Cultivos de los virus

Slo se desarrollan en el interior de clulas vivas. Para su aislamiento se han utilizado:

- Animales de experimentacin: La inoculacin de virus en los animales de experimentacin puede producir una
enfermedad con lesiones caractersicas, que se puede transmitir en serie, y es el mtodo ms antiguo para aislar y
conservar el virus. Los animales se utilizan en investigaciones experimentales sobre virus oncgenos, sobre la
patogenia e inmunidad de las virosis y para la obtencin de antisueros.

- Huevos embrionados: Los virus se pueden inocular en la cavidad alantoidea. El desarrollo del virus se manifiesta
por la muerte del embrin o la produccin de hemaglutininas. En la actualidad ha quedado limitado al cultivo de los
poxvirus y sobre todo del virus de la gripe tanto para su aislamiento como para la produccin de vacunas.

- Cultivos tisulares: Constituyen el mtodo de eleccin para el desarrollo de la mayora de virus y se utilizan los
cultivos de rganos para el aislamiento de virus de difcil desarrollo o en casos especiales.

- Cultivos celulares: Los cultivos de clulas aisladas en medios artificiales son muy inestables, de manera que los
cultivos primarios al cabo de pocos pases o cultivos secundarios, rpidamente mueren. En ocasiones pueden
seleccionarse clulas, que conservan su morfologa, carcter diploide y se mantienen su capacidad de crecimiento, lo
que permite obtener una cepa de clulas diploides, que al cabo de un nmero limitado de pases puede morir o dar
lugar a algunas clulas muy alteradas en cuanto a morfologa y dotacin gentica, que presentan la propiedad de
crecer ms rpidamente de manera continua y regular, son las lneas celulares. Estos tres tipos de cultivos celulares
son los ms utilizados en virologa:

* Cultivos celulares primarios: Consisten en el cultivo de clulas aisladas procedentes de tejidos normales. Las
clulas son de dos tipos, poligonales de tipo epitelial o alargadas de tipo fibroblstico y su capacidad de multiplicacin
es muy limitada. Los cultivos de clulas de rin de mono y de diversas clulas embrionarias son los ms empleados.
Es el mtodo ms costoso, pero las clulas presentan un amplio espectro de sensibilidad.

* Cultivos secundarios: Clulas epiteliales de cultivos celulares primarios subcultivadas y tratadas con tripsina
y la dispersin de una monocapa primaria.
* Cepas de clulas diploides: Cultivo seriado in vitro clulas diploides normales. Su sensibilidad a los virus es
mayor que la de las clulas adaptadas. Presentan la ventaja de no llevar virus latentes, ni estar infectadas por
micoplasmas.

* Lneas celulares heteroploides: Clulas al cultivo indefinido o "inmortalizadas" in vitro, de manera que se
pueden pasar de tubo a tubo de cultivo, sin tener que recurrir al tejido u rgano del que proceden. Las clulas
adaptadas han experimentado una mutacin en virtud de la cual presentan caracteres semejantes, cualquiera que
sea su procedencia. Son de aspecto epitelial y su sensibilidad a los virus est muy limitada. La mayora de ellas se
derivan de carcinomas epiteliales humanos o de clulas transformadas de otro modo.

- Cultivos de rganos: Son cortes de rganos embrionados, que en un medio adecuado pueden mantener su
estructura y funciones durante un corto periodo de tiempo.
La deteccin del desarrollo del virus puede reconocerse por las siguientes manifestaciones:
- Por su accin citoptica, los virus pueden producir diversas alteraciones de las clulas y del cultivo monocelular
que muchas veces son caractersticas. En la capa monocelular se observa que las clulas alteradas se redondean y

se retraen. La observacin de estas lesiones puede efectuarse ya en fresco o en preparaciones teidas en tubos de
Leighton.
- Por la aparicin de componentes del virus en el medio de cultivo , en especial de hemaglutininas o de
antgenos fijadores del complemento.
- Por hemadsorcin o fijacin de los glbulos rojos. Se presenta con los virus hemaglutinantes.
- Por inmunofluorescencia, por la presencia del virus o sus antgenos en las clulas mediante el empleo de un
suero inmune marcado con sustancia fluorescentes
- Por interferencia: el primer virus bloquea el desarrollo del segundo virus e interfieren con l.
Mtodo para la demostracin de placas de destruccin celular de esta manera, cada virin se multiplica y produce un
pequeo foco o clon de clulas infectadas, que a los pocos das se observa a simple vista como un rea o placa de
destruccin celular.
Medios
Soluciones concentradas o en forma de polvo o un medio esencial mnimo (MEM) que puede someterse al autoclave.
Debe comprobarse la esterilidad y el pH de todos los medios antes de ser utilizados.
Las soluciones salinas equilibradas de Hanks y Earle sirven de base para la mayora de los medios y son diluyentes
generales excelentes en el laboratorio de biologa. Difieren en la capacidad amortiguadora. La solucin de Hanks es
til en los medios de crecimiento donde los cultivos ocasionan cantidades bajas de cidos. Cuando es necesaria una
mayor capacidad de amortiguacin puede ser til el amortiguador de tris o tricina.
El rojo fenol, indicador del pH atxico es de oclor prpura a un pH de 8,4 y amarillo a un pH de 6,8 o por debajo.
Reactivos
Se prefiere la solucin salina equilibrada (SSE) de Hanks, que contiene penicilina G acuosa en una concentracin de
1000 U/ml, gentamicina a 0,5 mg/ml y anfotericina B a una concentracin 10 microg/ml. Cuando est congelada es
estable durante varios meses.
El bicarbonato sdico al 8,8%, se prepara en agua. Otros reactivos esenciales incluyen tripsina, solucin al 0,25%
con EDTA y solucin GKN
Preparacin de muestras
- Frotis: Se agitan vigorosamente en 2ml del medio de transporte, se exprimen en un lado del tubo y se eliminan. La
solucin se puede dejar a temperatura ambiente durante 30 minutos o bien filtrarla a travs de un filtro de una jeringa
de 0,45. En los tubos de cultivo hstico se colocan porciones de 0,5 ml. Los tubos inoculados se colocan en un tambor
agitador durante 1 hora para permitir la adsorcin del virus volviendo a aadir un medio de mantenimiento.
- Heces: 2g de heces con 12 ml de la SSe de Hanks con atibiticos en un tubo de centrifugadora y se mantiene a
temperatura ambiente durante 30 minutos se centrifuga la solucin a 3500 rpm durante 15 minutos y se inoculan 0,2
ml de sobrenadante.
- Orina: Se aaden 0,5 ml de SSE de Hanks con antibiticos a 2 ml de la muestra y se inoculan 0,2 ml en los tubos
de cultivo hstico lo ms pronto posible. Es aconsejable proceder a cambiar el medio a las 16 a 24 horas despus de
la inoculacin.
- Lquido cefalorraqudeo: 0,2 ml de LCR directamente en los tubos de cultivo hstico sin otro tratamiento previo y
se manipula en la forma descrita.
- Tejido: Se trituran de 1 a 2 g en un almirez para tejidos, de pYrex, y se prepara una suspensin con SSE de Hanks
con antibiticos.
CULTIVO DE VIRUS

Muchos virus pueden desarrollarse en cultivos celulares o en huevos frtiles en condiciones estrictamente
controladas. Sigue recurrindose al crecimiento de los virus en animales para el aislamiento primario de algunos de
ellos, y para los estudios de la patogenia de las enfermedades virales y de la oncognesis viral. En los laboratorios de
diagnstico se intenta recuperar a los virus de las muestras clnicas para establecer los aspectos etiolgicos de las
enfermedades. En los laboratorios de investigacin se cultivan virus como base de los anlisis detallados de la
expresin y la replicacin virales.
La disponibilidad de clulas desarrolladas in vitro ha facilitado la identificacin y el cultivo de virus recin aislados y la
caracterizacin de los que ya se conocan. Hay tres tipos bsicos de cultivo celular. Los cultivos primarios se efectan
mediante dispersin de clulas (por lo general con tripsina) de tejidos huspedes recin extirpados. En general no
pueden crecer ms all de unos cuantos pasos en cultivo, como cultivos secundarios. Las lneas celulares diploides
son cultivos secundarios que han experimentado un cambio que permite su cultivo limitado (hasta 50 pasos), pero
que retienen su patrn cromosmico normal. Las lneas celulares continuas son cultivos capaces de crecimiento ms
prolongado, quiz indefinido, y que se han obtenido de lneas celulares diploides o de tejidos malignos.
Invariablemente tienen nmeros alterados e irregulares de cromosomas. El tipo de cultivo celular que se emplee para
cultivar virus depende de la sensibilidad de las clulas a tal virus particular.
Identificacin de clulas infectadas por virus: Es posible vigilar la multiplicacin de un virus de diversas maneras:
l. Desarrollo de efectos citopticos, es decir, cambios morfolgicos en las clulas. Los tipos de efectos citopticos
inducidos por virus consisten en lisis o necrosis celulares, formacin de inclusiones, formacin de clulas gigantes y
vacuolizacin citoplsmica. La mayor parte de los virus producen algn efecto citoptico manifiesto en las clulas
infectadas que es, en general, caracterstico del grupo del virus.
2. Aparicin de una protena codificada por el virus, como la hemaglutinina del virus de la influenza. Se pueden
emplear antisueros especficos para identificar la sntesis de protenas virales en las clulas infectadas.
3. Adsorcin de eritrocitos a las clulas infectadas, tcnica que se llama hemadsorcin, a causa de la presencia de
hemaglutinina codificada por el virus (parainfluenza, influenza) en las membranas celulares. Esta reaccin se vuelve
positiva antes que sean visibles los cambios citopticos y, en algunos casos, ocurre en ausencia de stos.
4. Interferencia por un virus no citopatgeno (por ejemplo, el de la rubola) con la replicacin e induccin de efectos
citopticos por un segundo virus de carga (por ejemplo, echovirus) que se aade como indicador.
5. Transformacin morfolgica por un virus oncgeno (por ejemplo, virus del sarcoma de Rous), que suele
acompaarse de prdida de la inhibicin de contacto y acumulacin de clulas en focos definidos.
Durante la multiplicacin de los virus en el interior de las clulas, pueden producirse estructuras especficas de virus,
denominadas cuerpos de inclusin. Estas estructuras llegan a ser mucho ms grandes que las partculas individuales
del virus, y a menudo muestran afinidad para los colorantes cidos (por ejemplo, la eosina). Pueden situarse en el
ncleo (herpesvirus), en el citoplasma (poxvirus) o en ambos (virus del sarampin). En muchas infecciones virales,
los cuerpos de inclusin son el sitio de desarrollo del virin (la fbrica del virus). En algunas infecciones (poxvirus,
reovirus), el cuerpo de inclusin consiste en masas de partculas virales en el proceso de replicacin. Aun en otros
casos ms, como en el cuerpo de inclusin intranuclear del herpes, el virus se multiplica en una etapa ms temprana
de la infeccin y el cuerpo de inclusin parece ser un producto residual de la multiplicacin viral. Las variaciones en el
aspecto del material de inclusin, dependen de la composicin del fijador tisular empleado.
La presencia de cuerpos de inclusin puede ser de considerable utilidad en el diagnstico. Las inclusiones
intracitoplsmicas de las clulas nerviosas, denominadas cuerpos de Negri, son patognomnicas de la rabia.

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE AGENTES VIRALES

A diferencia de la mayora de bacterias (con la excepcin de las Chlamydias y Rickettsias) y hongos, los virus son
parsitos intracelulares obligados incapaces de crecer en medios de cultivo simples por enriquecidos que ellos
sean; esto es debido a que los virus requieren para su multiplicacin de la integridad de la maquinaria biosinttica de
la clula. Inicialmente se utiliz como mtodo de aislamiento y replicacin viral los animales de laboratorio (ratn,
hamster o conejo) y los embriones de pollo. El aislamiento de los virus requiere del uso de lneas celulares que en
trminos generales se conoce como cultivo de clulas. Fue hasta el inicio de la dcada de los 50 que J.F. Enders y
colaboradores pudieron desarrollar sta tcnica con ell subsecuente desarrollo de la caracterizacin de partculas
virales y la produccin de vacunas a partir de la atenuacin o inactivacin de grandes cantidades de virus que gracias
a este descubrimiento lograron obtenerse.
Si en el campo de la bacteriologa tenemos diferentes medios de cultivo, en el campo de la virologa este hecho es
mucho mas determinante, no todos los virus crecen en un mismo tipo de clula, porque como ya habamos sealado
previamente es necesario para que el virus entre al interior de la clula que esta sea permisiva y esta posibilidad est
marcada por el tipo de protenas que se expresan en la superficie de membrana celular. En otros trminos es
necesario que las clulas a ser infectadas posean una unidad receptora celular que reconozca las protenas de unin
de la partcula viral. Para que una lnea celular pueda mantenerse viable; es decir viva, sana y permisiva se requieren
de medios qumicos que poseen los nutrientes necesarios para la multiplicacin celular (sales, glucosa, vitaminas,
coenzimas, vitaminas, factores de crecimiento, aminocidos, etc). Estos medios esenciales tambin requieren que
sean isotnicos, con un pH cercano a 7.4. Debido a la produccin de metabolitos txicos fruto del metabolismo

celular debe realizarse cambios peridicos del medio de cultivo celular para garantizar de esta manera la presencia
de los requerimientos necesarios para el metabolismo de la clula. Por su contenido el medio de cultivo celular es
tambin un caldo muy apto para el crecimiento de microorganismos presentes en la muestra clnica o facilmente
obtenidos durante la manipulacin de la lnea celular, razn por la cual en muchos laboratorios se le adicionan
antibiticos y antimicticos en concentraciones inhibitorias del crecimiento microbiano, pero que carecen de txicidad
para las clulas.
Los medios de cultivo carecen de algunos factores de crecimiento celular que impiden una rpida proliferacin de las
clulas cultivadas, por sta razn se requiere de la adicin de algunos de estos factores presentes en el suero fetal
bovino, para la mayora de estos factores su naturaleza no es conocida.
Existen distintos tipos de lneas celulares como veremos a continuacin:
Cultivo celular primario: en el cual las clulas se obtienen a partir de los tejidos frescos de animales de laboratorio.
Las clulas se disgregan en clulas individuales gracias a la accin de varias enzimas hidrolticas como la tripsina o
la pronasa. Este tipo de clulas tiene como ventaja ell poder soportar una amplia gama de tipos virales y como
desventaja el no soportar ms que un limitado nmero de divisiones celulares.
Cultivo de clulas diploides: las clulas diploides poseen un genoma presente en dos juegos homlogos. Estas
clulas tienen una mayor capacidad de divisin celular y mantienen el nmero original de cromosomas. Son tiles a
nivel de diagnstico y de produccin de vacunas.
Cultivo de clulas continuas: estas son clulas que se han inmortalizado o que son inmortales por ser originarias
de clulas tumorales o por mutacin realizada sobre clulas diploides. Algunas derivan de tejidos humanos pero la
gran mayora son originadas en otras especies de animales o aun de insectos. Las lneas celulares mantienen in vitro
una morfologa que les es caracterstica, y bajo la influencia de la infeccin viral adquieren una serie de cambios
( citlisis, redondeamiento, formacin de clulas multinucleadas o de acmulos celulares o sincitios) que conforman
lo que se conoce como efecto citoptico y que constituyen un valioso elemento de diagnstico viral. Si bien este
efecto es caracterstico del tipo viral puede tambin corresponder a varios agentes virales y no es caracterstico de
variantes de estas familias virales. Por otro lado no siempre la partcula viral va a ocasionar efecto citoptico y la
presencia del virus se determina en forma indirecta por medio de hemaglutinacin o hemadsorcin,
inmunofluorescencia o mediante el fenmeno de interferencia viral usando partculas virales con efecto citoptico
conocido sobre la lnea celular utilizada.
ASPECTOS ULTRAESTRUCTURALES DE LA INFECCIN DEL VIRUS ASOCIADO CON SRAS
El uso del microscopio electrnico para el anlisis de tejidos en diferentes infecciones virales representa un
instrumento sensible que no requiere de reactivos especficos para la localizacin viral y las alteraciones producidas a
nivel celular. Los estudios acerca de los aspectos ultraestructurales del coronavirus asociado al SRAS se han
realizado principalmente en cultivos celulares, lo que es una herramienta importante para el anlisis de los hallazgos
a nivel del tejido humano. Mediante la tcnica de tincin negativa, el virus asociado a SRAS se presenta como una
partcula redonda u oval con un dimetro de 60 a 120 nm. Est cubierto por una estructura formada por
protuberancias de 10 a 20 nm y separadas por hendiduras. Esta estructura corresponde a la reportada para los
coronavirus (Fig. 1A) (47). Estudios realizados en clulas Vero E6 despus de ser infectadas por virus obtenido de
pacientes con SRAS, muestran en los primeros 30 minutos, a los virus alineados en la superficie celular ( Fig. 1B);
stos pasan al interior de la clula mediante fusin de sus envolturas con la membrana celular o por endocitosis.
Los nucleocpsidos penetran al citoplasma en grandes vacuolas (48). Las clulas infectadas presentan el efecto
citoptico caracterizado por la presencia de muchas vesculas citoplasmticas vacas, disminucin del nmero de
mitocondrias y ruptura de las membranas mitocondriales internas y externas. El retculo endoplsmico disminuye y se
edematiza (47). Las vesculas y sacos transversales del aparato de Golgi proliferan y contienen en su interior
partculas virales en diferentes estados de maduracin. Parte de las vesculas citoplasmticas contienen partculas
virales (Fig. 1C) y se localizan cerca de la membrana celular externa para liberar virus por exocitosis (49). Las
vesculas que contienen estos virus son llamadas vesculas relacionadas con la morfognesis viral (VMV), porque
se sospecha que all se ensamblan los virus (Figs. 1C y D) (47). Algunas partculas virales pueden encontrarse
pegadas en la membrana celular formando arreglos cristalinos (49). La cromatina nuclear se encuentra acumulada y
agregada en la parte interna de la membrana nuclear, observndose la presencia de grnulos en el ncleo. Algunas
partculas virales se pueden encontrar en la matriz nuclear. Estas se presentan como nucleocpsidos electrondensos
rodeados de un halo claro (Figuras 1F y G). La cisterna perinuclear se puede presentar edematizada con la presencia
de sacos que contienen varias partculas virales (Fig. 1H). En base a estos datos morfognicos, se hipotetiza que las
partculas virales inmaduras apareceran en las VMV en donde se ensamblaran con el cido nucleico, hacindose
ms grandes y electrondensas. Despus de lo cual los virus adquieren su envoltura gemando a travs de estas
vesculas o del retculo endoplsmico (Fig. 2A) con posterior salida de la clula. Si bien se describe que los
coronavirus se duplican y ensamblan en el citoplasma (50, 51), la presencia del virus en el ncleo y en la cisterna
perinuclear hace pensar que el virus asociado a SRAS puede representar un nuevo coronavirus y que su sitio de
ensamblaje y morfognesis puede haber cambiado (47). Los estudios realizados en humanos afectados por SRAS

han demostrado la presencia de virus relacionados con los coronavirus extra e intracelularmente en diferentes tejidos
y lavados bronquiales (Figura 2B y C) (9). Se han encontrado inclusiones virales en el citoplasma del epitelio alveolar
y macrfagos alveolares y en el endotelio de los vasos pequeos con un dimetro de 80-160 nm (52-54).

Fig. 1. A) Tincin negativa del virus asociado con el SRAS. B) Viriones en la parte externa de una clula, la flecha
seala a una partcula viral tpica con su envoltura. C) Viriones en vesculas relacionadas con la morfognesis viral
(VMV), ntese la presencia de partculas virales adoptando un patrn semejante a un ptalo (flecha). D) VMVs con
membranas claras (flecha). E) Vescula citoplasmtica mostrando en su interior viriones. Ntese la presencia de una
partcula viral con su envoltura (flecha). F) Partculas virales dentro de vesculas citoplasmticas (flecha) y en el
ncleo (flecha en cruz). G) Partculas virales en el ncleo (flecha). H) Presencia de partculas virales en la cisterna
perinuclear (flecha). Barras: 100 nm (29).

Fig. 2. A) Partculas virales gemando dentro del reticuloendoplasmico (flecha) y dentro de la cisterna en clulas Vero
E6. La cabeza de flecha muestra las protuberancias de la envoltura viral. B) clulas con efecto citoptico y partculas
virales obtenidas del lado bronquial de una paciente con SRAS. La flecha gruesa seala un acmulo de viriones, el
cual se encuentran amplificados en C. Barra: 100 nm. (9).
Los leucocitos de sangre perifrica pueden tambin ser afectados por el virus. Se ha demostrado la presencia de
partculas virales asociadas a coronavirus, especialmente en linfocitos T de sangre perifrica en donde los virus se
replican (47, 55). Si bien se ha reportado afectacin heptica durante el SRAS y evidencia de la presencia del
antgeno viral a travs de RT-PCR, no se han encontrado partculas virales, mitocondrias gigantes o aumento del
nmero de micro o macro vesculas en el tejido heptico (27). Tambin se ha reportado la presencia de partculas
virales en las clulas del intestino grueso y delgado en pacientes con SRAS (17). La presencia de apoptosis y la
infiltracin de monocitos es un fenmeno general en el SRAS. El virus induce apoptosis en celulas T y B del pulmn,
bazo y ndulos linfticos, disminuyendo los mecanismos de defensa inmunitarios (47).
TCNICAS PARA AISLAR LOS VIRUS. Los virus al infectar, se distribuyen por diferentes partes del organismo. A
partir de alguno/s de su/s componente/s, es que se intenta aislarlo para luego identificarlo. Los materiales en general
son: sangre (de sta, lo que se denomina suero), orina, materia fecal, lquido cefalorraqudeo (lquido que se obtiene
por puncin entre las vrtebras de la columna vertebral), lesiones en la piel o garganta, etctera.

A partir del material seleccionado es que se intenta el aislamiento usando la tcnica que generalmente est indicada.
Ellas son: cultivo celular (en el laboratorio se puede obtener clulas que forman una capa, simulando un tejido). Al
poner en contacto con las clulas el material a investigar, si ste contiene un virus, se pondr de manifiesto una
alteracin de las clulas, producida por el virus, que como ya se seal, son parsitos obligados de las clulas y por
ello se produce la alteracin. En el lquido que baa las clulas (medio de cultivo) se encontrarn los virus.
Otra tcnica de aislamiento de virus es la inoculacin de huevos de gallina embrionados entre los 8 y los 10 das.
El material se inocula a travs del saco de aire (el extremo ms redondeado del huevo). De estar presente un virus
con capacidad de replicarse (trmino que en Virologa significa que se estn formando nuevos virus iguales al
original), lo harn en el embrin, l que al observarse por medio del ovoscopio, mostrar movimientos muy lentos o
muerto. En el llamado lquido alantoideo, en el que est como flotando el embrin, se encuentran los virus que se
replicaron en el embrin. El lquido se obtiene por medio de jeringas, cuya aguja atraves la cmara de aire.
El ratn albino suizo, animalito muy conocido y popular como mascota, es tambin utilizado para el intento de
aislamiento de virus, en especial el que se denomina ratn recin nacido, que tiene una edad entre las 24 y 72
horas. El material se inocula generalmente por va cerebral, aunque tambin se usa la va intra peritoneal. Los
ratones son observados diariamente y si est presente un virus capaz de replicarse en el lugar inoculado, los
pequeos ratones no se alimentan, se muestran inquietos o muy pocos mviles, signos de enfermedad e incluso
algunos muertos.
Se dijo ms arriba: en especial el que se denomina ratn recin nacido. Esto significa que tambin pueden inocularse
ratones adultos, pero que son mucho menos sensibles que los recin nacidos.
Otro animal, tambin usado como tcnica de aislamiento de virus es el hamster (otra mascota). Al igual que el ratn
albino suizo, se usan edades iguales, as como vas de inoculacin.
Es importante comentar que hasta el desarrollo del cultivo celular en la dcada del ao 1950, el empleo del ratn o
del hamster era el husped obligado para el aislamiento de los virus. A partir de esa dcada, su uso ha disminuido
notoriamente. Actualmente, la tcnica de eleccin es el cultivo celular, en especial el llamado de lnea contnua,
sobre la base de clulas que se pueden mantener por perodos muy prolongados en condiciones especiales.
Tambin se emplea el cultivo celular primario, que se obtiene a partir de un rgano como puede ser por ejemplo el
rin o de un embrin como puede ser de pollo, del cual se obtiene entre otras, las llamadas clulas fibroblsticas. En
el caso de los huevos de gallina embrionados, su uso sigue siendo rutina para el caso del virus influenza (gripe),
usndose tambin el cultivo celular.
Tabla 2. Caractersticas de los coronavirus humanos habituales y del nuevo
coronavirus

Figura
Imagen a
(tincin
negativa)
partculas
virales
coronavirus
aislado
cultivo
clulas de
paciente
SARS.

2.
ME
de
de
en
de
un
con

Fotografa 5. Cultivo celular (CHSE-214) infectado con P. salmonis: Las clulas del cultivo presentan
vacuolas citoplasmticas en cuyo interior se observa la presencia de microorganismos cocoides
correspondientes a P. salmonis. 1000X.

AISLAMIENTO VIRAL
Inoculacin de Cultivos Celulares
Inoculacin de Animales de Laboratorio
Aislamiento Viral
1. Inoculacin de Cultivos Celulares
Este mtodo de gran sensibilidad para algunos agentes virales, consiste en poner en contacto el material sospechoso
con cultivos celulares susceptibles, para que el virus se multiplique y pueda detectarse su presencia por efecto
citoptico (ECP) u otros mtodos (inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, hemoadsorcin, etc.)
1.1.Procesamientos de las muestras

a) Organos: trozos de 2 x 2 cm. se trituran con tijera y luego se morterean con arena o vidrio molido estril. Este
macerado se resuspende 1/10 p/v en medio de cultivo de mantenimiento celular con antibiticos (100X) y se
centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4C. El sobrenadante constituye el inculo para los cultivos.

b)
Hisopados: una vez suspendido el material recogido en medio de cultivo celular con antibiticos
(100X) se elimina el hisopo y la suspensin se centrifuga a 3000 rpm durante 20 minutos a 4C. El
sobrenadante se constituye el inculo para cultivo celular.
c)
Lquidos transcelulares: (cefalorraqudeo, sinovial, etc.) deben centrifugarse a 3000 rpm, durante 20
minutos a 4C, utilizndose el sobrenadante como inculo para cultivo celular.
d)
Sangre: debe emplearse entera aunque puede diluirse 1/10, en medio de cultivo celular a fin de
disminuir su citotoxicidad. Si se sospecha de una asociacin viral con poblaciones celulares, es conveniente
separar la fraccin celular y luego inocular el cultivo celular.
e)
Semen: se diluye la pastilla y/o pajuela 1/10 en medio de cultivo celular, y esta solucin constituye el
inoculo para los cultivos. La toxidad del material seminal determina que luego de un perodo de adsorcin de
60 minutos debe descartarse el inculo y debe lavarse la monocapa con medio de cultivo celular (3 veces).
f)
Material fecal: se macera y resuspende la materia fecal en medio de mantenimiento 1/10 p/v. Se
clarifica por centreifugacin a 5000 rpm, 20 minutos a 4C y el sobrenadante se trata con una solucin de
tripsina (10 ug/ml). 1 hora a 37C, inoculando luego el sobrenadante en cultivo celular.
1.2.Inoculacin de los cultivos
Se emplean cultivos en monocapa, primarios o de lnea, susceptibles al virus que se desea aislar (ver cuadro
1) con ms de un 75% de la superficie cubierta y en envases adecuados. Para este propsito se emplean tubos de
Leighton o de ensayo comunes con laminillas de vidrio en su interior placas de 24 wells (LABTEK*). Estos cultivos
deben estar libres de virus y anticuerpos que interfieran con los virus que se desea investigar. Por ejemplo, es
frecuente que los cultivos primarios o de lnea puedan estar infectados con cepas no citopatognicas de BVDV o el
suero bovino que se usa en el medio de crecimiento pueda tener anticuerpos y/o virus.
Seleccionados los cultivos, se procede a :
Inoculacion de la muestra (1 pasaje) , utilizando no menos de 3 tubos o wells por muestra de material,
descartando el medio de crecimiento, se inoculan con 0,2 ml de suspensin problema por tubo o 0,1 ml por cada
orificio de placa x 24w. En estas condiciones se incuban a 37C durante 45-60 minutos para facilitar la adsorcin del
virus. Cumplimentado este perodo se debe volcar el inculo y realizar 2 lavados con medio de mantenimiento,
particularmente en el caso de materiales muy txicos para la clulas como sangre, MF, semen, bazo, hgado, etc.
Luego se incorpora 1,8 - 2 ml de medio de mantenimiento celular por tubo o 1ml por cada orificio de la placa y se
incuba a 37C. Se observan diariamente al microscopio durante 7 das para la deteccin de ECP. Si no se detecta
presencia viral al microscopio, se debe realizar un nuevo pasaje en cultivo celular (pasaje ciego).
Segundo pasaje: se congela la muestra a 20C durante 1 (+/-) 1/2 hora y se descongela a 37C (BDV,IBR) y de
ser necesario se clarificar por centrifugacin. Se procede a inocular como en el primer pasaje. Se considera
negativo si cumplido el perodo de incubacin de este segundo pasaje (7dias) no se detecta presencia viral , para el
caso de IBR, o se hace otro pasaje (3 pas.) en el caso de BVDV.
Al finalizar el procesamiento de las muestras, se deben realizar los controles en tubo o placa aparte, positivo: se
inocula el virus referencia conteniendo 100 DICT 50 y el negativo sin el agregado viral. Considerar que si el control
positivo no presenta ECP en el tiempo estimado y/o las celulas del control negativo se presentan anormales o con
signos de toxicidad el aislamiento debe ser repetido.
1.3. Identificacin Viral
Para confirmar la replicacin viral y establecer con certeza su identidad, para ello se puede recurrir a varias
tcnicas que, haciendo uso de reactivos de referencia, sirven para este fin: seroneutralizacin, fijacin de
complemento, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, ELISA o hemoadsorcin (descriptas en otros captulos).
2.

Inoculacin de Animales de Laboratorio

Se inocula animales de laboratorios (ratones, conejos, cobayos, etc.) susceptibles a la infeccin por el agente
viral cuya presencia se sospecha. Este se multiplicar en el hospedador experimental con la produccin de diferente
sintomatologa, hasta en algunos casos puede causarle la muerte.

Es un mtodo sencillo, sensible y rpido aunque son pocos los virus animales de nuestro inters que poseen
huspedes de laboratorio susceptibles (ver Cuadro 1). No obstante, constituye una importante tcnica en la
identificacin y caracterizacin de agentes (diagnstico diferencial).
2.1. Materiales y Mtodos
Procesamiento de la muestra.
Idem 1.1
2.1.1. Inoculacin de Ratn Lactante

a)
Va Intracerebral: el punto de inoculacin es la interseccin de dos lneas una que va desde el ojo a
la oreja y la otra perpendicular a esta lnea y cortndole por el centro. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina
con dosis menor a 0,02 ml.
b)
Va Intramuscular: se realiza la inoculacin en la masa muscular del miembro posterior, aspirando
previamente pra asegurarse de no estar en vena. Se utiliza aguja y jeringa similar al anterior.
c)
Va intraperitoneal: sujetando el animal por la piel de la nuca con el ndice y pulgar y con el resto de
los dedos por los miembros posteriores y cola, se lo presenta de cbito dorsal para inocularlo en un punto del
lado derecho y centro del abdomen. Se utiliza aguja y jeringa de tuberculina.
2.1.2. Inoculacin de huevos embrionados
Se seleccionan huevos de planteles libre de infecciones virales, observndolos en un ovoscopio o con
iluminacin adecuada.
De acuerdo al agente viral que se sospecha, ser la va de inoculacin y por ende, la edad del embrin (ver
cuadro 1) a utilizar.
Cuadro 1
Aislamiento viral

CULTIVO DE TEJIDOS
Bovine
Herpesvirus Type
1
(BHV-1)
Bovine
Viral
Diarhoea
Virus(BVDV)
Parainfluenza
Type 3 (PI-3)
Bovine
Adenovirus
(BAdV)
Foot and Mouse
Disease (FMDV)

PRIMARIOS
RFB-TFB

LINEAS
MDBK
BOV. TURB.

RFB-TFB

MDBK
BOV. TURB.

RFB-TFB

MDBK
BOV. TURB.
MDBK
BOV. TURB.

RFB-TFB
RFB-TFB
TirFB

BHK

ANIMALES
DE
LABORATORIO
OTROS

Ratn lactante (im., ic. o ip)

Cobayo (adap)

MDBK
IBRS2

Vesicular

EP.BOV

BOV. TURB
VERO

Ratn lactante

Stomatitis
(VSV)

Virus
CERDOS

MONO.COB.
Bovine
Entero RFB-TFB
Virus (BEV)

Huevos embrionados
Cobayo-Conejo
BHK
MDBK

Bovine Rotavirus
(BRV)
Bovine
Corona
Virus (BCV)
Pox V
Clasical
Swine
Fever
Virus
(CSFV)
African
Swine
Fever
Virus
(ASFV)
Porcine
Parvovirus (PVP)
Pseudorabies
Virus (PRV)

RFB

BOV. T (RB)
MA 104
Explantos

Homlogo
RFP (sin ecp)
TFP
C Leucocitos

Huevos embrionados. MCA.

PK15 (sin ecp)
VERO
MS

RFP (IF HA)

RFP y B

BHK

Conejo (sc.)

TFP y B

MDBK

Ratn lactante (ic.)

Fibroblasto de IBRS2
pollo

Huevo embrionado

PK15
Blue
Tongue
Virus (BTV)
Ovine Pulmonar Adenomatosis
(OPA)

VERO
BHK
-

Huevos embrionados (ev.)

Histopatologa

Vas de Inoculacin
a. Cavidad Amnitica: el material inoculado ingresar en el embrin va bucal y respiratoria , pudindose
multiplicar en cualquier tejido de ste. El embrin debe ser de 10-14 das de edad. Se desinfecta el extremo
del huevo que posee la cmara de aire y all se perforar con un trcar o taladro adecuado. Con una aguja
de 4,5 cm. de largo, orientada hacia la sombra del embrin se inocula 0,1-0,2 ml de material (Ver figura 1).
Sellar el orificio con parafina fundida u otro sellador no txico.
b. Membrana corioalantoidea: Usada para virus que producen placas, lesiones herpticas o tipo pox. Los
embriones deben ser de 10-12 das de edad. Se marca el punto de inoculacin en el costado del huevo
donde se observa buena irrigacin de la membrana. Como es necesario hacer caer la membrana para
obtener una buena superficie, se desinfecta el extremo del huevo que posee la cmara de aire y el punto de
inoculacin . Con sumo cuidado se perfora la cscara y la membrana de la misma en el punto de inoculacin
y se hace un orificio en la cmara de aire por donde se succiona con una perilla de goma para que se
produzca una falsa cmara de aire. All se depositar el inculo de 0,1 - 0,2 ml con jeringa y aguja de
tuberculina (ver figura 1). Sellar los orificios con parafina fundida u otro sellador no txico.
c.

Cavidad alantoidea: el virus se difundir en el fluido e infectar las clulas ectodrmicas de la membrana. Se
utilizan embriones de 10-11 das de edad, Observndose el ovoscopio, se marca en el extremo de la camara
de aire, el punto de inoculacin que debe ser opuesto a la ubicaicn del embrin y con pocos vasos
sanguneos. Se desinfecta y se perfora la cscara en dicho punto, inoculando (0,1-0,2 ml) con una aguja de
1,5 cm de largo que se introduce paralela a la pared del huevo (ver figura 2). Se sella con parafina fundida u
otro sellador no txico.

d. Saco vitelino: se emplean embriones de 8-12 das de edad con gran saco vitelino, Se desinfecta el extremo
de la cmara de aire y se perfora la cscara. Con una aguja en lnea recta (0,1 - 0,2 ml.) (ver figura 2). Se
sella con parafina lquida u otro sellador no txico.
e. Endovenosa: se emplean embriones de 8-12 das de edad. Observndose al ovoscopio se selecciona una
vena de buen grosor y que se dirija hacia el embrin. Se dibuja en la cscara su ubicacin. Usando un taladro
adecuado se marca un rectngulo, enmarcando la vena y que slo interese la cscara, sin romper la
membrana que se encuentra por debajo de sta. Se desinfecta la zona y con una aguja bien fina se inocula
(debe observarse cmo el inculo al diluir la sangre, circula por la vena). Ver figura 2. Se sella con parafina
fundida u otro sellador no txico.
INOCULACIN DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS
OBJETIVO
Estudio del procedimiento de inoculacin de virus de Newcastle y poxvirus que afectan a aves, en un embrin de
gallina.
INTRODUCCIN
Se han utilizado huevos fecundados para cultivar virus durante ms de 15 aos. El cultivo de virus gripal en huevo
embrionado fue empleado por primera vez por Burnet en 1935, demostrando que el embrin de pollo es un medio
muy sensible para el aislamiento de estos virus, siendo adems un medio estril y poco costoso. Ha sido posible
cultivar virus de diversos grupos en varias cavidades del huevo fecundado, o en el propio embrin en desarrollo.
Tambin se emplearon huevos de pato y de ganso para cultivar ciertos virus, pues estos animales tienen un periodo
de incubacin mas prolongado que el pollo; pero como regla, sigue usndose huevo de gallina de 6 a 8 das de
incubacin aproximadamente (a veces se usa huevos de mas tiempo de incubacin).
Los virus slo pueden reproducirse en determinadas partes del embrin; por consiguiente, se deben inyectar en la
regin apropiada, P. ej. los mixovirus crecen bien en la membrana corioalantoidea, en tanto que el virus de la
parotiditis prefiere la cavidad alantoidea. La infeccin puede producir una lesion tisular local conocida como pstula,
cuyo aspecto, a menudo, es caracteristico del virus.
El mtodo exacto de inoculacin y la edad del embrin que se emplea, dependen del virus problema. P. ej. para aislar
en forma primaria el virus de la influenza a partir de material recogido de la garganta, suele inocularse este en la
cavidad amnitica de embriones de 7 a 8 das; pero el virus se duplica fcilmente en la membrana alantoidea de
embriones de 12 a 13 das, despus de varias resiembras (adaptacin) en el amnios. Los focos mas utilizados para
la inoculacin, a parte de las cavidades amnitica y alantoidea, son la membrana corioalantoidea y el saco vitelino.
Algunas veces, puede inyectarse directamente el virus en el embrin en desarrollo, recurriendo a la inoculacin
intravenosa, intraperitoneal o intracerebral. Una vez que se duplic el virus dentro de las clulas de las membranas o
del embrin, puede liberarse a los lquidos vecinos, los cuales constituyen entonces una buena fuente de virus. P. ej.
el virus de la influenza, que se duplica en el sistema respiratorio del embrin y en las clulas de la membrana
amnitica, pasa al lquido amnitico, que luego puede recogerse con una jeringa y aguja. En cambio, otros virus,
como p.ej. los de la viruela y el herpes, que se duplican en la membrana corioalantoidea, siguen unidos a las clulas
en las lesiones o pstulas que se forman sobre dicha membrana. Al moler y deshacer en una solucin salina
isotnica las membranas, logran liberarse estos virus.
En consecuencia el crecimiento de un virus en un embrin de pollo puede provocar la muerte del embrin (p.ej. virus
de la encefalitis), producir pstulas o placas sobre la membrana corioalantoidea (como herpes, viruela, vacuna),
desarrollar hemaglutininas en los lquidos o tejidos embrionarios (p.ej. influenza) o desarrollar virus infectante (p.ej.
poliovirus tipo 2).
En el caso de los virus herpes y vaccinia, estos se pueden cuantificar por la tcnica de inoculacin de huevos
embrionados al correlacionar el nmero de pstulas contadas con la dilucion viral inoculada.
Actualmente el mtodo preferido para cultivar virus de influenza aviar es la inoculacin en huevos embrionados libres
de patgenos especficos (SPF) o huevos negativos a anticuerpos especficos (SAN). El sobrenadante de los
centrifugados de las muestras se inocula en el saco alantoideo de al menos 5 huevos de 9-11 das de incubacin y se
incuba a 35-37C durante 4-7 das. Luego los huevos con embriones muertos, cuando esto ocurra, o los que queden
al final del periodo de incubacin se refrigeran a 4 C y el lquido alantoideo se chequea con la prueba de
hemaglutinacin. Si se detecta actividad de hemoaglutinatin hay una probabilidad alta de la presencia de virus A de
influenza o de un paramixovirus aviar. Los fluidos que den reaccin negativa deben inocularse al menos en otro lote
de huevos.
Entre los lugares de inoculacin tenemos:
Membrana Corioalantoidea: Se emplean embriones de 10 12 das y la cantidad de inculo es de 0.1 0.5 ml.

Apropiada especialmente para el aislamiento y cultivo de virus variolicos; virus de laringotraqueitis aviar y de la
enfermedad de Beyer (Pseudorrabia); que provocan focos o pstulas fcilmente visibles.
Cavidad Alantoidea: Se emplean embriones de 9 12 das y la cantidad de inoculo es de 0.1 0.2 ml. Entre los virus
que desarrollan en el endodermo alantoideo tenemos: peste, New Castle, virus de la bronquitis infecciosa, encefalitis
equina occidental y oriental Venezuela, parotiditis. Ventaja: simplicidad de la inoculacin y toma de muestra
Cavidad Amnitica: Se emplean embriones de 7 15 das y la cantidad de inculo es de 0.1 0.2 ml. la edad de los
mismos depende fundamentalmente del tipo de virus o del estudio que se realiza.
Saco Vitelino: Se emplean embriones de 5 8 das de incubacin y la cantidad de inculo es de 0.2 1 ml. Va es
sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de los virus de enfermedades venreas, neumona y rickettsias. El
vitelo es empleado para la preparacin de vacunas y como antgeno para reacciones serolgicas de los virus ya
mencionados.
Va Intravenosa: La membrana corialantoidea est irrigada por vasos sanguneos, es susceptible de inoculacin para
casos especiales, virus que ocasionan cambios hematolgicos; por ejemplo, virus de la Leucemia. Son empleados
embriones de 10 - 15 das y la cantidad de inculo es de 0.02 - 0.05 ml.
Va Intracerebral (embrin): Se emplea embriones de 8 14 das, especficamente para virus que producen
alteraciones cerebrales: la rabia, herpes, etc; 0.01 0.02 ml.
MATERIALES Y MTODOS
Material de Laboratorio:
Ovoscopio.
Tijera Quirrgica.
Agua Destilada.
Azul de Metileno.
Agujas Hipodrmicas.
Placas Petri amplias.
Los virus pueden propagarse en las membranas extraembrionarias o en el propio embrin. Anatmicamente el huevo
embrionado de gallina presentan en su estructura las siguientes partes:
1.- Embrin
2.- Cavidad amnitica
2a.- Membrana amnitica
3.- Saco vitelino
4.- Albmina
5.- Cavidad alantoidea
6.- Membrana corioalantoidea
7.- Membrana externa del huevo
8.- Cscara
9.- Cmara de aire
A.Inoculacin:
Observar en el ovoscopio si el huevo es frtil o infrtil.
Determinar la edad del embrin.
Localizar la cmara de aire y marcarla.
Marcar el embrin.
Colocar los huevos frtiles en un porta huevos
Limpiar la cscara (con una torunda de alcohol yodado, todo, sobre todo,
la parte donde se va a inocular y luego, limpiar con alcohol).
Agujerear el cascarn con un taladro (dependiendo de dnde se vaya a
inocular).
Inoculamos el virus.
Tapamos el agujero con parafina (o cera de vela).
Luego llevamos a estufa (controlar temperatura y humedad adecuada)
Controlar, observar dos veces al da, para percatarse si estn vivos o muertos.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Se Inocul un embrin de gallina, de 5 das de edad, el cual se incubo por un periodo de 4 das antes de abrirlo, entre

ese periodo se observ si viva, y se cuid de que no se pegara el embrin; al abrirse el huevo, se observ el
progreso del virus inoculado en el embrin, observndose la membrana de la cmara de aire; en nuestro huevo no se
observ nada anormal, seguramente porque no fue suficiente tiempo para que el virus actuara, no creemos que haya
sido en el proceso inoculacin porque se hizo muy bien, con las medidas pertinentes, aunque puede ser otra
posibilidad. En el huevo de otros, se observ la membrana opaca y de color blanco.
CONCLUSIONES
Se practic el proceso de inoculacin del virus en el embrin. El embrin del equipo no tena manifestaciones
significativas del virus; en otros equipos se observ el progreso de este con manifestaciones como, membrana de la
cmara de aire de color blanco y opaco, del virus inoculado.