clulas en cultivo

Cultivo primario. Establecimiento de lneas celulares


El laboratorio

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INTRODUCCIN

INTRODUCCION

Rechlinhausen (1866): mantuvo vivas clulas sanguneas de anfibio


Roux (1885): clulas de embrin de pollo en solucin salina durante
dias
Harrison (1907):cultivos de tejido nervioso de rana
1940-1950:
Medios de cultivo
Antibiticos
Tripsina
SFB

Desarrollo, aplicabilidad y mejora de los cultivos celulares


como herramienta fundamental para la investigacin

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INTRODUCCION

Comercializacin de esta tecnologa Auge importante de los cultivos celulares


* 1960-1970
Plstico desechable
Sistema de filtracin
Medios de cultivo: liquido y polvo
Cabinas de flujo laminar

1er objetivo Estudio de las clulas

Cmo crecen
Qu necesitan para crecer
Cmo/Cuando dejan de crecer

BIOLOGIA DEL DESARROLLO


Y DIFERENCIACIN CELULAR

INTRODUCCION

Diferencias entre clulas in vivo e in vitro

Perdida de la geometra tridimensional


Perdida de interacciones celulares especficas
Perdida de la regulacin homeosttica por el Sistema Nervioso y Endocrino
Metabolismo energtico gliclisis
Actualidad Herramienta de trabajo fundamental

Ventajas in vitro

Desventajas in vitro

Control del medio

Esterilidad estricta

Caracterizacin y homogeneidad

Cantidad y costo

de las muestras
Econmico

Inestabilidad
Validacin del modelo in vitro

Motivaciones ticas

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Medio de cultivo = Medio artificial

1 Limitacin para establecer un CC Medio nutritivo adecuado

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Crecimiento en suspensin
Independiente de anclaje

Crecimiento en monocapa
Dependiente de anclaje

Vidrio
Plstico desechable
Membranas plsticas porosas
Microsoportes
Superficies tratadas
- medio de crecimiento de otros cultivos

Matrices tridimensionales
Sustratos no adherentes
Interfases liquida-gel, lquido-lquido
Haces microcapilares permeables

- gelatina
- poli-D-lisina

Recipientes
Placas de Petri

Frascos de Roux

Multiplacas

Roller bottles

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Oxigeno
Dioxido de carbono
H2O + CO2

H2CO3

H- + HCO3-

HCO3- CO2 pH 7,4

pH optimo 7.2-7.5 indicador Rojo Fenol (pH 7.4)


Osmolaridad: medios ligeramente hipotnicos
Temperatura 35-37C influye en la tasa de crecimiento celular
Viscosidad proteccin dao celular
Tensin superficial para evitar desnaturalizacin de protenas
y riesgo de contaminacin

Condiciones fisiolgicas
Composicin del medio = Nutrientes

Aminocidos (glutamina)
Vitaminas (grupo B)
Minerales
Carbohidratos (glucosa)

Adicin de factores de crecimiento y hormonas = SUERO


Problemas

Composicin
Lote
Coste
Dependencia del suministro

Adicin de Inhibidores del crecimiento de contaminantes


= Anibioticos y/o Antifungicos

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Para definir un medio de cultivo


SUPLEMENTOS:
1. Soluciones salinas equilibradas (BSS).
2. Aminocidos (Glm)
3. Vitaminas (Vit B)
4. Glucosa
5. Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular (Pyr, lipidos)
6. Hormonas y factores de crecimiento (suero).
7. Inhibidores del crecimiento de los contaminantes (antibiticos y antifngicos).

Si se reemplaza el Suero
+ factores de adhesin
+ inhibidores de proteasas
+ hormonas

+ factores de crecimiento
+ nutrientes
+ protenas y poliamidas

1. Medio Basal de Eagle (BME).


Aminocidos esenciales.

2. Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM).


Contiene ms aminocidos y en mayor concentracin que el BME.

3. R.P.M.I. 1640.
Medio diseado para el crecimiento de linfoblastos y lneas celulares leucmicas.

4. Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM).


Contiene cuatro veces la concentracin de aminocidos y vitaminas que el B.M.E.

5. Modificacin de Iscove del medio DMEM (IMDM).


Es un medio muy completo que incluye en su formulacin albmina bovina, transferrina, etc

6. McCoy 5A. Medio diseado para el crecimiento de lneas celulares diploides.


7. Medio L-15 de Leibovitz. Utilizado para el cultivo de virus.
8. Medio F-10 de Ham. Para el crecimiento de lneas celulares humanas.
Debe ser suplementado con protenas y hormonas. Contiene Fe, Cu, Zn.

9. Medio F-12 de Ham. til para el crecimiento de lneas celulares con suplementos
protenicos.

10. Medio 199. Muy usado para el cultivo de clulas no diferenciadas y estudio de
cromosomopatas

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Adhesin al sustrato para multiplicarse

Crecimiento en MONOCAPA

Confluencia (Inhibicin por contacto)

Crecimiento en SUSPENSIN

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Manipulacin de las clulas en cultivo = disociacin enzimtica

ESTRS

Cambio morfolgico
Perdida de polaridad
Alteracin protenas de membrana

Sobrevivir

Reparacin
Adaptacin

Crecer
Expresin funcin

Sin incremento en n neto de clulas

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N de clulas

Fase
estacionaria

Fase
exponencial
(log)

Fase
de declive
Muerte celular > divisin celular

Crecimiento exponencial

Fase de quietud
(lag)
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Periodo de
adaptacin al medio

Das en cultivo

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CARACTERISTICAS DE LAS
CELULAS EN CULTIVO

CULTIVO CELULAR Crecimiento de clulas in vitro,


CULTIVO PRIMARIO Cultivo iniciado a partir de clulas, tejidos u rganos tomados
directamente de un organismo.
DENSIDAD DE SATURACIN maximo n de clulas mantenibles bajo condiciones
especficas de cutivo en un recipiente.
N cels/cm2 . N cels/mm3
EFICIENCIA DE SIEMBRA El % de celulas sembradas que se adhieren a la superficie del
recipiente de cultivo en un tiempo determinado.
MEDIO QUIMICAMENTE DEFINIDO Solucin nutritiva para el cultivo de clulas, en el que se
conoce de cada componentela: su estructura qumica y los datos analticos de los posibles
contaminantes.
LINEA CELULAR
subcultivo exitoso.

Se origina a partir de un cultivo primario en el momento del primer

PASAJE (REPLIQUE) Transferencia o trasplante de clulas de un recipiente de cultivo a otro.


Sinnimo del trmino subcultivo.
PASAJE NUMERO (REPLIQUE NUMERO) El nmero de veces que las clulas en cultivo han
sido subcultivadas.

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Tejido, rgano o fragmento de rgano

Confluencia
Digestin enzimtica

Subcultivo
Listo para experimento

LINEAS CELULARES

Subcultivos..

LC FINITA
LC CONTNUA
LC TRANSFORMADA
LC NEOPLSICA

CARACTERISTICAS DE LAS CELULAS EN CULTIVO


Dependencia de anclaje
Inhibicin por contacto
Limitacin de crecimiento por densidad
Mantenimiento cclico
Requerimientos de suero elevado
Mantienen sus funciones especializadas
Tasa de crecimiento baja (24 a 96 h tiempo de replicacin)
Rendimiento en cultivo bajo (<106 clulas/ml)

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1. Establecimiento de un cultivo primario

Origen

Biopsia
Animales grandes (matadero)
Animales pequeos
a) rgano o tejido no patolgico o Tumor
b) Tejido embrionario o adulto
c) Especie

CONTENEDOR estril: medio de cultivo + Antibiticos (4C)

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2. Aislamiento de las clulas


a) Clulas circulantes (sanguneas) separar las que interesan

AISLAMIENTO DE CLULAS MONONUCLEARES (MNC)


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5.
6.
7.

Obtencin muestra de sangre (jeringa heparinizada)


Gradiente (percoll, sacarosa, metrizamida)
: 400xg, 30 min T ambiente
Colectar interfase (b MNC) tubo de centrfuga
Lavados x 3: PBS, : 250-300 xg, 5-10 min
Resuspender en medio de cultivo + SFB
Plantar

3. Digestin enzimticqa
b) Clulas organizadas en un tejido slido
separarlas del tejido
purificar las que interesan

+ TRIPSINA

Digestin tejido

15-60 min

Enzimas Proteolticos:
Tripsina
Dispasa
Colagenasa
Pronasa
Elastasa
Hialuronidasa

DMEM + SFB 10%

: 300-500xg, 5-10 min


T ambiente

Lavados x 3: PBS,
: 250-300 xg, 5-10 min

DMEM + SFB 10%

Sb
Sb

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Fibroblastos
Msculo liso humano
EPR humano

CGR bovino
EPR bovino

Mtodos de disgregacin celular en placa

Disociacin celular
Subcultivo

Enzimticos
Mecnicos
Qumicos

Separacin de clulas entre s


Separacin de las clulas de un sustrato

Romper malla proteica que forman la matriz extracelular

Mtodos qumicos

Mtodos Enzimaticos
+ Proteasas

+ EDTA

Mtodos Mecnicos

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TRIPSINIZAR: incubar las celulas con tripsina 10-15 min


Parar accin de tripsina

Inhibidores tripsina
Adicin de SFB

Lavados
Contar
Dividir en diferentes recipientes
TRIPSINIZAR
Contar
Sembrar en placas para experimento

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Tasa de crecimiento de las clulas en cultivo << contaminaciones habituales


Evitar aparicin de microorganismos indeseados

ASEPSIA

rea de trabajo
- Alejada de zona de paso
- Habitculo aislado:
- Aire filtrado:
- Equipo de filtracin
- Regulador de temperatura

El laboratorio de cultivos celulares


* Cabinas de flujo laminar

* Equipo de esterilizacin

* Incubadores

* Otros instrumentos

* Instrumentos pticos
Cabinas de flujo laminar Horizontal
Vertical

OBJETIVO
- Proteccin personal manipulador
- Proteccin cultivo, experimento..
- Proteccin del medio ambiente

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Incubador o Estufa: rotor de baja velocidad


Botellas cerradas No requieren CO2

Equipo de esterilizacin
Autoclave
Esterilizacin por calor tanto de slidos como de lquidos.
Se realiza a 121C, 1 atmsfera de sobrepresin
(t>20 min.)

Equipos de filtracin
- Fuente de vaco conectada a un kitasato dotado de una unidad de
filtracin (esterilizada por autoclavado)
- Bomba peristltica que fuerza el flujo de solucin a travs de una
unidad de filtracin hermtica.
En ambos casos la esterilizacin se produce al atravesar la solucin
un filtro de poro 0.22 m.

Mechero Bunsen

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Instrumentos pticos
MO de contraste de fases

Congeladores e instalacin de criogenia (depsito de N2 lquido)

Otros instrumentos
Contador electrnico de clulas
Centrfugas
Equipo de purificacin e agua
Balanzas
pHmetro
Pipeteadores

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Estudios de los fenmenos celulares

CULTIVOS CELULARES

reas de investigacin

Actividad intracelular
Flujo intracelular
Ecologa celular
Interacciones celulares
Animales transgnicos
Fusin celular
Citotoxicidad
Virologa
Cncer
Inmunolgica
Ingeniera de protenas
Interaccin y sealizacin celular
Diagnostico
Trasplantes rganos y/o tejidos
Industriales
Agronmicas

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