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UNIVERSIT DE NANTES

FACULT DES SCIENCES ET DES TECHNIQUES

_____
COLE DOCTORALE : VEGETAL, ENVIRONNEMENT, NUTRITION, AGROALIMENTAIRE, MER

Anne 2012

N attribu par la bibliothque

Purification de la chitine par hydrolyse enzymatique partir


de coproduits de crevette Penaeus vannamei.
Caractrisations des produits et optimisation du procd
___________

THSE DE DOCTORAT
Discipline : Gnie des procds
Spcialit : Biochimie et biotechnologie des produits marins
Prsente
et soutenue publiquement par

Karine LE ROUX
Le 4 mai 2012, devant le jury ci-dessous

Rapporteurs
Examinateurs

M. DESBRIERES Jacques, Professeur Universit de Pau et des Pays de lAdour


M. TRYSTRAM Gilles, Professeur AgroParisTech
M. HUBERT Antoine, Directeur de la Recherche et de l'Innovation - YNSECT
M. LEGRAND Jack, Professeur Universit de Nantes
M. ABDELLAH Arhaliass, Professeur Universit de Nantes
M. BERGE Jean-Pascal, Cadre de recherche IFREMER, Nantes
M. BARON Rgis (invit), Cadre de recherche IFREMER, Nantes

Directeurs de thse : Jean-Pascal Berg & Abdellah Arhaliass

Ce que signifie le mot recherche ? Vivre pleinement la question


Edgar Morin (1921-)

Remerciements
Jadresse tout dabord mes plus chaleureux remerciements Jacques Desbrires, Gilles
Trystram, Antoine Hubert et Jack Legrand, pour avoir accept de participer ce jury de thse.
En premier lieu, je remercie et flicite les initiateurs de ce sujet de thse, pour lequel je garde
un grand intrt au-del de la dmarche formation et pour lequel comme tout doctorant, je
me suis investie corps et me ! Je remercie vivement Rgis Baron pour son encadrement,
ses critiques constructives, son regard mthodique et surtout sa patience pour me rendre plus
rigoureuse. Je tiens exprimer ma reconnaissance Abdellah Arhaliass pour sa confiance au
cours de cette tude, ses encouragements et les opportunits de prsenter ce travail de thse
lors de confrences et sminaires. Je tiens galement remercier vivement Jean-Pascal Berg
pour avoir accept dencadrer cette thse, pour mavoir guide techniquement et mavoir fait
partager ses connaissances, ainsi que davoir su maintenir le cap de ltude lorsque des voies
divergentes taient possibles. Jai galement bnfici de laide et du soutien dEric Leroy,
avec qui les changes ont toujours aboutis un bond en avant.
Merci Patrick Durand pour les informations quil a pu mapporter au dmarrage de la thse.
Il faut bien avouer que la chitine ntait plus beaucoup tudie lIFREMER et par
consquent, la fusion des connaissances de chacun a t trs prcieuse. En premier lieu, Alain
Domard ma transmis lessentiel des points conserver en mmoire lorsquon tudie ce
polymre, je lui en suis trs reconnaissante. Ainsi qu Dominique Gillet et Jean-Pierre Say,
des socits Mahtani et France Chitine, qui mont apport des notions prcieuses lies aux
applications de la chitine et ses drivs, et donc aux exigences concrtes du march. Jai
toujours souhait rechercher en lien directe avec la ralit des ressources disponibles et des
demandes du march. Stphane Trombotto est sans aucun doute la personne qui ma le plus
enseign sur les caractristiques de la chitine et sur ces mthodes danalyse. De plus je lui suis
reconnaissante davoir pris part ltude, via des rsultats de RMN, et jai beaucoup apprci
nos changes.
Parmi les rsultats prsents dans ce manuscrit, une partie non ngligeable naurait pu tre
obtenue sans lquipe du MC2 de lINRA de Nantes. Je tiens donc exprimer mes plus vifs
remerciements Denis Lourdin, Marion de Carvellho, Alain Bulon, Bruno Pontoire et
Arnaud Turbin. Certains rsultats proviennent dune autre unit de lINRA, merci Corinne
Rondeau pour les analyses de RMN en 13C.
Pour leur aide technique et scientifique, merci galement Michal Paris de lIMN, Virginie
Sylvestre du CEISAM, ainsi que Marie-Madeleine Giraud-Guille de lUniversit de Pierre &
Marie Curie, Emmanuel Belammie de Montpellier, le Dr Varm de Biopolymer, Yves
Grohens de LIMAB et George Choubert, spcialiste en astaxanthine. Je remercie vivement
lancienne quipe de S3D pour leur accueil et les changes humains.

Merci Guillaume Roelens pour son aide prcieuse en ATG et MEB. Merci mes complices
du GEPEA : Benjamin, PEF, Hlne & son mari, le voisin, Luc, Anthony, Julie, Franois,
Anne, JB, Abdul, Seb, Farid, et jen oublie des doctorants et des stagiaires ! Un grand merci

galement Sandrine, Carole & Arnaud. Il est une personne que jaurais tant aim remercier
de son vivant, Maryse, technicienne irremplaable du GEPEA, lincarnation de la bonne
humeur, de la volont et de lefficacit, une profondment belle personne qui sen est alle
trop vite, trop tt et sans crier garde. Merci pour cette leon qui est tombe un moment
crucial.
Un norme remerciement gnral mes collgues du btiment T du centre IFREMER de
Nantes. Plus prcisment, je tiens remercier Isabelle pour sa gestion parfaite, Sylvie pour
son attention, sa confiance et ses connaissances en bibliographie, Franoise pour son nergie,
Fred pour son calme et sa bonne humeur, Sandrine pour sa complicit et son efficacit
exemplaire, Claire pour son volontarisme et ses comptences, JP pour son humour, Camille
pour sa culture gnrale des produits marins et des pays, Monique, Laetitia & Aurlie pour
leur attention et les transmissions dinformations prcieuses, les Christine pour diffrentes
raisons (humaines et techniques), Sylvia, Corinne et Jacqueline pour leur aide, leurs
connaissances en sucres et leur sympathieJojo, triple-J, Marc & Vronique, Mireille, Anne
& Anne vous avez tous apport une pierre agrable mon environnement de travail, tant
pour la bonne humeur que pour les ides en R&D. Je suis galement reconnaissante Claire
Boisset, Christophe Bailly, Nadia Nour et Aurlie Lecolier pour nos diffrents changes.
Merci galement Vincent Lorcy, pour sa participation active aux rsultats au cours de son
stage.
La thse est une succession daventures dans laventure, de grandes victoires autant que de
dceptions et de frustrations, quil est difficile dexpliquer aux non-pratiquants, cest pourquoi
je tiens remercier trs spcialement mes soupapes de scurit, amis et compres : Papa,
Raoul, Emna, Zo et surtout Christelle, Anas, Sabrina, Gatan, Vincent... & lodie, mme si
elle n'est pas doctorante ! Pour nos partages de coup-de-gueule et coup-de-cur merci
Benot, Myriam, Thierry, Marie, David, Aurlien, Dung, Cdric et jen oublie !
Un grand bravo mon entourage qui na pas eu dautre choix que me supporter pendant ces
trois annes ! En particulier Alex, Marielle, mes parents et le reste de ma famille, ainsi que
Tatiana, Katia, Stef, Rachou, Delphine, Sophie, Emilie, Julie, Aurlia, la Dream Team de la
Dfense et celle de Guiss Beach ! Enfin, je mexcuse auprs de tous ceux pour qui je suis
devenue un fantme ces dernires annes c'tait pour cet ouvrage que je vous ddis !

vi

SOMMAIRE
LISTE DES TABLEAUX ....................................................................................................... xi
LISTE DES FIGURES........................................................................................................... xii
ABREVIATIONS .................................................................................................................. xvi
Introduction .............................................................................................................................. 1
Chapitre 1 Etude bibliographique ....................................................................................... 9
I. Contexte conomique.................................................................................................... 11
I.1. volution du march des produits marins, focus sur les crustacs ................... 11
I.2. Valorisation des coproduits marins : la chitine et ses drivs ........................... 14
I.3. Disponibilit de la chitine, ressource naturelle ................................................. 16
II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs ........................................ 17
II.1. Les applications dans le domaine agricole ....................................................... 18
II.2. Les applications dans le domaine du traitement de leau ................................. 18
II.3. Les films de chitine/ chitosan........................................................................... 18
II.4. Les applications dans les industries alimentaires et dittiques ...................... 19
II.5. Les applications dans le domaine mdical ....................................................... 20
II.6. Autres applications ........................................................................................... 22
II.7. volution des volumes de ventes par domaine dapplication .......................... 22
II.8. Conclusions sur les caractristiques de la chitine et ses applications .............. 23
III. Structure de la matrice chitineuse chez les crustacs ................................................. 23
III.1. La biosynthse de la chitine ............................................................................ 23
III.2. Lorganisation de la cuticule des crustacs .................................................... 24
IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques de la chitine et ses drivs . 28
IV.1. La structure cristalline et lindice de cristallinit ........................................... 29
IV.2. Le degr de polymrisation ............................................................................ 31
IV.3. La masse molaire et la polydispersit des longueurs de chane ..................... 31
IV.4. La solubilit .................................................................................................... 32
IV.5. Le degr dactylation et la rpartition des groupes actyls ......................... 34
V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique ..................................... 35
V.1. Schma gnral ................................................................................................ 35
V.2. La dminralisation.......................................................................................... 36
V.3. La dprotinisation .......................................................................................... 37
V.4. Ltape de blanchiment .................................................................................... 39
V.5. La dsactylation et la dpolymrisation ......................................................... 39
VI. Les traitements biologiques ....................................................................................... 41
VI.1. La voie fermentaire......................................................................................... 41
VI.2. Dprotinisation et de dminralisation enzymatiques .................................. 43
VI.3. Dsactylation et dpolymrisation enzymatique .......................................... 46
VI.3.1. La dsactylation enzymatique.................................................................... 46
VI.3.2. La dpolymrisation enzymatique ou la chitinolyse ................................... 47
VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins .................................................... 48
VII.1. Valeur ajoute des coproduits marins ........................................................... 48
VII.1.1. Les composs protiques............................................................................ 49
VII.1.2. Les composs lipidiques ............................................................................ 50
VII.1.3. Les minraux .............................................................................................. 52
VII.2. Lhydrolyse enzymatique des coproduits marins .......................................... 53
VII.3. Les objectifs envisags par cette tude ......................................................... 53

vii

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence .................... 55
I. Mthodes danalyse de la composition des produits..................................................... 57
I.1. Identification et prparation de la matire premire ......................................... 57
I.2. Matire sche ..................................................................................................... 57
I.3. Teneur en cendres .............................................................................................. 58
I.4. Teneur en lipides ............................................................................................... 58
I.5. Teneur en protines ........................................................................................... 59
I.5.1. Dosage de lazote par Kjeldahl (Crooke et Simpson, 1971) .......................... 59
I.5.2. Mthodes de dosages colorimtriques des protines ...................................... 60
I.5.3. Dosage des acides amins par chromatographie en phase gazeuse ................ 61
I.6. Teneur en rsidus glycosidiques simples .......................................................... 62
I.6.1. Dosage colorimtrique de Dubois et al. (1956) .............................................. 62
I.6.2. Mthode de dosage colorimtrique des osamines .......................................... 62
I.6.3. Dosage des rsidus glycosidiques par chromatographie en phase gazeuse .... 63
I.7. Teneur en chitines ............................................................................................. 64
II. Mthode dextraction de la chitine .............................................................................. 64
II.1. L'extraction chimique ....................................................................................... 64
II.2. L'extraction enzymatique par protolyse acide ................................................ 65
III. Caractrisation qualitative des produits ..................................................................... 66
III.1. Mesure du degr dactylation........................................................................ 66
III.1.1. Rsonance magntique nuclaire du liquide 1H .......................................... 66
III.1.2. Rsonance magntique nuclaire du solide en 13C et 15N............................ 67
III.1.3. Spectroscopie infrarouge transformation de Fourrier - FTIR ................... 67
III.2. Mesure du degr de polymrisation ................................................................ 68
III.3. Mesure de lindice de cristallinit................................................................... 69
III.4. Caractrisation des proprits thermiques ...................................................... 70
III.4.1. Analyse thermogravimtrique (ATG).......................................................... 70
III.5. Lanalyse lmentaire ..................................................................................... 71
III.6. Colorimtrie .................................................................................................... 71
IV. Application, comparaison et slection des mthodes................................................. 71
IV.1. Composition de la matire premire............................................................... 72
IV.1.1. Quantification des protines ........................................................................ 72
IV.1.2. Caractrisation complte de la composition de la matire premire ........... 74
IV.2. Composition des produits commerciaux ........................................................ 75
IV.3. Composition des produits de lextraction enzymatique ................................. 76
IV.3.1. Les rsidus insolubles de la cintique de rfrence ..................................... 76
IV.4. Estimation du degr de puret ........................................................................ 77
IV.4.1. Recoupement par lanalyse lmentaire ...................................................... 77
IV.4.2. Recoupement par lanalyse thermogravimtrique ....................................... 82
IV.4.3. Recoupement par RMN et FT-IR ................................................................ 87
IV.5. Estimation du degr dactylation .................................................................. 89
IV.6. Estimation de lindice de cristallinit ............................................................. 91
V. Conclusion sur le choix des mthodes ........................................................................ 92
Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide ............. 95
I. Introduction ................................................................................................................... 97
II. Le milieu ractionnel acide.......................................................................................... 97
II.1. Choix de lacide : lacide phosphorique .......................................................... 97
II.2. Effet de lacide sur la dprotinisation et de la dminralisation .................... 97
III. La protase acide ........................................................................................................ 99

viii

III.1. Choix de la protase : la pepsine .................................................................... 99


III.1.1. Activit protolytique ................................................................................ 100
III.1.2. Activit chitinolytique ............................................................................... 102
III.2. Les conditions dhydrolyse par la pepsine pour extraire la chitine .............. 102
III.2.1. Les paramtres du procd tudier ......................................................... 103
III.2.2. Mise en place dun plan dexprience ....................................................... 103
IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique .................... 106
IV.1. Rsultats du plan dexprience ..................................................................... 106
IV.2. Rsultats de lanalyse statistique .................................................................. 112
IV.2.1. Degr de dminralisation ......................................................................... 112
IV.2.2. Le degr de dprotinisation ..................................................................... 113
IV.2.3. Estimation du degr de puret ................................................................... 114
IV.2.4. Rcapitulatif des analyses statistiques ....................................................... 115
IV.3. largissement du domaine dtude pour la dprotinisation ........................ 117
IV.3.1. Augmentation de la concentration en pepsine ........................................... 117
IV.3.2. Augmentation de la dure dhydrolyse...................................................... 119
V. Modlisation .............................................................................................................. 120
V.1. Introduction .................................................................................................... 120
V.2. Modlisation de la dminralisation .............................................................. 122
V.3. Modlisation de la dprotinisation ............................................................... 125
VI. Choix des conditions optimales ............................................................................... 129
VII. Composition de la phase liquide et balance massique ............................................ 130
VII.1. Bilan massique global des minraux ........................................................... 130
VII.2. Bilan massique global des protines ........................................................... 132
VII.3. Bilan massique global des autres composs ................................................ 133
VIII. Extension une autre enzyme et un autre acide .................................................... 134
IX. Conclusions du chapitre 3 ........................................................................................ 139
Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies
dextraction ........................................................................................................................... 143
I. Performances de dminralisation et de dprotinisation ........................................... 145
I.1. Comparaison avec lextraction chimique ........................................................ 145
I.1.1. Degr de dminralisation ............................................................................ 146
I.1.2. Degr de dprotinisation ............................................................................. 147
I.2. Comparaison avec dautres procds dextraction biologique ........................ 148
II. Qualit physico-chimique des produits ..................................................................... 150
II.1. Degr dactylation ........................................................................................ 150
II.2. Degr de polymrisation ................................................................................ 152
II.3. Degr de cristallinit ...................................................................................... 153
II.4. Stabilit thermique ......................................................................................... 154
III. Comparaison des mcanismes dextraction ............................................................. 155
IV. Valorisation de la phase soluble............................................................................... 157
IV.1. Analyse du poids molculaire des peptides solubles .................................... 157
IV.2. Evolution de llimination des acides amins dans le rsidu solide ............. 161
IV.3. Rsidus glycosidiques .................................................................................. 162
IV.4. Pigments ....................................................................................................... 163
IV.4.1. Quantit de lipides et dastaxanthine dans la phase soluble ...................... 163
IV.4.2. La couleur des rsidus insolubles .............................................................. 165
V. Conclusions du chapitre 4 ......................................................................................... 167

Conclusion & Perspectives .................................................................................................. 169


Rfrences ............................................................................................................................. 175
Annexes ................................................................................................................................ 201

LISTE DES TABLEAUX


Tab.I.1 : Production de drivs partir de chitine et gamme de prix (Einbu, 2007a) ......................................... 15
Tab.I.2 : Teneur en chitine par espces (Mathur et Narang, 1990 ; Shahidi, 2002) ............................................ 16
Tab.I.3 : Utilisations de la chitine/ chitosan en agroalimentaire (Crini et al. 2009)............................................ 19
Tab.I.4 : Rpartition des applications du chitosan, en tonnes, en 2006 (GIA, 2010) ........................................... 23
Tab.I.5 : Quantits de chitine et de carbonate de calcium (Kurita, 2006) ............................................................ 24
Tab.I.6 : Liste non-exhaustive des solvants de la chitine, (Shahidi, 2002 ; Kumar, 2004 ; Morris 2009) ............ 33
Tab.I.7 : Sites des liaisons lyses en fonction de lenzyme (Rao, 1998)................................................................ 43
Tab.II.1: Caractristiques des principaux dosages colorimtriques des protines (Tyr=tyrosine, Cys=cystine et
Trp=tryptophane, His=histidine, Arg=arginine et Lys=lysine) ........................................................................... 60
Tab.II.2 : Dplacements chimiques des protons et carbones en RMN (Kasaai,2010) .......................................... 66
Tab.II.3 : Pics caractristiques en FT-IR de la chitine (Pawlak et al. 2003) ....................................................... 67
Tab.II.4 : Exemples de le relations employes pour dterminer le DA via la spectroscopie FT-IR ..................... 68
Tab.II.5 : Rsultats de la teneur en protines comparaison des mthodes ........................................................ 72
Tab.II.6 : Composition en acides amins dans la matire premire comparaison entre laboratoires .............. 73
Tab.II.7 : Composition globale des exosquelettes de crevette P. vannamei .......................................................... 74
Tab.II.8 : Comparaison des compositions de la chitine commerciale (% en poids sec) ....................................... 75
Tab II.9 : Comparaison de plages de dgradation thermique de la chitine et des protines selon les tudes ...... 83
Tab.II.10 : Caractristiques des comportements thermiques des produits de diffrents degrs de puret ........... 84
Tab.II.11 : Composition des produits de diffrents degrs de puret (estimation par *CPG, **lavage au NaOH)
.............................................................................................................................................................................. 85
Tab.II.12 : Comparaison des DA, DP, C/N et ICr entre chitine commerciale ....................................................... 93
Tab.III.1 : Composition du substrat t0 de lhydrolyse enzymatique ................................................................... 99
Tab.III.2 : Conditions du plan dexprience : bornes des paramtres tudis ................................................... 104
Tab.III.3 : Description des conditions du plan dexprience .............................................................................. 105
Tab.III.4 : Lgende des rsultats du plan dexprience ...................................................................................... 106
Tab.III.5 : Statistiques appliques au degr de dminralisation ....................................................................... 112
Tab.III.6 : Statistiques appliques au degr de dprotinisation ........................................................................ 113
Tab.III.7 : Statistiques appliques au rapport C/N ............................................................................................. 114
Tab.III.8 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH ..................... 115
Tab.III.9 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH ..................... 116
Tab.III.10 : Comparaison des effets sur les diffrents aspects de lhydrolyse par la pepsine ............................ 116
Tab.III.11 : Impact relatif des variables sur les deux composantes du modle MA ............................................ 122
Tab.III.12 : Impact relatif des variables sur le modle MC ................................................................................. 125
Tab.III.13 : Description dtaille des recherches de modlisation de la dprotinisation ................................. 126
Tab.III.14 : Comparaison des caractristiques des produits insolubles obtenus par hydrolyse enzymatique, par
la pepsine et par lASP, aprs 6 h et 12 h de raction ........................................................................................ 137
Tab.III.15: Rcapitulatifs des performances atteintes aprs 6 h de protolyse acide ......................................... 139
Tab.IV.1 : Comparaison des performances dextraction de la chitine par voies biologiques, Xu et al. 2008 .... 149
Tab.IV.2 : Liste des bactries utilises par les tests dactivits antimicrobienne de la phase soluble ................ 159
Tab.IV.3 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction ... 165
Tab.IV.4 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction ... 165
Tab.IV.5 : Comparaison des performances en purification de chitine en fonction du procd .......................... 168
Tab.IV.6 : Comparaison des performances en purification de chitine en fonction du procd .......................... 168
Tab.IV.7 : Comparaison de la production deffluents chimique en fonction du procd.................................... 168

xi

LISTE DES FIGURES


Fig.1 : Reprsentation gnrale de la chitine comme copolymre de glucosamine et Nactylglucosamine ................................................................................................................................... 3
Fig.2 : Chitine et drivs de la chitine .................................................................................................... 3
Fig.3 : Evolution du nombre de publication par anne traitant de chitine ou chitosan sur Web
of Science................................................................................................................................................. 4
Fig.4 : Schma du procd dextraction de linvention dcrite par le brevet FR 11 54580, 24 mai
2011. ........................................................................................................................................................ 7
Fig.I.1 : Rpartition de la consommation moyenne de produits marins par habitant de 2003 2005. 11
Fig.I.2 : Secteurs approvisionns par la production de poissons dans le monde (sauf Chine) FAO 2009
............................................................................................................................................................... 12
Fig.I.3 : Contribution relative de laquaculture et des captures en mer dans la consommation humaine
de PM .................................................................................................................................................... 12
Fig.I.4 : Production de crevettes dans le monde, rpartition entre la pche (P) et laquaculture (A),
FAO, 2006 ............................................................................................................................................. 13
Fig.I.5 : Rpartition des pnides leves en aquaculture dans le monde, FAO, 2010 ........................ 13
Fig.I.6 : Ventes de chitine en fonction des zones gographiques (Daprs GIA, 2010) ....................... 15
Fig.I.7 : Procd de fabrication de chitine-glucane par Kitozyme ....................................................... 17
Fig.I.8 : volution des domaines dapplication pour lesquels le chitosan est employ (Daprs GIA,
2010)...................................................................................................................................................... 22
Fig.I.9 : Niveaux hirarchiques dans lorganisation de la cuticule de crabe H. americanus (Raabe,
2005)...................................................................................................................................................... 25
Fig.I.10: (a) Motifs de Bouligand, CT de cuticule de homard en MEB, Raabe, 2006 ; (b)
reprsentations schmatiques de lempilement des fibres, Pillai et al. 2009 ........................................ 25
Fig.I.11 : Structure en nid dabeilles de cuticule de homard en CT par MEB (a) Pillai, 2009 (b)
Raabe, 2006 ........................................................................................................................................... 26
Fig.I.12 : Structure de la cuticule normal (a) et dcalcifie (b) par MEB (Raabe, 2005) .................... 26
Fig.I.13: Proposition de structure entre chitine et protines, a) Stankiewicz et al. 1996 b)
Hamodrakas, 2002 ................................................................................................................................ 27
Fig.I.14 : Reprsentation idale de la chitine (a) et son driv obtenu par dsactylation, le chitosan
(b). ......................................................................................................................................................... 28
Fig.I.15: Arrangement des trois formes existantes de chitine : , et (Einbu 2007) ......................... 29
Fig.I.16: Maille cristalline .................................................................................................................... 30
Fig.I.17 : Dispersion des masses molculaires ..................................................................................... 31
Fig.I.18: Schmas de distribution des groupes actyles le long de la chane carbone du chitosan, a)
PA=0: rpartition par blocs uniformes, b) PA=1: rpartition alatoire et c) PA=2: rpartition
alterne entre A et D. ............................................................................................................................ 34
Fig.I.19 : Procd industriel de fabrication de la chitine et de ses drivs (France Chitine) .............. 35
Fig.I.20 : Schma des ractions chimiques de dsactylation et dpolymrisation Sigma-Aldrich,
Tutorial .................................................................................................................................................. 39
Fig.I.21: Schma du procd d'hydrolyse enzymatique par Beaulieu, 2009......................................... 45
Fig.I.22: Voies enzymatiques de conversion de la chitine en drivs dsactyls et dpolymriss
(Jeon et al. 2000) ................................................................................................................................... 48
Fig.I.23 : Parts (en tonnage) des voies de valorisation de coproduits marins en France, Andrieux,
2004 ....................................................................................................................................................... 48
Fig.I.24 : Mcanismes de digestion et dabsorption des protines par lorganisme ............................ 50
Fig.I.25 : Schma dune membrane cellulaire, rpartition des composs lipidiques ........................... 51
Fig.I.26 : La cuisson des crustacs modifie la conformation des pigments et donc change leur couleur
............................................................................................................................................................... 51
FigI.27 : Cristal de calcite, support de nanocristaux de brushite (Maity et al. 2011) et ciment de
phosphate de calcium appliqu (Callos Bone) ................................................................................... 53
Fig.I.28 : Hypothse de liaison entre chitine et protines proposes par Armenta et GuerreroLegarreta (2009) ................................................................................................................................... 54

xii

Fig.II.1 : Rpartition des parts de produits et coproduits de crevettes (en pourcentage de poids
humide) .................................................................................................................................................. 57
Fig.II.2 : Hydrolyse enzymatique d'exosquelette de crevette par la pepsine en milieu maintenu acide
par H3PO4.............................................................................................................................................. 65
Fig.II.3 : Spectre 1H RMN de chitosan, 600 MHz, en D2O, 65 C, (Yang et Montgomery, 2000) ... 66
Fig.II.4 : Viscosimtre capillaire dUbbelhode .................................................................................... 69
Fig.II.5 : Dispositif danalyse thermogravimtrique (Source Web, Wikipedia).................................... 70
Fig.II.6 : Composition en acides amins de l'exosquelette de crevette comparaison par laboratoires
............................................................................................................................................................... 73
Fig.II.7 : Principaux composs prsents dans la matire premire en fonction de la catgorie de taille
(n > 3).................................................................................................................................................... 75
Fig.II.8 : Cintique dhydrolyse enzymatique (25 % de pepsine/prot 40 C taille < 1mm)............ 76
Fig.II.9 : Variations de teneur en azote pour diffrents composs azots (P et Q)............................... 79
Fig.II.10 : Pourcentage de chitine (Q) et de protines (P), minimal (---) et maximal ( ) en fonction de
Nt ........................................................................................................................................................... 79
Fig.II.11 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan
massique ; en bleu, via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp
dtermin par CPG) .............................................................................................................................. 80
Fig.II.12 : Corrlation entre les mthodes de quantification de la chitine (NaOH= via le traitement
chimique, Bilan = via le bilan massique, N (AE) = via lanalyse lmentaire, Naa = via la
composition en acides amins ............................................................................................................... 81
Fig.II.13: Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique (25 % pepsine,
40 C) .................................................................................................................................................... 82
Fig.II.14 : Thermogramme de produits de diffrents degrs de puret (1 C/min) .............................. 84
Fig.II.15 : Relation entre la perte de masse de la 1re tape et la quantit de protines....................... 86
Fig.II.16 : Relation entre lestimation du taux de puret et la quantit de protines rsiduelles dune
part et ltendue de la premire plage de temprature de dcomposition dautre part ........................ 86
Fig.II.17 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la
matire premire, en rouge ................................................................................................................... 87
Fig.II.18 : Spectres de spectroscopie FT-IR de la chitine commerciale Sigma (en bleu), extraite par
voie chimique (en rouge) et enzymatique (en vert) au laboratoire. ...................................................... 88
Fig.II.19 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la
matire premire, en rouge ................................................................................................................... 90
Fig.II.20 :Spectre RMN 1H de la chitine commerciale.......................................................................... 90
Fig.II.21 : Spectre FT-IR sur le rsidu solide de 6 h lhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C, (analyse
mene par le laboratoire BMM) ............................................................................................................ 91
Fig.II.22 : Dconvolution du spectre de diffraction aux rayons X de la chitine commerciale Mahtani 92
Fig.II.23 : Comparaison visuelle entre le produit dextraction chimique (a) et le produit dhydrolyse
enzymatique(b) ...................................................................................................................................... 93
Fig.III.1 : Composition des produits traits par lacide phosphorique en fonction du temps .............. 98
Fig.III.2 : Reprsentation schmatique de la pepsine (Source Web, http://dwb4.unl.edu) ................... 99
Fig.III.3 : Mcanisme propos pour la protolyse par les aspartate-protases (Reginald et al. 1974)
............................................................................................................................................................. 100
Fig.III.4 : Conditions de pH (A) et T(B) optimales de protolyse ..................................................... 100
Fig.III.5 : Modle selon Michalis-Menten, de la vitesse de raction en fonction de la consommation
en substrat ........................................................................................................................................... 101
Fig.III.6 : Comparaison sur la chitosanolyse selon 3 protases diffrentes, effet de la concentration en
enzyme (A), du pH (B), de la temprature (C) et de la concentration en substrat (D), Kumar et
Tharanathan 2004 ............................................................................................................................... 102
Fig.III.7 : Reprsentation schmatique dun plan factoriel complet dexprience 2k ......................... 103
Fig.III.8 : Rponses du plan dexprience : analyses de caractrisation des produits dhydrolyse
tudies ................................................................................................................................................ 105
Fig.III.9 : Rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience ................ 106
Fig.III.10 : Quantit de minraux limins en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience
............................................................................................................................................................. 107

xiii

Fig.III.11 : Quantit de protines limines en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience


............................................................................................................................................................. 107
Fig.III.12 : Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse plan dexprience ....... 108
Fig.III.13 : Evolution du pourcentage dazote en fonction de la dure dhydrolyse plan dexprience
............................................................................................................................................................. 109
Fig.III.14 : Estimation du degr de puret de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience...... 109
Fig.III.15 : Estimation de la quantit absolue de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience 110
Fig.III.16 : Degrs dlimination (%) des minraux (a) et des protines (b) en fonction de lexprience
............................................................................................................................................................. 110
Fig.III.1 : Estimation du degr de puret (a) et rapport C/N (b) en fonction de lexprience ............ 111
Fig.III.18 : Reprsentation du degr de dminralisation en fonction de la dure dhydrolyse
enzymatique et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine, 40C, selon lquation III.2
............................................................................................................................................................. 113
Fig.III.19 : Reprsentation du degr de dprotinisation en fonction de la dure dhydrolyse
enzymatique et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C ............................. 114
Fig.III.20 : Reprsentation du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la
taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C .............................................................. 115
Fig.III.21 : Reprsentation du rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique
et de la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C .................................................. 116
Fig.III.22 : Hydrolyse enzymatique par 25 % de pepsine (T 40 C Taille < 1 mm)........................ 118
Fig.III.23 : Hydrolyse enzymatique par 41 % de pepsine (T40 C Taille < 1 mm)........................ 118
Fig.III.24 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan
massique ; en bleu, via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp
dtermin par CPG) ............................................................................................................................ 119
Fig.III.25 : Comparaison des extractions par 25 % de pepsine entre 6 h et 12 h dhydrolyse (n=3) 119
Fig.III.26 : tapes du mcanisme dhydrolyse enzymatique (Hosseini et al. 2011) ........................... 121
Fig.III.27 : Confrontation entre le modle MA et les mesures observes, sse = 136 et rmse = 1,01 .. 123
Fig.III.28 : Confrontation entre le modle MB et les mesures observes, sse = 205, rmse = 1,21 ..... 124
Fig.III.29 : Confrontation entre le modle C et les mesures observes, sse = 118 et rmse = 0,93 .... 124
Fig.III.30 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1087 et
rmse = 3,14 ......................................................................................................................................... 126
Fig.III.31 : Effets inhibiteur et activateur selon laffinit avec les effecteurs forte (a) ou faible (b) .. 127
Fig.III.32 : Interaction et formation du complexe ENZYME-SUBSTRAT-EFFECTEUR ................... 127
Fig.III.33 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1072 et
rmse = 3,08 ......................................................................................................................................... 128
Fig.III.34 : Reprsentation du prix de vente de la chitine en fonction du cot de production (J) ...... 130
Fig.III.35 : Cintique de la composition de la phase soluble Hydrolyse de rfrence .................... 131
Fig.III.36 : Quantits de minraux dans les phases solubles et insolubles au cours de la raction ... 132
Fig.III.37 : Quantits de protines dans les phases solubles et insolubles au cours de la raction ... 133
Fig.III.38 : Composition de la phase soluble aprs 6 h dextraction enzymatique (cintique de
rfrence) ............................................................................................................................................ 133
Fig.III.39 : Caractristiques techniques de lAcide Stable Protase, analyses par Bio-Cat Inc ...... 134
Fig.III.40 : Comparaison du rendement massique (a), de la quantit de minraux rsiduels (b) et des
protines rsiduelles (c) en fonction de lacide employ .................................................................... 135
Fig.III.41 : Composition des rsidus solides de lhydrolyse par 25 % dASP 45 C, pH 2,7 .......... 136
Fig.III.42 : Comparaison des performences dextraction enzymatique selon lacide employ, de part
les degrs de dminralisation et de dprotinisation (a), le rendement massique et la quantit de
chitine (b), n=3 .................................................................................................................................... 137
Fig.IV.1 : Consquence de la dminralisation et dprotinisation chimique sur la composition des
produits................................................................................................................................................ 145
Fig.IV.2 : Comparaison des degrs de dminralisation en fonction des procds dextraction ....... 146
Fig.IV.3 : Comparaison des degrs de dprotinisation en fonction du procd dextraction........... 147
Fig.IV.4 : Degr dactylation des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique 151
Fig.IV.5 : Degr de polymrisation des principales chitines produites par voie enzymatique et
chimique .............................................................................................................................................. 152

xiv

Fig.IV.6 : Indice de cristallinit des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique
............................................................................................................................................................. 153
Fig.IV.7 : Profils dATG de la chitine commerciale (Mahtani) et du produit de lextraction
enzymatique modle ............................................................................................................................ 154
Fig.IV.8 : Micrographies de MEB du produit de 6 h dhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C ....... 155
Fig.IV.9 : Organisation schmatique de la cuticule de homard, coupe transversale, Raabe et al. 2006
............................................................................................................................................................. 156
Fig.IV.10 : Micrographes de MEB dexosquelettes soit dminraliss (a) ou dprotiniss (b) par
traitement chimique ............................................................................................................................. 156
Fig.IV.11 : Schma de la cuticule des crustacs, ep = picuticule, pi = couche pigmentaire, pr =
couche principale, E = cellules pithliales, p.c. = canaux de ports transversaux, i.s. = septum
interprismatique, Giraud-Guille, 1984 ............................................................................................... 157
Fig.IV.12 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction
enzymatique (par 25 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse..... 158
Fig.IV.13 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction
enzymatique (par 41 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse..... 159
Fig.IV.14 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction
enzymatique (par 25 % dASP en acide formique 40 C) selon la dure dhydrolyse ..................... 160
Fig.IV.15 : Quantits dacides amins rsiduels dans les produits insolubles de lextraction
enzymatique par 25% de pepsine 40C (petite taille) en fonction de la dure dhydrolyse ............. 161
Fig.IV.16 : Rpartition des catgories de rsidus glycosidiques dans la phase soluble des extractions
enzymatiques ....................................................................................................................................... 162
Fig.IV.17 : Carotnodes prsents dans la phase soluble de lhydrolyse 25 % de pepsine, 6 h 40
C......................................................................................................................................................... 164
Fig.IV.18 : Comparaison des coefficients de spectrophotomtrie ...................................................... 166
Fig.IV.19 : Chitine obtenue par lavage chimique, par hydrolyse par la pepsine et par lASP (de
gauche droite) .................................................................................................................................. 166
Fig.IV.20 : Schma rcapitulatif des tapes du procd de protolyse acide et des analyses
conscutives ......................................................................................................................................... 167

xv

ABREVIATIONS
AA
ABVT
ATG
BSA
CHOS
CPG
CS
CT
Da
DA
DCO
DD
DCl
DSC
DHA
DP :
EPA
FA ; FD
FID
GC/MS
HPLC
JO
LMWC
MES
Mdt
Mt
NMR
PA
PER
USD

Acide amin
Azote basique volatil total
Analyse ThermoGravimtrique
Srum albumine bovine
Chitooligosaccharides
Chromatographie en phase gazeuse
Chitine-synthtase
Coupe transversale
Dalton
Degr dactylation
Demande chimique en Oxygne
Degr de dsactylation
Deuterated hydrochloric acid
Differential scanning calorimetry
Acide docosahexanoque
Degr de polymrisation
Acide eicosapentanoque
Fraction des units actyles ; Fraction des units actyles
Dtection par ionisation de flamme
Chromatographie en phase Gazeuse-Spectromtrie de Masse
Chromatographie en phase liquide
Journal Officiel
Chitosan de trs faible masse molaire (oppos HMWC)
Matires en suspension
Milliard de tonnes
Million de tonnes
Rsonnance magntique nuclaire
Pattern of N-acetylation
Pourcentage defficacit des protines (Protein Efficiency Ratio)
United States Dollar

Abrviations chimiques
CH3COCH3
Actone
(COOH)2
Acide oxalique
Ca(H2PO4)2
Bis-dihydrognophosphate de calcium
CaHPO4
phosphate de calcium de formule (brushite)
Ca3(PO4)2
Tricalcium phosphate
CH3COOCH2CH3 thyle-actate
H202
Peroxyde dhydrogne
HNO2
Acide nitreux
KBr
Potassium bromide
KMnO4
Permanganate de potassium
KNaC4H4O6
Tartrate de sodium et potassium
Na2CO3
Carbonate de sodium
NaBH4
Sodium borohydride
NaClO
Hypochlorite de sodium

xvi

Introduction

Introduction

Gnralits
La chitine a t isole pour la premire fois, en 1811, par un chercheur franais, Henri
Braconnot, sur un champignon. Son driv, le chitosan a t dcouvert en 1859 par Charles
Rouget alors quil chauffait la chitine avec du KOH concentr.
Ce polymre est un des plus abondants sur Terre, la fois dans le milieu terrestre et marin. Il
est traditionnellement extrait partir des carapaces des crustacs depuis les annes 70, pour
des domaines dapplication varis, tels que la pharmaceutique, la cosmtique, la dittique et
le traitement des eaux. Il est compos dun squelette carbon linaire, des units de
glucosamine et de N-actylglucosamine (Fig.1).

Fig.1 : Reprsentation gnrale de la chitine comme copolymre de glucosamine et N-actylglucosamine

La chitine et le chitosan sont principalement caractriss par leur degr de polymrisation


(DP), c'est--dire par le nombre dunits qui constituent la chane du polymre, et par leur
degr dactylation (DA), c'est--dire le pourcentage dunits actyles. Ces paramtres
modulent par exemple la densit de charge du polymre, et donc sa solubilit et ses biofonctionnalits. Dautres caractristiques sont parfois mesures en raison de leur influence sur
les proprits du polymre, tels que lindice de cristallinit et la poly-dispersion des units de
glucosamine (Glu) et N-actylglucosamine (NacGlu). Les applications de la chitine et de ses
drivs sont lies leurs proprits et par consquent ces caractristiques (Kasaai, 2010).

Fig.2 : Chitine et drivs de la chitine

Les principaux drivs de la chitine et les mcanismes pour les produire sont schmatiss par

Introduction

la figure 2. Par dsactylation, la chitine est convertie en chitosan, tandis que la


dpolymrisation rduit la chitine en oligomres. Si le procd est men son terme, le
polymre est entirement converti en rsidus de Glu ou NacGlu. La dpolymrisation
applique au chitosan produit des oligomres de chitosan puis des units de glucosamine.
La recherche sintresse de plus en plus la chitine et ses drivs
Le nombre de publications sur le thme de la chitine et ses drivs ne cesse de stendre
depuis 1970. Cette anne-l, le nombre de publication portant sur la chitine ou le chitosan
tait de 40, daprs la base Web of Science, alors quil atteint 5 260 en 2011. Avant 1960, le
nombre dtudes publies par an sur ce thme tait infrieur 5. La figure 3 illustre cette
volution. Daprs les conclusions de ces publications, ces produits sont promis un bel
avenir. Leurs proprits biologiques et rhologiques sont encore sous-exploites par rapport
leurs potentiels, par exemple comme films alimentaires. De nombreux laboratoires
sinvestissent dans la mise au point de nouvelles applications, notamment dans le domaine
mdical. De plus, il existe un engouement pour les produits dorigine naturelle et de surcrot
dorigine marine.
Les premiers brevets concernant le chitosan semblent dater des annes 30 (Rigby, 1934 et
1935) et son application concernait la fabrication de biofilms (Shahidi, 2002). Au cours de
lanne 2010, la littrature sur la chitine et le chitosan sest enrichie de nombreuses revues qui
constituent de rels atouts pour la poursuite des tudes dans ce domaine. Les laboratoires
leaders se situent majoritairement en Asie, o se situe galement la majorit de la production
et des applications.

Nombre de publications

5000
4000
3000
2000
1000

2011

2009

2007

2005

2003

2001

1999

1997

1995

1993

1991

1989

1988

1985

1983

1979

1980

1977

1975

1972

1971

1970

1967

1957

1960

Fig.3 : Evolution du nombre de publication par anne traitant de chitine ou chitosan sur Web of Science

Les enjeux de ltude


La thmatique de cette tude sinscrit dans la valorisation des coproduits de crustacs. La
chitine est lun des constituants majoritaires de lexosquelette des crustacs. Son extraction
est habituellement ralise par traitement chimique. Elle repose principalement sur deux
tapes :
- la dminralisation, par hydrolyse acide, pour liminer les minraux ;
- la dprotinisation, par hydrolyse basique, pour liminer les protines.

Introduction

Ce procd chimique consomme de grandes quantits deau et de ractifs (principalement


lacide chlorhydrique, lhydroxyde de sodium et des agents de blanchiment) qui sont nocifs
pour les manipulateurs, les quipements et lenvironnement. De plus, ltape de
dprotinisation basique se fait en gnral chaud et donc ncessite un apport nergtique
consquent. En outre, les tapes de lavage gnrent des volumes trs importants deffluents
pollus, dont le recyclage engendre un cot. Enfin, le procd dextraction chimique risque de
dnaturer la structure de la chitine et ne permet pas la valorisation des autres composs des
coproduits de crustacs, tels que les peptides et les pigments (Crini et al. 2009).
l'inverse, un procd biologique de purification de la chitine rpondrait mieux aux enjeux
actuels de dveloppement durable. Son empreinte sur lenvironnement devrait tre rduite car
les volumes d'effluents chargs en ractifs chimiques sont plus faibles. Ses conditions plus
douces devraient prserver la qualit de la chitine. Enfin elles devraient galement favoriser la
valorisation des autres constituants, prsents dans les coproduits de crustacs. Il sagit
notamment des peptides et des pigments.
Les expriences dextraction de chitine par voie fermentaire et enzymatique seront dcrites au
cours du premier chapitre de ce manuscrit. Par ces voies, les taux de protines et minraux
rsiduels sont plus importants par rapport lemploi de lextraction chimique. Des traitements
complmentaires sont souvent ncessaires pour amliorer le degr de puret en chitine. Enfin,
les temps de raction sont beaucoup plus longs que par la voie chimique.
Lide directrice de ltude
Dans ce contexte, la prsente tude prtend appliquer un traitement enzymatique optimis afin
dextraire la chitine des coproduits de crustacs. Conscients des contraintes conomiques et
environnementales actuelles, le procd dcrit aura pour principe de fusionner les deux
principales tapes de l'extraction de la chitine en une seule tape. Cela a pour consquence
directe une rduction du risque de perte de produit au cours des tapes de lavage et une
rduction de temps par rapport aux prcdents traitements biologiques.
Lide directrice de cette tude est dutiliser des protases mme de fonctionner pH acide,
afin de runir les deux tapes de dminralisation et dprotinisation en une seule tape de
protolyse acide.
Pour favoriser la dminralisation et la dprotinisation, le pH du milieu doit tre proche dun
pH optimis pour raliser ces deux ractions simultanment. De plus il doit prserver
l'intgrit structurelle et fonctionnelle des composs hydrolyss. Enfin, son innocuit doit tre
garantie pour envisager dventuelles applications dans les domaines de lagroalimentaire, de
la nutraceutique et des cosmtiques.
Les objectifs sous-jacents concernent dune part lapproche mthodologique pour caractriser
le substrat et les produits obtenus. Dautre part, une tude des paramtres qui influencent les
performances du procd est ncessaire pour son optimisation.

Introduction

Prsentation des objectifs et organisation du manuscrit


Le premier chapitre situe le contexte de la filire des coproduits marins sur le march actuel et
retrace ltat de lart concernant la chitine et ses drivs. Un accent particulier est port sur le
lien entre les caractristiques de la chitine ou de ses drivs et leurs proprits. Notre sujet
sinscrivant dans une rflexion sur la valorisation maximale des coproduits de crustacs,
lexploitation des autres composs prsents (protines, minraux et pigments) est galement
tudie.
La caractrisation de la matire premire, de la chitine commerciale et des produits issus du
procd enzymatique est ncessaire. Elle consiste dterminer la composition de ces produits
et leurs caractristiques physico-chimiques. Au cours du chapitre 2, plusieurs mthodes sont
compares et discutes. Elles font face la difficult de sparer la chitine et les protines. Une
stratgie analytique est mise en uvre pour estimer au mieux la composition des produits et le
degr de puret en chitine (ou linverse son degr dimpurets). Cette stratgie permet
destimer les performances du procd.
Le chapitre 3 traite des paramtres influenant les performances de lextraction enzymatique.
Ils permettent doptimiser et de contrler les conditions du procd. Les paramtres tudis
sont la temprature, la concentration en enzymes et la taille des fragments de matire
premire. Un plan dexprience est ralis pour suivre les cintiques de dminralisation et de
dprotinisation. Daprs les rsultats obtenus, le domaine dtude est tendu, notamment
avec laugmentation de la concentration en enzyme. Un travail est alors entrepris pour
modliser les cintiques de dminralisation et de dprotinisation. Sur la base du modle
retenu, un travail prliminaire doptimisation du procd est engag. Il permet didentifier nos
conditions de rfrence. Lutilisation dune autre enzyme et dun autre acide est explore. Une
validation du bilan massique des deux phases issues de lhydrolyse enzymatique est propose.
Ce procd de purification de la chitine en une seule tape par voie enzymatique, a fait lobjet
dun dpt de brevet (FR 11 54580 ; Fig.4).
Le chapitre 4 compare les performances du nouveau procd par rapport l'extraction
chimique traditionnelle, sur la base de critres de caractrisation tels que les degrs
dactylation et de polymrisation, ainsi que lindice de cristallinit. La structure des rsidus
solides, supposs tre majoritairement de la chitine, est observe par microscopie balayage
lectronique. Une analyse plus fine des composs solubiliss par lhydrolyse enzymatique est
ensuite propose.
La dernire partie soulignera les principales conclusions apportes par ce travail.

Introduction

Fig.4 : Schma du procd dextraction de linvention dcrite par le brevet FR 11 54580, 24 mai 2011.

Chapitre 1 Etude bibliographique

I. Contexte conomique

I. Contexte conomique
I.1. volution du march des produits marins, focus sur les crustacs
Le march des produits aquatiques ne cesse daugmenter lchelle internationale. La forte
hausse de la demande est principalement lie laugmentation de la consommation humaine.
Elle reprsentait 0,7 Kg par habitant en 1970 tandis quelle a atteint 7,8 Kg par habitant en
2008, soit une augmentation de 6,6 % par an (FAO, 2010).
La consommation de produits marins est ingalement rpartie sur la surface de la plante,
comme le montre la figure I.1 (FAO, 2008).

Fig.I.1 : Rpartition de la consommation moyenne de produits marins par habitant de 2003 2005

Cette rpartition ingale est le reflet de valeurs traditionnelles et culturelles, de la disponibilit


en ressources marines et de critres socio-conomiques. La consommation est la plus leve
au Groenland et au Japon. Elle est la plus faible en Afrique. Elle est importante en AsieIndonsie-Ocanie, en Europe Occidentale, en Amrique du Nord, Centrale et sur la cte
chilienne.
La consommation humaine de produits marins a atteint 72,1 Mt en 2006. Son augmentation
suit celle de la population. Les utilisations non-alimentaires ont augment jusqu la fin des
annes 90 (Fig.I.2) et contribue leffort de pche mondial. La principale utilisation nonalimentaire est la production de fourniture pour lalimentation animale, notamment pour
laquaculture.

11

Chapitre 1 Etude bibliographique

Fig.I.2 : Secteurs approvisionns par la production de poissons dans le monde (sauf Chine) FAO 2009

La hausse de la production sexplique par la progression de la production aquacole depuis le


milieu des annes 80. Cette part de laquaculture doit tre pondre par la place de lAsie,
notamment la Chine, dont la production de poissons dlevage prsente une forte ascension
depuis les vingt dernires annes (Fig.I.3. FAO, 2009).

Fig.I.3 : Contribution relative de laquaculture et des captures en mer dans la consommation humaine de PM

Avant la crise de 2009, laugmentation de la consommation tait particulirement marque


pour les crustacs, principalement la crevette. La consommation mondiale est passe de
0,4 kg/hab en 1961 1,6 kg/hab en 2005. Aujourdhui, la crevette est la premire valeur
change parmi les produits marins. Sa production annuelle mondiale tait estime plus de
6 Mt en 2005. La rgion Asie-Pacifique, et notamment la Chine, la Thalande, le Vietnam,
lIndonsie et lInde, est la principale productrice, totalisant prs de 88 % des productions
(FAO, 2009 ; GLOBEFISH, 2011). Les exportations de crevettes atteignent 14 milliards de
dollars par an, soit 16 % des produits marins.

12

I. Contexte conomique

La part de laquaculture reprsente 70 % de la production mondiale de crevettes et plus


gnralement 76 % pour lensemble des crustacs (FAO, 2006). Cependant, la rpartition
entre laquaculture et la pche de crevettes est trs ingale selon la rgion du globe (Fig.I.4).

Fig.I.4 : Production de crevettes dans le monde, rpartition entre la pche (P) et laquaculture (A), FAO, 2006

Les crevettes sont gnralement traites aux mtabisulfites la sortie de leau, pour viter leur
dgradation et le noircissement des carapaces par oxydation, (Chantereau, 1991). Elles sont
vendues soit fraches, soit congeles, cuites ou marines. De plus, elles sont proposes
entires ou dcortiques. En 2010, la plus forte augmentation tait la part des crevettes cuites
et dcortiques. Gnralement, cette forme de produit est destine une post-transformation,
telle que la fabrication de brochettes de la mer ou de plats prpars.
Lune des espces de crevette les plus commercialises est la crevette tropicale, dite crevette
patte blanches, Penaeus vannamei. lorigine, elle tait cultive uniquement sur la cte
Pacifique de lAmrique latine. Depuis sa production sest tendue. Elle a atteint 67 % de la
production mondiale en 2008 (FAO, 2010), soit 70 % des pnides (Fig. I.5). La
consommation de P. vannamei est trs prise. Elle a augment de 58 % en Asie et de 211 %
en Amrique latine entre 2001 et 2006.

Fig.I.5 : Rpartition des pnides leves en aquaculture dans le monde, FAO, 2010

13

Chapitre 1 Etude bibliographique

Laugmentation de la production des crustacs entrane une augmentation du volume de leurs


coproduits1. Des plateformes de dcorticage de crevettes existent notamment au Maroc et en
Asie. Leur principale voie de valorisation est la production de chitine, lun des composs
majoritaires des cuticules de crustacs.

I.2. Valorisation des coproduits marins : la chitine et ses drivs


Les coproduits marins dsignent les parties (de poissons, cphalopodes, crustacs, etc.) issues
dun procd de transformation pour la consommation humaine (filetage, viscration,
ttage, pelage ou cuisson). Il sagit des peaux, artes, ttes, queues, ou carapaces. Leur
valorisation nest pas une proccupation rcente. Ils font lobjet dune attention particulire
du fait de la valeur ajoute quils apportent aux procds industriels classiques (Cf. section
VIII).
Valorisation des coproduits de crustacs : la production de chitine
Les coproduits de crustacs reprsentent plus de 60 % du poids frais (Wang et al. 2011). Ce
volume constitue une ressource abondante de chitine. Ce polysaccharide ancien constitue
lexosquelette des crustacs. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs ne
cessent de stendre (Cf. section III).
La production de chitine se situe en majorit en Asie-Pacifique. Les coproduits de crustacs y
sont disponibles et la lgislation lie au retraitement des effluents est peu contraignante. En
2004, on rpertoriait 63 producteurs de chitine ayant une place importante sur le march, dont
la moiti en Asie (Montfort-Windels, 2004). Le Japon est le premier producteur (FAO, 2009).
Pour la plupart des applications, la chitine nest pas utilise directement. Elle est convertie,
principalement en chitosan et chitooligosaccharides (Fig.2, p3). La production de chitine tait
de lordre de 25 000 tonnes en 2006, dont prs de 8 000 tonnes pour sa conversion en chitosan
(GIA, 2010). En 2000, 10 000 tonnes de chitine taient produites (Kurita, 2006), dont prs de
6 667 T pour la fabrication de glucosamine, 2 667 T pour le chitosan et 1 000 T pour les
oligosaccharides. Le march de la chitine na cess de crotre comme en tmoigne la figure
I.6. Les ventes de chitine ont atteint prs de 25 000 tonnes en 2006 (GIA, 2010).

Les coproduits se dfinissent comme tant la matire issue du processus de fabrication dun produit principal.
Tout comme le produit fini principal, les coproduits doivent se soumettre une rglementation spcifique pour
tre utiliss directement ou indirectement dans lindustrie

14

I. Contexte conomique

USA
Canada

15000

Vente (en tonnes)

Japon
Europe
10000

Asie-Pacifique
Reste

5000

0
2001

2002

2003

2004

2005

2006

Fig.I.6 : Ventes de chitine en fonction des zones gographiques (Daprs GIA, 2010)

Daprs la figure I.6, le Japon domine nettement le march de la chitine. Il participe 61 %


des ventes mondiales. Les perspectives annonces lhorizon 2015 maintiennent globalement
ces carts entre les rgions. La production de chitine atteindrait prs de 63 000 tonnes (GIA,
2010).
En 2006, 60 % de la chitine a t convertie en glucosamine. Ceci place la glucosamine au
premier rang des volumes de ventes. Le second driv est le chitosan, dont la part des ventes
reprsente prs de 34 %. Cependant, ces chiffres masquent des disparits rgionales. Par
exemple, en Asie-Pacifique la mme anne, la part du chitosan est suprieure celle de la
glucosamine (50 % contre 46 %). Au contraire, le Japon consomme 25 % de chitosan contre
plus de 66 % de glucosamine. Les perspectives tendent vers une trs lgre diminution de la
part des autres drivs au profit de la glucosamine et du chitosan (GIA, 2010).
LAsie produit de la chitine un cot trs comptitif. En Chine, 90 % de ce cot correspond
au prix des matires premires et des ractifs (CCM International, 2009). Le tableau I.1
montre les diffrences de prix en fonction des catgories de drivs de chitine (Einbu, 2007a).
Drivs
Production (T)
Chitine consomme (T)
Prix du march (USD/Kg)
Glucosamine
4 500
9 000
7 35
Chitosan
3 000
4 000
10 100
Oligosaccharides
500
1 000
50 100
N-actylglucosamine
100
200
20 140
Tab.I.1 : Production de drivs partir de chitine et gamme de prix (Einbu, 2007a)

Le principal critre qui dfinit le prix est le taux de puret, lui-mme li au procd
dextraction de la chitine. Einbu (2007a) rapporte des prix bien plus levs pour des drivs
de trs forts degrs de puret, de lordre de 10 000 USD/Kg pour des oligosaccharides ultrapurs et 50 000 USD/Kg pour le chitosan. Les prix de la N-actylglucosamine obtenue par voie
chimique et par voie enzymatique sont de lordre de 20 USD/Kg et de 100 140 USD/Kg
respectivement.

15

Chapitre 1 Etude bibliographique

I.3. Disponibilit de la chitine, ressource naturelle


La chitine est lun des polymres naturels les plus abondants sur le globe avec la cellulose
(Khanafari et al. 2008). Ces deux polysaccharides sont similaires du point de vue de leur
structure et leurs fonctionnalits. La chitine entre dans la composition de la cuticule des
arthropodes et de certains mollusques (les cphalopodes), dans la paroi de certains
microorganismes tels que les micro-algues et les moisissures. Les teneurs en chitine varient
dune espce lautre. Le tableau I.2 montre les carts qui existent selon les ressources
disponibles pour produire la chitine.
Teneur en chitine
Teneur en chitine
Source
(en % mat sec)
(en % mat sec)
Arthropodes
2 72
Crabes Chinoecetes opilio
26,6
Mollusques
6 40
Crevettes Pandallus borealis
17,0
Ponophores
33
Crevettes Cangron cangron
33
Cnidaires (capsules ufs)
3 30
Crevettes Penaeus monodon
3 30
Annlides
0,2 38
Ecrevisses Procamborus darkia
0,2 38
Brachiopodes
4 29
Bouquet
4 29
Champignons
2,9 20,1
Plume de calmar
2,9 20,1
Algues/ Lichen
Faible
Krill Euphasia superba
Faible
Tab.I.2 : Teneur en chitine par espces (Mathur et Narang, 1990 ; Shahidi, 2002)
Source

La production naturelle de chitine est estime plus dun milliard de tonnes par an, jusqu
2,3 milliard de tonnes par an selon Jeuniaux (1991). 1 328 Mt proviennent de ressources
marines (Cauchie, 2000), dont 29,9 Mt des crustacs, 1,4 Mt des mollusques et 0,7 Mt des
calmars (Synowiecki et Al-Khateeb, 2003).
Les ressources pour la production de chitine
Les sources privilgies pour la production de chitine sont les coproduits de crustacs, en
particulier les crevettes et les crabes. Cependant, le choix de la matire premire est li
lactivit locale. Certaines zones gographiques privilgient dautres ressources, telles que les
krills ou les bouquets. Les plumes de calmar sont parfois exploites pour extraire de la chitine
. Cette structure est diffrente de la chitine extraite des crustacs (Cf. section III). Leurs
proprits sadressent des applications technologiques spcifiques (Cf. section V). Des
tudes ont galement t menes sur la chitine des ponges telles que Verongula gigantea et
sur la chitine de tubes digestifs de vers telles que Riftia pachyptila (Ehrlich et al. 2007).
La biomasse des microorganismes constitue une quantit de chitine abondante. Parmi eux, on
peut citer les levures, les moisissures, certains ciliates, les algues appartenant aux
chrysophytes et certaines bactries dont les streptomyctes (Kim, 2010). Lavantage dune
telle production repose sur la matrise de la culture des microorganismes. La production de
chitine peut tre complmentaire la production dacide citrique de mycelium dAspergillus
niger (Cai et al. 2006). Une entreprise belge, Kitozyme, ne en dcembre 2000, propose des
drivs de chitine-glucanes (complexe de chitine ramifi avec des units de glucanes) obtenus
partir de paroi dAspergillus Niger (Fig.I.7).

16

I. Contexte conomique

Fig.I.7 : Procd de fabrication de chitine-glucane par Kitozyme

Le rendement en chitine varie en fonction de lespce entre 9 35 % par rapport la biomasse


sche. Le chitosan peut galement tre produit partir de moisissures telles que Rhizopus et
Mucor (Nadarajah et al. 2001).
Louvrage de Kim (2010) inventorie les avantages et les inconvnients des productions
partir des microorganismes. La matrise et la rapidit de leur croissance constituent les
principaux avantages. Cependant le rendement en chitine est seulement de 8,5 19,6 % et
celui en chitosan de 1 4 % par rapport au poids sec de la biomasse.
Dautres ressources terrestres ont galement t explores. Des tudes se sont intresses la
production de chitine partir de champignons (Zhang et al. 2000 ; Wu et al. 2004 ; Yen et
Mau 2007), de vers soie et dabeilles (Nemtsev et al. 2004 ; Paulino et al. 2006). Les larves
de vers sont composes de 24 % de chitine et les tonnages disponibles lis lindustrie de la
soie, plusieurs milliers de tonnes par an, justifieraient leurs exploitations (Zhang et al. 2000).
De mme, les abeilles exploites pour la production de miel ont t proposes comme
ressource pour lextraction de chitine en Russie (Nemtev et al. 2004).
Enfin, des fermes ou des cultures sur milieux synthtiques ont t labores pour diffrentes
espces telles que Agaricus bisporus, Lentinula edodes, Trametes versicolor, Armillaria
mellea et Pleurotus ostreatus (Pochanavanich et Suntornsuk, 2002 ; Yen et Mau, 2007, Di
Mario et al. 2008). Le rendement en chitine atteint 8,5 16,9 % et celui en chitosan entre 1 et
4 % par rapport la biomasse sche.

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses


drivs
La chitine est naturelle, non-toxique, biodgradable et versatile. Son utilisation repose
principalement sur sa capacit former des matrices et ses activits biologiques intressantes
(Goycoolea et al. 1999).
Le caractre poly-cationique de trs forte densit de charge du chitosan est souvent lorigine
de ses proprits. En effet, il favorise la formation de complexes poly-lectrolytes et ainsi la
capacit former des matrices (Shahidi, 1999). De plus, les drivs de la chitine possdent
des activits biologiques comme hypo-cholestrolmique, antioxydant, anti-tumoral,
antimicrobien, anti-hypertensive, antidiabtique et favorisant le systme immunitaire (Kim,
2010). Ces domaines dapplication vont tre dtaills ci-dessous, par ordre croissant de grade
technologique.

17

Chapitre 1 Etude bibliographique

II.1. Les applications dans le domaine agricole


La chitine sert de substrat aux microorganismes producteurs de chitinase et danthraquinone
par Morinda citrifolia par exemple (Dornenburg et Knorr, 1994). De plus, la chitine et ses
drivs jouent un rle dliciteur sur les plantes. Il consiste favoriser la production de
mtabolites secondaires qui renforcent les dfenses immunitaires. Les drivs de chitine
stimulent par exemple la production de lenzyme phnylalanine ammonia-lyase (PAL) et de la
tyrosine ammonia-lyase (TAL), qui interviennent dans la synthse de composs du systme
de rsistance contre les pathognes (Khan et al. 2003 ; Kim et al. 2005). Par consquent, de
meilleurs rendements de germination et de rcolte sont obtenus (Crini et al. 2009 ; Rabea et
al. 2003). Enfin, les produits chitineux apportent de lazote ( 7 %) lorsquils se dcomposent,
contribuant lenrichissement du sol et de la plante.

II.2. Les applications dans le domaine du traitement de leau


Des rductions de 70 98 % de la teneur en MES (matire en suspension, responsable de la
turbidit) et de 55 80 % la demande chimique en oxygne (DCO) ont t observes pour le
traitement des eaux uses (Jun et al. 1994) en utilisant du chitosan comme floculant.
Du fait de leur forte densit de charge, les drivs de chitine sont capables dinteragir avec les
MES, les microorganismes et les ions mtalliques (Taboada, 2003 ; Cardenas, 1876). Cette
proprit est utilise pour piger les composs dangereux, pour les liminer ou les doser
(Camci-Unal et Pohl, 2010 ; Skorik et al. 2010). Guibal et al. (1994) ont tudi limpact des
caractristiques des drivs du chitosan et de leur environnement (lumire, gaz) sur leur
capacit dadsorption avec les ions uranyle. Le chitosan est galement employ pour recycler
les effluents de lindustrie textile en retenant des pigments (Yap et al. 2008).
Le chitosan peut tre utilis de plusieurs faons, la principale tant comme floculant (Crini,
2009). Les collodes en suspension, les mtaux lourds, les colorants des eaux de teintureries
(Hsien et Rorrer, 1995) ou encore les molcules aromatiques et phnoliques (No et Meyers,
2000 ; Krajewska, 2005) sagglomrent avec le chitosan et les flocs sont retenus par filtration.
Les flocs de chitosan rduisent de 50 % les MES (Rhee et al. 1998). Un autre mode daction
consiste intgrer le chitosan directement dans la composition des membranes de filtration.
Lencapsulation denzyme par des matrices chitineuses est une piste tudie pour le traitement
de leau. Miao et al. (2000) ont montr la capacit du chitosan associ la glutaraldhyde
immobiliser la peroxydase extraite de raifort. Cette enzyme est employe pour liminer les
phnols des effluents de raffineries (Lu et al. 2010).

II.3. Les films de chitine/ chitosan


Les films de chitine et de chitosan sobtiennent par leur dissolution dans une solution acide.
La teneur en humidit du polysaccharide doit tre faible pour russir le film.
Du point de vue de leurs caractristiques mcaniques, les films de chitine ne peuvent pas subir

18

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

dlongation. Ceux base de chitosan peuvent tre tirs deux fois seulement. Ces proprits
mcaniques peuvent tre amliores par modification du chitosan (par ramification) ou par
des ajustements de formulation. Par exemple, le chitosan-poly(vinyl-alcool) prsente une
meilleure rsistance mcanique, stabilit et capacit dlongation (Nakano, 2007).
Les produits cosmtiques
Beaucoup dapplications dans le domaine cosmtique reposent sur ces proprits filmognes.
Des principes actifs peuvent tre pigs dans des films ou des billes de chitosan. Ces principes
actifs sont librs au contact de la peau par leffet de la diminution du pH. Les produits le plus
couramment rencontrs sont des soins pour la peau, contre lacn et pour les cheveux,
notamment pour leur souplesse. Cette application repose sur les proprits lectrostatiques du
chitosan (Rinaudo, 2006)

II.4. Les applications dans les industries alimentaires et dittiques


Plusieurs proprits de la chitine ou de ses drivs sont exploites dans le domaine de
lagroalimentaire. Elles sont rsumes dans le tableau I.3 :
Applications
Prservation de la qualit des aliments
Films comestibles
Additif alimentaire

Nutraceutique (complments nutritifs)

Rle
Antimicrobien
Antioxydant
Structurant
Texturant, mulsifiant
Ajoute arme et couleur
Fibres
Hypocholestrolmiant
Contre lintolrance au lactose
Rduction de labsorption des lipides

Recyclage des effluents


Tab.I.3 : Utilisations de la chitine/ chitosan en agroalimentaire (Crini et al. 2009)

Les films alimentaires base de drivs de chitine sont la fois une barrire physique et
biologique contre les flores daltration et les contaminations extrieures. Le chitosan serait
plus efficace que les CHOS dans ce domaine, cependant les tudes ne sont pas unanimes. Tsai
et al. (2004) montrent que le chitosan a un effet inhibiteur sur des pathognes tels que
Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella enterica
serovar Typhi. linverse, Kittur et al. (2005) et Kumar et al. (2005) ont montr que les
CHOS taient plus actifs. Lin et al. (2009) expliquent cette contradiction par le rle dominant
du degr dactylation par rapport celui du degr de polymrisation. Ceci illustre bien quel
point les caractristiques des drivs de la chitine influent sur leurs proprits.
Ces films alimentaires sont galement antioxydants (Jeon et al. 2002). Kim et Thomas (2007)
ont montr un rsultat positif contre loxydation des lipides. Cette proprit est lie la
prsence de deux groupes hydroxyles, en C-3 et C-6 (Cf. Fig.1). Ils attirent fortement les
atomes dhydrogne en les dtournant des lipides (Je et al. 2004 ; Park et al. 2004). Il est

19

Chapitre 1 Etude bibliographique

possible de raliser des films alimentaires comestibles grce au chitosan (De Moura et al.
2009 ; Cardenas et al. 2008).
Le chitosan et la glucosamine sont commercialiss comme complments alimentaires. Les
proprits revendiques reposent sur leur pouvoir antioxydant et leur capacit faire perdre
du poids. Le chitosan agirait comme film intestinal et comme fibre. Il inhiberait labsorption
des lipides et des sucres (Ylitalo et al. 2002), ou activerait directement le dstockage des
lipides (Helgason, 2008). Les oligomres du chitosan semblent galement prvenir les risques
de diabte (Kumar et Tharanathan, 2004).
Les CHOS serraient galement intressants comme prbiotiques. Des rsultats prometteurs
ont t obtenus par Pan et al. (2009) avec des chitooligosaccharides de 90 % de DD et de 3
6 DP.
Les utilisations comme auxiliaires technologiques
Du point de vue technique, le chitosan constitue un agent de clarification, par exemple pour
lindustrie du vin (Chatterjee et al. 2004). Il permet dviter lemploi du collagne, qui suscite
la crainte des consommateurs depuis la crise de Creutzfeld-Jacob. Une rduction jusqu 95 %
de la turbidit a t observe aprs utilisation de la chitine-glucane (Kim, 2010). De plus, le
rle antioxydant des drivs de la chitine est exploit pour stabiliser les polyphnols du vin, et
ainsi prserver sa couleur et ses armes. Ils sont employs pour capter les mtaux lourds par
bio-adsorption, tels que le Cadmium, le Fer et le Plomb (Bornet et Teissedre, 2008). Dautres
applications existent, telles que lutilisation du chitosan pour recouvrir des fruits et lgumes
aprs leur rcolte ou lors du procd de fabrication du caf (Scheruhn, 1999).
Les limites et les risques dallergies
Des cas dallergies ont t rapports. Les procds de fabrication et le degr de purification de
la chitine peuvent tre mis en cause puisque les allergnes incrimins seraient des agents
chimiques tels que les mtabisulfites, des amines biognes ou des rsidus protiques tels que
la trompomyosine (Lopata, 2010). La chitine dclenche galement des ractions immunitaires
qui peuvent aboutir des ractions allergiques (Reese et al. 2007 ; Kim, 2012). Nanmoins,
certains auteurs, dont Muzzareli (2010), revendiquent linnocuit des complments base de
drivs de la chitine. De plus, le rle du chitosan contre les inflammations lies aux ractions
allergiques et lasthme a t dcrit. Lexplication de ces deux phnomnes antagonistes
dpend de la taille du polymre (Brinchmann et al. 2011).
La consommation de chitosan doit galement tre soumise des prcautions vis--vis du
calcium. Liao et al. (2007) ont montr quil limitait labsorption du calcium tandis que les
CHOS favoriseraient le phnomne inverse, et donc renforceraient les os (Jung et al. 2006).

II.5. Les applications dans le domaine mdical


Lactivit antimicrobienne
Le chitosan est antibactrien et antifongique (Hirano et Horiuchi, 1989 ; Allan et Hadwiger,

20

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

1979). Le mcanisme daction de leffet anti-microbiologique serait li la charge positive du


C-2 (Cf. Fig.1). Cette activit serait favorise lorsque la solubilit augmente (Chen et al.
1998). Le mode daction du chitosan repose sur son interaction avec les membranes des
cellules microbiennes (Shahidi et al. 1999). Les bactries Gram-ngatifs, telles quE. coli,
paraissent particulirement concernes (Chung et al, 2004). Cette activit semble tre
favorise par des degrs de dsactylation levs.
Lactivit cicatrisante
Le rle du chitosan est avr dans la rparation tissulaire de lpiderme (Howling et al. 2001)
et la cicatrisation (Lahiji et al. 2000). De ce fait, le chitosan est utilis pour fabriquer des
pansements et des bandages (Ribeiro, 2009). Par exemple, un mlange de chitosan et
oxychitine est commercialis comme agent de recouvrement pour les greffes, le HemCon
Bandage. Le degr de dsactylation augmentant, les performances de cicatrisation sont
amliore (Minagawa et al. 2007).
Lactivit de chitooligosaccharides
Les chitooligosaccharides (CHOS) sont caractriss par leur trs faible longueur de chane,
homogne ou htrogne, dunit de N-actylglucosamine ou glucosamine. Selon Zhang et al.
(1999), leur DP est compris entre 3 et 10, alors que celui de la chitine peut atteindre 5 000.
Lengouement rcent pour les CHOS sexplique par leurs proprits intressantes pour le
domaine mdical (Aam, 2010). Depuis les annes 1970, leurs activits anti-tumorales et sur la
rduction des mtastases ont t mises en vidence (Muzzarelli, 1977 ; Suzuki et al. 1986 ;
Nam et al. 2007 ; Shen et al. 2009). Laction sappliquerait sur le contrle de la croissance des
vaisseaux sanguins (Prashanth et al. 2005 ; Wu et al. 2008). Les CHOS seraient galement
reconnus comme anti-inflammatoires en cas dasthme (Kim, 2010) et comme anti-ulcre (Ito,
2000). Ils sont aussi connus pour favoriser la rgnration osseuse (Klokkevold et al. 1996 ;
Park et al. 2008 ; Ratanavaraporn et al. 2009) et la minralisation du tissu osseux (Jung et al.
2006 ; Kim et al. 2005). Ils sont galement utiliss comme vecteurs de gnes (Jiang et al.
2008 ; Kumar et al. 2004 ; MacLaughlin et al. 1998) et comme inhibiteurs de la malaria (Tsai
et al. 2001 ; Takeo et al. 2009 ; Langer et al. 2001). Enfin, la glucosamine est largement
utilise pour rduire les douleurs lies linflammation des articulations (Crini et al. 2009).
Le rle de support matriel
Lintrt pour les nanofibres et nanoparticules base de chitosan saccrot en mdecine.
base de drivs tels que la chitine carboxymthyle et le poly(vinyl alcool) ou associs des
complexes, des matrices pour la bio-ingnierie sont obtenues. Elles peuvent servir pour la
diffusion contrle et cible de principes actifs, et pour la rgnration osseuse, de la peau, du
foie et de la prostate (Jayakumar et al. 2011). Le chitosan permet une libration et une
diffusion progressive et contrle lorsquil est impliqu dans lencapsulation de molcules
actives (Thanou et Junginger, 2005 ; Kumar et al. 2004 ; Agnihotri et al. 2004 ; Berger et al.
2004 ; Peniche et al. 2003).
Les applications en soin dentaire ou vtrinaire
Le chitosan intgre des pansements appliqus sur des lsions dues aux infections de la dent. Il
21

Chapitre 1 Etude bibliographique

constitue un bio-matriel inoffensif, anti-inflammatoire et antimicrobien (Berthold et al.


1996). Des ptes mcher base de chitosan et CHOS ont galement t tudies, pour ter
les dbris alimentaires ingrs. La salive libre les chito-oligomres, activant ainsi leur rle
anti-carie (Hayashi et al. 2007).
Le chitosan est utilis par les vtrinaires comme moyen dadministration, tel que les sprays
(application par douche), implant, bain, dispositif intra-mammaires, intra-rumen et intrautrin. Certains drivs de la chitine sont indiqus pour favoriser la croissance et stimuler les
dfenses immunitaires (Kim, 2010 ; Senel et McClure, 2004).

II.6. Autres applications


Limmobilisation denzymes dans des matrices base de chitosan stend aujourdhui tous
les domaines (Kim, 2010). Les drivs de chitine peuvent intgrer des lectrodes, des
capteurs, des phases stationnaires de colonne de chromatographie, des membranes dosmose
inverse et de dialyse. Dans lindustrie du papier et de la photographie, on utilise le chitosan
pour obtenir une meilleure surface et pour rsister lhumidit. Les feuilles enduites de
chitosan renforcent les proprits morphologiques, mcaniques, optiques, de vieillissement et
offrent une meilleure qualit dimpression (Kim, 2010). Dans le domaine textile, des
principes actifs peuvent tre encapsuls dans du chitosan et imprgns dans les tissus pour
fabriquer des vtements dits intelligents . Les principes actifs se diffusent progressivement
sur la peau mesure que le vtement est port (Crini, 2009). Le chitosan est galement
capable damliorer la force et la rigidit dun tissu (Kim, 2010). Enfin, la chitine, comme
substrat nutritif, favorise la croissance de microorganismes chitinolytiques. Cette proprit est
exploite pour amliorer des composts (De Jin et al. 2005) et comme mthode didentification
de ces microorganismes (Gomez-Ramirez et al. 2004).

II.7. volution des volumes de ventes par domaine dapplication


La figure I.8 illustre, lvolution des secteurs dapplication du chitosan de 2001 2006.
Traitement de leau

Ventes annuelles (tonnes)

4000

Cosmtique
Agroalimentaire
Sant / Mdecine
Agrochimie
Biotechnologie

2000

Pulpe / papier
Textile
Photographie
Applications diverses
0
2001

2002

2003

2004

2005

2006

Fig.I.8 : volution des domaines dapplication pour lesquels le chitosan est employ (Daprs GIA, 2010)

Les applications du chitosan sont largement domines par le secteur du traitement de leau,

22

II. Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

qui atteint plus de 4 000 tonnes consommes en 2006. Ce secteur est suivi par celui de la
cosmtique, de lagroalimentaire, du mdical et de lagrochimie. Les autres secteurs tels que
la biotechnologie, la papterie, le textile et la photographie reprsentent de faibles volumes de
ventes. Les prvisions volueraient peu lhorizon 2015 (GIA, 2010).
Le premier pays consommateur de chitosan, notamment pour le secteur du traitement de leau
est le Japon, avec prs de 3 700 t en 2006. Les pays occidentaliss, tels que les tats-Unis,
consomment davantage le chitosan dans les domaines de la cosmtique, de lagroalimentaire,
du mdical et de la biotechnologie. La zone Asie-Pacifique est leader dans la consommation
du chitosan en agriculture/agrochimie (Tab.I.4).
Domaine dapplication
USA
Europe
Japon
Asie-Pacifique
Canada
Autres
Traitement de leau
450,3
368,6
2 900,8
245,8
74,9
101,0
Cosmtique
535,8
173,6
209,6
136,4
54,2
79,8
Agroalimentaire
352,0
209,6
197,2
72,2
67,8
33,1
Sant/Mdecine
306,5
84,9
156,2
200,5
31,1
13,9
Agrochimie
125,6
73,4
89,0
285,5
29,2
20,0
Biotechnologie
131,2
37,1
57,5
45,2
15,8
12,1
Pulpe/papier
39,1
28,9
36,1
29,6
11,2
6,8
Textile
23,47
17,8
25,5
19,9
6,3
4,3
Photographie
13,04
9,1
29,7
8,9
2,9
1,7
Applications diverses
28,89
18,9
54,1
19,1
8,3
4,1
TOTAL
2005,9
1021,9
3755,7
1063,1
301,7
276,8
Tab.I.4 : Rpartition des applications du chitosan, en tonnes, en 2006 (GIA, 2010)

Total
4141,4
1189,4
931,9
793,1
622,7
298,9
151,7
97,3
65,3
133,4
8425,1

II.8. Conclusions sur les caractristiques de la chitine et ses


applications
Les applications dcrites ci-dessus soulignent le lien entre les caractristiques structurelles des
drivs de la chitine avec leurs domaines dapplication. En particulier, le degr dactylation
(Bajaj et al. 2011 ; Kurmirska et al. 2010) et le poids molculaire sont dterminants. Sorlier et
al. (2001, 2003) ont tudi limpact du DA sur les proprits lectrostatiques de la chitine et
du chitosan. Aranaz (2009) dresse un bilan assez complet des proprits de la chitine et du
chitosan en fonction de leurs caractristiques (Annexe B).

III. Structure de la matrice chitineuse chez les crustacs


III.1. La biosynthse de la chitine
La biosynthse de la chitine fait intervenir des enzymes nommes chitine-synthases (CS), de
la famille des glycotransfrases. Elles catalysent lassociation de deux monomres de Nactylglucosamines. Elles requirent de lUDP-N-actylglucosamine comme substrat et des
cations divalents (Khoushab et al. 2010). La biosynthse est divise en trois tapes distinctes.
Au cours de la premire tape, lenzyme se place le long de la membrane cytoplasmique et
oriente convenablement le polymre vis--vis de son site actif. La seconde tape est la

23

Chapitre 1 Etude bibliographique

translocation du polymre travers la membrane. Il est alors libr dans lespace


extracellulaire. La dernire tape permet lassemblage de plusieurs polymres en microfibres
cristallines.

III.2. Lorganisation de la cuticule des crustacs


Les cuticules de crustacs sont constitues de chitine, protines et minraux (essentiellement
le carbonate de calcium). Les proportions sont variables selon les espces. Le tableau I.5
(Kurita, 2006) illustre les quantits de chitine et de carbonate que lon peut trouver selon la
source. Les ressources traditionnellement exploites pour extraire la chitine, sont composes
de 15 40 % de chitine, 20 40 % de protines et 20 50 % de carbonate de calcium (en
poids sec). Pour une espce donne, la rpartition est plus stable (Bouchon, 1995).
Source
Chitine (%)
CaCO3 (%)
Cuticule de crabe
15-30
40-50
Cuticule de crevette
30-40
20-30
Cuticule de bouquet
20-30
20-25
Plume de calmar
20-40
Ngligeable
Coquille dhutre/ palourde
3-6
85-90
Cuticule dinsectes
5-25
Ngligeable
Paroi de cellule fongique
10-25
Ngligeable
Tab.I.5 : Quantits de chitine et de carbonate de calcium (Kurita, 2006)

Les trois constituants majoritaires, chitine, protines et CaCO3, forment un rseau dense. La
chitine y joue plusieurs rles structurels et fonctionnels vitaux. Elle forme une barrire
physique entre le corps de lorganisme et son environnement (Roer et Dillaman, 1984). Elle
participe sa protection contre les radiations, la chaleur, les agressions chimiques et
physiques. Elle est galement le site dattachement des muscles et le lieu dchange et de
transport de substances, notamment ladsorption de composs anioniques. Enfin, elle joue un
rle dans le systme immunitaire (Tokura et Tamura, 2007).
Lorigine du nom de la chitine est issue du grec khiton qui signifie tunique car elle
participe lenveloppe extrieure de nombreux organismes depuis des milliers dannes. ce
titre, la chitine ou ses units osidiques servent tudier les fossiles et la phylognie (Shen et
Jacobs, 1998). Par exemple, Furuhashi a utilis la chitine pour dterminer lanctre commun
des mollusques (Furuhashi, 2009).
La chitine forme, avec les protines, des microfibrilles cristallines. Llasticit de la carapace
dpend du degr de liaison entre la chitine et les protines, et de leur rpartition dans la
matrice. Ces protines peuvent tre des arthropodines2 (responsables de la rigidit), des
sclrotines3 (rle dans la pigmentation) ou des rsilines4 (attribues llasticit des cuticules
et permet les mouvements).

Protine associe la chitine dans l'endocuticule des arthropodes, elle se caractrise par une forte rigidit
Protine tanne entrant dans la composition de la cuticule des Arthropodes
4
Famille des protines lastiques (inclue llastine, le gluten). Chez les insectes elles participent la capacit de
sauter ou tout autre mouvement rapide ou rptitif qui ncessite du stockage dnergie
3

24

III.Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

Lun des premiers avoir dcrit prcisment la structure de la cuticule des crustacs est Yves
Bouligand (1972), le motif de la structure porte donc son nom. Elle sorganise en plusieurs
tages (Fig.I.9), on peut distinguer sept niveaux hirarchiques qui vont tre dcrits ci-dessous.
Au premier niveau se trouve la structure molculaire de la chane linaire polysaccharidique
de la chitine. Au second, on distingue les trois formes darrangement gomtrique de ces
chanes, soit , ou (Cf. IV.1). Au troisime niveau, 18 25 molcules de chitine
sassemblent en units cristallines, troites et longues, enveloppes de protines. Ces
nanofibres ainsi obtenues mesurent 2 5 nm de diamtre et environ 300 nm de longueur.
Elles sassemblent ensuite en fibrilles plus importantes, de lordre de 50 300 nm de
diamtre. Lespace disponible entre les fibrilles est combl par les protines et des minraux,
principalement le carbonate de calcium, soit sous forme cristalline (calcite), soit amorphe
(Vincent, 2002 ; Raabe et al. 2005).

Fig.I.9 : Niveaux hirarchiques dans lorganisation de la cuticule de crabe H. americanus (Raabe, 2005).

Au niveau suivant, les microfibrilles sorganisent en plans. Enfin les plans se superposent,
chacun tant tourn dun degr de rotation constant par rapport laxe normal. On obtient une
structure hlicodale (Fig.I.10). Cette organisation particulire est appele motifs de
Bouligand (Bouligand, 1972 ; Giraud-Guille, 1984).

Fig.I.10: (a) Motifs de Bouligand, CT de cuticule de homard en MEB, Raabe, 2006 ; (b) reprsentations
schmatiques de lempilement des fibres, Pillai et al. 2009

Lobservation des plans superposs de chitine-protines permet de distinguer des perforations


perpendiculaires qui constituent des pores traverss par des canaux. cause de son aspect,
25

Chapitre 1 Etude bibliographique

cette structure est appele nids dabeilles (Fig.I.11). Les canaux sont forms de fibres de
chitine-protines minralises et ils sont flexibles (Fabritius et al. 2009).

Fig.I.11 : Structure en nid dabeilles de cuticule de homard en CT par MEB (a) Pillai, 2009 (b) Raabe, 2006

Daprs ltude de Raabe (2005), on peut distinguer deux parties dans lorganisation de la
cuticule. Lexo-cuticule est caractrise par une forte rigidit (8,5-9,5 GPa) et une forte
rsistance (130 270 MPa). Lendo-cuticule est plus dsorganise, moins rigide (3-4,5 GPa)
et moins rsistante (30-55 MPa).
La minralisation a t tudie par Giraud-Guille et al. (2004) partir de la cuticule du crabe.
Les cristaux de calcite sont produits la surface de lpicuticule par des enzymes pendant la
mue. La production stend en surface tels des disques plats, puis sinfiltre verticalement et
horizontalement, partout o lespace est libre entre les cellules pidermiques.
Ces travaux suggrent que la minralisation est initie par du carbonate de calcium analogue
du cristal liquide (phase dite cholestrique). Les molcules volueraient vers une phase
nmatique chirale (orientation dirige et arrangement hlicodal) en fonction de la teneur en
chitine dans le milieu. Ceci conduit la minralisation progressive, la formation de nouvelles
liaisons entre molcules et laugmentation progressive de la rigidit des carapaces. La figure
I.12 montre la structure de la cuticule normale et dcalcifie.

b
Fig.I.12 : Structure de la cuticule normal (a) et dcalcifie (b) par MEB (Raabe, 2005)

Lensemble du dispositif fibrillaire torsad confre la cuticule une grande cohsion rigide.
Les microfibrilles et les plans sont stabiliss par des liaisons hydrognes ou covalentes (Pillai
et al. 2009; Rinaudo, 2008). Parmi ces liaisons, lune des plus fortes, CONH, permet de
26

III.Les domaines dapplications de la chitine et de ses drivs

maintenir les chanes primaires de chitine une distance de 0,47 nm (Pillai et al. 2009).
La chitine et les protines sont lies indirectement (Neville et al. 1976). Leurs liaisons seraient
similaires celles qui soprent entre la cellulose et les protines (Tormo et al. 1996). Ces
liaisons reposent sur des noyaux aromatiques fixs dun cot au squelette carbon du
polysaccharide et de lautre la protine. Les noyaux aromatiques seraient lis aux carbones
C-1 et C-2 (Cf. Fig.1, p3) des N-actylglucosamines de la chitine dune part, laspartate et
lhistidine des protines dautre part. Plus de 50 % des protines seraient impliques dans
cette interaction (Diaz-Rojas et al. 2006). La prsence de phnol-o-dihydrique a galement t
rapporte (Roberts, 1992). Cette molcule serait situe entre les protines afin de les protger
contre les chitinases et de la dshydratation.
La relation entre les protines et la chitine a t tudie par pyrolyse et chromatographie
GC/MS par le biais de marqueurs (Stankiewicz et al. 1996). Un rsidu dhystidyle et un
groupe catchol serviraient de lien pour relier la chitine et les protines (Fig.I.13).

Fig.I.13: Proposition de structure entre chitine et protines, a) Stankiewicz et al. 1996 b) Hamodrakas, 2002

Les protines impliques dans cette interaction prsenteraient une surface plane, selon une
configuration en feuillet- (Iconomidou et al. 1999). Dun cot, les groupes aromatiques se
lient la chitine, de lautre des liaisons entre protines stablissent (Hamodrakas, 2002).
Lanalyse darthropodes fossiliss a rvl une structure soutenue par un polymre minral,
dit gopolymre. Il est similaire au squelette carbon de cphalopodes rcents sur lequel sont
fixes des molcules aromatiques (Gupta et al. 2008).
Certains peptides prsents dans les cuticules sont responsables de linhibition de la
calcification (Inoue et al. 2004). Lactivit repose sur une affinit du peptide avec les ions
calcium, qui sont ainsi dtourns. Des lipocalines5 sont galement prsentes dans la cuticule.
Elles jouent un rle dans le transport de substances et le maintien de la structure gnrale
(Grzyb et al. 2006). Hackman et Goldberg (1978) ont mis en vidence linfluence du pH sur
des liaisons non-covalentes entre les protines et la chitine.
5

Protines impliques dans le transport de petites molcules hydrophobes (strodes, sels biliaires, rtinodes).
Elles partagent des rgions de squences homologues et une architecture tertiaire commune

27

Chapitre 1 Etude bibliographique

Dautres recherches se concentrent sur les gnes codant les protines de cuticules (Willis et al.
2010). Des protines sont prcisment identifies, rfrences et cibles pour une activit
spcifique. Elles intressent notamment le secteur mdical (Khoushab, 2010). Parmi ces
protines, la tachycitine est reconnue pour son activit antifongique (Suetake et al. 2002).

IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques


de la chitine et ses drivs
Chitine peut tre considre comme le terme gnrique pour les amino-polysaccharides
composs dunits de N-actyl--D-glucosamines (NacGlu ou A), hauteur de 50 100 %,
et de D-glucosamines (Glu ou D), la fraction complmentaire. Les units sont relies entre
elles par des liaisons (1-4) et les groupements N-actyles sont fixs au C-2 (Tokura et
Tamura, 2007).
Une chitine parfaite possderait un degr dactylation (DA) de 100 % tandis que le chitosan,
son driv dsactyl idal, aurait un DA de 0 % (ou un degr de dsactylation, DD, de
100 %) si la dsactylation tait complte. Dans la nature, ces deux extrmes nexistent pas, la
forme la plus courante est une chitine de DA de 85-95 %, rarement moins. Le chitosan est
obtenu par dsactylation de la chitine. La limite de DA entre chitine et chitosan varie selon
les auteurs. On parle de chitosan partir de 50 % de NacGlu selon Al Sagheer (2009), plus
gnralement le chitosan est dfini comme tant la forme dsactyle plus de 60-70 %. La
figure I.14 reprsente les deux molcules.

a)

b)

Fig.I.14 : Reprsentation idale de la chitine (a) et son driv obtenu par dsactylation, le chitosan (b).

La stabilit thermique de la chitine est tudie pour caractriser les diffrentes chitines et ses
drivs. Elle est value par analyse thermogravimtrique (ATG) et se situe entre 370 C et
600 C (Romano et al. 2007). Lorsquelle est complexe dans la matrice des cuticules, la
stabilit thermique est modifie, influence par les interactions avec les protines et minraux
(Zhou, 2010). Une approche dtaille de cette technique sera prsente ultrieurement, au
Chapitre 2. (Section III.5.2).

28

IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques de la chitine

Les caractristiques structurelles de la chitine et de ses drivs dterminent directement leurs


proprits et par consquent leurs domaines dapplication (Berth et Dautzenberg, 2002 ;
Lamarque et al. 2004 ; De Alvarenga et al. 2010). Leurs proprits sont principalement lies
au degr de polymrisation (correspond la longueur de la chane), au degr dactylation,
la rpartition des groupes actyles et la cristallinit (Jaworska et al. 2003).

IV.1. La structure cristalline et lindice de cristallinit


La prsence des trois arrangements , et (Fig.I.15) varie selon le type de tissu. Elle est
associe un rle physiologique particulier (Pillai et al. 2009). La chitine est caractrise
par des chanes antiparallles. linverse les chanes de la chitine sont disposes en
parallle. Le troisime allomorphe6, , est peu courant et alternerait les arrangements
parallles et antiparallles (Rinaudo, 2008).
La chitine est la plus courante, prsente chez les Arthropodes, dont les crustacs, chez les
fongiques et les levures. Elle est la forme la plus stable grce aux liaisons hydrognes et
covalentes entre les chanes. Les liaisons glycosidiques sont orientes selon une gomtrie diaxiale, ce qui implique une position diagonale des motifs de N-actylglucosamines. Ceci
favorise lassociation latrale de ponts hydrognes entre chanes et des groupes C=O aux
groupes N-H (Rinaudo, 2006). Einbu (2007) note galement des liaisons intramolculaires
entre le C-6 et le carbonyle, puis entre loxygne du cycle et le C-3 (Fig.1, p3). Par
consquent, la cristallinit de la chitine est leve.
Au contraire, la chitine est moins stable, moins cristalline et plus rare. Elle est prsente dans
les plumes de calmar, dans les tubes produits par des vers de la famille des pogonophores7 et
vestimentifres8, chez certaines algues et protozoaires (Rinaudo, 2006). En particulier, une
forme trs pure de la chitine est synthtise par la diatome Thalassiosira fluviatilis (Herth,
1979). cause de sa stabilit rduite, la chitine est plus ractive que la chitine ,
notamment avec les solvants (Shimojoh et al. 1998 ; Aranaz, 2010).

Fig.I.15: Arrangement des trois formes existantes de chitine : , et (Einbu 2007)

La distinction entre ces formes peut tre ralise par RMN, Rayons X ou spectrophotomtrie
6

Formes diffrentes partir dune mme unit de base


Vers cloms sdentaires vivant dans des tubes annels sur les fonds marins
8
Vers marins vivant dans de grands tubes, nayant pas de systme digestif, mais en symbiose avec des bactries
7

29

Chapitre 1 Etude bibliographique

IR (Sun et al. 2006).


Lorganisation dun solide est soit amorphe, soit cristalline, soit semi-cristalline. Ltat
cristallin est caractris par la rptition priodique dun motif, lequel est plac dans une
maille fictive. Cette mthode permet de dterminer les caractristiques spatiales du motif et
donc du cristal. La maille est gnralement un paralllpipde dfini par trois longueurs a, b
et c et trois angles dorientation , et (Fig.I.16). Ensuite, lassemblage des motifs forme un
rseau priodique monodirectionnel, bidirectionnel (plan 2D) ou tridirectionnel (espace 3D).
Les points du rseau o sont situes les particules sappellent des nuds. Ils caractrisent
galement lorganisation cristalline.

Fig.I.16: Maille cristalline

Okuyama (1997) a tudi lorganisation cristalline du chitosan, partir de chitine de crabe


dsactyle. Le motif cristallin prsente une structure orthorhombique9, selon les dimensions
a = 8,9, b = 17,0, c (axe de la chane) = 10,3 , dans un espace de type P212121. Takura et
Tamura (2007) comparent la cristallinit de chitine et . La chitine prsente une structure
orthorhombique de dimension a = 4,7, b = 18,9 et c =10,3 (Minke et Blakwell, 1978).
Tandis que la chitine est monoclinique, de dimension a = 4,8, b = 9,3 et c =10,4 et
despace P21. Ils montrent galement des modifications selon la teneur en eau dans les
produits. Ces rsultats illustrent les diffrences de cristallinit qui peuvent tre rencontres en
fonction de lorigine de la chitine et du type de driv.
Dautres paramtres ont une influence sur la cristallinit, tous sont lis au procd de
fabrication. Les traitements acides et basiques prolongs ont tendance rduire la cristallinit
(Seoudi et Nada, 2007), ainsi que la dsactylation (Revol et Marchessault, 1993 ; Vikhoreva
et al. 1999). De plus, la solubilit est directement lie la cristallinit et la teneur en
glucosamines dans le produit (Cho et al. 2000). Cependant, il est possible de rgnrer le
systme cristallin par un traitement basique adapt (Pillai et al. 2009). Lamarque et al. (2004)
rvlent que laugmentation de la cristallinit soppose la dsactylation.
Lorganisation microscopique des cristaux de chitine ou de chitosan est tudie par diffraction
aux rayons X. Le principe de son calcul sera dtaill au chapitre 2.III.3. Cette technique
permet de dcrire lorganisation cristalline et de mesurer lindice de cristallinit dun
9

Terme qualifiant un systme cristallin qui est un prisme droit, et dont la base est en forme de losange

30

IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques de la chitine

chantillon. Cet indice traduit la proportion de zones cristallines au sein dune structure
(Jaworska et al, 2003). Il est important de noter que les traitements acides liminent les zones
amorphes et par consquent augmentent l'indice de cristallinit (Remol et Marchessault,
1993).

IV.2. Le degr de polymrisation


Les macromolcules de chitine possdent un poids molculaire important, gnralement
suprieur 106 Da (1 2,5*106 Da selon Pacheco, 2009), soit plus de 3 000 5 000 units
rptitives, en fonction de la proportion de Glu10 et de NacGlu11. Les poids molculaires des
chitosans sont souvent rduits au cours du procd de dsactylation, cependant ils demeurent
levs, de lordre de 105 5*103 Da. Les exemples cits par la littrature varient. Fischer et al.
(2004) utilisent du chitosan de 0,4 1*105 Da, dsactyl entre 70 et 95 %. No et al. (2003)
voquent des poids molculaires de lordre de 106 Da tandis que Ito et al. (2000) situent la
chitine au-del de 106 Da, le chitosan entre 0,5 et 1*106 Da et ses oligomres entre 25 et
500 kDa. Kumar et Tharanathan (2004) dlimitent le poids molculaire des LMWC (low
molecular weight chitosan) de 5 20 kDa. Notons que la taille des macromolcules est
importante pour les applications tel que le mdical (Cf. section II).
Les oligomres de chitine et de chitosan sobtiennent par hydrolyse de la chane carbone.
Jung et al. (2007) obtiennent des chitobioses [(NacGlu)2], chitotrioses [(NacGlu)3], chitoheptoses [(NacGlu)7] et chitooctoses [(NacGlu)8]. Les traitements acides et la dprotinisation
enzymatique favorisent la dpolymrisation (Poirier et Charlet, 2002).

IV.3. La masse molaire et la polydispersit des longueurs de chane


Les polymres nont pas de masse molaire car la nature et le nombre de leurs units varient.
On parle de distribution de masse molculaire moyenne en nombre (Mn), en poids (Mp) et
viscosimtrique (Mv). Elles sont illustres par la figure I.17. Cependant, par abus de langage
le terme masse molaire est souvent utilis.

Fig.I.17 : Dispersion des masses molculaires


10
11

Glu ou D : D-glucosamines, monosaccharide constitutif du chitosan pur


NacGlu ou A N-actyl--D-glucosamines, monosaccharide constitutif de la chitine pure

31

Chapitre 1 Etude bibliographique

Le rapport Ip entre Mp et Mn est appel indice de polymolcularit. Plus celui-ci est lev,
plus la distribution est leve.

Ip

Mp
Mn

(I.1)

Par dfinition, la masse molaire Mn est lie au degr de polymrisation moyen en nombre,
DPn, selon la relation suivante :
Mn DPn m0 , avec m0 la masse molaired' une unit

(I.2)

Les deux grandeurs traduisent la longueur moyenne des polymres. En pratique, on a recours
des techniques telles que la chromatographie dexclusion strique pour estimer la masse
molaire moyenne en nombre. Cependant, cette technique serait trs difficile mettre en uvre
pour la chitine. On dtermine donc plutt la masse molaire viscosimtrique, daprs les
travaux de Staudinger (1881-1965) sur la viscosit des solutions de polymres.
Daprs lquation de Mark-Houwink-Sakura (MHS), la viscosit intrinsque est
proportionnelle Mv lorsque la concentration des polymres dissous tend vers zro. Or, la
viscosit intrinsque peut tre mesure laide dun viscosimtre capillaire.
[] = KMva (MHS)

(I.3)

Les coefficients a et K de lquation MHS dpendent du type de solvant, du polymre et de la


temprature (Flory et Fox, 1996). Le coefficient a est relatif la conformation de la molcule.
Le polymre tend tre linaire lorsque a tend vers 1. linverse quand a dcrot, la
molcule tend vers une forme de pelote compacte. De plus, la valeur de a confirme le
caractre linaire de la chitine. Les coefficients a et K ont t calculs pour la chitine
solubilise dans le DMAc/LiCl (Poirier et Charlet, 2002 ; Rinaudo, 2006). Leur valeur et la
mthode pour dterminer la masse molaire est dcrite au chapitre 2 (section III.2).
Kasaai et al. (2000) ajoutent un facteur de correction qMHS dans lquation de Mark-HouwinkSakurada pour tenir compte de limpact de la polydispersit des chanes. Pour la chitine
comme pour le chitosan, la masse molaire moyenne et la polydispersit des longueurs de
chane dpendent essentiellement des conditions du procd de fabrication (Tsai et al. 2010).
La polydispersit affecte indirectement les proprits de la chitine et du chitosan, en attnuant
celles lies la masse molaire. Lorsque la polydispersit est troite, son impact est minimal.
Au contraire, si Ip est lev, les proprits lies la masse molaire sont affectes. Par exemple,
la capacit former des capsules, des nanoparticules et des liaisons avec dautres substances,
sera diffrente (Tsai et al. 2010). Limiter la poly-dispersion favorise donc le contrle des
procds dapplications. La polydispersit peut tre rduite par un traitement mcanique tel
que les ultrasons (Chen et al. 1997 ; Wu et al. 2008).

IV.4. La solubilit
La solubilit dun polymre est lie aux interactions intra et inter molculaire entre les chanes
(Ravindra et al. 1998). La densit de charge de la chitine implique son caractre hydrophobe.
Par consquent, elle nest pas soluble dans les solvants classiques. Les acides concentrs, de

32

IV. Les caractristiques biochimiques et physicochimiques de la chitine

prfrence chaud, et certains solvants toxiques sont capables de solubiliser la chitine. Leur
utilisation est dangereuse pour loprateur et dgradent la structure de la chitine et du chitosan
(Hsiao et al. 2004). Le tableau I.6 dresse une liste non-exhaustive de ces solvants.
Chitine

Dimethylformamide/ 5% chlorure de lithium


Dimethylactamide/ 5% chlorure de lithium
Hexafluoroisoactone sesquiquihydrate
Hexafluoroisopropanol
Chitosan
Acide formique/w, Acide actique/w,
Acide lactique/w, Acide glutamique/w,
Acide dicholoractique
Acides trichlorothane, dichlorothane
Tab.I.6 : Liste non-exhaustive des solvants de la chitine, (Shahidi, 2002 ; Kumar, 2004 ; Morris 2009)

Ceci constitue linconvnient majeur qui limite lutilisation de la chitine et rend difficile sa
caractrisation. Des recherches rcentes portent sur le potentiel des liquides ioniques pour
solubiliser la chitine dune part, et former un film dautre part (Wu et al. 2008 ; Kadokawa et
al. 2011).
Lacide phosphorique (H3PO4) est un acide alimentaire galement capable de solubiliser la
chitine. Hein et al. (2007) lutilisent pour la mise au point dune mthode de dtermination du
DA. La chitine est dissoute 55 C, par H3PO4 0,5 M, dans un ratio w/v de 1 :200 et
pendant 1 h. Wu et Zivanovic (2008) pratiquent la mme technique sous des conditions plus
fortes, 60 C et jusqu 3 h. Linconvnient de cette mthode est la production dions
glucofuranosyl oxazolinium (Vincendon et al. 1997), composs intermdiaires instables qui
peuvent nuire la mesure de DA par RMN (Einbu et al, 2007b).
Pour obtenir un quilibre entre la dgradation minimale et la solubilisation maximale de la
chitine, le solvant privilgi est gnralement le DMAc/LiCl. Un complexe se forme entre les
ions Cl- et les groupes protons OH- et NHCOCH3- de la chitine. La formation de ce
complexe polylectrolyte saccompagne de la rupture des liaisons hydrognes qui stabilise
la structure cristalline du polymre, favorisant sa solubilisation (Poirier et Charlet, 2002). La
viscosit intrinsque de la chitine solubilise est alors dtermine pour estimer sa masse
molaire moyenne en nombre.
La solubilisation du chitosan est davantage accessible par des solvants acides, un pH < 6,5,
correspondant au pKa du chitosan. La prsence des groupements protons NH3+ modifie la
densit de charge de la molcule. Par consquent, la solubilisation dpendra du DA, ainsi que
de la nature du solvant. Le tableau I.6 donne galement une liste non-exhaustive de solvants
du chitosan. Gnralement, les plus courants sont des mlanges base dacide actique et
dactate de sodium (Kasaai, 2007).
La masse molaire, la polydispersit et la solubilit de la chitine et ses drivs ont un impact
direct sur leur comportement rhologique. Par exemple, la viscolasticit et le volume molaire
sont affects. La concentration en polymre dans le solvant est galement importante. Il existe
une concentration critique, dite denchevtrement ou de recouvrement, au-del de laquelle les
pelotes de macromolcules sinterpntrent. Cette concentration dpend de la masse molaire

33

Chapitre 1 Etude bibliographique

et du degr dactylation (Dong et al. 2002 ; Franca et al. 2008).

IV.5. Le degr dactylation et la rpartition des groupes actyls


Ce critre dpend exclusivement des conditions du procd de fabrication du chitosan.
Le degr dactylation ou de dsactylation peut tre dtermin par plusieurs techniques. Le
choix de la mthode est dict par lordre de grandeur du DA. En effet, chaque mthode
prsente nombre davantages et dinconvnients en fonction de lchantillon, du DA du
polymre et de lventuelle prsence dinterfrences par dautres composs. Kasaai (2009) a
compar les diffrences entre mthodes, parmi lesquelles on peut citer la spectroscopie UV,
visible et infrarouge, la spectroscopie par rsonance magntique et la potentiomtrie (ou
titration), l'analyse lmentaire et la diffraction aux rayons X. Ramos-Ponce et al. (2010) ont
rcemment mis au point une mthode de spectrophotomtrie base sur la ractivit de la
gnipine (extrait de plantes mdicinales) avec les groupes amines. Toutes les techniques
s'adressent une gamme de DA spcifique (Hein et al. 2007; Kasaai, 2009).
La rpartition (PA12) des units de N-actylglucosamines et glucosamines le long de la chane
polysaccharidique est htrogne. Cette caractristique est galement dterminante pour les
proprits de la chitine (Kumirska et al. 2009). D'aprs la figure I.18, on distingue plusieurs
modes de rpartition des motifs.

Fig.I.18: Schmas de distribution des groupes actyles le long de la chane carbone du chitosan, a) PA=0:
rpartition par blocs uniformes, b) PA=1: rpartition alatoire et c) PA=2: rpartition alterne entre A et D.

Le DA et le PA influencent la solubilit de la chitine et de ses drivs, les interactions entre


les chanes, leur flexibilit, leur conformation et par consquent, leur domaines dapplications
(Kumirska et al. 2009; 2010; Weinhold et al. 2009).
Il a t soulign que les conditions de production ont un impact sur les caractristiques de la
chitine et ses drivs. Nous allons maintenant aborder la mise en uvre du procd classique
dextraction. Il sagit de la voie chimique, employe traditionnellement par les industries.

12

PA pour Pattern of N-acetylation correspond la rpartition des glucosamines actyles ou non le long
de la chane carbonne

34

V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique

V. La production de chitine et de ses drivs par voie


chimique
V.1. Schma gnral
La production de chitine repose sur la purification de la matire premire. Lattention est
principalement porte sur llimination du carbonate de calcium et des protines. Bien que ce
procd rponde la dfinition dune purification, nous continuerons employer labus de
langage gnralement admis qui consiste parler d extraction de la chitine.
Lextraction chimique consiste en un traitement acide pour la dminralisation et un
traitement alcalin pour la dprotinisation. Les autres composs minoritaires sont supposs
tre entrains au cours de ces deux ractions. La dminralisation prcde gnralement la
dprotinisation car linverse aurait un impact sur le DP et le DA du polymre (Rao et
Stevens, 2005). Entre chaque tape, le produit est rinc abondamment leau dminralise.
La figure I.19 schmatise un exemple de production de chitine et de ses drivs.

Fig.I.19 : Procd industriel de fabrication de la chitine et de ses drivs (France Chitine)

En amont, la prparation de la matire premire est indispensable pour rduire les risques de
dgradation de la chitine. Les modes opratoires sont propres chaque entreprise, souvent
bass sur le schage pour viter lautolyse13 naturelle. France Chitine a fait le choix d'ensiler
et de saler les carapaces de crevettes et de crabes pour les conserver. Elles sont ensuite rinces
13

Activit des enzymes endognes

35

Chapitre 1 Etude bibliographique

leau distille jusqu obtenir la conductivit dune eau pure, puis sches froid. Enfin
elles sont cryobroyes lazote liquide (Percot et al. 2003a). Cette mthode permet de stocker
la matire premire pour l'anne, ce qui lisse les variations saisonnires. De plus, les produits
extraits auront une couleur plus blanche, compar au produit obtenu aprs schage au soleil.
Les rendements en chitine dpendent du choix de la matire premire et des conditions du
procd dextraction. De plus, les travaux de Einbu (2007a) montrent des variations sensibles
dans la composition des coproduits de crevettes au cours des saisons. De manire gnrale,
partir des ressources industriellement exploites, le rendement est compris entre 20 et 40 %
(Cf. section III ; Charoenvuttitham et al. 2006). Tolaimate et al (2003) soulignent que
loptimisation des conditions est fonction de la matire premire. Par exemple, ltape de
dminralisation lHCl est accentue lorsque lextraction seffectue partir de crabe ou de
homard (HCl 2 M, Tamb, 5 48 h). Au contraire, pour le bouquet ou les calmars, la
concentration en acide et la dure du traitement doivent tre limites (HCl 0,6 M, Tamb, 2 h).
Ces conditions sont lies la quantit de carbonate de calcium prsente.
Le procd dextraction repose sur la dminralisation et la dprotinisation. Pour les raliser,
de nombreuses combinaisons de concentration en ractifs, dure, temprature et ratio
ractif/substrat ont t testes. Les entreprises privilgient la formule qui convient leur
propre cahier des charges.

V.2. La dminralisation
Le traitement acide limine les minraux, qui passent en solution sous forme de sels. Pour des
raisons conomiques, lacide hydrochloridrique (HCl) est privilgi.
La concentration minimale, pour mener cette tape, est dtermine par lquation chimique
(I.4) de la raction entre llment minral majoritaire, le carbonate de calcium, et le HCl. En
principe, la dminralisation est complte ds lors o les proportions sont stchiomtriques,
mais dans les faits, les entreprises utilisent des solutions en excs.
2 HCl (aq) + CaCO3 (s) CaCl2 (aq) + H20 (l) + CO2 (g)

(I.4)

Les concentrations en HCl rencontres sont comprises 0,5 et 11 N et le ratio substrat/solvant


entre 1:10 et 1:40. La dminralisation dure entre 15 min et 48 h, de la temprature ambiante
50 C (Tolaimate et al 2003 ; Al Sagheer et al. 2009). La raction avec le carbonate de
sodium est acheve lorsque le dgagement de CO2 cesse.
Le degr de dminralisation est un indicateur de la performance de la dminralisation, il
est dfinit par la formule suivante (Rao et Stevens, 2005):

%DM

(A0M0) (ArMr)
*100
A0M0

(I.5)

%DM est le degr de dminralisation, Mo et Mr sont les masses initiale et rsiduelle du produit hydrolys, Ao
et Ar les pourcentages de cendres dans le produit initial et rsiduel respectivement.

36

V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique

Linfluence de la granulomtrie sur la dminralisation a t tudie par Marquis-Duval


(2008). Un traitement acide de 30 min a t effectu sur trois lots de Chitane, cuticules de
crevettes dprotinises par voie enzymatique. Trois catgories de tailles comprises entre 25
et 850 m ont t compares. Pour cette gamme de granulomtrie, la dminralisation atteint
des teneurs en minraux similaires, infrieures 0,5 %. Cependant Levque (Marquis-Duval,
2008) montre linfluence de la taille lorsque les fragments sont suprieurs 2 mm. Les deux
tudes saccordent sur limportance de la surface de contact entre le substrat et lenzyme.
Il faut prendre garde la production de mousse, cause par le dgagement de CO2. Elle peut
tre limite par lajout dun agent anti-moussant (No et Hur 1998). La dminralisation est
suivie par une tape de rinage car le produit doit atteindre la neutralit avant ltape suivante
de dprotinisation.
La prolongation de la dure du traitement, une temprature et une solution acide trop leve
conduisent lhydrolyse des liaisons glycosidiques et par consquent la dpolymrisation de
la chane carbone de la chitine et du chitosan (Lavall et al. 2007 ; Osorio-Madrazo, 2010). La
dsactylation peut intervenir en parallle en fonction de la temprature et de la concentration
en acide. Selon Gizatulina et al. (2005) la dpolymrisation est correctement dcrite par une
cintique du premier ordre, en fonction de la concentration en HCl et dont le taux maximal est
obtenu par une concentration de 29,8 %.
Lquipe de Varm a mis en vidence que le traitement acide par HCl 0,1 M 83 C pendant
10 103 h entrane la fois la dpolymrisation et la dsactylation du polymre. La
cintique de lyse des liaisons O-glycosidique est similaire celle des liaisons N-actylglycosidique lorsque la concentration en acide est faible. La vitesse k de dpolymrisation et
dsactylation est alors de lordre de 10-5 min-1. linverse, la liaison O-glycosidique est
lyse presque 10 fois plus rapidement (k atteint alors 10-4 min-1) lorsque la concentration
augmente de 0,1 1 M de HCl (Varm et al. 2001). Le degr dactylation et le type de
liaisons (A-A, A-D, D-A ou D-D) modifient galement les cintiques. Ainsi, Einbu et al.
(2007b) montrent que le taux dhydrolyse des liaisons O-glycosidique dun oligomre de DP4
compltement dsactyl est 50 fois suprieur celui de son homologue actyl. La prsence
du groupe actyle, charg positivement, protge la molcule de la dpolymrisation.

V.3. La dprotinisation
Lors de la description de la structure des cuticules (Chap.1.III), la forte interaction entre les
protines et la chitine a t dcrite. Ceci implique des conditions drastiques pour les sparer.
Un traitement basique permet dliminer les protines par solubilisation. Les ractifs
employs pour cette tape sont des bases fortes comme lhydroxyde de potassium (KOH). Le
plus courant, pour des raisons dconomie et technique, est lhydroxyde de sodium (NaOH).
Les concentrations utilises sont comprises entre 0,3 et 2,5 M, selon un ratio compris entre
1:10 et 1:40. La temprature est comprise entre 50 et 110 C et la dure peut varier de 1 h
plus de 24 h (Tolaimate et al 2003 ; Al Sagheer et al. 2009). Ces deux paramtres sont lis,

37

Chapitre 1 Etude bibliographique

ainsi la dure doit tre augmente si la temprature est baisse, et rciproquement.


Laugmentation de la concentration, de la dure et de la temprature de raction, amliorent la
dprotinisation (De Hollanda et Netto, 2006). Cependant, tout comme la dminralisation,
les conditions drastiques de la dprotinisation modifient la structure native de la chitine. Par
consquent, le choix du couple temps-temprature est dict par les caractristiques de la
chitine obtenir. Les modifications que peuvent entraner des conditions trop drastiques
concernent la perte de poids molculaire ou loxydation des extrmits rductrices (Crini et al.
2009).
Le degr de dprotinisation est un indicateur pour suivre lefficacit de la raction, il est
dfinit par la formule I.6 (Rao et Stevens, 2005):

%DProt

(P0M0) (PrMr)
*100
P0M0

(I.6)

%DProt est le degr de dprotinisation, M0 et Mr sont les masses initiale et rsiduelle du produit hydrolys, P 0
et Pr sont les pourcentages de protines dans le produit initial et rsiduel respectivement.

Des travaux ont port sur ltude la cintique de dprotinisation Tamb et NaOH 1 M (Percot
et al. 2003a). Une formalisation de la cintique est propose suivant un modle du premier
ordre, dP/dt = -kt, caractris par trois tapes distinctes. Chacune prsente une constante k
diffrente. La premire tape sattaquerait prfrentiellement aux acides amins basiques. Au
cours de la seconde tape, llimination des acides amins acides rattrape celle des acides
amins basiques. Les constantes k diminuent au fur et mesure de la dprotinisation. Percot
et al. (2003a) se sont galement intresss lnergie dactivation14 associe la
dprotinisation. Elle diminue avec la dure du traitement. Ceci suggre que les composs
protiques rsiduels sont plus difficiles daccs ou protgs par des conformations chimiques.
Par exemple il peut sagir de lipoprotines, dont les liaisons hydrophobes les protgeraient de
lhydrolyse.
Il existe peu dtudes sur la nature et lorganisation des protines dans les cuticules des
crustacs (Percot et al. 2003a). Les compositions en acides amins sont mesures dans
certains coproduits de crevettes, tels que Parapenaeopsis stylifera (Percot et al. 2003a),
Penaeus vannamei (Armenta et Guerrero-Legarreta, 2009) et Penaeus monodon (Narayan et
al. 2010). La composition diffre dun substrat lautre. Gnralement, le glutamate et la
glutamine, doss ensemble, sont majoritaires. Lacide aspartique/laspargine, larginine,
lalanine, la leucine, la valine et la proline sont abondants. Tandis que le tryptophane, la
tyrosine, la cystine, lhistidine et la mthionine sont faiblement prsents. Mura et al. (1994)
comparent lvolution de la composition en acide amin entre ltape juvnile et adulte de
Chirocephalus kerkyrensis et C. diaphanus, deux branchiopodes. Ils nobservent pas de
modification sauf une augmentation darginine.

14

Quantit dnergie ncessaire pour lancer un processus chimique

38

V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique

Des procds alternatifs ont t expriments pour remplacer ou tre combins avec la
dprotinisation chimique. Un couplage avec une mise sous pression 100 C et lutilisation
dun cuiseur (Boucher, 1991) a t propos, ainsi que la sonication (Kjartansson et al.
2006a,b ; Marquis Duval, 2008). Kjartansson et al. (2006b) ont obtenu une rduction de la
teneur en protines rsiduelles de 10,6 8,3 %, par 1 h de sonication, partir de crevettes
nordiques.

V.4. Ltape de blanchiment


Cette tape est optionnelle, elle nest pas ncessaire si le barme temps-temprature penche en
faveur dune longue dure. Cependant, il est trs difficile dobtenir un produit pur cause des
fortes interactions entre la chitine, les pigments et les protines. Une autre cause de coloration
des produits peut tre la raction de Maillard qui implique les groupes azots et les aldhydes
(Einbu, 2007a).
Gnralement, lagent de blanchiment employ est le peroxyde dhydrogne (H202), dont la
concentration est comprise entre 0,1 et 33 %, il peut galement tre mlang avec du HCl. La
dure du traitement est souvent trs courte, de lordre de quelques minutes (Tolaimate et al.
2003). En effet, tout comme les deux prcdentes tapes, les conditions de dcoloration
induisent une altration de la structure de la chitine, qui se traduit par une rduction du poids
molculaire. Les autres agents de blanchiment sont lhypochlorite de sodium (NaClO), le
permanganate de potassium (KMnO4), lactone, lthyle-actate et lacide oxalique (No et al.
1989 ; Synowiecki et Al-Khateeb, 2003; Abdou et al. 2008 ; Xu et Winter, 2008). Du et al.
(2009) utilisent le peroxyde dhydrogne pour hydrolyser le chitosan, afin daugmenter sa
solubilit, et privilgient lthanol pour le blanchiment.
Le traitement chimique modifie le poids molculaire et le degr dactylation de la structure
originelle de la chitine, il dtruit galement la structure des protines (Synowiecki et AlKhateeb, 2003). Pour rduire le risque daltration du polymre li la dminralisation et la
dprotinisation, il est conseill de rpter plusieurs fois lopration, pendant une courte dure
et intercaler des phases de rinage leau distille (Tolaimate et al. 2003). Daprs ArguellesMonal et al. (2000), 420 l deau par kilogramme de chitine sont consomms au cours de
lextraction chimique.

V.5. La dsactylation et la dpolymrisation


Des traitements acides et basiques svres catalysent la dpolymrisation et la dsactylation
(Gizatulina, 2005) et aboutissent au chitosan et aux oligosaccharides (Fig.I.20).

Fig.I.20 : Schma des ractions chimiques de dsactylation et dpolymrisation Sigma-Aldrich, Tutorial

39

Chapitre 1 Etude bibliographique

Le chitosan est obtenu par dsactylation de la chitine. Tout comme le procd dextraction
de la chitine, de nombreuses combinaisons de conditions de dsactylation sont dcrites dans
la littrature. Gnralement, la chitine est chauffe au-del de 80 C (jusqu 150 C), dans
une solution de NaOH (ou KOH) concentre entre 40 et 60 %, selon un ratio w/v entre 1:5 et
1:45, pendant au moins 10 h (Chang et al. 1997 ; Jaworska et Konieczna, 2001 ; Tsai et al.
2002 ; Synowiecki et Al-Khateeb, 2003). Le degr d'actylation obtenu est gnralement
compris entre 30 et 50 % (Kurita, 2006).
Il est possible d'amliorer la dsactylation par une alternance de traitements alcalins et de
rinages leau distille, rpte successivement le temps suffisant pour obtenir le DA vis
(Yaghobi et Mirzadeh, 2004). La dsactylation est homogne ou htrogne (Tsigo et al.
2000 ; Lamarque et al. 2004). Le chitosan est davantage soluble par dsactylation homogne
car le DD est plus lev ( 50 %). Cependant la raction dure plusieurs jours. Tandis que
lapplication de plusieurs tapes successives de dsactylation htrogne permet datteindre
un DD quivalent en quelques heures.
Galed et al (2005) ont tudi la dsactylation, par un traitement au NaOH 50 % (w) de 3 h
110 C, de trois crustacs Paralomis granulosa, Lithodes antarcticus et Palinurus vulgaris.
Les cintiques de dsactylation ont t formalises par une quation du premier ordre et
prsentent des constantes de vitesses lentes, autour de 0,04 min-1. Au contraire, Shahidi et
Abuzaytoun (2005) rapportent que la cintique de dsactylation est rapide dans la premire
heure puis peine abaisser le DA du chitosan. Aprs 5 h de raction, le DD naugmenterait
plus alors que le poids molculaire diminuerait. La taille des particules de chitine aurait
galement un impact sur le rendement de dsactylation. Enfin, il faut souligner que la
dsactylation est sensible loxydation. Le problme peut tre contourn en ralisant la
raction sous un gaz inerte ou en abaissant la pression. Lajout de NaBH4, un agent
antioxydant, protge le polysaccharide de la rduction des groupements aldhydes en alditols
(Tolaimate et al. 2003).
Lune des techniques traditionnellement employe, la mthode de Broussignac, consiste
prparer un milieu anhydre compos de 50 % dhydroxyde de potassium (KOH), 25 %
dthanol 96 % et 25 % de mono-thylne glycol. Le mlange est chauff 90 C avant
dajouter la chitine peu peu dans le racteur. La temprature est alors leve une consigne
qui dpend des adaptations ce procd, autour de 110 C (Rhazi et al. 2000).
La dpolymrisation se traduit par hydrolyse des liaisons O-glycosidiques. Comme cela a t
prsent prcdemment, les traitements acides favorisent cette lyse (Kurita, 2006). En gnral,
l'acide hydrochloridrique concentr est employ ou l'acide nitreux (HNO2) Cependant, il
provoque la dsamination de la glucosamine (Kumirska et al. 2009) et l'excs de HCl conduit
la destruction des oses. Einbu et Varm (2007) comparent la dpolymrisation selon
diffrentes concentrations en HCl, comprise entre 3 et 12 M, le taux maximal est atteint avec
6 M. L'nergie dactivation des liaisons O-glycosidique et N-glycosidique semblent similaires.
Le pH aurait galement un impact important sur la dpolymrisation tandis que la prsence
doxygne naurait pas deffet (Shahidi et Abuzaytoun, 2005 ; Holmes et al. 2001). Les
oligosaccharides peuvent ensuite tre spars sur colonne par fractionnement (Jeon et al.

40

V. La production de chitine et de ses drivs par voie chimique

2000). D'autres mthodes existent, telles que la sonication (Kasaai, 2008) ou les radiations
gamma (Min et al. 2004). Leur intrt varie selon le type matire premire.

VI. Les traitements biologiques


VI.1. La voie fermentaire
De nombreuses tudes font part de lintrt de la fermentation pour traiter les coproduits de
crustacs. En effet, la production de protases exocellulaires par certains microorganismes,
combine la production despces ioniques acides (comme l'acide lactique), quivaut aux
conditions dextraction de la chitine. Traditionnellement, la fermentation se droule dans un
racteur o les conditions de temprature, pH, pression et agitation sont suivies. lissue de
la fermentation, une filtration spare deux fractions. La fraction solide est compose en
majorit de chitine et la fraction liquide contient les autres constituants solubiliss. Lun des
intrts du procd biologique rsulte du potentiel de valorisation de cette dernire fraction.
Au cours de la fermentation, une protolyse sopre et libre des peptides et des acides amins
dont la digestibilit est amliore par rapport aux protines initiales (Bueno-Solano et al.
2009).
Wang et Chio (1998) exploitent les capacits de Pseudomonas aeruginosa K-187, source
traditionnelle pour la production de protases, chitinases et lysozymes. La fermentation dure
15 jours 37 C. Aprs 5 jours, la dprotinisation atteint 81% pour les exosquelettes et 82 %
pour les ttes. Au-del, la dprotinisation se poursuit lentement. Cette souche tant
galement riche en chitinases, Wang et Chio ont pris soin de contrler lactivit propre aux
chitinases, qui joue galement un rle dans la dprotinisation.
Teng et al. (2001) rapportent que les fermentations par Pseudomonas maltophilia, Bacillus
subtilis, Streptococcus faecium, Pediococcus pentosaseus et Aspergillus oryzae, permettaient
dextraire la chitine en prservant la longueur des chanes du polymre. Leur travail a port
sur la comparaison entre 34 myctes. Trois Aspergillus niger, 0307, 0474 et 0576, ont t
slectionns pour leur activit protolytique et leur composition riche en chitine. Ces microorganismes consomment les protines libres et abaissent le pH. La fermentation dure 4 7
jours, 30 C. Le rendement en chitine est autour de 48 % et la teneur en protines rsiduelles
entre 1,6 et 3,9%. Les souches fongiques prsentent lavantage de possder une proportion de
chitine dans leur structure externe. La teneur en chitine varie de 42 % pour Aspergillus niger
2,3 % pour Saccharomyces gulutara (Synowiecki et Al-Khateeb, 2003). Mucor rouxii est
lune des plus communment utilises car sa structure possde directement la forme
dsactyle de la chitine, le chitosan (8,9 35 % du poids sec). Cette proportion sajoute au
rendement dextraction. Les microorganismes sont limins par autolyse (Wang et al. 2009).
Aprs 14 jours de fermentation par B. subtilus 30 C, dprotinisation et dminralisation
atteignent 86 % et 72 % respectivement, soit 6,1 % et 5,2 % de teneurs rsiduelles (Sini et al.
2007). Le DA des produits obtenu est de 84 %. Manni et al. (2010) utilisent Bacillus cereus
SV1, pH 8 et 40 C. Un ratio protines dans le substrat / enzyme (w/w) de 20 est

41

Chapitre 1 Etude bibliographique

appliqu. Aprs 3 h de raction, la dprotinisation atteint 88,8 %. Elle est suivie d'une
dminralisation chimique de 6 h Tamb. Le DA est alors de 89,5 %.
La fermentation par bactries lactiques est largement traite dans la littrature (Zakaria et al.
1998 ; Khanafari et al. 2008). Rao et Stevens (2005) testent le potentiel de Lactobacillus
planturum 541 des coproduits de crevettes. La fermentation dure 24 h et linoculum est fix
5% en w/w. Les expriences comparent la fermentation avec ou sans acide actique ajout
lautolyse. Les meilleurs rsultats sont obtenus lorsque la fermentation est soutenue par
lappoint dacide actique ajust pH 6. La dprotinisation et la dminralisation atteignent
66 % et 63 % respectivement partir des cuticules de crevettes, tandis quelles atteignent
83 % et 88 % respectivement partir de ttes de crevettes. Cependant, les teneurs en protines
et minraux sont initialement plus leves dans les ttes, par consquent le rendement en
chitine est plus faible. La composition en acides amins dans la fraction liquide a t tudie
et compare des rfrences alimentaires (buf, poudre de lait et ufs). Rao et Stevens
prouvent ainsi la haute valeur nutritive de cette fraction.
Les cocktails de ferment lactique sont trs priss. Par exemple, Beaney et al. (2005) ont
slectionn Lactobacillus salvarius, Enterococus facium et Pediococcus acidilactici. La
fermentation a lieu dans un bioracteur o le pH nest pas contrl. Le pH initial est de 11, il
diminue rapidement (24 h) jusqu 6, puis la baisse se poursuit lentement jusqu 3,5 aprs 7
jours. La temprature est maintenue 30 C. lissue de la fermentation, les teneurs
rsiduelles en protines et en minraux sont de 11,9 % et 19,6 % respectivement. La
dminralisation est amliore lorsque la taille des fragments de matire premire est rduite.
Jung et al. (2007) tudient un mlange de Lactobacillus paracasei subsp. tolerans KCTC3074 et Serratia marcens FS-3. Il est appliqu des coproduits de crabes. lissue de la
fermentation, le pH atteint 3,6. La dprotinisation et la dminralisation aboutissent 68,9 %
et 94,3 % respectivement. La fermentation par la souche Pediococcus acidolactici CFR2182,
72 h, atteint 97,9 et 72,5 % en dprotinisation et dminralisation respectivement. De plus,
elle permet de rcuprer 72,4 78,5 % dastaxanthine (Bhaskar et al. 2007). Xu et al. (2008)
dans une tude approfondie, comparent les rendements de dprotinisation et dminralisation
par Lactobacillus casei MRS1 avec d'autres fermentations (Cf. Chapitre 4.I).
Depuis, Phuvasate et Su (2010) ont utilis Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarium,
Lactobacillus acidophilus, pour mener la dminralisation. Lhydrolyse dure 5 jours 30C,
elle est suivie par un lavage basique de NaOH 0,5 M 25 C pendant 4 h. Dans ces
conditions, les teneurs rsiduelles en protines et minraux sont de 4,89 % et 1,44 %. Par
comparaison, un traitement acide par HCl ou acide lactique permet une dprotinisation
suprieure, tandis que la teneur en minraux rsiduels est ngligeable. La fermentation par
Lactobacillus plantarium a t applique des coproduits des crevettes Litopenaeus sp.
pendant 6 jours pour extraire de faon concomitante la chitine et lastaxanthine. Pacheco
(2010) obtient une dminralisation de 80 % et une dprotinisation de 91 % 35 C.
La difficult liminer les protines est rcurrente (Gagne et al. 1993 ; Wang et Chio, 1998 ;

42

VI. Les traitements biologiques

Zakaria et al. 1998 ; Synowiecki et Al-Khateeb, 2000 ; Healy et al. 2003). Le rle prventif de
la fermentation vis vis des contaminations microbiennes est galement soulign (Sini et al.
2007 ; Phuvasate et Su, 2010). Il repose sur la diminution du pH. Cependant, lexcs dacide
dtruit les protines les plus sensibles dans la fraction liquide (Wang et Chio, 1998).
Beaney et al. (2005) comparent lextraction chimique une extraction par fermentation
lactique. partir de ses travaux, les teneurs en protines rsiduelles sont de 2,1 % et 11,9 %
par voie chimique et enzymatique respectivement, soit 5,6 fois moindre. Llimination des
minraux est quasi-complte par la voie chimique et de 68 % par fermentation lactique. Le
degr de dminralisation semble tre amlior par la rduction des tailles. De plus, aprs
dsactylation, le poids molculaire et le degr dactylation ne prsente pas de diffrences
significatives (Beaney et al. 2005).

VI.2. Dprotinisation et de dminralisation enzymatiques


Les enzymes sont largement exploites par les industries, en particulier les protases. Leur
activit principale est la lyse des liaisons peptidiques. Elles ciblent galement les liaisons
esters (Bornscheuer et Kazlauskas, 2004). Leur mode daction fait intervenir une molcule
deau, ce qui les place dans la catgorie des hydrolases. Parmi leurs domaines dapplication
en agroalimentaire, les protases interviennent dans la fabrication de boissons, ptisseries,
fromages et autres produits laitiers, ainsi qu la transformation de viande et de poissons
(Burstein, 2000). Elles interviennent galement dans lindustrie du cuir, de la photographie et
comme dtergents, notamment dans les lessives (Yang et al. 2000). Dans le domaine mdical,
les protases sont admises comme anti-inflammatoires, combines avec des antibiotiques. Le
principe dutilisation des protases se base sur leur capacit liminer des impurets
organiques, se substituant aux agents toxiques classiques (Rao, 1998).
Les protases sont dorigine animale, vgtale, microbienne ou fongique. Pour rpondre la
demande actuelle, lextraction des protases se fait partir de cultures en bioracteur. Les
liaisons peptidiques vises prfrentiellement sont spcifiques chaque protase (Tab.I.7).
Enzymes
Origine
Site de clivage de liaison peptidique
Trypsine
Animale
-Lys (or Arg)--Chymotrysines, subtilisine
Animale/ bact.
-Try (or Tyr, Phe, Leu)--Staphylococcus V8 protase
Bactrienne
-Asp (or Glu) --Papane
Vgtale
-Phe (or Val, Leu)-Xaa--Thermolysine
Bactrienne
---Leu (or Phe)--Pepsine
Animale
-Phe (or Tyr, Leu)-Trp (or Phe, Tyr)
Tab.I.7 : Sites des liaisons lyses en fonction de lenzyme (Rao, 1998).

Ds les annes 60, des investigations se sont orientes vers les protases pour extraire la
chitine, entre pH 5 et 8 (Wang 1998). Roussina a test la dprotinisation par la papane, la
pepsine et la trypsine en 1968. Gagne et Simpson (1993) ont dtermin les conditions
optimales de dprotinisation par la chymotrypsine et la papane, autour de pH 8 40 C.
partir de coproduits de crevettes prtraits, les teneurs en protines rsiduelles sont de 1,3 %
et 2,8 % respectivement.

43

Chapitre 1 Etude bibliographique

Parmi les protases tudies pour leur capacit dprotiniser les coproduits de crustacs, les
alcalases ont intress Synowiecki et Al-Khateeb (2000). Les conditions optimales dactivits
se situent autour de pH 8,5 et 55 C et le substrat (exosquelette de crevettes) est prdminralis. Aprs 4 h dhydrolyse enzymatique et des tapes de rinage/blanchiment, la
fraction chitineuse rcupre prsente des teneurs rsiduelles en protines et cendres de
4,45 % et 1,56 % respectivement.
Un argument en faveur de la dprotinisation enzymatique est galement sa capacit
prserver les peptides passs dans la fraction liquide lissue de lextraction. Synowiecki et
Al-Khateeb (2000) exploitent ce potentiel et obtiennent une fraction liquide contenant 64,3 %
de protines (en poids sec), caractrises par un PER15 de 2,99. De plus, lindice en acide
amins essentiels est de 125,4. Ces rsultats sont suprieurs la capeline (protine du capelan,
poisson dAtlantique nord, utilise comme rfrence de haute valeur nutritive), 2,64 et 99
respectivement.
De Hollanda et Neto (2006) procdent la mme dmarche en cherchant extraire des
coproduits de crevettes, la chitine, les protines, ainsi que lastaxanthine. La dprotinisation
est ralise avant la dminralisation, selon un degr dhydrolyse de 6 %. La fraction liquide
contient 77,58 % de protines et 1,79 % de lipides. Lautre fraction contient de la chitine
associe 9,19 % de protines et 2,44 % de cendres rsiduelles. Puis lexprience a t mene
en utilisant une autre protase, la pancratine. La fraction qui contient majoritairement la
chitine prsente une composition similaire. Celle de lhydrolysat montre un taux de
rcupration des protines infrieur au prcdent (39,5 % contre 49,5 % avec lalcalase). Ces
rsultats ont montr quune augmentation du degr dhydrolyse avait un effet controvers.
Le complexe enzymatique propos par Novozyme, Protamex, a t utilis pour valoriser des
coproduits de crabes (Beaulieu et al. 2009). Les conditions de protolyse sont fixes 40 C
pH 8, le ratio d'enzyme/substrat est de 1 g/1 kg et celui de la dilution est de 1 :1. Aprs
hydrolyse enzymatique, le procd dvelopp consiste tout d'abord sparer la fraction solide
de la fraction liquide par dcantation, puis centrifuger cette dernire fraction, afin d'obtenir
des phases spcifiques (Fig.I.21).

15

Protein Efficiency Ratio : indicateur bas sur le gain de poids (en g), par quantit de protines ingres (en g)

44

VI. Les traitements biologiques

Fig.I.21: Schma du procd d'hydrolyse enzymatique par Beaulieu, 2009

La fraction solide contient 26 % de chitine et beaucoup d'impurets protiques et minrales,


15,6 % et 39,7 % respectivement. Le procd est destin valoriser les acides amins,
peptides et acides gras polyinsaturs contenus dans l'hydrolysat. Cette tude est intressante
du point de vue des techniques de filtration. D'autres tudes se concentrent sur la valorisation
des hydrolysats issus de l'extraction enzymatique de la chitine, telle que celle catalyse par
l'alcalase 2,4 1 FG (Novo Nordisk) 2h 40 C (Gildberg et Stenberg, 2001). L'hydrolysat
contient 86% de protines, 10 % de minraux et 1 500 ppm d'astaxanthine, tandis que la partie
solide, appele gteau , subit un traitement chimique complmentaire pour extraire le
chitosan.
Dlaisse pendant quelques annes, la dprotinisation par la pepsine est de nouveau tudie
depuis 2002 (Chakrabarti, 2002; Babu et al. 2008), afin de valoriser les carotnoprotines
contenus dans les hydrolysats des coproduits de crevettes. Ils comparent les rendements
d'hydrolyse enzymatique partir de la trypsine (pH 7,6/45 C), la papane (pH 6,2/55 C) et la
pepsine (pH 4/45 C). Les rsultats montrent que les rendements sont dpendants du type de
matire premire et gnralement la trypsine offre les meilleures performances.
La dprotinisation enzymatique par la papane a t tudie sur des coproduits de crevettes
Penaeus vannamei par Gartner et al. (2010). Cependant, les teneurs rsiduelles en protines et
minraux sont telles quun traitement chimique complmentaire est ncessaire. De plus, la
papane coupe de faon alatoire les liaisons N-glycosidique et les liaisons avec les protines,
ce qui initie la dsactylation de la chitine.

45

Chapitre 1 Etude bibliographique

VI.3. Dsactylation et dpolymrisation enzymatique


VI.3.1. La dsactylation enzymatique
De nombreuses tudes traitent de la dsactylation enzymatique par laction de chitinases ou
chitosanylases. Ces enzymes sont rfrences EC 3.51.41. Elles sont extraites de levures telles
que Colletotrichum lindemuthianum ou Mucor rouxii ou Aspergillus niger, o elles
participent au mtabolisme des sucres (Tsigos et Bouriotis, 1995 ; Gildberg et Stenberg,
2001). Les chitinases peuvent galement tre extraites de lhpatopancras de crevettes
(Esaiassen et al. 1996).
Tsai et al. (2002) ont compar lactivit antimicrobienne de chitosans de diffrents DA. Ils ont
utilis de la chitine obtenue soit par voie chimique, soit par voie fermentaire par laction de
Pseudomonas maltophilia. Ensuite, chaque chitine est dsactyle soit par voie chimique, ou
par voie enzymatique, par la trypsine, la pronase, la pepsine et la chymotrypsine. Les DA
obtenus sont de 40%, 38 %, 37 % et 31 % respectivement. Ces travaux montrent galement
que lactivit antimicrobienne semblent tre amliore par de faibles DA (ou forts degrs de
dsactylation) et que la masse molaire diminue mesure que le DA diminue.
La dsactylation enzymatique peut tre catalyse par une chitine-dsactylase extraite de
Mucor rouxii pH 4,5 50 C (Kafetzopoulos et al. 1993). Cette enzyme est active sur des
substrats chitineux suprieurs 4 units et prsente un degr d'activit plus lev lorsque le
substrat prsente une solubilit plus leve. Aprs 13 h de raction partir de chitosan prdsactyl (DA=42 %), le DD est gale 98 % (Martinou et al. 1995, Martinou et al. 1998).
Aspergillus nidulans est galement une source de chitine dsactylase (Alfonso et al. 1995)
ainsi que Bacillus licheniformis. partir de cette souche, lendochitinase extraite a t
implante dans E. coli pour produire une enzyme recombinante commercialise (rfrence
EC 3.2.1.14). Elle est applique pour convertir la chitine collodale en N-actylglucosamine et
chitobiose pH 4-6, 50 C, 3 jours (Songsiriritthigul et al. 2010).
Par la voie chimique comme enzymatique, la chitine est plus facile dsactyler que son
homologue , qui est mieux protg par sa conformation. La dsactylation enzymatique
semble hydrolyser les liaisons N-actyles de faon alatoire (Kumirska et al. 2010).
Cai et al. (2006) explorent le potentiel de production concomitante de chitosan et d'acide
citrique par Aspergillus niger. Les parois de cette levure contiennent du chitosan. Afin
dexploiter cette biomasse lissue de la production dacide citrique, elle subit un traitement
par des lysozymes, snailases et protases neutres, pour rompre les membranes des cellules.
Puis la partie solide est traite par des dsactylases extraites de Scopulariopsis brevicaulis.
Le produit obtenu est caractris par un poids molculaire et un degr de dsactylation de
2,7*105 Da et 73,6 % respectivement.
L'un des avantages de la dsactylation enzymatique, revendiqu par rapport au traitement
chimique, est sa capacit mieux prserver le poids molculaire initial du polymre
(Martinou et al. 1995; Cai et al 2006). Les produits drivs de chitine commercialiss sont

46

VI. Les traitements biologiques

gnralement des glucosamines de rpartition de motifs A et D connus. L'entreprise


Amicogen Inc (Chine) fournit des ChitoOligo-100 pour l'industrie agroalimentaire comme
supplment dittique et pour l'industrie mdicale comme immuno-stimulant, antimicrobien,
et antitumoral.
VI.3.2. La dpolymrisation enzymatique ou la chitinolyse
La dpolymrisation enzymatique requiert des conditions plus douces, elle est plus spcifique
et plus contrlable que la dpolymrisation chimique (Li et al. 2005, Mourya et al. 2011).
Les chitinases et chitosanases qui hydrolysent les liaisons glycosidiques sont classes comme
Carbohydrate-Active enZYmes (CAZy) dans la base des enzymes (Aam, 2010), et plus
prcisment dans la catgorie des glycoside-hydrolases (GH). Il a t dmontr que les
chitinases ne pouvaient hydrolyser que les liaisons A-A, contrairement aux chitosanases. De
plus, ces enzymes ont gnralement un mode daction par reconnaissance des extrmits
rductrices ou non et des sites de coupures privilgis (Varm et al. 1996, Mourya et al.
2011). Cette spcificit peut tre exploite pour produire des dimres, trimres ou ttramres
de succession de motifs spcifiques (Aam, 2010).
Le chitosan est sensible l'activit d'enzymes tels que les amylases, les cellulases, les
dextranases, les pectinases, les lipases et les protases dont la pepsine et la papane
(Muzzarelli et al. 2002). La papane est une enzyme peu couteuse et active pH acide.
L'hydrolyse est conduite 7 jours pH 3,2 (en acide lactique) 40 C. La masse molaire (Mn)
est rduite de 195 000 prs de 67 000 g/mol (Terbojevich et al. 1996). Cette tude montre
galement que la papane offre une meilleure capacit dpolymriser que les lipases et les
lysozymes. Ces derniers sont pourtant indiqus pour dpolymriser la chitine hautement
actyle, car elles ciblent les N-actylglucosamine (Jeon et al. 2000).
Une comparaison entre l'hydrolyse chimique, par HCl 37 %, pendant 30 min 72 C, et
lhydrolyse enzymatique, par Ultra Spl pH 5,5 et 37 C 24 h est ralise par Cabrera et Van
Cutsen (2005). Ils montrent que les chitooligosaccharides sont plus courts et davantage
dsactyls par la voie enzymatique.
Une protase neutre extraite de Bacillus subtilis a t teste pour dpolymriser le chitosan
(Li et al. 2005). Les conditions optimales ont t dtermines pH 5,4 et 50 C. Le ratio E/S
appliqu a t de 1:20 (w/v). L'exprience a port sur des chitosans de diffrents DA et de
diffrents temps d'hydrolyse, les oligosaccharides obtenus taient majoritairement des
(NacGlu)2, (NacGlu)5 et (NGlu)2-NacGlu. La dpolymrisation par une lipase fournie par
Novozyme (Lee et al. 2008) a t ralise entre pH 4,2 et 5,0, 37 C et 55 C, et pendant 6
24 h. La cintique de dpolymrisation semble tre trs rapide la premire heure, puis ralentie,
avant de prsenter une ractivit trs rduite partir de 12 h. Les rendements d'hydrolyse sont
plus levs lorsque la temprature est stabilise 37 C. Les oligosaccharides obtenus sont de
DP 2 6. Ilankova et al. (2005) ont test le potentiel de la pepsine pour dpolymriser le
chitosan. Les conditions optimales ont t dtermines pH 4,5 et 44 C. L'hydrolyse se
poursuivie 24 h, l'issue desquelles le rendement se rparti entre 71,5 % de chitobioses, 19 %
de NacGlu et 9,5 % de chitotrioses.

47

Chapitre 1 Etude bibliographique

Fig.I.22: Voies enzymatiques de conversion de la chitine en drivs dsactyls et dpolymriss (Jeon et al.
2000)

Plusieurs modes opratoires sont disponibles selon la nature des produits obtenir (Fig.I.22).
La littrature dcrit la spcificit des activits de plusieurs enzymes. Ainsi il est possible de
combiner plusieurs enzymes, sous contrle des conditions environnementales, afin de tendre
vers des caractristiques de DP, DA et PA prcis. Les connaissances en gnie enzymatique
acquises depuis 2000 augmentent le potentiel dcrit par la figure I.20. Le cot de la
dsactylation et la dpolymrisation enzymatique tant suprieur celui des traitements
chimiques, elles sont rserves la production de drivs de chitine spcifiques.

VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins


VII.1. Valeur ajoute des coproduits marins
Dans un contexte gnral de valorisation des coproduits marins, lextraction de la chitine nest
que lune des voies exploites. La majorit des coproduits marins est valorise sous forme de
farine et dhuile. Ils sont galement convertis en hachis congel et hydrolysats protiques
(Fig.I.23). Ces voies de transformation ne gnrent quune faible valeur ajoute.
Hachis congel
23%

Hydrolysats
protiques
21%
1% Armes

farine/huile
52%

3% Autres
(cuir, glatine,
collagne,
engrais, )

Fig.I.23 : Parts (en tonnage) des voies de valorisation de coproduits marins en France, Andrieux, 2004

48

VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins

Au premier trimestre 2009, les productions de farine et dhuile de poissons atteignaient


respectivement 433 000 tonnes et 530 000 tonnes. Elles dclinent depuis 2004 alors que les
prix augmentent. Le Prou est le premier producteur (Globefish, 2010). Les hydrolysats sont
issus dautolyse (enzymes endognes, exemple le nuoc mam, la sauce vietnamienne
traditionnelle) ou dhtrolyse (enzymes exognes ajoutes). Ils se dmarquent par une forte
teneur en protines et sont destins lalimentation animale. Le hachis congel peut tre
labor partir de tous coproduits, except ceux des poissons cartilagineux et les viscres. Il
est destin au secteur du petfood (Dumay, 2006).
Pour atteindre une valeur ajoute suprieure, il faut se tourner vers lextraction de molcules
spcifiques ou des valorisations particulires. La peau est utilise pour la fabrication de cuir
(Gurard et al. 2004). Parmi les molcules dintrt, on peut citer la chondrotine sulfate, les
vitamines et minraux, llastine, les drivs dacides nucliques et la kratine. Ces molcules
sont utilises en nutraceutique, dittique, cosmtique, pharmaceutique et agroalimentaire.
La farine de poissons est riche en protines, de 72,5 80 %, et la teneur en lipides varie de
21,2 4,7 %, pour les poissons gras et maigres respectivement. La part dacides gras insaturs
est gnralement leve. Les hydrolysats comprennent 73 85 % de composs protiques.
Schs, ils sont vendus en complment de la farine de poissons (site IFREMER).
VII.1.1. Les composs protiques
La protolyse est un mcanisme de lyse des liaisons peptiques. Par consquent, elle induit une
modification de la conformation des protines et une rduction de leur taille en peptides et
acides amins. Leur digestibilit est ainsi augmente, se traduit par une meilleure assimilation
par lorganisme. De plus, la valeur nutritive est augmente si les acides amins librs sont
considrs comme essentiels (Bueno-Solano et al. 2009).
La part dacides amins essentiels dans lalimentation est un facteur important pour les
levages et laquaculture. De nombreuses tudes portent sur les besoins spcifiques de chaque
espce. Millamena et al. (1997) se sont intresss lapport en mthionine et thronine
ncessaire pour la croissance des juvniles de Penaeus monodon. La figure I.24 illustre le
mcanisme dabsorption des peptides.

49

Chapitre 1 Etude bibliographique

Fig.I.24 : Mcanismes de digestion et dabsorption des protines par lorganisme

Bougl (2007) tudie les activits biologiques des peptides marins, par exemple leur rle dans
la dfense immunitaire, contre les infections et dans la prvention du cancer, ainsi que des
complications cardio-vasculaires et mtaboliques lies lobsit.
De plus, certains acides amins sont responsables de notes aromatiques spcifiques aux
crustacs (Narayan et al. 2010). Par consquent, ils constituent des ingrdients intermdiaires
pour lagroalimentaire, comme complments aromatiques incorpors dans des plats prpars,
des soupes, etc. Ces composs peuvent tre valoriss partir de jus de cuisson issus des
procds de transformations des produits marins (Cros et al. 2004).
De nombreux peptides activit antimicrobienne ont t identifis chez les crevettes
(Randriamahatody, 2011). Parmi eux, on citera les crustines et les pnaeidines. Les premires
sont volumineuses, autour de 10 kDa et constitues de 84 144 acides amins (Fleury et al.
2008). Les secondes sont cationiques, de 5,5 et 6,6 kDa et formes de 50 67 acides amins.
Elles doivent leur nom leur isolation, pour la premire fois, dans P. vannamei, par un
laboratoire IFREMER (Brevet Destoumieux, 2000). De plus, leur activit antimicrobienne est
lie la prsence de chitine (Destoumieux et al. 1997, 2000a, 2000b). Les microorganismes
principalement viss sont les Gram + et en moindre mesure, les champignons.
VII.1.2. Les composs lipidiques
Les organismes marins sont capables de synthtiser des acides gras insaturs de la famille des
3 et 6, contrairement aux organismes terrestres. Cette capacit est lie la temprature de
leur milieu de vie. Les acides gras assurent llasticit des membranes basse temprature.
Ces acides gras sont galement ncessaires aux organismes terrestres qui nont dautres choix
que lapport alimentaire. ce titre, les organismes marins constituent une source intressante,

50

VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins

avec une teneur en acides gras jusqu 40 %, parmi lesquels lEPA et le DHA (Berg et
Barnathan, 2005). Ces acides gras polyinsaturs sont conseills pour rduire les risques de
maladies lies au mauvais cholestrol et aurait des effets contre les inflammations, les ulcres
et lathrosclrose (Dumay, 2006)

Fig.I.25 : Schma dune membrane cellulaire, rpartition des composs lipidiques

La figure I.25 schmatise la membrane cellulaire. Les phospholipides sont prsents dans les
membranes cellulaires de tous les organismes mais seraient en proportion suprieure dans les
ttes de poissons. Ils sont souvent nomms lcithines lorsquils sont utiliss comme
additifs en agroalimentaire. Ils ont un rle texturant grce leur pouvoir mulsifiant. De plus,
ils prsentent des activits biologiques, telle que lactivit antimicrobienne (Tamehiro et al.
2002).
Il existe dautres composs lipidiques dintrt, tels que les sphingolipides, les squalnes ou
les strols, prsents dans les produits marins. Cependant, leur proportion est ngligeable chez
les crustacs, lexception des terpnes. Une quantit importante de pigments issus de cette
famille est prsente dans lexosquelette des crustacs. Ces pigments sont responsables du
changement de couleur lorsque les crustacs sont ports haute temprature (Fig.I.26). La
conformation des molcules est modifie ainsi que sa frquence dabsorption.

Fig.I.26 : La cuisson des crustacs modifie la conformation des pigments et donc change leur couleur

51

Chapitre 1 Etude bibliographique

Les pigments des crustacs appartiennent la famille des carotnodes, prcurseur de la


vitamine A. En gnrale, le pigment majoritaire est lastaxanthine, entre 63,5 92,2 %. On
trouve galement du -carotne et de la zaxanthine (Sachindra et al. 2005). Ogawa et al.
(2006) ont extrait, partir de ttes de Penaeus. vannamei bouillies 15 min, 37,62 g/g de
carotnodes dont 45 % dastaxanthine, 33,5 % de -carotne-5,6-poxyde et 21 % dastacine.
Lastaxanthine est particulirement prise par les leveurs. Ajoute l'alimentation des
volailles, elle colore leur coquille, ou ajout celle des saumons, elle rougit leur chaire. De
plus, son pouvoir antioxydant est largement dmontr (Naguib, 2000 ; Guerin et al. 2003 ;
Gimeno et al. 2007 ; Sachindra et al. 2008) et soulign par les industries cosmtiques et
nutraceutiques.
De nombreux travaux mens par le groupe de Sachindra explorent les techniques dextraction
de lastaxanthine partir des coproduits de crevettes. Notamment lextraction par des huiles
vgtales (Sachindra et Mahendraker, 2005), par fermentation 15 jours (Sachindra et al. 2007)
et par voie enzymatique. Lactivit de trois enzymes, lalcalase, la papane et la trypsine, a t
compare sur des coproduits de P. indicus. Les rendements en carotnodes sont de 28,6 ;
24,8 et 25,3 g/g respectivement (Sachindra et al. 2011). Sowmya et al. (2011) ont extrait
lastaxanthine partir de tte de crevettes P. monodon, par autolyse pH 8 50 C. Le
meilleur rendement atteint 58,5 6,4 %, aprs 4 h et selon un ratio de 1 : 2,5. Tandis que le
plus fort pouvoir antioxydant est atteint lorsque lautolyse dure 2 h selon le ratio 1 :5. Nawani
et al. (2010) dveloppent la possibilit d'extraire et de purifier les antioxydants des coproduits
marins par les chitinases issues de Bacillus sp. et Microbispora sp. Aurioles et al. (2004) ont
travaill sur lextraction des lipides totaux de crabes et homards, afin dexploiter la fois
lastaxanthine et les acides gras polyinsaturs dans cette matire premire. Les rsultats ont
mis en vidence la forte valeur nutritive des extraits.
VII.1.3. Les minraux
Les coproduits de crevettes sont riches en lments minraux, particulirement en calcium. Il
existe sous forme cristalline, semi-cristalline ou amorphe, lindice de cristallinit indique la
proportion de zone cristalline (Cf. V.1). Al-Sawalmih et al. (2008) ont tudi la distinction
entre les zones amorphes de carbonate de calcium, de phosphates de calcium et les zones de
calcites (forme cristalline) dans la cuticule de homard. Ils expliquent la rpartition de chaque
zone et leur rle soit pour la rigidit de lexosquelette et des canaux transversaux, soit pour la
stabilisation gnrale.
Les complexes drivs du calcium, tel que laragonite, lhydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH) et son
prcurseur, le brushite (CaHPO4), sont utiliss comme matriel de substitution en mdecine
(Fig.I.27). Ces biomatriaux sont la fois actif et permettent de remplacer des tissus osseux
ou des dents, cest la raison pour laquelle ils sont aussi nomms ciment . Ils peuvent tre
intgrs sous forme de nanoparticules (Maity et al. 2011), fibres (Zhang et Darvell, 2011) ou
associs avec des polymres, dont le chitosan (Pea et al. 2006 ; Paduraru et al. 2011). Ils sont
gnralement injects liquides ou visqueux dans lorganisme o ils se solidifient (Komath et
Varma, 2003). La solidification est progressive et dpend du pH.

52

VII. Les enjeux de la valorisation des produits marins

FigI.27 : Cristal de calcite, support de nanocristaux de brushite (Maity et al. 2011) et ciment de phosphate de
calcium appliqu (Callos Bone)

Les calcium-orthophosphates sont indiqus comme ciment de reconstruction des tissus car ils
sont biocompatibles et donc vitent les risques de rejets par lorganisme. Ainsi, ils sont
indiqus pour les cas dathrosclrose et de dcalcification dentaire. Enfin, il faut galement
signaler quils sont dexcellents engrais (Dorozhkin, 2007). Des instituts tels que le British
Calcium Carbonates Federation au Royaume-Uni se sont ddis aux voies dapplications de
ces biomatriaux.

VII.2. Lhydrolyse enzymatique des coproduits marins


Lhydrolyse enzymatique des coproduits marins librent les composs haute valeur ajoute
dcrits prcdemment. Pour cette raison, elle est de plus en plus tudie. Applique aux ttes
de crevettes P. semisulcatus, par laction dalcalases, elle atteint un rendement massique de
protines dans la phase liquide de 45 %. Lorsque lon ajoute du sulfite de sodium, le
rendement atteint alors 62 %. Cette fraction protique contient une part suffisante d'acides
amins essentiels pour l'alimentation animale et les rsidus sulfites peuvent tre limins par
prcipitation acide (Mizani et al. 2005).

VII.3. Les objectifs envisags par cette tude


Le principal objectif de cette tude est dappliquer lhydrolyse enzymatique pour extraire la
chitine partir des coproduits de marins. Les travaux antrieurs ont dmontr le potentiel de
la fermentation lactique et des protases extraites de microorganismes. Cependant, les teneurs
en protines et minraux rsiduels natteignent pas les niveaux quivalents ceux obtenus par
lextraction chimique dans les mmes dlais. Le degr de puret est suffisant lorsque la dure
du traitement biologique dure plusieurs jours. De plus, les procds dcrits aux sections
prcdentes conservent gnralement le principe dextraire la chitine par deux tapes cl,
lune associe llimination des minraux, lautre celle des protines. Certains traitements
biologiques prcdemment dcrit, parviennent accomplir les deux tapes, cependant les
dures de ces traitements sont longues.
Des travaux ont t mens au laboratoire STBM par Randriamahatody (2010) sur lhydrolyse
enzymatique pour valoriser les coproduits de crevettes Penaeus vannamei. Ils ont mis en
lumire le potentiel de la pepsine pour extraire la chitine. En effet, lhydrolyse acide a libr

53

Chapitre 1 Etude bibliographique

des peptides actifs dans la phase soluble dune part, et de la chitine purifie dans la phase
insoluble dautre part. Ces rsultats ont inspir deux perspectives de valorisation :
- La premire est lapplication de lhydrolyse enzymatique acide par une protase telle
que la pepsine. Le procd repose sur une seule tape cl. De plus, la pepsine est une
enzyme industrielle dj utilise en agroalimentaire (produits laitiers notamment) et sa
cintique dactivit est rapide.
- La seconde est lexploitation des composs solubles de lextraction. Habituellement
dtruits par les traitements chimiques, la voie biologique est plus douce et peut donc
prserver leur structure.
Cette tude est loccasion de confronter deux mthodes, le traitement chimique et le
traitement biologique. Les liaisons entre chitine, protines et minraux, comme cela a t
voqu prcdemment, sont fortes et font obstacle la purification de la chitine. Avec les
pigments se forment des complexes glycoprotiques, lipoprotiques ou glycolipidiques quil
est difficile de sparer (Fig.I.28). Le traitement doux par hydrolyse enzymatique, sera-t-il
suffisant pour concurrencer lextraction chimique dont les conditions svres favorisent
lobtention de chitine de haut degr de puret ? Le cas chant, lhydrolyse enzymatique
prservera-t-elle les caractristiques physico-chimiques (DA, DP, Icr) de la chitine,
contrairement lextraction chimique ? Ceci reprsentera-t-il une valeur ajoute ? Les
conditions svres de lextraction chimique dtruisent les autres composs disponibles dans
les coproduits de crustacs, telle que lastaxanthine. La protolyse acide sera-t-elle capable de
prserver lintgrit de ces composs?

Fig.I.28 : Hypothse de liaison entre chitine et protines proposes par Armenta et Guerrero-Legarreta (2009)

54

Chapitre 2 Choix des mthodes &


application aux produits
de rfrence

Lobjectif gnral est destimer les performances de ce nouveau procd et de les comparer au
procd classique. Pour atteindre cet objectif, la composition et les caractristiques physicochimiques des produits doivent tre dtermines. Rappelons-le, la matire premire est
initialement constitue dun rseau dense o chitines et protines sont imbriques. La
principale difficult est de quantifier distinctement ces deux polymres. Pour dterminer les
critres de qualit de la chitine, la prsence des protines constitue galement un obstacle. Ce
chapitre compare les mthodes disponibles dans la littrature et justifie les choix
mthodologiques qui ont t slectionns. Ces choix reposent sur des rsultats danalyses
biochimiques et physico-chimiques appliqus aux produits de rfrence pour notre tude : la
matire premire, les produits commerciaux et les produits dhydrolyse enzymatique modles.

I. Mthodes danalyse de la composition des produits


I.1. Identification et prparation de la matire premire
La matire premire utilise pour cette tude est lexosquelette de crevette blanche Penaeus
vannamei. Les crevettes sont fournies par la compagnie Capitaine Cook et proviennent des
ctes dAmrique Centrale (principalement Equateur). Elles sont reues congeles -18 C.
Les crevettes sont dcortiques 12 C, les carapaces sont ensuite laves puis sches entre
10 et 15 C sous ventilation, 50 % dhumidit relative. Ltape suivante consiste broyer les
carapaces au blender. Les fragments obtenus sont tris sur tamis afin de sparer trois tailles :
infrieur 1 mm, compris entre 1 et 2,5 mm et suprieur 2,5 mm. La matire premire ainsi
obtenue est stocke dans des sachets sous-vide, placs en chambre froide -20 C.
La figure II.1 illustre les parts de produits obtenues par le dcorticage des crevettes. Elles se
rpartissent entre 50 % de chair, 30 % de ttes et 20 % de carapaces (en poids humide).

Fig.II.1 : Rpartition des parts de produits et coproduits de crevettes (en pourcentage de poids humide)

I.2. Matire sche


Pour estimer la part deau dans un produit, 1 2 g d'chantillon sont prlevs et pess dans
une coupelle de poids connu. La coupelle est place 24 h dans une tuve 105 C, puis pese
aprs 30 min de refroidissement. Lexprience est ralise en triplicat (AOAC, 1980).
La teneur en eau est dtermine dans la matire premire et dans les produits d'extraction
chimique et enzymatique. Ses produits sont marqus par une forte hygroscopie.

57

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

ES %

M2M0
* 100
M1 M 0

(II.1)

ES % est la part d'extrait sec, M0 le poids de la coupelle, le poids humide est ajout, M1, et le poids sec final est
de nouveau pes, M2. La teneur en humidit correspond la part complmentaire.

I.3. Teneur en cendres


Le principe de la dtermination de la teneur en minraux repose sur leur rsistance la
chaleur. Environ 1 g dchantillon est pes dans une feuille de papier en aluminium de poids
connu. Elle est replie et place au moins 5 h 600 C. Aprs refroidissement, elle est de
nouveau pese. Le poids des cendres rsiduelles est assimil la teneur en minraux. Chaque
mesure est rpte trois fois (Mthodes de rfrence AOAC, 1980).
M2M0
Cendres %
* 100
M1 M 0
(II.2)
Cendres% est la teneur en cendres, M0 le poids du rcipient, M1 et M2 sont les poids avant et aprs incinration
respectivement.

Pour s'affranchir de l'influence des conditions environnementales (T et P), les supports


(coupelles, creusets, feuille daluminium, etc.) peuvent tre placs 1 h en tuve 105 C, puis
refroidis 30 min dans un dessiccateur avant dtre utiliss. Tous les rsultats sont exprims
par rapport la matire sche.

I.4. Teneur en lipides


Les lipides sont extraits selon la mthode de Folch et al. (1957). Le solvant organique utilis
est un mlange de mthanol/chloroforme (1:2, v/v). Lchantillon analyser et le solvant sont
introduits dans un erlenmayer hauteur de 1:20 (substrat solide/ volume en ml). Aprs 1 h
d'agitation, le produit est filtr sous vide travers un verre fritt d'indice 3. Le filtrat est
introduit dans une ampoule dcanter. Du NaCl 0,9 % (w/v) est ajout hauteur de 0,2 (v/v
total). Le mlange dcante jusqu' l'obtention d'un systme biphasique net. L'ampoule est
dgaze plusieurs fois, puis la partie huileuse, situe dans la phase infrieure, est verse dans
un ballon pralablement pes. Le contenu du ballon est distill sous rotavapor (pression de
220 bars), puis sch sous azote. Enfin le poids du ballon est pes, la teneur en lipides est
calcule par la diffrence de poids.
Les chantillons peuvent tre humides (4 g dans ce cas) ou lyophiliss (1 g) puis dissous. La
seconde option donne des rsultats plus homognes.

Lipides %

M2 M0
M1

(II.3)

Lipides% est la teneur en lipides, M0 le poids du ballon, M1 est la prise dessai et M2 est le poids du ballon
contenant les lipides schs aprs lextraction.

La phase huileuse sche peut tre conserve dans du chloroforme pour subir des analyses
approfondies, sur la nature des acides gras qu'elle contient, en chromatographie.

58

I. Mthodes danalyse de la composition des produits

I.5. Teneur en protines


I.5.1. Dosage de lazote par Kjeldahl (Crooke et Simpson, 1971)
La mthode de Kjeldahl a t dveloppe par Johan Kjeldahl, chimiste danois, en 1883. Son
principe consiste doser la teneur en azote et dutiliser un coefficient de conversion pour
estimer la teneur en protines. Le dosage repose sur trois tapes.
La premire tape du dosage est la digestion acide, appele galement minralisation . La
prise d'essai est de 4 1 g (poids humide), pese dans un tube minralisation. On y introduit
alors 20 ml d'acide sulfurique (H2SO4 96 %) et une pastille de K2SO4/CuSO4 (5/2, w/w) qui
catalyse la raction en augmentant le point d'bullition (Raul, 2009). Le mlange est port
lentement 450 C. La minralisation convertit lazote des composs amines et amides en
ions ammonium NH4+, lesquels se lient aux ions sulfates SO42-. Le reste de la matire est
digr sous forme de CO2 et H20. D'aprs l'quation (II.4), les espces obtenues l'issue de la
raction sont les suivantes:
Norganique + H2SO4 (NH4) 2SO4 + H2O +CO2

(II.4)

Un changement de couleur vers le vert ple ou le bleu indique la fin de la raction. L'tape
dure au minimum 2 h. Elle est suivie d'une neutralisation. Aprs refroidissement, 20 ml d'eau
distille sont ajouts pour stabiliser le milieu, puis suffisamment de NaOH 10 M pour
atteindre un volume final de 80 ml. La forte alcalinit convertie l'ammonium en ammoniac
gazeux (II.5):
(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O

(II.5)

Le tube est plac dans une unit de distillation (Modle K-314, Bchi Labortechnick AG,
Suisse). La distillation transfert l'ammoniac gazeux vers une solution de 20 ml d'acide borique
(H3BO3, 2 %, w/w) en formant un complexe ammonium-borate (II.6):
NH3 + H3BO3 (en excs) NH4 + H2BO3

(II.6)

La dernire tape est la titration de lazote, sous sa forme complexe avec le borate, par
l'acide hydrochlorhydrique 1 M. La solution titrer contient un indicateur color qui vire au
vert lorsque le pH est l'quilibre. Le volume de HCl est alors identique celui de NH4+
(II.7) :
NH4+ + 2H2BO3- + HCl (NH4)Cl + 2H3BO3

(II.7)

Le pourcentage dazote, %N, est donn par la relation (II.8) :

%N

1.4 *V * [ HCl ]
M

(II.8)

V est le volume de HCl vers (en ml), [HCl] sa concentration (gnralement gale 1 g/l), M est la masse
dchantillon introduite dans les tubes (en g) et 14 correspond la masse atomique de lazote. La relation
intgre le facteur 0,1 qui comprend la conversion du volume de HCl en litre et la conversion en pourcentage

Enfin, la teneur en protines dans l'chantillon est dduite de la formule suivante (II.9) :

59

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

% P N * 6.25

(II.9)

La teneur en azote dans les protines a t estime en moyenne 16 %, ce qui correspond


un coefficient de conversion entre azote et protines de 6,25. Bien que communment admis,
ce coefficient est parfois contest, notamment lorsquil est appliqu aux produits marins, ces
derniers tant plus riches en azote. Le coefficient de conversion varierait de 6,25 5,8 0,1
(Gnaiger, 1984).
I.5.2. Mthodes de dosages colorimtriques des protines
Plusieurs dosages colorimtriques servent dterminer la concentration en protines solubles.
Ils partagent le mme principe, bas sur la formation dun complexe avec les liaisons
peptidiques, dtects sous UV. La premire tape consiste solubiliser les protines. Pour les
substrats tels que les carapaces de crustacs, o les protines sont intimement fixes la
chitine, il est ncessaire d'appliquer un traitement alcalin svre pour garantir la solubilisation
totale de la fraction protique. Ce traitement ne doit pas solubiliser la chitine.
Environ 1 g d'chantillon est pes dans un tube dans lequel est ajout 10 ml de NaOH 2 M. Le
tube est port 90 C pendant 1 h. Aprs refroidissement, le contenu du tube est fractionn
par centrifugation 10 C, pendant 10 min 10 000 rpm. La fraction de protines solubilises
se situe dans le filtrat, sur lequel s'effectue le dosage colorimtrique. Le tableau II.1 compare
les caractristiques de diffrents dosages.
Dosage

Principe

Interfrences

Biuret
Formation d'un complexe cuivre/ liaison peptidique/ biuret
(Gornall et al. 1949) (NH2-CO-NH-CO-NH2 compos issu de la condensation de
l'ure) en milieu alcalin. Formation dun complexe violet rose,
lecture 545 nm

Glycrol, certains
peptides, saccharose

Lowry
(Lowry et al. 1951)

Mthode de biuret complte par le ractif de Folin-Ciocalteu


(phosphomolybdate et phosphotungstate) qui se lie avec la Tyr
et le Trp et, dans une moindre mesure, avec la Cys et l'His.
L'absorbance est observe 750 nm.

Forte influence de
certains peptides,
glycrol, saccharose,
EDTA, dtergents

BCA: acide
bicinchoninique

Formation d'un complexe cuivrique trs similaire la raction


2+
du biuret, entre le BCA, Cu et les liaisons peptidiques des
protines.

Thiols Tyr, Cys, Try,


sucres rducteurs, ac.
ascorbique et urique

Bradford
(Bradford et al.
1976)

Le ractif est le bleu de Coomassie, il ragit avec l'Arg et, dans


une moindre mesure, avec l'His, la Lys et les acides amins
aromatiques en milieu mthanolique acide. Labsorbance est
mesure 465 nm.

Forte influence des


dtergents et bases
fortes

Tab.II.1: Caractristiques des principaux dosages colorimtriques des protines (Tyr=tyrosine, Cys=cystine et
Trp=tryptophane, His=histidine, Arg=arginine et Lys=lysine)

La protine de rfrence utilise pour ces dosages est un srum base dalbumine bovine
(BSA). La gamme talon s'tend de 12,5 300 g/ml pour nos exprimentations. Le choix de
cette protine de rfrence est li son accessibilit.
(a) Lowry: Ce dosage repose sur une double raction. Dune part, un complexe cuivreprotine est form partir des atomes dazote des liaisons peptidiques, en condition alcaline
60

I. Mthodes danalyse de la composition des produits

(II.10.a). Ce complexe est oxyd (II.10.b). Dautre part, les ions Cu+ et certains radicaux
dacides amins rduisent le complexe acide phosphotungstique/ acide phosphomolybdique
contenu dans le ractif F-C pour Folin-Ciocalteau (II.11). Le produit obtenu dveloppe une
coloration bleue mesure 750 nm.
Cu2+ + protines [Cu2+-protines]

(II.10a)

Cu2+ + (acides amins)red Cu+ + (acides amins) ox

(II.10b)

Cu+ + (F-C)ox Cu2+ + (F-C)red (bleu)

(II.10c)

Au pralable, deux ractifs sont prpars partir d'un kit Sigma. Le premier est un mlange
d'une solution 2 % de Na2CO3 (dans du NaOH 0,1 N), dune solution 1 % du CuSO4
(dans de l'eau distille) et dune solution de KNaC4H4O6, 2 % (dans de l'eau distille). Les
proportions du mlange se rpartissent respectivement entre 1:1:100 et il n'est plus stable
lorsqu'il se trouble. Le second ractif est le ractif de Folin-Ciocalteu (F-C) base dacide
phosphotungstique et de cuivre.
La prise d'essai pour chaque chantillon ou standard est de 0,5 ml, auquel on ajoute 2,5 ml du
premier mixe de ractifs. Les tubes sont agits et maintenus Tamb 10 min. On ajoute ensuite
25 ml de ractif de Folin-Ciocalteu. Les tubes sont nouveau agits. L'absorbance peut tre
lue aprs 30 min Tamb 745 nm. L'chantillon est reproduit en triplicat.
(b) BCA sur microplaques: les dosages ont t effectus sur des microplaques. Deux ractifs
sont fourmis par Sigma. Le premier correspond l'acide bicinchoninique et le second au
CuSO4, 5H2O. Au pralable, 1 ml du premier ractif est mlang 50 ml du second. La prise
d'essai pour un dosage sur microplaques est de 25 l pour 200 l du mlange des ractifs. Les
microplaques sont places 37 C pendant 30 min. Aprs refroidissement, l'absorbance est
lue 555 nm. L'chantillon est reproduit en triplicat.
Les autres mthodes n'ont pas t testes sur nos produits, de mme que le dosage du
tryptophane 280 nm. En effet, le tryptophane n'est pas un acide amin majoritaire dans la
cuticule de crustacs (Narayan et al. 2010). Chaque mthode colorimtrique est caractrise
par sa sensibilit, son seuil de dtection et ses risques dinterfrence avec d'autres espces.
Des prcautions doivent tre prises en ce sens (Peterson, 1979).
I.5.3. Dosage des acides amins par chromatographie en phase gazeuse
La composition en acides amins est analyse par chromatographie en phase gazeuse (CPGFID). La premire tape consiste d'abord dgrader compltement les protines en acides
amins par hydrolyse acide. Un chantillon lyophilis d'environ 10 mg est pes dans une
ampoule dans laquelle est ajout 200 l de HCl 6 N. L'ampoule est scelle sous vide et place
24 h 110 C dans un bain sec. Puis l'chantillon hydrolys est sch sous azote et dilu
dans 2,5 ml deau milliQ. L'analyse des acides amins est ralise en utilisant la procdure
EZ:Faast (Phenomenex, Etats-Unis) qui consiste en une tape d'extraction de la phase solide,
suivie dune drivatisation et d'une extraction liquide/liquide. La phase organique qui contient
les acides amins drivs est introduite dans une aliquote et analyse par un systme CPG-

61

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

FID (Perkin Elmer Autosystem XL). Les acides amins sont identifis selon leur temps de
rtention et quantifis d'aprs une courbe dtalonnage et leur facteur de rponse par rapport
au standard interne (la norvaline ajoute une concentration de 200 mol/l dans chaque
chantillon).
Lchantillon est reproduit en triplicat et labsence dinterfrences par la prsence de NacGlu
a t vrifie. La technique ne permet pas de quantifier tous les acides amins. Le tryptophane
est dtruit par ltape dhydrolyse acide. Lasparagine et la glutamine sont respectivement
convertis en acide aspartique et glutamique. Larginine nest pas dtecte et la cystine lest
faiblement. Selon lquipement et leur capacit se volatiliser, le taux de recouvrement des
acides amins peut varier. Adams (1974) note un degr de recouvrement de 90 99 % par
CPG, except pour larginine dont le recouvrement nexcderait pas 78 %.

I.6. Teneur en rsidus glycosidiques simples


I.6.1. Dosage colorimtrique de Dubois et al. (1956)
La mthode de Dubois et al. (1956) est utilise pour estimer la teneur en rsidus glycosidiques
totaux. Elle n'est pas spcifique et ragit indiffremment avec les mono-oses neutres, les
aldoses et les ctoses librs par hydrolyse l'acide sulfurique. Cette tape dshydrate les oses
qui forment des hydroxy-mthylfurfural (HMF) partir des hexoses ou des furfurals partir de
pentoses. Ces composs se condensent avec le phnol pour donner des complexes colors (jauneorang).
Les gammes talon peuvent tre prpares partir de glucose, fructose ou mannose, de 50
500 g/ml. Dans chaque tube essai, 500 l de standard ou d'chantillon sont introduits. Puis
1 ml de phnol 5 % est ajout, les tubes sont vortexs et maintenus Tamb 40 min. Puis 5 ml
dacide sulfurique (H2SO4) concentr sont ajouts et aprs 10 min, l'absorbance peut tre lue
au spectrophotomtre 480 nm. L'chantillon est reproduit en triplicat.
I.6.2. Mthode de dosage colorimtrique des osamines
Les osamines ne sont pas concernes par le dosage de Dubois. Deux mthodes, issues du
mme principe, ont t compares. Elles ont t utilises pour estimer la teneur en chitine
dans la paroi de certains champignons ou bactries (Swift, 1973 ; Chen et Johnson, 1983).
La premire tape consiste pratiquer une hydrolyse acide pousse afin de convertir le
polymre en units glycosidiques. Pour cela, 10 mg dchantillon sont introduits dans un tube
Pirex, avec 5 ml de HCl 6 N. Aprs centrifugation, le surnageant est rcupr et neutralis.
(a) Mthode au DMAB Elson Morgan. Un ractif A est prpar par dissolution de 6,1 g
de di-potassium ttraborate ttrahydrate dans 80 ml d'eau distille, ajust 100 ml. Un ractif
B est prpar par ajout de 1,5 ml d'eau distill 11 ml d'acide chlorhydrique concentr (12 N),
auquel on ajoute 87,5 ml d'acide actique glacial. 10 g de para-dimthylamino-benzaldhyde
(DMAB-P5) sont dissous dans le mlange. Cette solution est dilue 10 fois avant utilisation.
La gamme talon est prpare partir de N-actylglucosamine ou de N-actyl-galactosamine.
62

I. Mthodes danalyse de la composition des produits

Une hydrolyse est ralise en ajoutant 50 l de ractif A 250 l de solution ou d'talon. Les
tubes sont chauffs 3 min 100 C, puis refroidis rapidement sous leau courante. 1,5 ml de
ractif B sont ajouts, puis les tubes sont agits et incubs 20 min 37 C. L'absorbance est
mesure 585 nm (ou 550 nm en microplaques) aprs refroidissement des tubes. L'exprience
est ralise en triplicat.
(b) Mthode de Belcher et al. (1954). Les ractifs prparer sont lacide hydrochloridrique 8
N (66,6 ml de HCl 12 N dans 33,4 ml de H20), lhydroxyde de sodium 4 N ( partir de 40 ml
de NaOH 10 N dans 60 ml de H20), dactylactone (avec 2 ml dactylactone + 48 ml de
carbonate de sodium 0,625 M, solution elle-mme prpare partir de 6,62 g de Na2CO3
pur dans 100 ml deau) et de ractif dEhrlich, qui consiste un mlange de 1,6 g de paradimthylaminobenzaldyde dans 30 ml de HCl 12 N.
La gamme talon est prpare partir de 2 mg/ml de N-actylglucosamines ou galactosamine,
les concentrations stalent entre 0,1 et 1 mg/ml. Il est ncessaire de procder une tape
pralable dhydrolyse, 500 l dchantillon ou de standard sont introduits dans des tubes en
verre avec 500 l dHCl 8 N, lesquels sont placs dans un bain sec 100 C une heure. Puis,
la neutralisation est obtenue par ajout de 850 l de NaOH 4 N.
Le dosage consiste prlever 250 l de produit hydrolys, les introduire dans un tube en verre
avec 250 l de ractif dactylactone et 500 l deau distille. Une fois vortxs, les tubes
sont placs en bain-marie 100 C une heure (prendre soin de recouvrir les tubes de papier
daluminium pour la lumire). La temprature du bain est ensuite abaisse 75 C tandis que
les tubes sont refroidis dans la glace. On ajoute alors 1,25 ml dthanol absolu dans les tubes,
puis ils sont voxtxs et placs 75 C. Aprs 5 min, on ajoute doucement 250 l de ractif
dEhrlich. Aprs 30 min, les tubes sont refroidis avant dy ajouter 1,25 ml dthanol absolu.
Labsorbance 520 nm est lue aprs une attente de 30 min o les tubes sont maintenus
lobscurit.
I.6.3. Dosage des rsidus glycosidiques par chromatographie en phase gazeuse
Le dosage des rsidus glycosidiques par CPG est pratiqu selon la mthode de Kamerling et
al. (1975), modifie par Montreuil et al. (1986). Lappareil utilis est un chromatographe HP5890 (Hewlett-Packard), quip dune colonne capillaire apolaire en silice fondue CPSil-5CB
(Chrompack). Les polymres subissent une mthanolyse. Les rsidus glycosidiques sont
ensuite trimthylsilyls afin de leur rendre plus volatils. Enfin, ils sont identifis par CPG
sous forme de glycosides de mthyle O-trimthylsilyss.
Ce dosage ne permet pas de distinguer les glucosamines des N-actylglucosamines, cause de
ltape de mthylsilylation.

63

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

I.7. Teneur en chitines


Lcriture non conventionnelle de chitines au pluriel souligne la varit de molcules
dsignes par ce terme. Gnralement, lobjectif est de connatre la quantit totale de chitine
incluant ses diffrentes formes. Cependant, certaines techniques sadressent une catgorie en
particulier. De nombreuses mthodes de quantification ont t dveloppes. La plus rpandue,
dite de gravimtrie, consiste liminer de lchantillon tout autre compos que la chitine, par
traitement chimique (Black et Schwartz, 1950). La masse de chitine est calcule par
diffrence de poids entre lchantillon initial et lchantillon nettoy (Cf. section II). Cette
technique est destine tous les drivs associs la chitine, except les units glycosidiques
et les oligomres infrieurs au seuil de filtration, aprs le traitement chimique.
Dautres mthodes sont voques par la littrature (Muzzareli, 2003). Cependant, elles ont t
abandonnes au cours du temps. Elles font appel soit la colorimtrie (dosage des osamines,
mthode peu reproductible et de faible recouvrement), soit au dosage de lacide actique, qui
est libr lors de lhydrolyse de la chitine (Holan, Votruba et al. 1980). Dautres mthodes
indirectes permettent destimer le degr de puret en chitine. Elles vont tre abordes dans la
section III.

II. Mthode dextraction de la chitine


II.1. L'extraction chimique
Selon le principe dcrit par la section VI du chapitre 1, l'extraction chimique consiste en une
dminralisation acide et une dprotinisation basique. Le protocole adopt est inspir de
l'tude de Tolaimate et al. (2003).
La matire premire est prpare selon la description en I.1. Puis, environ 3 g sont prlevs et
mlangs avec 30 ml de HCl 1 M dans un tube. Il est plac sous agitation 1 h Tamb. Pendant
cette tape, le CO2 est limin sous forme gazeuse, c'est pourquoi le tube doit tre ouvert. Le
contenu du tube est ensuite filtr sur toile filtrante et rinc abondamment l'eau distille. Le
retentt est introduit dans un flacon en Pirex, dans lequel sont ajouts 30 ml de NaOH 1,25 M.
La dprotinisation dure 2 h dans un bain marie 90 C. Le contenu du flacon est nouveau
filtr sur toile filtrante et rinc abondamment l'eau distille. Le degr de dprotinisation
peut tre amlior par une tape intermdiaire, au bout d'une heure, de filtration et rinage.
Quand l'eau de rinage n'est plus colore, l'eau distille est remplace par un volume de 20 ml
de peroxyde d'hydrogne (H2O2) pour blanchir le produit. Un ultime rinage l'actone
permet d'entrainer les impurets lipidiques rsiduelles. Le filtrat est alors transfr dans une
coupelle pralablement pese qui est place en tuve 90 C pendant une nuit. Le nouveau
poids de la coupelle, contenant le produit sec, permet de dduire le rendement massique
daprs la formule gnrique (II.11) :

Ym %

Mf
* 100
Mi

Chaque extraction chimique est ralise en triplicat.


64

(II.11)

II. Mthode dextraction de la chitine

II.2. L'extraction enzymatique par protolyse acide


La mise au point du protocole d'extraction enzymatique de la chitine sinspire des tudes
dcrites dans le chapitre 1, section VII.2. L'accent est port sur la fusion de l'tape de
dminralisation et de dprotinisation en une seule tape en milieu acide. Nous avons
slectionn la pepsine pour raliser la protolyse acide.
La premire tape consiste donc en la prparation du milieu de ractif. Le solvant choisi est
l'acide phosphorique, H3PO4. La concentration de la solution est calcule de faon atteindre
les conditions stchiomtriques de la raction II.12, avec le carbonate de calcium contenu
dans la matire premire. Le pH se stabilise autour de 2 lorsque la raction est l'quilibre
(pKa = 1,9). Ce pH concide avec l'activit optimale de la pepsine.
CaCO3 + 2H3PO4 Ca(H2PO4) 2 + CO2 + H2O

(II.12)

La prise d'essai de matire premire est de 5 g environ, ce qui reprsente 1,125 g de CaCO3.
Le solvant est ajout selon le ratio 1:5 (w/v). Par consquent, 25 ml d'acide phosphorique
0,9 M sont ajouts au 5 g de matire premire, dans un erlenmayer pralablement pes. Le
mlange est chauff 40 C. Gnralement, les paramtres du procd sont stabiliss autour
de 40 C, concernant la temprature, et autour de 2 pour le pH, en 7 2 min. L'enzyme est
alors introduite dans le milieu ractionnel. Ce moment correspond au dmarrage de
l'hydrolyse enzymatique (t=0). Ds lors, l'erlenmayer est plac sous agitation magntique, en
tuve (Fig.II.2). Diffrentes concentration en enzyme et diffrentes dures d'hydrolyse seront
appliques. Puis le contenu de l'erlenmayer est filtr sur toile filtrante (0,45 nm) et rinc
abondamment l'eau distille.

Fig.II.2 : Hydrolyse enzymatique d'exosquelette de crevette par la pepsine en milieu maintenu acide par H 3PO4

Le rsidu solide retenu par la toile filtrante est transfr dans une coupelle de poids connu,
laquelle est place dans une tuve 90 C pendant une nuit. Le poids est alors nouveau pes
et permet de connatre la masse de produit rcupr. Cette partie correspond la chitine et aux
ventuels protines et minraux rsiduels, qui n'ont pu tre limins. Enfin, le rendement
massique est mesur par gravimtrie.
D'autre part, la phase soluble filtre est neutralise par de la soude 10 M. Le volume ajout
pour atteindre la neutralisation est not. Lchantillon est ensuite lyophilis pour des analyses
postrieures.

65

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

III. Caractrisation qualitative des produits


III.1. Mesure du degr dactylation
DA (%) =

FA
*100
FD FA

(II.13)
Le degr dactylation de la chitine correspond la fraction molaire moyenne des units de Nactyl D-glucosamine par rapport au nombre total dunits (II.13). De nombreuses mthodes
ont t dveloppes pour dterminer le DA. Kasaai (2010) compare les avantages et
inconvnients de chacune et cible les gammes de DA auxquelles elles sappliquent.
III.1.1. Rsonance magntique nuclaire du liquide 1H
La RMN aide comprendre comment les structures molculaires sont organises. Lorsque les
noyaux sont soumis un champ magntique, produit par un aimant, les interactions entre eux
provoquent des rsonnances. Elles sont lies au spin, I , qui est une grandeur intrinsque
des noyaux atomiques. Les noyaux retrouvent leur stabilit au bout dune dure appele temps
de relaxation. La RMN mesure lintensit des frquences mises pendant le temps de
relaxation. Or ces frquences sont caractristiques de lenvironnement du noyau. Les atomes
voisins causent un dplacement chimique spcifique, not (Rouessac et al. 2004).
20 mg de chitine sont solubiliss dans 1 ml de DCl (7,6 N dans D2O, Euriso-top) sous
agitation magntique temprature ambiante pendant 12 h. Lanalyse RMN 1H est ralise
300 K laide dun spectromtre Bruker ALS300 (300 MHz, rfrence TMSP 0,00 ppm). Le
DA est dtermin selon la mthode de calcul dcrite par Einbu et Varm (2008).

DA(%)

( IH 1 A I H 1 A H 1D I H 1 A ) I H 2 D
( IH 1 A I H 1 A H 1D I H 1 A )

*100
(II.14)

Un groupe datome est identifi par son , connue grce des produits de rfrence (Tab.II.2).
Type de proto ou carbone
H1 (GluNAc)
H1 (GluNH2)
H2 (GluNH2)
H2 (GluAc)
H3 (GluNH2)
H3 (GluNAc)
H3, H4, H5, H6, H6
HN-COCH3
CH3COOH (AcOH)
C1
C2
C3
C4
C5
C6
N-CH3 (C7)
N-C=O (C8)

Position (, ppm)
4,62 - 4,85
4,85 4,97
3,18 3,24
3,38 3,65
3,52 3,87
3,52 3,65
3,74 4,34
1,95 2,09
2,09 2,11
102,7 105,7
55,2 57,6
73,1 75,7
80,9 85,7
73,1 75,7
59,6 60,8
22,8 23,3
173,6 173,8

Tab.II.2 : Dplacements chimiques des


protons et carbones en RMN (Kasaai,2010)

66

Fig.II.3 : Spectre 1H RMN de chitosan, 600 MHz, en D2O,


65 C, (Yang et Montgomery, 2000)

III. Caractrisation qualitative des produits

La figure II.3 montre le spectre de RMN 1H du chitosan. Labsence de proton mthyle entre
1,0 et 1,5 ppm serait un gage de puret (Al Sagheer et al. 2009). Lintensit des frquences est
lie la quantit dudit groupe datomes, lanalyse qualitative est donc possible. De plus, cette
technique peut tre utilise pour distinguer les allomorphes de la chitine et (Cardenas et al.
2004).
III.1.2. Rsonance magntique nuclaire du solide en 13C et 15N
Les mesures de degr dactylation par RMN du liquide 1H sont compares des mesures
effectues en RMN du solide 13C et 15N. Le temps dacquisition est plus long pour la RMN du
solide, en particulier celle du 15N. Le spectromtre utilis est un DRX AVIII 400 MHz,
accompagn dune sonde 4 mm CPMAS H/X. La temprature est de 20 C et la rotation de 9
KHz. La rfrence externe de dplacement chimique est la glycine (13CO = 176,03 ppm,
15NH = 110 ppm). En RMN du 13C, le temps de contact est de 1 ms (AQ= 44 ms, D1= 5 s,
Ns= 8 192). En RMN du 15N, il est de 2 ms (AQ= 44 ms, D1= 1 s, Ns= 31 7440 pour la
chitine commerciale et 256 000 pour le produit dhydrolyse).
III.1.3. Spectroscopie infrarouge transformation de Fourrier - FTIR
Cette technique simple mettre en uvre, est largement utilise pour tudier la composition
et la structure de la chitine, pour distinguer la forme de la forme (Duarte et al. 2002 ;
Cardenas et al. 2004) et parfois pour dterminer le degr dactylation (Einbu, 2007 ; Ng et al.
2006). Le principe de la spectroscopie infrarouge se base sur les missions de vibrations entre
deux atomes. Elles sont spcifiques chaque environnement atomique. Ces vibrations sont
identifies selon leurs frquences.
Pour la chitine pure, ces frquences ont t identifies et commentes par de nombreuses
tudes, dont lune des premires est celle de Pearson et al. (1960). Le tableau II.3 situe les
absorbances des principales bandes caractristiques de la chitine :
-1

Absorbance (cm )
3450
3360
2920, 2880, 1420,
1275, 1245
1730
1660
1560
1590
1415, 1320
1380
1255
1150-1040
850, 838

Structure
OH, groupe hydroxyle
NH, vibration tendue
CH2 (symtrique ou asymtrique)
du cycle pyranose
Groupe carbonyle
C=0 du groupe amide (I)
NH du groupe amide, vibration
replie
NH2 de groupe amine
OH et CH du cycle
CH3 du groupe amide
Groupe C-O
-C-O-C- de la liaison glycosidique
Groupe CH3COH

Tab.II.3 : Pics caractristiques en FT-IR de la chitine (Pawlak et al. 2003)

Il faut ajouter ce tableau la prsence systmatique du doublet 1 626 cm-1 et 1 663 cm-1,
associ la chitine et attribu aux vibrations entre les groupes C-N et C=O de lamide 1aire,
67

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

lis par un pont hydrogne aux groupes OH. Lapparition dun pic 1 656 cm-1 correspond
un tat amorphe, o les vibrations dtectes correspondent aux liaisons entre lamide 1aire et le
groupe C=O. Les bandes 3 474 et 3 434 cm-1 indiquent les vibrations de groupes hydroxyles.
De larges bandes entre 3 500 et 1 650 cm-1 indiquent que ces groupes sont soit libres, soit
impliqus dans des liaisons hydrognes faibles. Des bandes 1345 et 1344 cm-1 peuvent
correspondre respectivement aux vibrations de CO-NH et CH3 dformes symtriquement.
Une bande 1 557 cm-1 indiquerait la vibration entre N-H dun amide 2aire dform. Enfin,
lintensit 1159 cm-1 est modifie lorsque les chanes sont rduites par dpolymrisation.
(Ravindra al. 1998 ; Duarte et al. 2002 ; Al Sagheer et al. 2009).
La spectroscopie FTIR permettrait de dterminer le degr dactylation. Le principe repose
sur le rapport des aires entre bandes caractristiques de la N-actylglucosamine, de la
glucosamine ou de la chitine. Plusieurs formules sont proposes, selon les tudes (II.4) :
Formule
A1550/A2878
A1655/A2867
A1655/A3450
A1554/A897
A1554/A3450
(A1655 + A1630)/A3450
A1626/A2877

Source
Sannan et al. 1978
Miya et al. 1980
Moore et al. 1980 ; Domszy et al. 1985
Miya et al. 1985
Baxter et al. 1992, Roberts et al. 1992
Shigemasa et al. 1996
Duarte et al. 2002

Tab.II.4 : Exemples de le relations employes pour dterminer le DA via la spectroscopie FT-IR

Le mode opratoire consiste gnralement broyer 1 mg dchantillon avec 100 mg de KBr


(Fluka). Le mlange est compact sous presse afin de former une pastille. Celle-ci est place
dans le spectromtre, sous le faisceau de rayons infrarouges. Il est important dliminer
lhumidit lintrieur du spectromtre avant la prise de la mesure. Lappareil est un Nicolet
iS10 de Thermo Scientific avec un accessoire Smart iTR (pour l'analyse ATR) et le logiciel
est OMNIC 8,1. Lnergie absorbe entre 1 200 et 3 000 cm-1 est enregistre. Les spectres des
chantillons sont alors compars entre eux et aux standards.

III.2. Mesure du degr de polymrisation


La section IV du chapitre 1 explique le lien entre la longueur de la chane exprime par le
degr de polymrisation et la masse molaire. Cette dernire est estime via la mesure de la
viscosit intrinsque, laide dun viscosimtre capillaire, selon lquation de MHS (Cf.
Chapitre 1.IV.2) :
[] = K*Mva

(II.15)

Pour rappel, K et a sont deux constantes, la viscosit rduite et Mv la masse molculaire


viscosimtrique. Les constantes sont dtermines partir dune courbe qui exprime le log de
en fonction du log de M (tablie grce des solutions de masses molculaires fixes). La
constante a correspond la pente de la droite et K correspond la valeur de lordonne
lorigine. Elles varient selon la temprature ambiante, les caractristiques du solvant et du
produit. Pour cette tude, les coefficients utiliss sont ceux tablis par Poirier (2000) 0,95 et
7,6*10-5 dl/g respectivement. La viscosit rduite est dtermine par un viscosimtre

68

III. Caractrisation qualitative des produits

capillaire dUbbelhode. Des solutions de diffrentes concentrations en chitine sont prpares


et le temps dcoulement entre les deux repres (Fig.II.4) est not pour chacune des solutions.

Fig.II.4 : Viscosimtre capillaire dUbbelhode

La viscosit rduite correspond la viscosit intrinsque lorsque les concentrations tendent


vers zro. On peut alors utiliser la formule II.15 pour dterminer Mv.

III.3. Mesure de lindice de cristallinit


Lindice de cristallinit (ICr) indique la proportion de zone cristalline dans lchantillon de
chitine (Chapitre 1, section IV.1). Lindice ICr se dtermine par diffraction aux rayons X.
Cette technique distingue les zones cristallines des zones amorphes.
Les diagrammes de diffraction ont t enregistrs sur un diffractomtre D8 Discover de
Bruker-axs (Karlsruhe, Allemagne) toutes les 10 minutes. La radiation (Cu K1 = 1,5405 ),
produite dans un tube cuivre, scell 40 kV et 40 mA, a t slectionne et paralllise par
l'utilisation de miroirs de Gobl croiss et collimats pour produire un faisceau de 500 m.
Les donnes de diffraction ont t recueillies en utilisant un dtecteur deux dimensions
GADDS. Les chantillons sont placs entre deux feuilles de ruban-adhsifs afin de prvenir
d'une perte d'humidit.
Deux mthodes sont rpertories dans la littrature pour dterminer lindice ICr daprs les
rsultats de diffraction. Une dconvolution est pratique partir des spectres dintensit des
radiations. Cette opration consiste sparer distinctement chaque pic et dterminer chacune
de leur aire. Les pics associs aux zones amorphes et cristallines ont bien t rfrencs
(Osorio-Madrazo et al. 2011)
- La mthode de Focher et al. (1990) consiste identifier le pic dintensit maximale,
not I110, ( 2 = 20 dans le plan de rflexion (110)h) et lintensit du pic reprsentatif
des hydrates amorphes, not Iam (autour de 2 = 16) :

ICr ( I 110 Iam) / I 110


-

(II.13)

La seconde se base sur le rapport entre la somme totale des aires des zones cristallines
sur la somme totale des aires.

Jaworska et al. (2003) comparent les deux mthodes et mettent en vidence leur manque de
corrlation. La fiabilit de la premire mthode semble dpendre la structure de

69

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

lchantillon tandis que la seconde semble plus cohrente (Osorio-Madrazo et al. 2010).

III.4. Caractrisation des proprits thermiques


III.4.1. Analyse thermogravimtrique (ATG)
Le principe de cette mthode repose sur la stabilit thermique des produits. Lchantillon est
dpos dans une coupelle pralablement pese. Elle est introduite dans un four, chauff
progressivement par induction. Le poids est mesur rgulirement pour suivre la perte de
masse en fonction de l'augmentation de la temprature.
L'ATG s'applique aussi bien des composs purs quhtrognes. Pour cette tude, les
produits analyss sont la matire premire, lexosquelette de crevettes lav, sch et broy
finement (<1 mm), la chitine commerciale (Mahtani), la N-actylglucosamine, la glucosamine
et le chitosan commercial (Sigma). Enfin, les produits issus dhydrolyses enzymatiques sont
analyss, la fois les fractions solubles et insolubles. La partie insoluble, contenant la chitine,
est analyse soit brute soit traite par nettoyage chimique (NaOH 1,25 M, 1 h 90 C). Cette
tape rduit efficacement la teneur en protines et sensiblement la teneur en minraux. Elle
permet donc dobtenir une chitine purifie si la teneur en minraux du produit est faible.
Lappareil utilis est le modle TGA 2050 de TA Instruments. Les chantillons sont pess sur
une nacelle en alumine pralablement pese. Le dispositif gnral de lATG est reprsent par
la figure II.5. Le programme de la monte en temprature est le suivant :
monte en temprature initiale de 10 C/min jusqu 125 C
10 min de stabilisation thermique 125 C
1 C/min jusqu 700 C sous azote
10 min de stabilisation thermique 700 C.

Fig.II.5 : Dispositif danalyse thermogravimtrique (Source Web, Wikipedia)

70

III. Caractrisation qualitative des produits

LATG est ralise sous azote afin dviter loxydation des produits (Gartner & al. 2010). Les
rsidus secondaires produits sous azote sont carbons tandis que loxygne produit des gaz
simples (Aggarwal et Dollimore, 1998).

III.5. Lanalyse lmentaire


Lobjectif de lanalyse lmentaire est de dterminer les proportions massiques de chaque
lment organique dun produit. Cette analyse peut tre utilise pour caractriser un produit,
notamment la chitine et ses drivs. Schimmelmann (2011) a largement tudi les proportions
de carbone, dazote et doxygne dans de nombreux arthropodes, terrestres et marins, dans
diffrents cosystmes. La rpartition varie selon lorigine et les caractristiques de la source.
Plusieurs dispositifs existent, celui utilis dans cette tude est un analyseur lmentaire de
type Flash EA 1112 NC (Interscience, Pays-Bas). Son principe repose sur une analyse
chromatographique des gaz produits par une combustion de l'chantillon trs haute
temprature. Chaque atome, par ractions doxydorductions en prsence de catalyseur, est
libr sous forme molculaire unique et analys par un dtecteur TCD. Les chantillons sont
introduits dans un passeur d'chantillon automatique MAS 200R. La programmation et
l'enregistrement des rsultats sont entirement contrls par le logiciel Eager 300. La prise
d'essai est de 1 3 mg dchantillon sec. Elle est pese dans une micro-coupelle en tain,
places en tuve 70 C une nuit, avant l'analyse.

III.6. Colorimtrie
Lintensit de la coloration des produits obtenus a t observe par un spectrocolorimtre
CM-2500d, de source de lumire D65, 10 C (Konica Minolta). La calibration repose sur le
blanc et le noir. Daprs les recommandations de la Commission Internationale de lEclairage
(CIE, 1976) les facteurs de rflexions L*, a* et b* sont mesurs de 400 700 nm. L* traduit la
clart de la lumire (L* = 0 pour le noir et L* =100 pour le blanc). Les valeurs a* et b*
indiquent respectivement lintensit vers le rouge et de jaunes lorsquelles sont positives et
vers le vert et le bleu lorsquelles sont ngatives (Valente et al. 2011). Le facteur WI indique
galement lintensit vers le blanc.

IV. Application, comparaison et slection des mthodes


La littrature propose de nombreuses mthodes pour mesurer le degr de puret en chitine et
son degr dactylation. La majorit dentre elles ncessitent une tape pralable de sparation
de la chitine des protines. Cette opration est dlicate et des carts de rsultats sont observs
en fonction des mthodes employes. Comparer et tablir quelles sont les mthodes les plus
pertinentes a t une priorit de ce travail de thse. Pour cela, elles ont t appliques la
matire premire, aux produits commerciaux ou aux produits dhydrolyse enzymatique.

71

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

IV.1. Composition de la matire premire


Suite au schage froid de la matire premire (Cf. I.1), la teneur en eau est comprise entre
10 et 20 %, quelle que soit la granulomtrie des fragments. Pour la suite de ltude, les teneurs
de chaque compos, seront exprimes en pourcentage de produit sec.
La quantit de cendres, dtermine par l'incinration, varie de 19 % 28 % (en poids sec),
selon des lots de matire premire. La moyenne est de 24,2 0,7 %. Les teneurs en lipides et
rsidus glycosidiques totaux sont respectivement de 3,6 0,4 % et 2,7 0,2 %.
IV.1.1. Quantification des protines
La teneur en protines s'est distingue par une trs forte variation selon la mthode employe
(Tab.II.5). La proportion de protines est estime 36,7 0,1 % ; 14,8 1,1 % ; 30,3 4,0 %
et 42,9 2,9 % par le dosage de Lowry, au BCA, par CPG et par la mthode Kjeldahl
respectivement.
Mthodes

Lowry

BCA

CPG

Kjeldahl

Nb d'exp (en triplicat)

Moyenne cart-type

36,7 0,1 %

14,8 1,1 %

30,3 4,0 %

42,9 2,9 %

Tab.II.5 : Rsultats de la teneur en protines comparaison des mthodes

Lors de la description des mthodes, les limites de chacune ont t souleves. Le dosage par
Kjeldahl est indirect. Il doit tenir compte de lestimation de la quantit de chitine et des
coefficients de conversion entre la proportion dazote associe aux protines dune part et
celle associe la chitine dautre part. Des interfrences biaisent le dosage au BCA et dans
une moindre mesure le dosage de Lowry. Enfin le dosage des acides amins par CPG sousestime la quantit de protines totale car tous ne sont pas dtects par cette mthode.
Cependant, il est possible d'estimer la proportion manquante par comparaison avec une
mthode de rfrence.
Une analyse de la composition en acides amins a t ralise par un laboratoire extrieur,
Lareal (Saint-Nolff, 56). Ces rsultats ont t compars ceux obtenus au laboratoire STBM
(Tab II.6).
La mthode employe par le laboratoire Lareal ne dtecte pas la quantit d'alanine,
contrairement celle du laboratoire STBM. Il faut galement tenir compte des incertitudes
lies aux mesures et l'htrognit de la matire premire. L'cart-type atteint jusqu
4,0 g/100 g au laboratoire STBM et 0,2 g/100 g au laboratoire Lareal. Par consquent, les
diffrences de quantits en acides amins observes entre les deux mthodes ne sont pas
significatives.

72

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

Acides amins

STBM
g/100g (poids sec)

Arginine
Alanine
Glycine
Valine
Leucine
Isoleucine
Thronine
Srine
Proline
Aspartique ac.
Mthionine
Glutamique ac.
Phnylalanine
Lysine
Histidine
Tyrosine
Cystine
hydroxyproline
Tryptophane
SOMME

/
3,05
2,79
2,10
2,45
1,48
1,64
1,16
2,57
3,81
0,22
5,26
2,40
0,73
0,00
0,61
0,00
/
/
30,27

Lareal

% (acides amins)
/
10,1
9,2
6,9
8,1
4,9
5,4
3,8
8,5
12,6
0,7
17,4
7,9
2,4
0,0
2,0
0,0
/
/
100

g/100g (poids sec)

% (acides amins)

2,25
/
2,62
1,98
1,98
1,26
1,59
1,87
2,32
3,48
0,47
4,56
1,94
1,62
0,90
1,59
0,32
<0,2
0,23
31,18

7,2
/
8,4
6,4
6,4
4,0
5,1
6,9
7,4
11,2
1,5
14,6
6,2
5,2
2,9
5,1
1,0
0,6
0,7
100

Tab.II.6 : Composition en acides amins dans la matire premire comparaison entre laboratoires

Au regard de la comparaison entre ces deux analyses (Tab.II.6 et Fig.II.6), chacune est
incomplte. Le laboratoire Lareal quantifie mieux la cystine et la mthionine (les acides
amins soufrs), le tryptophane, lhistidine et l'arginine, contrairement au laboratoire STBM.
L'arginine reprsente plus de 7 % des acides amins, tandis que les autres acides amins
prcdemment cits sont moins prsents, entre 1 et 3 %. linverse, lalanine nest pas
dtecte par le laboratoire STBM, alors quelle reprsente prs de 10 %. En compltant
l'analyse de Lareal par les rsultats du laboratoire STBM pour lalanine, la somme dacides
amins atteint 34,2 g/100 g. Cette quantit est encore sous-value. Par exemple, les acides
amins soufrs ne supportent pas lhydrolyse acide, un traitement par lacide performique
serait mieux adapt selon Armenta et Gueretto-Lagarreta (2009).

Fig.II.6 : Composition en acides amins de l'exosquelette de crevette comparaison par laboratoires

Le tableau II.6 et la figure II.6 illustrent les diffrences de quantit entre chaque acide amin
dans les exosquelettes de crevettes. Lacide glutamique et la glutamine regroups, ainsi que
73

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

lacide aspartique avec lasparagine, sont majoritaires. La mthionine et la cystine sont


minoritaires, rappelons cependant que les deux mthodes les sous-estiment. Fall (2011) rvle
la prsence de 1,5 % de taurine et 0,2 % dornithine dans la chair de crevette nordique.
Cependant, la composition dans les carapaces est diffrente. Armenta et Guerrero-Legarreta
(2009) mesurent 2,0 % de taurine dans la carapace de P. vannamei.
Percot et al. (2003) dterminent galement la composition en acides amins de coproduits de
crevettes Parapenaeopsis stylifera. Leurs mesures sont du mme ordre de grandeur que la
composition de lexosquelette de P. vannamei, except pour la leucine et l'isoleucine.
Bien quil sous-estime la quantit de protines, le dosage par la CPG est une mthode qui ne
ncessite pas de sparation pralable de la chitine, contrairement aux autres mthodes. De
plus, ce dosage ne subit pas interfrences. Enfin, il apporte des informations complmentaires
sur la nature des acides amins qui composent la fraction protique. Par consquent, cette
mthode est slectionne pour estimer la quantit de protines minima. En tenant compte de
cette sous-estimation et des donnes de la littrature (Shahidi et Synowiecki, 1991 ;
Synowiecki et Al-Khateeb, 2003 ; Valdez-Pea et al. 2010 ; Gartner et al. 2010), la proportion
de protines dans la matire premire est estime proche de 40 %. Ceci signifie quun facteur
de conversion de 1,17 % relie le dosage par CPG la valeur dite relle .
IV.1.2. Caractrisation complte de la composition de la matire premire
Pour dterminer la teneur en chitine, plusieurs mthodes ont t appliques et compares.
Gnralement, la mthode privilgie est par la gravimtrie, grce l'extraction chimique. Ce
protocole a fait l'objet d'une mise au point, afin de maximiser llimination des protines et
minraux, tout en limitant la perte en chitine. Il est adapt spcifiquement aux exosquelettes
de crevettes P. vannamei. Par cette mthode, la quantit de chitine se situe autour de 28,2 %
(n = 3, chacun en triplicat). Dautres mthodes de quantification de la chitine seront dcrites
et appliques aux produits dhydrolyse enzymatique au cours des sections suivantes.
Le tableau II.7 synthtise et dresse la rpartition de la composition de la matire premire.
Constituants

Protines

Chitine

Minraux

Lipides

Oses totaux

C/N

Gamme
Moyenne

30 50 %
40 %

24 32 %
28,2 %

19 28 %
24,7 %

/
3,6 %

/
2,7 %

4,3

Tab.II.7 : Composition globale des exosquelettes de crevette P. vannamei

Les compositions dtermines par des tudes similaires (Shahidi et al. 2003 ; Waldeck et al.
2006 ; Kurita, 2006) montrent galement une grande variabilit des proportions. Elles varient
en fonction des espces, de lge, du genre et peuvent fluctuer en fonction des saisons et des
conditions environnementales.
Lidentification de la nature des minraux et leur quantification na pas t ncessaire pour
cette tude. Ces informations sont parfois voques (Percot et al. 2003 ; Cho et al. 1998).
Lanalyse lmentaire indique que llment majoritaire est le calcium (15,3 30,5 % en

74

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

poids sec), le second est le magnsium (1,0 2,0 %), le reste est constitu de traces de
phosphore, sodium et potassium (Tolaimate, 2003).
Composition par catgorie de taille
Pour les besoins des expriences suivre, les cuticules de crevettes sont broyes et tries par
catgorie de taille. Linfluence de la taille des fragments sur la composition de la matire
premire a t vrifie. Deux tamis de 2,5 mm et 1 mm sparent les fragments. La figure II.7
prsente la composition des fragments. Au regard de leurs variances, les compositions des
deux catgories de taille de fragments ne sont pas significativement diffrentes. Toutefois, la
part de minraux semble plus leve parmi les gros fragments. Pour cette catgorie, la
variance est plus importante, tous composs confondus. Ceci sexplique du fait que le tamis
de 2,5 mm retient des fragments plus htrognes.
50

fragments
< 1mm

Quant en %

40

fragments
> 2.5mm
44,4

30
33,5

42,2

34,2

20
22,1

23,7

10

0
Minraux

Total acides amins

Reste

Fig.II.7 : Principaux composs prsents dans la matire premire en fonction de la catgorie de taille (n > 3)

Ces rsultats ne remettent pas en cause la composition gnrale de la matire premire. Bien
que faibles par rapport la moyenne en minraux et en protines, les proportions de ces
chantillons respectent la gamme prsente dans le tableau II.7. Elles montrent galement
lhtrognit du substrat, notamment pour les plus gros fragments.

IV.2. Composition des produits commerciaux


Les mthodes de caractrisation de la composition sont appliques la chitine commerciale,
sur trois rfrences diffrentes (Tab.II.8).
Fournisseurs
France Chitine
Sigma
Mahtani

Extrait sec (%)

Cendres (%)

Protines (%)

Osamines (%)

Couleur

96,4 0,1
95,3 1,7
97,1 0,3

2,7 0,1
0,5 0,4
4,2 0,0

0,9 0,2
0,2 0,0
0,9 0,1

70,7 2,9
71,0 5,7
/

Crme
Blanc
Ivoire

Tab.II.8 : Comparaison des compositions de la chitine commerciale (% en poids sec)

Le tableau II.8 indique que la teneur en eau atteint jusqu 5 %, celle des protines est
infrieure 1 % et celle des cendres varie dun produit lautre. Le dosage des osamines,
incluant la glucosamine qui constitue la chitine, a t test pour estimer le taux de puret du

75

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

polymre. Les teneurs mesures se situent autour de 70 %. Ces rsultats sont suprieurs aux
rendements obtenus dans les travaux de Plassard et al. (1983) sur des ectomycorhizes16, dont
les teneurs taient comprises entre 50 et 60 %. Au contraire ces rsultats sont infrieurs aux
teneurs atteintes par Rao (1987), dont le rendement avoisine les 90 %. En effet, les tudes de
Chen (1983) expliquent que lhydrolyse acide occasionne la perte dunit de NacGlu et Glu.
Cette dgradation a t estime entre 7 et 10 %. Bien que les produits analyss prsentent une
puret de plus 95 %, les rsultats des teneurs en osamines montrent une perte de plus de 10 %.
De plus la reproductibilit de la technique sest rvle peu prcise. Par consquent, ce dosage
na pas t retenu pour estimer le taux de puret.

IV.3. Composition des produits de lextraction enzymatique


IV.3.1. Les rsidus insolubles de la cintique de rfrence
Afin dexpliquer la dmarche mthodologique de caractrisation des produits dhydrolyse
enzymatique, nous prendrons comme exemple la cintique dextraction par 25 % de pepsine
(par rapport la quantit de protine dans la matire premire) 40 1 C, 6 h en tuve.

Quantit (en g/100 g)

La figure II.8 prsente lvolution au cours du temps des quantits rsiduelles de minraux et
de protines dans la fraction insoluble.

40

minraux

35

protines

30

autres

25
20
15
10
5
0
MP

10

20

30

60

120

180

240

360

Dure d'hydrolyse (min)


Fig.II.8 : Cintique dhydrolyse enzymatique (25 % de pepsine/prot 40 C taille < 1mm)

Les cintiques dlimination des minraux et des protines sont mises en vidence. Le produit
solide final, 6 h dhydrolyse, se caractrise par la prsence de 3,5 g et 0,3 g (pour 100 g de
produit) de protines et minraux rsiduels respectivement. Daprs la composition de la
matire premire en protines et en minraux, leur degr dlimination atteint respectivement
91 % et 99 %. La cintique de dminralisation semble plus rapide que la cintique de
dprotinisation (Cf. Chapitre 3). Pour estimer la quantit de chitine, deux mthodes sont
compares :
16

Association symbiotique entre champignons et racines de plantes

76

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

(a) daprs le bilan massique. Si la partie insoluble est compose uniquement de protines,
de minraux et de chitine. Ds lors que les quantits de protines et de minraux sont
connues, celle de la chitine peut tre dduite. Cette mthode est valable en considrant que la
quantit des autres composs (les glucolipides, glucoprotines ou lipides rsiduels) est
ngligeable. La partie autres de la figure II.8 quivaut alors la quantit de chitine dans le
produit. Cependant, le graphique montre que lhypothse nest pas valable pour les dures
courtes dhydrolyse. Lvolution de la teneur en lipides est difficile suivre en raison de leurs
faibles quantits par rapport limportance de lcart-type. Ds 10 min dhydrolyse, la teneur
en lipide dans le rsidu solide est de 1,8 % et elle atteint, jusqu 0,6 0,4 % pour le produit
de 6 h dhydrolyse. La littrature rapporte que les pigments rsiduels sont trs difficiles
sparer (Percot et al. 2003a). Concernant les rsidus glycosidiques, du fait de leur taille, ils
sont rapidement limins suite au rinage et la filtration. Ils ninterfrent donc pas dans cette
mthode. La question se pose davantage pour les glycoprotines. Au regard de la figure II.8,
la part des autres composs se stabilise partir de 60 min dhydrolyse. Avant cette dure,
la composition du rsidu solide semble tre trop riche en impurets. La mthode
sappliquerait donc aux produits au-del de 60 min dhydrolyse et serait dautant plus lgitime
mesure que la dure augmente.
(b) la purification par lavage au NaOH. Le principe de cette technique repose sur
lextraction chimique en considrant que les impurets majoritaires sont les protines. Ltape
de dprotinisation chimique est applique. Un volume 10 fois suprieur de NaOH 1,25 N est
ajout lchantillon dans un tube plac 1 h 90 C. Daprs la figure II.8, les protines sont
effectivement les impurets majoritaires. Cependant, les minraux sont prsents en moindre
mesure. Pour ces produits, la teneur en minraux est comprise entre 4,8 et 0,9 %. La perte en
minraux aprs le traitement au NaOH est de 29 1 %. La teneur rsiduelle en minraux dans
les produits nettoys est donc comprise entre 1,4 et 0,4 %. Comme la mthode prcdente,
celle-ci est donc davantage lgitime lorsque les produits contiennent peu dimpurets, c'est-dire pour les produits issus de plus longues dures dhydrolyse.
La description de ces deux mthodes met en vidence leur limite vis--vis de la composition
des produits. Pour les produits les moins hydrolyss, donc moins purs, lestimation de la
quantit de chitine est biaise. Dautres mthodes sont donc requises pour suivre lvolution
du degr de puret.

IV.4. Estimation du degr de puret


IV.4.1. Recoupement par lanalyse lmentaire
(a) Mthodes de quantification de la chitine et des protines
partir de lanalyse lmentaire, nous disposons des teneurs en azote (Nt) et en carbone (Ct).
Le rapport C/N est un indicateur courant pour caractriser les produits, ce titre il figure sur
les fiches techniques des drivs de chitine commerciale. La formule de la chitine pure est
dfinie par (C8H13NO5)n. Les proportions de carbone et dazote sont donc de 47,3 % et 6,89 %
respectivement (pourcentages massiques). Par consquent, le rapport C/N de la chitine pure
vaut 6,86 et celui du chitosan de 5,33.
77

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

Les cuticules de crustacs sont riches en azote, issu la fois des protines, de la chitine et de
ses drivs. Lanalyse lmentaire et les mthodes de type Kjeldahl mesurent lazote total
sans distinguer lazote associ aux drivs de la chitine (Nq) de celui associ aux protines
(Np). Lazote total (Nt) peut tre exprim selon lquation II.17 :
Nt = Np + Nq
(II.17)
Les rsidus solides issus de lhydrolyse enzymatique sont composs de chitine (Q), protines
(P) et du reste (K), cest--dire des lipides (L), des matires inorganiques (I) et de leau (W).
Lcriture en teneurs relatives dans ses produits scrit (II.18) :
100 = Q + P + K

(II.18)

(o K = L +I + W)
Les facteurs de conversion entre lazote dun compos et la quantit dudit compos sont nots
Cq et Cp pour la chitine et les protines respectivement. Il est donc possible dutiliser
lexpression II.19 :
Q = Nq*Cq

(II.19)

dans II.17 :
Nt = P/ Cp + Q/ Cp
et den dduire :
Q

(NtCp K - 100) * Cq
Cp Cq

(II.20)

La mme approche est applique aux protines :


P

(NtCq K - 100) * Cp
Cq Cp

(II.21)

Ces quations sont utilises par Diaz-Rojas et al. (2006) pour dterminer les teneurs en chitine
et en protines. Une prcaution doit tre prise concernant Cq et Cp qui varient respectivement
en fonction du degr dactylation et de la nature des produits. Cq est compris entre 14,5
(produit 100 % actyl) et 12,1 (produit 100 % dsactyl). Gnralement, le facteur de
conversion des protines, Cp, est de 6,25. Cependant des tudes montrent quil ne convient
pas tous les produits, notamment aux produits marins, riches en azote (Gnaiger et Bitterlich,
2001 ; Diaz-Rojas et al. 2006). Le facteur propos pour les animaux aquatiques, les algues et
bactries est alors de 5,8. Dautres facteurs de conversion sont galement prsents, tels que
5,51 ; 3,59 ; 5,64 ; 3,24 pour les vgtaux. Pour les macroalgues, le facteur de conversion
voluerait de 3,75 5,72 (Gonzalez Lopez et al. 2010). La figure II.9 illustre la part dazote
dans la chitine et les protines, en tenant compte des variations de Cq et Cp. Pour Cp, lcart
tudi se limite de 6,25 5,8 (Diaz-Rojas et al. 2006).

78

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

Fig.II.9 : Variations de teneur en azote pour diffrents composs azots (P et Q)

Pour un produit compos uniquement de chitine et de protines (K = 0), les quations II.20 et
II.21 sont simplifies. Lazote total, en respectant la stchiomtrie, est rparti entre celui de la
chitine et celui des protines. Les teneurs des deux composs, peuvent alors tre dduites de
la mesure de lazote total (Fig.II.10) :
0

20

40

20

40

%P

60

80

100

60

80

100

18
16

% Nt

14
12
10
8
6

%Q

Fig.II.10 : Pourcentage de chitine (Q) et de protines (P), minimal (---) et maximal ( ) en fonction de Nt

Les proportions de chitine et de protines varient entre les droites reprsentes sur la figure
II.10, selon les variations de Cq et Cp. Ceci est valable uniquement lorsque K est nul. Pour ces
carts de Cq et Cp, lerreur associe aux proportions de chitine et de protines peut atteindre
14 %. Cette approche est utilise par Diaz-Rojas et al (2006) qui fait lhypothse de se
conformer aux Cq et Cp classiques, 14,51 et 6,25 respectivement. Dans ce cas, deux droites
uniquement demeurent sur la figure II.10, lune rciproque de lautre, dont les quations
permettent de dterminer la teneur en chitine et en protines (II.22) :
Nt = -0,091*Q + 16

et

Nt = 0,091*P + 6,89

(II.22)

La mme expression sous sa forme littrale et qui tient compte de la prsence dimpurets est
galement dveloppe (II.23) :

79

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

Nt = -

(Cq Cp)
1
Q (100 K)
CqCp
Cp

et

Nt =

(Cq Cp)
1
Q (100 K)
CqCp
Cq

(II.23)

La relation II.23 est applique aux produits de la cintique de rfrence (hydrolyse par 25 %
de pepsine/protines 40 C), partir des mesures de Nt fournies par lanalyse lmentaire.
La quantit de chitine ainsi obtenue est ensuite compare celles dtermines par le lavage au
NaOH et par le bilan massique (Fig.II.11).
Sur le mme principe, la relation II.23 devrait tre affine en prcisant davantage les facteurs
Cq et Cp. Par exemple, le facteur Cq peut tre confirm par la dtermination du degr
dactylation et Cp peut tre prcis par une analyse complte des acides amins. En effet, la
teneur en azote Np peut tre dtermine via le dosage par CPG, qui fournit la proportion de
chaque acide amin. Par connaissance de la composition lmentaire de chaque acide amin,
la proportion en azote protique peut tre tablie. La teneur en azote total, Nt, tant donne
par lanalyse lmentaire, il est possible den dduire, par diffrence entre Nt et Np, la quantit
en azote Nq. Enfin, on peut dduire la quantit de chitine Q (via Cq = 14,51, car le DA tend
vers 100 %). Une nouvelle quation est donc tablie et galement compare aux prcdentes
mthodes (Fig.II.11).
50

Quantit de chitine (g)

40
y = -0,03x + 35,1

y = -0,01x + 28,8

30

y = -0,01x + 28,3

20

y = -0,01x + 28,5

10

0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure d'hydrolyse enzymatique (min)


Fig.II.11 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan massique ; en bleu,
via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp dtermin par CPG)

La figure II.11 montre trois droites de tendance proches, celles qui correspondent aux trois
premires mthodes dcrites, via le bilan massique, le traitement chimique et lanalyse
lmentaire (respectivement rouge, bleu et vert). Au regard de la figure II.12, la corrlation
entre les mthodes est importante car les coefficients R sont compris entre 0,77 et 0,91. De
plus, la pente des trois droites est proche de 1 (Fig.II.12).
Par ailleurs, ces trois mthodes saccordent sur une volution de la quantit de chitine qui
varie de prs de 28,5 g/100 g environ 23 g/100 g aprs 6 h dhydrolyse enzymatique
(Fig.II.11).

80

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

32
30

Quantit de chitine (g)

NaOH vs Bilan

y = 0,99x - 0,21
R = 0,77

NaOH vs Naa

y = 2,2x - 28,5
R = 0,74

28

NaOH vs N (AE)
N (AE) vs bilan

y = 0,96x + 0,79
R = 0,83

y = 2,21x - 29,63
R = 0,65

26

N (AE) vs Naa

y = 0,89x + 3,24
R = 0,91

24
22
20
20

22

24

26

28

30

32

Quantit de chitine (g)


Fig.II.12 : Corrlation entre les mthodes de quantification de la chitine (NaOH= via le traitement chimique,
Bilan = via le bilan massique, N (AE) = via lanalyse lmentaire, Naa = via la composition en acides amins

Pour la dernire mthode, qui exploite la fois lanalyse lmentaire et la composition en


acides amins pour dterminer prcisment le facteur Cp, la quantit de chitine est illustre en
orange. La droite de tendance se dmarque par des mesures suprieures aux autres mthodes.
La corrlation avec les autres mthodes est plus mdiocre (Fig.II.12). Soulignons que cette
mthode est plus sensible que les autres. En effet, elle repose sur le calcul de la teneur en
azote protique associ la quantit de chaque acide amin. Par consquent, lcart-type de
chaque mesure dacide amin par CPG saccumule. De plus, lensemble des acides amins
nest pas dos par la CPG (Cf. section, IV.1.1). Par exemple, larginine est absente, ainsi que
le tryptophane. De plus, lacide aspartique et glutamique sont respectivement runis avec
larginine et la glutamine, alors que leur composition lmentaire est diffrente. Ceci entrane
un dfaut destimation du Np qui se rpercute sur Nq.
Pour conclure, on retiendra que le traitement chimique au NaOH, le bilan massique et
lanalyse lmentaire semblent tre des mthodes assez bien adaptes pour estimer la quantit
de chitine. Nanmoins, dautres exemples, non prsents ici, ont montr de plus fortes
disparits (Cf. Chapitre 3, IV.3.1) Il convient donc dtre prudent, notamment lorsque les
produits sont les moins purifis.
Enfin, lvolution des droites de la figure II.11 suggre une faible perte de chitine lie
laugmentation de la dure dhydrolyse enzymatique ( 10 % en 6 h). Ce phnomne sera
tudi de faon plus approfondie dans le chapitre 4 (section IV.3).
(b) Mthodes indirectes destimation de la puret en chitine
Le rapport C/N constitue un indicateur complmentaire qui prsente lavantage destomper
lventuelle htrognit de la composition des produits en saffranchissant des impurets (si
elles ne comportent ni carbone, ni azote). Le rapport C/N des protines est thoriquement
compris entre 0,7 et 8,5, tandis que celui de la chitine pure est de 6,9, puis tend vers 5,3 lors

81

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

quelle est convertie en chitosan. Donc, la gamme des rapports C/N des protines couvre celle
des drivs de la chitine. Cependant une tendance peut tre observe au fur et mesure de
lhydrolyse par la pepsine (Fig.II.13) :
6

Rapport C/N

5
4
3
2
1
0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure de l'hydrolyse (min)


Fig.II.13: Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique (25 % pepsine, 40 C)

La figure II.13 dvoile une augmentation du rapport C/N mesure que lhydrolyse progresse.
Les valeurs de la cintique atteignent 5,73 6 h et tendent vers 6. la fin de la raction, le
rapport C/N est infrieur celui de la chitine pure. Ce rapport correspond aussi bien celui
dun chitosan que dun mlange de chitine et de protines. Cependant, il est davantage
conforme aux objectifs.
IV.4.2. Recoupement par lanalyse thermogravimtrique
Lanalyse thermogravimtrique est applique aux produits dhydrolyse enzymatique comme
outil de caractrisation. Cette approche originale se base sur les diffrences de comportements
thermiques des principaux constituants des carapaces de crevettes. Lobjectif de cette partie
de ltude est de comparer lATG avec les mthodes destimation de la quantit de chitine et
du degr de puret. Laugmentation de la temprature entrane des modifications de la
structure des molcules et des pertes de masse, associes leur volatilisation. Chaque
compos est caractris par une stabilit thermique spcifique, il peut donc tre identifi. Les
principaux composs rencontrs dans nos produits sont leau, les minraux, les protines et la
chitine.
-

leau svapore entre la temprature ambiante et 105 C. Llimination complte et


rapide de leau ncessite une temprature plus leve, environ 125 C, cause de
fortes liaisons avec les autres composs ;
les minraux sont les plus rsistants aux fortes tempratures, ils constituent une masse
rsiduelle lorsque lATG sachve 700 C ;
les polymres, tels que la chitine ou les protines, se dcomposent sur une large
gamme de temprature en fonction de leur structure.

Laugmentation de la temprature conduit des modifications de structure des composs

82

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

initialement prsents dans le produit. Ceci conduit la production de drivs secondaires,


eux-mmes dgrads thermiquement une temprature plus leve. Aggarwal & Dollimore
(1998) considrent la dcomposition des polymres en deux tapes. La premire correspond
une combustion gazeuse flamboyante et la seconde une combustion incandescente durant
laquelle les rsidus carbons, issus de ltape prcdente, sont dgrads. Pour Marcilla et al.
(2009) la premire tape est dite de dvolatilisation car la dcomposition des produits
conduit la production de matire volatile (dioxyde de carbone, hydrocarbures, oxyde de
carbone, hydrogne). Tandis que ltape suivante est la dgradation des drivs secondaires
carbons solides. La premire dcomposition gazeuse serait associe la dcomposition des
liaisons hydrognes et des groupes C=O et C-N, suivie de la dpolymrisation thermique par
dgradation des liaisons C-CO et condensation (Mosquera et al. 1994).
La dgradation des protines se situerait une temprature infrieure celle de la dgradation
de la chitine (Alonso et Vega, 1990 ; Zhou et al. 2010). Cependant, les auteurs ne sont pas
unanimes sur la dlimitation des plages de temprature de dgradation. Elles dpendent des
caractristiques des chantillons et des paramtres de mesure, tel que le type datmosphre
dans lappareil et la vitesse de monte en temprature. Zheng et al. (2003) montrent que les
protines de soja seules commencent tre dgrades une temprature infrieure celle de
la chitine tandis que les mlanges chitine-protines-glycrol (pour raliser des bioplastiques)
ragissent diffremment. Protines et chitines partagent certains groupes et des liaisons
similaires, tels que les C=0 et NH, ce qui peut expliquer une dcomposition sur des plages
thermiques communes.
Les travaux dAlonso voquent lexistence dune seconde plage de dgradation thermique,
entre 420 et 560 C, qui correspondrait la dgradation commune de composs secondaires
de polysaccharides et de protines (Alonso & Vega 1990). Amorim et al. (2004) montrent que
les plages de dgradation de lamidon et des protines se chevauchent. Marcilla et al. (2009)
voquent des plages de dgradation thermique communes aux protines et aux
polysaccharides paritaux des microalgues, tandis que les lipides seraient dgrads une
temprature plus leve. Le tableau II.9 compare les plages de temprature de dgradation
thermique des protines et de la chitine, selon les auteurs :
limination des protines
limination de la chitine
Alonso, 1990
180 280 C et 420 560 C
280 et 360 C
Gartner, 2010
Pic 316 et 511 C (papane)
Pic 327 et 500 C
Marcilla, 2009
180 400 C et 400 760 C
Romano, 2007 ; Zhou, 2010
50 270 C
270 et 600 C
Tab II.9 : Comparaison de plages de dgradation thermique de la chitine et des protines selon les tudes

Selon ltude de Pawlak et Mucha (2003), la premire tape de dgradation thermique du


chitosan correspond la formation de nouvelles liaisons intermolculaires aprs la destruction
de groupes amines. Ces nouvelles liaisons sont elles-mmes dgrades lors de la seconde
tape (Tang et al. 2005).
Quatre profils ATG appliqus nos produits ont t compars. Chacun est associ une dure
dhydrolyse diffrente, et par consquent un degr de puret diffrent. Ils sont nomms MP
83

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

la matire premire, P180 le produit dhydrolyse de 180 min, P360 le produit dhydrolyse de
360 min et PP ce mme produit purifi par lavage au NaOH.
Les profils ATG ont t obtenus par le programme suivant : tout dabord, un palier de
stabilisation thermique de 10 min a t appliqu 125 C, puis la temprature est leve
vitesse constante de 1 C/min. Une ultime tape de stabilisation thermique est enfin applique
700 C afin dassurer llimination complte des composs organiques. La figure II.14
illustre les profils ATG des quatre produits de diffrents degrs de puret et le tableau II.10
rsume les caractristiques de leurs comportements thermiques.

er

1 pic caractristique
Plage 1 : masse perdue
Plage 1 : tendue T
Plage 2 : masse perdue
Plage 2 : tendue T
Plage 3 : masse perdue

MP (cuticule de
crevettes)
340 C
42 %
196 C
28 %
280 C
10 %

P180
(180min)
295 C
56 %
130 C
42 %
272 C
/

P360
(360min)
298 C
60 %
110 C
38,50 %
325 C
/

PP (lavage chimique
de P360)
315 C
70 %
98 C
29 %
370 C
/

Tab.II.10 : Caractristiques des comportements thermiques des produits de diffrents degrs de puret

Les plages de temprature de chaque tape sont dlimites par les flches sur la figure II.14.
Elles correspondent une vitesse de perte de masse minimale lie la fin dun processus de
dgradation. On considre le dmarrage de la perte de masse lorsque le seuil de 99 % est
dpass.

Fig.II.14 : Thermogramme de produits de diffrents degrs de puret (1 C/min)

Le comportement thermique gnral des quatre profils (Fig.II.14) montre un dcalage des pics

84

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

de dgradation (TabII.10). La matire premire prsente trois pics 340 C, 525 C et 613 C.
On peut distinguer trois tapes. Au cours de la premire, le produit perd 42 % de sa matire,
les protines et la chitine sont dgrades en rsidus secondaires. la fin de ltape suivante,
autour de 550 C, 28 % du poids est limin. La dernire tape sachve vers 620 C,
temprature laquelle il ne reste que les minraux. Les 10 % de matire limine lors de la
dernire tape correspondent probablement aux rsidus secondaires des protines. Cette ATG
est similaire celle dcrite par Gartner et al. (2010), applique la mme matire premire.
P180 et P360 prsentent des pics 295 C et 298 C respectivement. la premire tape,
P180 perd 56 % de masse entre 200 et 330 C, tandis que P360 en perd 60 % entre 207 et
317 C. Le pic de dgradation thermique du produit PP se situe 315 C et 70 % du poids est
limin entre 232 et 330 C.
Les quatre profils ATG sont confronts aux rsultats pralablement acquis par lanalyse de la
composition des produits. Le tableau II.11 dcrit ces compositions. Le degr de puret
augmente de 30 % dans la cuticule de crevette (moyenne estime partir de 4 chantillons)
plus de 99 % dans le produit PP.
MP (cuticule
P180
P360
PP (lavage chimique de
crevettes)
(180 min)
(360 min)
P360)
Rsidus ATG (%)
19,6
1,7
1,3
1,0
Minraux (%)
19-28
1,5
0,7
0,2
Protines (%)*
30-50
16,5
10,3
0,3
D de puret (%)**
~ 30
82
93
99
Tab.II.11 : Composition des produits de diffrents degrs de puret (estimation par *CPG, **lavage au NaOH)

Un dcalage du dmarrage de la premire tape est observ. Elle commence ds 146 C pour
MP, 200 C et 207 C pour P180 et P360 respectivement. La perte de matire du produit PP
ne commence qu partir de 232 C. On note que la temprature initiale de perte de masse est
dautant plus retarde que le produit est pauvre en protines. Ce qui confirme les observations
dtudes antrieures (Alonso et Vega, 1990). Le tableau II.10 montre galement que la plage
de temprature de la premire tape est dautant plus courte que lchantillon est pauvre en
protines, tandis que la quantit de matire limine lors de cette tape augmente. La figure
II.15 reprsente les mesures des quantits de masse perdues la premire tape en fonction
des quantits de protines dans lchantillon.

85

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

Mass lost during 1st set (%)

80

y = -0,5927x + 67,157
R2 = 0,9321

70
60
50
40
30
20

1st set

10

Linaire (1st set)

0
0

10

15

20

25

30

35

40

Protein content (%)

Fig.II.15 : Relation entre la perte de masse de la 1re tape et la quantit de protines

Un autre produit a t ajout, il sagit de P30 (34 % de protines aprs 30 min dhydrolyse).
Une rgression linaire dcrit convenablement, sur le domaine observ, le lien entre la
quantit de masse perdue lors de la premire tape et la quantit de protines dans
lchantillon. Compte tenu des incertitudes de mesures lies lhtrognit des produits, le
R observ, de 0,93, est satisfaisant. La premire tape est donc fortement lie la
dcomposition dune partie des protines en drivs carbons secondaires.
Un lien est tabli entre la plage de temprature de la premire tape de dcomposition, la
quantit de protines et lestimation du taux de puret par lavage au NaOH (Fig.II.16).
100

200

Protines (%)

80

160

Plage de
tempratures

60

120

40

80

20

40

y = -0,70x + 74,28
R = 0,94

Plage de tempratures - tape 1 (C)

y = -1,40x + 241,62
R = 0,98

Protines

0
0

20

40

60

80

100

Estimation du degr de puret en chitine (%)


Fig.II.16 : Relation entre lestimation du taux de puret et la quantit de protines rsiduelles dune part et
ltendue de la premire plage de temprature de dcomposition dautre part

Dune part, lestimation du degr de puret, via le traitement chimique des produits, repose
prcisment sur llimination des protines. On retrouve donc une corrlation linaire leve
entre le degr de puret et la quantit de protines rsiduelles. Dautre part, une bonne

86

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

corrlation linaire est galement observe entre le degr de puret et ltendue de la plage de
dcomposition thermique de la premire tape. La prsence de protines rsiduelles allonge
cette tape de dcomposition thermique.
LATG ne permet pas la quantification directe des protines et de la chitine. Un modle
pourrait tre envisag pour dterminer la quantit de protines partir de ltendue de la
premire plage de dgradation thermique. Cependant il devra alors tenir compte dautres
paramtres, tels que le DA et DP, qui modifient certainement les comportements thermiques
des polymres. En revanche, lATG se rvle tre un bon outil pour comparer la prsence ou
non de protines entre deux chantillons de chitine.
IV.4.3. Recoupement par RMN et FT-IR
(a) Rsonance magntique nuclaire
Des mesures de RMN en 13C sont effectues lINRA de Nantes (plateforme BIBS), la fois
sur la chitine commerciale, considre comme pure (< 1 %), et la matire premire. Le degr
dimpurets a t tudi selon deux mthodes. La premire a consist superposer les
spectres de RMN (Fig.II.17) et dterminer le facteur de conversion entre les deux spectres
(en tenant compte de la diffrence de masse des prises dessais). La seconde repose sur le
rapport entre les intgrations des signaux du carbone CO, 173,7 ppm, de la chitine
commerciale et du produit dhydrolyse.

CO

Fig.II.17 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la matire
premire, en rouge

87

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

Appliqu lexosquelette de crevettes, les rsultats obtenus sont de 68 % et 60 % pour la


premire et la seconde mthode respectivement. Lerreur est de 2,4 % (rapport signal/bruit).
La mthode danalyse de la composition a indiqu prcdemment un degr dimpurets de
prs de 70 % (Cf. Tab.II.7). La premire mthode via la RMN 13C, qui repose sur la
diffrence entre les deux aires, semble donc convenir davantage. La seconde mthode peut
tre perturbe par la prsence des CO de la chitine.
(b) Spectroscopie FT-IR
La mme approche a t applique par la spectroscopie FT-IR, pour comparer la chitine
commerciale (Sigma), la chitine obtenue par voie chimique et celle obtenue par voie
enzymatique. La diffrence daire est calcule entre la rfrence commerciale et les deux
autres.
La figure II.18 montre les spectres de FTIR de la chitine commerciale (en bleu), de la chitine
obtenue par voie chimique (en rouge) et de celle obtenue par voie enzymatique (en vert).

Fig.II.18 : Spectres de spectroscopie FT-IR de la chitine commerciale Sigma (en bleu), extraite par voie
chimique (en rouge) et enzymatique (en vert) au laboratoire.

Au regard de la figure II.18, il semblerait que la chitine extraite par voie enzymatique soit
plus pure que celle obtenue par voie chimique tant les similarits sont importantes avec la
rfrence commerciale. Cependant, les rsultats de lanalyse de leur composition dmontrent
le contraire puisque le produit extrait contient moins de 1 % de protines et de minraux
tandis que celui extrait par voie enzymatique natteignait pas ce niveau de puret ( peine
60 % de degr de puret estim partir du nettoyage chimique). La prsence de protines
dans lchantillon provoque une augmentation dintensit dabsorbance des pics communs
la chitine, notamment entre 2 800 et 3 500 cm-1.

88

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

Le rapport des aires par rapport au profil de la chitine commerciale, indiquerait le degr de
puret en chitine. Daprs cette mthode, la chitine extraite par voie chimique serait pure
87,3 % et celle extraite par voie enzymatique 94,7 %. Ces rsultats ne concordent pas avec
lanalyse de la composition, ni avec les rsultats obtenus via la RMN 1H.
Linconvnient majeur de la spectroscopie FTIR apparat lorsque des protines rsiduelles
sont prsentes dans lchantillon. Elles prsentent des groupes en communs avec la chitine.
Falini et al. (2003) mettent en vidence les bandes spcifiques aux protines et la chitine qui
se chevauchent. Par ailleurs, dans son tude, Furuhashi et al. (2009) ont compar les spectres
de protines pures (la BSA), un mannane et un glucane pur comme polysaccharides. Enfin,
ces standards sont compars la chitine dexosquelette de crabe. Ils montrent que les bandes
caractristiques de la chitine concident la fois avec celles des oses et des protines. Paulino
et al. (2006) montrent que certains rendements dapparence levs, taient dus la prsence
dimpurets rsiduelles, visibles par FT-IR. Les protines provoquent donc des interfrences
et biaisent lestimation du degr de puret en chitine.

IV.5. Estimation du degr dactylation


(a) Rsonance magntique nuclaire
Les RMN du solide en 13C et 15N sont parfois utilises pour dterminer le degr dactylation
(Kasaai, 2010). En 13C, elle identifie 8 signaux qui correspondent aux 8 carbones de la chitine
et du chitosan (Tab.II.2). La seule diffrence entre la chitine et le chitosan tant situe au
niveau du N-CH3, le DA est calcul de la faon suivante :

DA 100 INCH 3 /[1 / 6( IC1 IC 2 IC 3 IC 4 IC 5 IC 6)]


DA 100 INCH 3 /[1 / 6 Iprincipales chaines carbones]

(II.24)

En 15N, les spectres ne prsentent quun seul signal, directement li au degr dactylation.

DA ( INactyl) /( INactyle Iamine) (II.25)


Les spectres en 15N de la matire premire et du produit dhydrolyse sont prsents en figure
II.19.

89

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

Fig.II.19 : Superposition des spectres RMN 13C de la chitine commerciale (Sigma), en bleu, et de la matire
premire, en rouge

Le degr dactylation obtenu est de 65,0 5,3 %. Par cette mthode, le temps dacquisition a
t trs long et le rapport signal/bruit lev. Le DA observ est faible, ceci tend confirmer
quen prsence dimpurets protiques, les RMN du solide 13C et 15N sont perturbes. En
effet, les protines modifieraient les intgrales des signaux (Kasaai, 2010).
La RMN 1H est galement applique la chitine commerciale selon la technique dcrite la
section III.1.1. Le spectre rsultant de cette analyse est illustr par la figure II.20.

Actone

Fig.II.20 :Spectre RMN 1H de la chitine commerciale

90

IV. Application, comparaison et slection des mthodes

Le degr dactylation observ est de 95,5 1,0 %, ce qui correspond lensemble des
donnes de la littrature. La mesure est valable uniquement lorsque la production dacide
actique/actone, issu de la dsactylation de la chitine, est ngligeable. Daprs la figure
II.20, la flche noire montre la faible proportion dactone.
(b) Spectroscopie FT-IR
La spectroscopie FT-IR est galement utilise pour dterminer le degr dactylation. Elle a
donc t applique au produit de 6 h dhydrolyse enzymatique par 25 % de pepsine, 40 C
(Fig.II.21).

Fig.II.21 : Spectre FT-IR sur le rsidu solide de 6 h lhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C, (analyse mene
par le laboratoire BMM)

La littrature propose de nombreux rapports de signaux spcifiques la chitine et au chitosan


(Tab.II.3) pour dterminer le degr dacetylation. Pour ce rsidu insoluble dhydrolyse
enzymatique, le DA atteint prs de 82,9 % avec les rapports des intensits I1652/I1070 et
I1652/I3428. Cette valeur est infrieure aux rfrences de la littrature et au rsultat obtenu par
RMN 1H.

IV.6. Estimation de lindice de cristallinit


Comme lexplique la section III.3, suite lacquisition des donnes de diffractions aux rayons
X, une dconvolution est pratique sur les spectres obtenus. Cette opration permet de
distinguer les pics associs aux zones cristallines des zones amorphes. Lanalyse est applique
la chitine commerciale (Fig.II.22).

91

Chapitre 2 Choix des mthodes & application aux produits de rfrence

Fig.II.22 : Dconvolution du spectre de diffraction aux rayons X de la chitine commerciale Mahtani

La technique adopte pour dterminer lindice de cristallinit consiste calculer le rapport


entre laire des pics associs aux zones cristallines sur laire totale. Lindice de cristallinit
atteint donc 53,9 % pour la chitine fournie par Mahtani.

V. Conclusion sur le choix des mthodes


La composition des produits est analyse par les mthodes classiques pour la teneur en eau, en
lipides et en minraux. La mthode slectionne pour les protines est le dosage des acides
amins totaux par CPG. Bien que cette mthode sous-estime la quantit de protines, elle
demeure plus fiable et elle apporte des informations complmentaires sur la composition
prcise en acides amins. Pour estimer la quantit de chitine, la mthode slectionne est la
gravimtrie suite au traitement de lchantillon au NaOH. Cette mthode est adapte aux
produits dont les protines constituent lessentiel des impurets. Cependant, il est ncessaire
de la valider par les bilans massiques et/ou lanalyse lmentaire.
Nous disposons galement de lATG pour valider les rsultats observs. Comme les autres
mthodes, elle ne peut tre employe seule pour estimer le degr de puret en chitine dun
produit. Cependant, par comparaison entre produits, elle offre une indication sur leur degr de
relatif.
La RMN du liquide 1H est slectionne pour mesurer le degr dactylation. Nos produits
tant composs essentiellement de chitine peu dsactyle, cette mthode convient. Elle est
prfre la spectroscopie FT-IR car cette dernire sest montre plus sensible la prsence
des impurets, notamment des protines. La prsence, ou labsence, des pics caractristiques
de la chitine est utilise uniquement en tant quindice qualitatif. Tandis que la RMN 1H sest
rvle tre davantage reproductible et fiable. Lavertu et al. (2003) rapportent galement que
la RMN 1H lemporte grce sa stabilit, sa spcificit et sa robustesse.
Lindice de cristallinit est mesur via la diffraction par rayons X. La masse molaire, lie au
degr de polymrisation, est estime via la viscosit rduite par viscosimtrie capillaire. Le
tableau II.12 compare des caractristiques physico-chimiques de chitines fournies par
Mahtani et Sigma :

92

V. Conclusion sur le choix des mthodes

Fournisseurs
Sigma
Mahtani

DA (%)

DP

C/N

ICr (%)

95,5 1
/
7,0 0,1
/
5
5
95,5 1
5,7*10 0,5*10
7,3 0,1
53.9
Tab.II.12 : Comparaison des DA, DP, C/N et ICr entre chitine commerciale

Le degr de polymrisation de la chitine fournie par Mahtani est plus faible que celui
gnralement exprim dans la littrature (Pacheco, 2010 ; Ito et al 2000). Cependant, il faut
souligner limportance de lincertitude de mesure, de lordre de 0,5*105 g/mol. Le degr
dactylation est conforme aux donnes que la littrature communique (Cf. Chapitre 1, V.2).
Visuellement, laspect gnral du produit constitue galement un critre dapprciation. Le
produit obtenu par hydrolyse enzymatique est plus ros que celui obtenu par voie chimique
(Fig.II.23) :

Fig.II.23 : Comparaison visuelle entre le produit dextraction chimique (a) et le produit dhydrolyse
enzymatique(b)

La diffrence de couleur est clairement visualise sur la figure II.23 et laisse deviner la forte
prsence dimpurets dans le produit dhydrolyse enzymatique (5 % de pepsine, 6 h de
protolyse et 42 C, partir fragments > 2,5 mm). Nous avons observ que la couleur des
produits de lhydrolyse enzymatique sestompait avec le temps, probablement du fait de la
dgradation des carotno-protines. Au contraire, le produit dextraction chimique prsente un
bel aspect blanc, de texture plastique, convenable pour sa commercialisation.

93

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique


en une seule tape par
protolyse acide

I. Introduction
Comme cela a t dcrit prcdemment, le principe du procd dextraction de la chitine,
dvelopp dans cette tude, consiste procder la dprotinisation et la dminralisation
simultanment. Cette fusion est permise grce une protase dont lactivit protolytique est
optimale pH acide. Ainsi, lacidit du milieu ractionnel favorise la fois la
dminralisation et la dprotinisation. Le chapitre 3 traite des rsultats concernant leffet du
milieu acide seul, puis les cintiques dhydrolyse enzymatique applique aux coproduits de
crevettes. Les facteurs qui influencent les cintiques de dprotinisation et de
dminralisation sont analyss. Cette tude conduit une optimisation des conditions
dextraction, via un plan dexprience, et la modlisation des cintiques.

II. Le milieu ractionnel acide


Le protocole mis en place est dcrit au chapitre 2.II. Lacide et lenzyme employs requirent
certaines conditions qui vont tre dtailles maintenant.

II.1. Choix de lacide : lacide phosphorique


Lacide slectionn rpond deux exigences :
- ragir comme tampon avec le CaCO3 prsent dans la matire premire,
- permettre la valorisation des composs issus de la phase liquide, notamment en agroalimentaire.
Lacide employ pour tablir ce protocole est lacide phosphorique, H3PO4. Il forme avec le
CaCO3, un tampon autour de pH 2, lorsque lquilibre stchiomtrique est atteint. De plus,
lacide phosphorique est autoris en agroalimentaire comme dadditif, dsign sous le code
E338, daprs la nomenclature europenne. La lgislation qui concerne le H3PO4, est relative
son utilisation comme additifs et auxiliaire technologique. Il figure dans la liste des
substances autorises dans les matriaux au contact des denres alimentaires (Journal Officiel
N67 du 20/03/2007 texte N13). Dans lalimentation, il est limit 700 mg/l dans les
boissons non alcoolises (JO du 02/10/97), 1 g/l dans les boissons alcoolises lexception
de la bire et du vin, 5 g/kg dans les crales pour petit-djeuner, 5 g/kg dans les amusegueules, 1 g/kg dans le surimi, 5 g/kg dans les pts de poissons et de crustacs, 3 g/kg
dans les nappages, 4 g/kg dans les enrobages pour produits carns et vgtaux et 5 g/kg
dans les plats spciaux (JO du 01/08/1998 ; Annexe A).

II.2. Effet de lacide sur la dprotinisation et de la dminralisation


Avant dtudier lhydrolyse enzymatique, leffet de lacide ortho-phosphorique (H3PO4) seul
est analys. La temprature est fixe 40 C et le ratio dacide par rapport la matire
premire est de 5 :1 (v : w). Ainsi le pH est maintenu 2 et les conditions sont similaires aux
prochaines hydrolyses enzymatiques. La dure dacidification varie de 7 360 min. Le poids
final et les quantits rsiduelles de minraux et de protines sont mesurs sur les produits
97

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

obtenus. Le premier point 7 min marque le moment o lenzyme sera introduite lors des
prochaines hydrolyses enzymatiques (t0).
La figure III.1 illustre les compositions des produits traits lacide phosphorique. Elle rvle
que la quantit de minraux diminue rapidement tandis que celle des protines ne varie pas
compte tenu de lcart type des mesures.
100

Rendement massique (en g/ 100g initial)

poids final

minraux

protines

80

60

40

20

0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure du traitement d'acidification (min)


Fig.III.1 : Composition des produits traits par lacide phosphorique en fonction du temps

Aprs 6 h dacidification, la quantit rsiduelle de minraux sapproche de 0,5 0,4 g/100 g.


Celle des protines rsiduelles semble constante, autour de 28,7 3,3 g/100 g pendant toute la
dure du traitement. Lacidification de 6 h entrane donc la perte de prs de 98,1 % et 28,2 %
respectivement.
Ceci signifie que lacide phosphorique dissout convenablement le CaCO3, sans impact sur les
liaisons peptidiques ni celles qui relient les protines la chitine. Moins de 2 % du CaCO3
initialement prsent demeure dans le produit trait 6 h 40 C, cette part est probablement
pige dans le rseau form par les protines et la chitine.
Les concentrations tant calcules pour tre en conditions stchiomtriques, on peut mettre
lhypothse que tout lacide ortho-phosphorique est monopolis pour ragir avec le carbonate
de calcium. De plus, lacidit du milieu implique que les protines se comportent comme des
donneurs de protons, au mme titre que lacide phosphorique. La ractivit entre protines et
H3PO4 est donc plus faible que celle qui sopre entre H3PO4 le CaCO3 dissout.
Rappelons que le temps initial de la raction est compt partir du moment o lenzyme est
introduite dans le milieu ractionnel, soit aprs environ 7 min dacidification. De plus, leffet
de la taille initiale des fragments dexosquelettes de crevettes sur lextraction enzymatique est
lun des facteurs tudis. La composition du substrat t0 est donc identifie par catgorie de
taille :

98

III. La protolyse acide

Poids (rendement massique)


Protines
Protines (g/100g)
Minraux
Minraux (g/100g)

< 1 mm
64 %
45 %
29
10 %
6

1 2,5 mm
71 %
49 %
35
14 %
10

> 2,5 mm
78 %
54 %
38
18 %
14

Tab.III.1 : Composition du substrat t0 de lhydrolyse enzymatique

Le tableau III.1 nous indique la composition de la matire premire en fonction de trois


catgories de taille des fragments dexosquelette de crevettes. Des diffrences de rendements
massiques, protines et minraux rsiduels sont observes. Cette caractrisation sera utilise
pour ltude des cintiques dhydrolyse pour la suite de ltude ( partir de la section IV).

III. La protase acide


III.1. Choix de la protase : la pepsine
La pepsine a t identifie au 18me sicle, puis elle est tudie et dcrite par T. Schwann en
1825. Lorigine de son nom se rfre pepsis , la digestion en grec ancien (Barret et al.
1998). On distingue les pepsines A, B et C. La pepsine A (ou I dans certaine littrature) est la
principale enzyme de lestomac humain, tandis que la pepsine C est une enzyme mineure de
la digestion. La forme B est caractristique du porc, cest la forme gnralement utilise par
les industries (EC 3.4.23.1) et celle que nous utilisons pour cette tude. Son poids molculaire
est de lordre de 34,5 KDa. Elle compte 326 acides amins et sa structure cristalline (Cf.
Chapitre 1.V.1) est caractrise par un dimensionnement de a et b = 6,74 et c = 29,01 nm
avec les angles et = 90 et = 120 (Cooper et al. 1990). La protolyse mise en uvre
dans cette tude, est suivie dune filtration travers des toiles filtrantes, dont la porosit est de
45 m. La pepsine peut donc passer dans la phase soluble.
La pepsine est prsente dans le systme digestif de la plupart des vertbrs, en particulier dans
le duodnum, o elle est employe hydrolyser les protines. Son prcurseur est le
pepsinogne, il est activ ds sa libration en milieu acide (Rao et al. 1998).

Fig.III.2 : Reprsentation schmatique de la pepsine (Source Web, http://dwb4.unl.edu)

99

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Cette endopeptidase appartient la famille des aspartate-protases, comme dautres


cathepsines17 et les rnines18. Sur la figure III.2, la zone rouge correspond au site actif
constitu daspartates et les zones dores sont quatre peptides utiliss comme anticorps.
La pepsine est galement considre comme une hydrolase car elle requiert une molcule
deau. Son mode daction est dcrit par la figure III.3 :

Fig.III.3 : Mcanisme propos pour la protolyse par les aspartate-protases (Reginald et al. 1974)

La premire tape (a) consiste en deux transferts de protons, ce qui facilite (b) lattaque
nuclophile du carbone du carbonyle de la liaison peptidique par leau. Puis (c) un rsidu
aspartate accepte un proton de lun des deux groupes hydroxyle de lamide dshydrat de la
liaison peptidique. Lamine libre de la liaison est comble par un proton donn par un autre
rsidu aspartate (d).
III.1.1. Activit protolytique
La pepsine lyse prfrentiellement les extrmits N-terminales des acides amins polaires
aromatiques, qui sont la phnylalanine, le tryptophane et la tyrosine.
Gnralement les conditions de protolyse par la pepsine se situent entre pH 1,8 et 4,4 et entre
37 C et 50 C (Fig.III.4) :

Fig.III.4 : Conditions de pH (A) et T(B) optimales de protolyse

17
18

Famille de protases impliques dans la dgradation de protines par le lysosome


Enzyme du rein

100

III. La protolyse acide

Nanmoins cette gamme est nuancer car les conditions optimales de protolyse sont
spcifiques un couple enzyme-substrat donn. Lactivit protolytique est mesure via
labsorbance 280 nm de la phase soluble, cette mesure est lie la quantit de tryptophanes
librs. Lunit dactivit protolytique est fonction du temps et de la quantit de protines
prsentes initialement (Fig.III.4).
La pepsine porcine est inactive lorsque le pH dpasse 6. Les constantes kcat (constante de
catalyse dans la relation Vmax = kcat[E]t) et kM (constante de Michalis, quivalent la
consommation en substrat lorsque Vmax = 1/2) caractrisent les ractions enzymatiques
(Fig.III.5). Le rapport optimal kcat/kM, utilis comme indicateur, se situe autour de 3,5 (Lin et
al. 1992), cependant il dpend galement du couple enzyme-substrat. Pour lhmoglobine, le
pH optimal de la protolyse est 2.

Fig.III.5 : Modle selon Michalis-Menten, de la vitesse de raction en fonction de la consommation en substrat

Outre la pepsine porcine, celles extraites destomac de poissons, principalement du thon, ont
t tudies. Par exemple (Nalinanon et al. 2010), cette pepsine a t utilise pour purifier des
composs protiques de haute valeur ajoute, telles que des molcules aromatiques. Ses
conditions dactivit optimales sont proches de celles de la pepsine porcine, bien que de
temprature lgrement plus faible. La cause provient du fait que les poissons sont adapts
pour des environnements plus froids. Le rapport kcat/kM de la pepsine de thon, de lordre de
0,6, est infrieur celui de la pepsine porcine.
La pepsine est dj employe industriellement en agroalimentaire. Elle est utilise dans la
fabrication de boissons et en fromagerie. Son activit protolytique est galement exploite
pour liminer des impurets protiques. Furuhashi et al. (2009) lemploient pour traiter au
pralable des carapaces de mollusques, avant dtre analyses en spectroscopie IR et
CP/MAS. Le cas chant, ces impurets protiques interfrent et biaisent lanalyse. La
digestibilit de la pepsine vis--vis de lazote a t estime 78,9 % par Rehbein et al. (1981)
sur du krill.

101

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

III.1.2. Activit chitinolytique


Ilankovan et al. (2006) montrent que la pepsine possde galement une activit chitinolytique
leve, cest--dire la capacit hydrolyser des liaisons glycosidiques. Cette activit conduit
la dpolymrisation du polysaccharide. Le substrat des expriences dIlankovan et al. (2006)
est le chitosan. Il est consomm par la pepsine qui le convertit en oligomres de chitosan. Une
incubation de 24 h pH 5,4 et 44 C aboutit 71,5 % de chitobioses, 19 % de N-actylglucosamines et 9,5 % de chitotrioses.

Fig.III.6 : Comparaison sur la chitosanolyse selon 3 protases diffrentes, effet de la concentration en enzyme
(A), du pH (B), de la temprature (C) et de la concentration en substrat (D), Kumar et Tharanathan 2004

Lactivit chitinolytique est mesure pour 1 % denzyme par rapport la quantit de chitosan,
lui-mme dissous dans de lacide actique 1 %. La raction est stoppe par du NaOH 2N,
jusqu neutralit, puis le mlange est centrifug. Le culot est lav et dialys. Enfin les
groupes extrmits rductrices sont quantifis pas HPLC. Lunit est exprime en
moles/min /mg de protines initiales. La chitosanolyse optimale a t obtenue avec un pH de
5,0 et une temprature proche de 44 C (Fig.III.6). Avec 4,98 units, la pepsine de porc
prsente lactivit chitinolytique la plus leve, par rapport la papane et la pronase (protase
extraite de Streptocymes griseus). Cependant, elle reste infrieure celle dune chitosanase
standard, dont lactivit se situe autour de 50,0 units (Kumar et Tharanathan, 2004).
La chitine, protge par son groupement actyle, est suppose tre moins sensible
lhydrolyse des liaisons glycosidique par rapport au chitosan. Ce risque devra tre vrifi par
la suite.

III.2. Les conditions dhydrolyse par la pepsine pour extraire la chitine


102

III. La protolyse acide

III.2.1. Les paramtres du procd tudier


Laccessibilit au site actif de lenzyme dpend de laffinit de lenzyme avec le substrat et
des conditions du milieu. En effet, lenzyme reconnat une structure spcifique mais cette
structure est sensible son environnement tel que le pH, la temprature et lhydratation.
La pepsine est employe, dans cette tude, pour sa capacit hydrolyser les liaisons
peptidiques, et non les liaisons glycosidiques. Le pH optimal de la dpolymrisation se situe
autour de 5 tandis que celui de la protolyse se situe autour de 2 (Fig.III.4). Par consquent, le
pH du milieu ractionnel, fix 2, devrait favoriser la dprotinisation et non la
dpolymrisation.
La temprature optimale de la chitosanolyse est lgrement plus leve (45 50 C) que celle
de la protolyse (40 45 C). Pour viter le risque de dpolymrisation, il est plus sr de
maintenir une temprature plus faible. Cependant, aucune donne nest disponible sur leffet
de la temprature vis--vis de la pepsine sur la carapace de P. vannamei. Une variation
sensible de la temprature peut favoriser la protolyse. Cet impact va tre tudi dans le cadre
dun plan dexprience.
Le rapport entre la concentration en enzyme et la concentration en substrat est galement un
paramtre dterminant vis--vis de lactivit enzymatique. Comme les prcdents paramtres,
le rapport optimal est spcifique un couple enzyme/substrat. Pour le couple de cette tude,
pepsine/exosquelette de crevettes, nous ne disposons pas de donnes. Ce paramtre va donc
tre tudi dans le cadre du plan dexprience.
Enfin, laccessibilit au site actif a t voque prcdemment. Outre la strospcificit du
substrat, elle est lie la taille des fragments et plus particulirement la surface de contact
disponible entre les fragments de substrat et les sites actifs enzymatiques. Cet aspect doit
galement tre tudi pour le couple pepsine/ exosquelette de crevettes, il intgre donc le plan
dexprience.
III.2.2. Mise en place dun plan dexprience

Fig.III.7 : Reprsentation schmatique dun plan factoriel complet dexprience 2k

Le plan dexprience est un outil indiqu lorsque plusieurs facteurs sont susceptibles

103

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

dinfluencer un procd. Son intrt est destimer leurs effets, leurs poids et leurs interactions,
par un nombre minimal dexpriences. Il existe une vaste gamme de plans dexpriences
disponibles, qui sadaptent selon les phnomnes tudis. Pour cette tude le choix sest port
sur un modle simple, un plan factoriel complet deux niveaux, dcrit par la formule 2k. La
premire tape consiste tablir les bornes du domaine dtude qui sont les valeurs minimales
et maximales des facteurs tudier. Les extrmits du plan sont notes (-1) et (+1). Les
bornes du domaine peuvent tre reprsentes par les points rouges de la figure III.7.
Les variables tudies sont la temprature, la concentration en pepsine par rapport la
quantit de protines dans la matire premire et la taille des fragments dexosquelette de
crevette P. vannamei. Leffet de la dure dhydrolyse enzymatique est galement suivi. Les
bornes du plan dexprience sont dcrites par le tableau III.2 :
Dure
6h

Temprature
[pepsine]/[protines]
Taille des fragments
-1
0
+1
-1
0
+1
-1
0
+1
37 C
40 C
43 C
5%
10 %
15 %
<1 mm
>2,5 mm
Tab.III.2 : Conditions du plan dexprience : bornes des paramtres tudis

Ce plan dexprience mise en uvre est un plan factoriel complet deux niveaux (23) dont
chaque exprience correspond 10 dures dhydrolyse diffrentes et indpendantes. Les
dures sont comprises entre 10 et 360 min. Le plan est complt par trois expriences aux
conditions moyennes, dites des points centraux et notes (0, 0, 0). Ces trois expriences
permettent destimer la variabilit associe aux exprimentations. Le nombre dexpriences
du plan est dfini par la formule (23 + 3)*10, soit 110 expriences indpendantes.
Les bornes minimales et maximales du plan, notes (-1) et (+1) ont t tablies grce a des
expriences pralables et la littrature. La temprature minimale est fixe 37 0,5 C et la
temprature maximale 43 0,5 C. Dans ce rapport, nous avons fait le choix dexprimer la
concentration en enzyme par rapport la quantit de protines dans la matire premire. Ceci
facilite la transposition du procd dautre type de matire premire. Pour les bornes (-1) et
(+1) du plan dexprience, la concentration est fixe 5 % et 15 % respectivement. La
matire premire broye et trie sur des tamis constitue trois catgories de taille de fragments,
infrieure 1 mm, suprieure 2,5 mm et entre ces deux limites. Ces fractions constituent
respectivement les bornes (-1) et (+1) et le point central (0). La rpartition des expriences est
dcrite par le tableau III.3.
Les rsultats des expriences, dites rponses , servent ensuite tablir un modle sur une
base polynomiale dordre 1 (III.1) :
N

N 1 N

n 1 : Y 0t iXi
i 1

XX
ij i

(III.1)

i 1 j i 1

Une fois le modle de prdiction tablit, il est confront aux mesures observes grce la
mthode des moindres carrs.
Ce plan dexprience est conu pour tudier les caractristiques de la cintique de protolyse
104

III. La protolyse acide

acide, en fonction des paramtres qui linfluencent. Lexploitation plus approfondie de ces
cintiques sera aborde la section V.
Facteurs
Temprature

[Pepsine]

Taille

+1

-1

+1

II

+1

+1

+1

III

-1

-1

-1

IV

-1

+1

-1

VI

+1

-1

-1

VII

+1

+1

-1

VIII

-1

-1

+1

IX

-1

+1

+1

XI

0
0
0
Tab.III.3 : Description des conditions du plan dexprience

Les rponses du plan correspondent aux analyses de caractrisation dcrites au Chapitre 2.II,
appliques aux produits issus de chaque exprience (Fig.III.8). Le poids final est mesur et
rapport au poids initial de matire premire. Il traduit donc le rendement massique de
lextraction. Les principales impurets lies la chitine sont les protines et les minraux.
Leur quantit est mesure via le dosage des acides amins et par incinration respectivement.
De plus, elle est rapporte la quantit initialement prsente dans la matire premire, afin
den dduire leur degr dlimination (degr de dminralisation et de dprotinisation). La
mesure des lipides rsiduels a t nglige. Elle est rapidement confondue avec lincertitude
lie la mthode. Enfin, le degr de puret est estim par deux mthodes, le nettoyage des
produits par traitement au NaOH 1,25 N et par le bilan massique. Le rapport C/N est
galement analys et observ. Il constitue un indicateur complmentaire pour confirmer les
deux prcdentes mthodes.

Rendement en poids

Quantit de
minraux
rsiduels

Produit
d'hydrolyse
enzymatique
acide

Estimation
du degr
de puret

- purification
chimique
- bilan massique
- analyse
lmentaire

Quantit de protines
rsiduelles (aa)

Fig.III.8 : Rponses du plan dexprience : analyses de caractrisation des produits dhydrolyse tudies

105

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse


enzymatique
IV.1. Rsultats du plan dexprience
Les rsultats bruts du plan dexprience sont dabord prsents de la figure III.9 III.15.
Entre -7 min et t0, lvolution des mesures est essentiellement due lacidification pendant la
phase de stabilisation. partir de t0, les mesures correspondent la cintique de lhydrolyse
enzymatique par la pepsine sur les exosquelettes de crevettes, selon les conditions du plan
exprimental (Tab.III.4).
Les expriences aux conditions moyennes (points centraux, en vert) montrent une importante
variation des rsultats. Le rendement massique moyen est de 37,9 1,3 g/100 g. Les degrs
dlimination des minraux et des protines moyens sont de 97,2 1,6 % et 85,5 2,9 %
respectivement. Ceci traduit un manque de reproductibilit des expriences.
+1
-1
0

Temprature
[pepsine]
Sans contour
Contour
Taille fragments
Bleu
Jaune
Vert
Tab.III.4 : Lgende des rsultats du plan dexprience

Fig.III.9 : Rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience

Les rendements massiques, illustrs par la figure III.9, diminuent progressivement de


71,3 g/100 g 37,9 1,3 g/100 g pour les points centraux. Comme le tableau III.1 lexprimait
dj, les expriences se distinguent nettement en fonction de la taille des fragments, ds t0.
Pour les fragments suprieurs 2,5 mm, la masse du rsidu solide est de 78,1 g/100 g et de
64,4 g/100 g pour les fragments infrieurs 1 mm. Lcart se rduit au fur et mesure de
lhydrolyse. Aprs 6 h dextraction, les moyennes des rendements massiques sont de 39,6

106

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

4,4 et 34,5 2,6 g/100 g pour les tailles (+1) et (-1) respectivement. Seul leffet de la taille est
clairement visible sur la figure III.9.

Fig.III.10 : Quantit de minraux limins en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience

La figure III.10 exprime lvolution du degr de dminralisation. La lgende est identique au


prcdent graphique. Elle est complte par la courbe rouge qui illustre les pertes de minraux
loccasion de lacidification seule (points relis en rouge). Cette exprience a t mene
pour des tailles de fragments intermdiaires. Ds t0, on observe que les points bleus sont
situs sous la courbe tandis que les points jaunes sont au-dessus. On a donc un effet de la
taille sur la dminralisation. La diffrence de minraux rsiduels mesurs entre les deux
catgories de tailles se rduit au fur-et--mesure de lhydrolyse. Llimination des minraux
aprs 6 h dhydrolyse atteint en moyenne 98,8 0,4 et 93,1 3,3 % pour les tailles (-1) et
(+1) respectivement.

Fig.III.11 : Quantit de protines limines en fonction de la dure dhydrolyse Plan dexprience

107

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Une dmarche analogue est applique pour tudier la dprotinisation (Figure III.11). La
courbe rouge illustre la moyenne des pertes en protines loccasion de lacidification seule,
pour des tailles intermdiaires. Aucune limination significative de protines na t constate
partir de t0 (Fig.III.1). Lintroduction de la pepsine est donc ncessaire pour initier la
dprotinisation. La distinction entre les points bleus (grande taille) et jaunes (petite taille) est
nouveau trs visible. En moyenne la dprotinisation atteint 63,6 5,7 % et 86,4 3,8 %
pour les tailles (+1) et (-1) respectivement, aprs 6 h dhydrolyse. Leffet de la taille semble
donc dominer le contrle de la dprotinisation.

Fig.III.12 : Evolution du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse plan dexprience

Enfin, lanalyse lmentaire est exploite. Elle fournie plusieurs informations, dune part le
pourcentage de carbone, celle de lazote et donc le rapport entre les deux. Les teneurs en azote
et les rapports de C/N permettent de dgager certaines tendances. La figure III.12 illustre
lvolution du rapport C/N. La moyenne observe pour les points centraux, 6 h dhydrolyse,
est de 5,1 0,3. Celui de la matire premire est de 4,3 0,2. Les rapports C/N des points
bleus, voquant la grande taille de fragments, ne semblent pas varier significativement. Leur
moyenne se situe 4,3 0,4. Elle est proche de celle de la matire premire. Tandis que les
points jaunes, associs la petite taille de fragments, prsentent une augmentation relative du
rapport C/N. Leur moyenne est de 5,63 0,26 et il atteint jusqu 5,89 avec lexprience VII.
La part de lazote est un indicateur important. Le chapitre 2.V.4.1, voque que la gamme
thorique de teneurs en azote associs aux protines couvre celle de la chitine. Sur la base de
leur composition lmentaire, le pourcentage de N des acides amins est compris entre 7,73 et
32,16 %. Il se situe entre 6,89 et 8,26 % pour les drivs de la chitine. Ceci ce traduit par un
rapport C/N de 1,29 7,72 pour les protines et de 5,33 6,86 pour le chitosan et la chitine
respectivement. Le rapport C/N mdian des protines est de 4,5. Or les mesures effectues sur
la matire premire se situent autour de 4,3 0,2.
Le rapport C/N du produit solide de lhydrolyse enzymatique doit donc thoriquement crotre
et tendre vers 6,86. Les rapports C/N des rsidus solides du plan dexprience augmentent
progressivement jusqu un maximum de 5,89. Ceci montre une tendance vers la purification

108

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

de la chitine sans latteindre compltement.


Le raisonnement est identique pour la teneur en azote seule. Celle de la chitine est de 6,89 %
et celle du chitosan est de 8,26 %. Les produits issus de ce procd dextraction doivent
tendre vers 6,89 %. Lvolution de la teneur en azote (Fig.III.13) se distingue entre les gros
fragments (en bleu) et les plus petits (en jaune). La teneur en azote des produits issus de
lhydrolyse partir de substrats de petite taille, part de valeurs leves, autour de 10,51 %, et
tend vers des valeurs plus faibles et plus proche de celle de la chitine. La valeur minimale est
obtenue par lexprience VII (+1, +1, -1) avec 7,51 %. Toutefois, ce rsultat nindique pas le
degr de puret exacte de la chitine. Pour les produits issus dhydrolyse partir des fragments
de plus grande taille, la teneur en azote semble reste globalement constante.

Fig.III.13 : Evolution du pourcentage dazote en fonction de la dure dhydrolyse plan dexprience

Lestimation du degr de puret des produits, via le lavage chimique au NaOH, est prsent
en figure III.14.

Fig.III.14 : Estimation du degr de puret de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience

109

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

La lgende est identique aux prcdents graphiques. Une nette distinction entre les points
jaunes et les points bleus est nouveau constate. Lestimation du degr de puret en chitine
est faible lorsque la taille des fragments est grande, la moyenne 6 h dhydrolyse est de 57,6
6,5%. linverse quand la taille des fragments est plus petite, lestimation du degr de
puret est plus leve, avec 74,5 6,3 % de moyenne, aprs 6 h dhydrolyse. Lcart type
observ est important.
La quantit de chitine est galement dtermine partir du lavage chimique, elle est donc
associe aux mmes cart-types. La figure III.15 montre une variation de 20 30 g/100 g de
chitine. Cette amplitude semble dissocie des conditions dexpriences. En effet, la moyenne
des hydrolyses de 6 h, pour les plus petits et les plus grands fragments, atteint respectivement
25,4 1,8 et 22,5 0,9 g/100 g. Lcart est trs peu significatif. Par ailleurs, les cintiques
prsentent des estimations de quantits de chitine relativement constantes. Ceci semble
indiquer que le procd ninduise pas ou peu de pertes de chitine.

Fig.III.15 : Estimation de la quantit absolue de chitine par lavage au NaOH Plan dexprience

Pour conclure sur les rsultats bruts de ces expriences, intressons-nous aux caractristiques
des produits obtenus aprs 360 min dhydrolyse enzymatique (Fig.III.16a et b).

100

90

Protines limines (%)

Minraux limins (%)

100

80

70

60

50

90

80

70

60

50
I

II

III

IV

VI

VII

VIII

IX

II

III

IV

VI

VII

VIII

Fig.III.16 : Degrs dlimination (%) des minraux (a) et des protines (b) en fonction de lexprience

110

IX

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

Sur la figure III.16, lexprience M correspond la moyenne des trois produits des cintiques
intermdiaires (0, 0, 0). Lcart-type associ ces cintiques est report chaque exprience.
Il est estim 1,8 et 3,3 % pour le degr de dminralisation et de dprotinisation. Les
expriences illustres en jaune, pour les petites tailles, se distinguent par leurs meilleurs
degrs dlimination. Parmi ces expriences, la IV (-1, +1, -1) et la VII (+1, +1, -1) prsentent
les meilleurs rsultats, respectivement 99,5 et 98,5 % pour la dminralisation, 86,3 et 92,4 %
pour la dprotinisation. Elles ont en commun lemploi dune forte concentration en pepsine,
applique aux petites tailles des fragments.
Le degr de dminralisation est satisfaisant compar au rendement obtenus par dautres
procds extraction biologique (Cf. chapitre 4, section I ; Xu et al. 2008) et au regard des
objectifs qualitatifs industriels. linverse, la teneur en protines rsiduelles est encore
leve, bien que ces degrs de dprotinisation se situent dans la mme gamme des rsultats
des tudes similaires (Cf. chapitre 4, section I ; Xu et al. 2008).

Estimation d de puret (%)

100

Rapport C/N

80

60

40

20

0
EXP I

EXP II

EXP III

EXP IV

EXP 0

EXP VI

EXP VII EXP VIII EXP IX

EXP I

EXP II

EXP III

EXP IV

EXP 0

EXP VI EXP VII EXP VIII EXP IX

Fig.III.1 : Estimation du degr de puret (a) et rapport C/N (b) en fonction de lexprience

La figure III.17 montre lestimation du degr de puret par le lavage au NaOH (a) et le
rapport C/N (b) des produits aprs 6 h dhydrolyse par la pepsine. La lgende est identique
la prcdente figure. Les expriences IV et VII prsentent des estimations de degr de puret
et de rapport C/N plus levs. Ces expriences ont galement en commun la concentration en
pepsine la plus leve, applique aux plus petits fragments. En plus de leffet taille, dj
signal, la concentration en pepsine semble donc amliorer les performances de lhydrolyse
enzymatique.

111

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

IV.2. Rsultats de lanalyse statistique


Le traitement des rsultats du modle III.1 par STATGRAPHIC est bas sur une analyse de
la variance, selon une rgression par un modle linaire gnralis. Un tableau danalyse des
variances est tabli et permet destimer la significativit des variables. Le niveau de confiance
est fix 5 %. Les coefficients discuts sont les valeurs p (ou p-value) et les ratios F (ou ratio
F). Le premier permet de valider lhypothse selon laquelle le facteur un effet (si la p-value
ne dpasse pas 0,05) et le second, compare la robustesse du modle. Les conclusions de ces
analyses sont valables uniquement pour le domaine dtude dcrit par le tableau III.2.
Le traitement statistique est appliqu aux rsultats du plan dexprience (de t0 t360), ce qui
reprsente 120 rsultats pour chaque rponse tudie. Lintrt est particulirement port sur
la dminralisation et la dprotinisation.
IV.2.1. Degr de dminralisation
Le modle retenu pour le degr de dminralisation, est dduit par lquation III.2 :
-2

-4

D dminralisation (%) = 53,4 + 0,2*Tps + 0,6*T 10,4*Taille + 2,5*10 *Tps*Taille - 3,8*10 *Tps (III.2)

Lquation III.2 exprime que laugmentation de la dure dhydrolyse et de la temprature


pepsine favorise la perte en minraux. linverse, la taille des fragments doit diminuer pour
aider la dminralisation. Le R est de 70,5 % et le R ajust est de 69,2 %. Les
caractristiques des coefficients statistiques sont dtailles dans le tableau III.5 :
Facteurs

Coefficients

Ratio-F

p-value

Dure

0,2

121,01

0,0000

Temprature

0,6

5,10

0,0258

Taille

10,4

92,59

0,0000

15,45

0,0001

Dure*Taille

-2

2,5*10

-4

Dure
3,8*10
40,64
0,0000
Tab.III.5 : Statistiques appliques au degr de dminralisation

Lanalyse des p-values valide leffet de la dure dhydrolyse, de la taille des fragments et,
dans une moindre mesure, celle de la temprature dont la p-value est plus leve. De plus, il
existe un effet de linteraction entre la dure dhydrolyse et la taille des fragments, ainsi quun
effet quadratique de la dure dhydrolyse. Le coefficient le plus important est celui associ
la taille des fragments de substrat, dmontrant le poids de ce facteur. linverse, leffet de la
concentration en pepsine na pas deffet significatif sur la dminralisation.
La figure III.18 reprsente le degr de dminralisation estim par lquation III.2 en fonction
de la taille de fragments et de la dure dhydrolyse :

112

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

Degr de
dminralisation (%)

Fig.III.18 : Reprsentation du degr de dminralisation en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de


la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine, 40C, selon lquation III.2

La lgende de la figure III.18 indique que les meilleures performances de dminralisation


tendent vers le rouge sombre, cest--dire lorsque la taille des fragments de matire premire
est infrieure 1 mm et que la dure dhydrolyse augmente. Ces prdictions sont confirmes
par les rsultats observs et dcrits la section prcdente. Cependant, le modle prdit des
performances au-del de 100 %. On peut supposer que le modle ne dcrive pas parfaitement
le phnomne. En effet, la structure polynomiale ne tend pas vers une stabilisation de la perte
en minraux en fin dhydrolyse enzymatique. Une modlisation plus fine devrait permettre de
dcrire plus prcisment la dminralisation la section V.
IV.2.2. Le degr de dprotinisation
La mme dmarche est applique llimination des protines. Le degr de dprotinisation
est dcrit par la relation III.3 et les indicateurs statistiques sont prsents par le tableau III.6 :
-4

D dprotinisation (%) = 43,1 + 0,2*Tps - + 0,5*[pep] 12,2*Taille - 4,1*10 *Tps

Facteurs
Dure

Coefficients

Ratio-F

p-value

0,2

91,64

0,0000

[pepsine]

0,5

5,85

0,0173

Taille

12,1

158,15

0,0000

(III.3)

-4

Dure
4,1*10
29,33
0,0000
Tab.III.6 : Statistiques appliques au degr de dprotinisation

Le tableau III.6 montre un incontestable effet de la taille des fragments. De mme, la dure de
lhydrolyse a un impact et montre un effet quadratique sur la dprotinisation. La temprature
na pas deffet significatif, sa p-value dpasse 0,05. La concentration en pepsine prsente un
effet moins significatif que celui des autres facteurs. Lquation III.3, prdit de meilleures
performances de dprotinisation lorsque la dure dhydrolyse et la concentration en pepsine
augmentent dune part, et la taille des fragments de substrat dcrot dautre part. Leffet
quadratique de la dure dhydrolyse est galement prsent. Le R associ lquation est de
82,1 % et le R ajust de 81,5 %. La figure III.19 du modle estim par lquation III.3, en
113

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

fonction de la dure dhydrolyse et de la taille des fragments, pour 15 % de pepsine et 40 C.


Degr de
dprotinisation (%)

Fig.III.19 : Reprsentation du degr de dprotinisation en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de


la taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C

La lgende de la figure III.19 est identique la prcdente. Les meilleures performances de


dprotinisation sont atteintes, en rouge sombre, lorsque la taille des fragments de matire
premire est infrieure 1 mm et que la dure dhydrolyse augmente.
IV.2.3. Estimation du degr de puret
Lvolution du rapport C/N en fonction de lvolution des facteurs est dcrite par la relation
III.4 et les coefficients statistiques associs ce modle sont dtaills dans le tableau III.7:
-3

-2

C/N = 4,1 + 2,0*10 *Tps + 1,9*10 *[pep] 0,4*Taille

Facteurs
Dure
[pepsine]

Coefficients

Ratio-F

p-value

-3

85,05

0,0002

-2

9,28

0,0029

2,0*10
1,9*10

(III.4)

Taille
0,4
182,90
0,0000
Tab.III.7 : Statistiques appliques au rapport C/N

Contrairement aux prcdentes rponses, leffet quadratique nopre pas significativement sur
le rapport C/N. Leffet de la dure dhydrolyse est confirm, bien quil soit moins marqu que
prcdemment. La temprature est sans impact (sa p-value dpasse largement 0,05), tandis
que la concentration en pepsine a un effet limit. Le facteur qui se distingue est nouveau la
taille des fragments de matire premire. Daprs lquation III.4, le rapport C/N augmente
lorsque la concentration en pepsine et la dure de lhydrolyse augmentent, et que la taille des
fragments de substrat est rduite au-del de 1 mm. Le R et le R ajust du modle atteignent
respectivement 70,3 % et 69,56 %. La rponse du modle, illustre par la figure III.20, se
distingue des prcdentes du fait de sa surface plane, associe labsence deffet quadratique
et dinteractions.
114

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

C/N

Fig.III.20 : Reprsentation du rapport C/N en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la taille des
fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C

Quant lestimation de la quantit de la chitine, aprs traitement chimique par NaOH, elle
semble correctement dcrite par la relation III.5 :
-4

Estimation chitine (%) = 37,5 + 0,2*Tps + 0,4*[pep] 7,7*Taille - 2,5*10 *Tps

(III.5)

Le R de lquation III.5 est de 68,1 % et le R ajust est de 67,0 %. Comme pour le rapport
C/N, la temprature na pas dimpact sur lhydrolyse (la p-value est suprieure 0,5) et celui
de la concentration en pepsine est faible (p-value de 0,235), comme le montre le tableau III.8.
Contrairement au rapport C/N, leffet quadratique de la dure dhydrolyse est significatif.
Facteurs

Coefficients

Ratio-F

p-value

Dure

0,2

44,21

0,0000

[pepsine]

0,4

5,27

0,0235

Taille

7,7

81,39

0,0000

-3

Dure
2,5*10
13,35
0,004
Tab.III.8 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH

Laugmentation de la masse rsiduelle aprs traitement chimique au NaOH est favorise par
laugmentation de la dure dhydrolyse, de la concentration en pepsine et par la rduction de
taille des fragments de substrat.
IV.2.4. Rcapitulatif des analyses statistiques
Le rendement massique est une combinaison des prcdentes rponses, tous les facteurs
interviennent (III.8). Cependant, limpact de la concentration en pepsine est moindre par
rapport aux autres facteurs, sa p-value est de 0,0092 et son ratio-F est de 7,02. Leffet de
linteraction entre la dure de lhydrolyse enzymatique et la taille des fragments est galement
limite, la p-value et le ratio-F sont de 0,005 et 8,19 respectivement. Le tableau III.9 dtaille
les rsultats du traitement statistique associ au modle de prdiction III.6

115

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

-2

-4

Rdt massique = 87,8 - 0,2*Tps - 0,6*T - 0,2*[pep] + 6,9*Taille 1,1*10 *Tps*Taille + 2,9*10 *Tps (III.6)

Facteurs

Coefficients

Ratio-F

p-value

Dure

0,2

181,94

0,0000

Temprature

0,6

14,73

0,0002

[pepsine]

0,2

7,02

0,0092

Taille

6,9

109,79

0,0000

8,19

0,0050

-2

Dure*Taille

1,1*10

-4

Dure
2,9*10
67,15
0,0000
Tab.III.9 : Statistiques appliques au rendement massique aprs traitement chimique au NaOH

Lobjectif pour le rendement massique est datteindre la masse correspondante la chitine


seule, soit une masse infrieure 30 g/100 g. Daprs la figure III.21, lobjectif est obtenu
lorsque la dure dhydrolyse est augmente et la taille des fragments rduite 1 mm. Aucune
dduction sur la qualit de la chitine ne peut tre avance daprs cette seule rponse.

Rendement
massique (%)

Fig.III.21 : Reprsentation du rendement massique en fonction de la dure dhydrolyse enzymatique et de la


taille des fragments de substrat, 15 % de pepsine et 40C

Afin de vrifier la cohrence entre les rponses, le tableau III.10 rsume et compare quels
facteurs ont un effet sur chacune des rponses, et indique si cet effet est positif ou ngatif.
Rponses

Dure

Temprature

Concentration

Taille

en pepsine

fragments

D de dminralisation

D de dprotinisation

Rapport C/N

Nettoyage chimique

Rendement massique
+
Tab.III.10 : Comparaison des effets sur les diffrents aspects de lhydrolyse par la pepsine

Leffet de linteraction entre la dure de lhydrolyse enzymatique et de la taille des fragments


nest pas reprsent. Laugmentation de la temprature favoriserait la dminralisation.

116

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

Laugmentation de la concentration en pepsine semble favorable la dprotinisation et la


purification de la chitine, daprs le lavage au NaOH et le rapport C/N. Laugmentation de la
temprature et de la concentration en pepsine amliore le rendement massique. La taille des
fragments dexosquelette de crevettes est sans conteste llment dont leffet est le plus
marqu. La borne minimale du plan dexprience englobe lensemble des morceaux infrieurs
1 mm. Or daprs ltude de Marquis-Duval (2008) au-del de cette borne, la taille
ninfluence plus la cintique de dminralisation. Gnralement, les cart-types associs aux
rsultats des cintiques taient suprieurs pour les tailles de fragments suprieures 2,5 mm.
Ceci est la consquence dune plus forte htrognit du substrat dans cette catgorie de
taille. En effet, le tri des fragments a certainement retenu tous les rsidus de taille varie audel de 2,5 mm, compars ceux dont la forme devait traverser les tamis (Cf. Fig.II.7).
Enfin, les conclusions sur les effets des facteurs sur le rapport C/N paraissent incohrentes.
Dune part le modle ne prsente par de convergence asymptotique, dautre part, leffet de la
taille nest pas significatif. Il semble que le domaine dtude soit trop restreint par rapport
lchelle des valeurs de C/N obtenues.
Parmi les facteurs, la temprature, le ratio enzyme/substrat, le pH, le mode de prparation du
substrat et le mode dagitation du milieu ractif sont connus pour influencer les ractions
enzymatiques. Les trois derniers paramtres cits ont t figs pour ces expriences et
naffectent pas le plan dexprience. La taille initiale des fragments est indniablement le
facteur le plus important, quelque soit la rponse analyse. Cependant, laspect de la surface
des fragments nest pas connu et pourrait tre tudi davantage pour dterminer si
laccessibilit est complte ou non.
Le traitement statistique est limit par sa structure polynomiale. Nanmoins, les rsultats
montrent un vident manque de performances vis--vis du degr de dprotinisation. Les
possibilits envisages ce stage de ltude sont un lavage chimique complmentaire ou
lallongement de la dure dhydrolyse enzymatique. La seconde hypothse est tudie dans la
section IV.3. Si aucun traitement complmentaire nest pratiqu, le produit peut tre vendu
comme intermdiaire pour la fabrication du chitosan ou dun autre driv de la chitine.

IV.3. largissement du domaine dtude pour la dprotinisation


IV.3.1. Augmentation de la concentration en pepsine
Les prcdents rsultats et leurs conclusions invitent poursuivre les expriences dans le sens
de laugmentation de la concentration en pepsine, afin damliorer la dprotinisation. Deux
concentrations sont exprimentes, 25 % et 41 % de pepsine par rapport la quantit de
protines (soit prs de 3 % et 5 % par rapport au poids de matire premire). Au regard des
prcdents rsultats, la temprature est fixe 40 C et la taille de fragments dexosquelette
est infrieur 1 mm. La cintique est galement suivie six heures.
La figure III.22 montre les cintiques obtenues avec 25 % de pepsine. Le rendement massique
atteint 30,3 g/100 g aprs 6 h dhydrolyse. Le rsidu solide contient 0,3 g/100 g de minraux
et prs de 3,5 g/100 g de protines. Par le bilan massique, la quantit de chitine atteindrait
donc 26,5 g/100 g, or le nettoyage chimique par NaOH estime le degr de puret 87,2 %, ce
117

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

qui correspond la mme quantit de chitine de 26,5 g/100 g. Les diffrentes mthodes de
quantification de la chitine convergent bien vers le mme rsultat (Cf. Fig.II.11). Bien que les
performances de dprotinisation et dminralisation soient amliores par rapport au plan
dexprience, le rapport C/N, non illustre ici, atteint 5,7. Cette valeur est lgrement
infrieure au rapport C/N de lexprience VII, soit 5,9. Ceci montre le manque de sensibilit
de lanalyse par rapport la faible amlioration de la purification de la chitine.

Fig.III.22 : Hydrolyse enzymatique par 25 % de pepsine (T 40 C Taille < 1 mm)

Comme cela avait dj t observ pour le plan dexprience, les cintiques du rendement
massique et de la dprotinisation semblent sattnuer lentement. Celle de la dminralisation
est rapide les 10 premires minutes, puis ralentit. Au-del de 30 min, la quantit de minraux
rsiduels volue peu. Les mmes constatations sont valables pour lhydrolyse suivante, par
41 % de pepsine (Fig.III.23).

Fig.III.23 : Hydrolyse enzymatique par 41 % de pepsine (T40 C Taille < 1 mm)

118

IV. Optimisation de lextraction de la chitine par hydrolyse enzymatique

Aprs 6 h dhydrolyse, le rendement massique est de 28,2 g/100 g. Le rsidu solide contient
0,2 et 2,9 g/100 g de minraux et protines respectivement. Le degr de puret, obtenu par
lavage au NaOH, est estim 93,2 % et le rapport C/N atteint 6,2. Ces valeurs indiquent une
meilleure purification de la chitine par rapport aux prcdentes cintiques. Les mthodes de
quantification de la chitine ne convergent pas toutes vers la mme valeur (Fig.III.24),
contrairement la cintique 25 % de pepsine (Fig.II.11), ce qui confirme les limites de
chacune. Nanmoins, elles semblent indiquer une stabilisation de la quantit de chitine autour
de 26,5 g/100 g aprs 6 h dhydrolyse enzymatique.

Quantit de chitine (g/100g)

50
40
y = -0,034x + 36,78

y = 0,003x + 28,83

30
y = -0,002x + 27,15

20

y = -0,010x + 30,80

10
0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure d'hydrolyse enzymatique (min)


Fig.III.24 : Comparaison des mthodes de quantification de la chitine (en rouge, via le bilan massique ; en bleu,
via le lavage au NaOH ; en vert, via lanalyse lmentaire ; en orange, via le Cp dtermin par CPG)

IV.3.2. Augmentation de la dure dhydrolyse


La dure dhydrolyse de 6 h est-elle suffisante ? Au regard des rsultats prcdents, ce facteur
a un impact certain et la cintique de dprotinisation ne montre pas de stabilisation finale. Ce
qui laisse supposer que la dprotinisation peut tre amliore par un allongement de la dure
dhydrolyse enzymatique. La figure III.21 expose les rsultats du traitement des exosquelettes
de crevettes par 25 % de pepsine pendant 12 h, compar ceux obtenus aprs 6 h dhydrolyse
avec la mme concentration en pepsine.

Quantit en g/100g

30

6h

25

12h

20
15
10
5
0
Rdt massique

Minraux

Protines

Chitine bilan Chitine NaOH

Fig.III.25 : Comparaison des extractions par 25 % de pepsine entre 6 h et 12 h dhydrolyse (n=3)

119

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

La figure III.25 montre que le degr de dminralisation nest pas amlior par lallongement
de la dure dhydrolyse. La quantit de protines rsiduelle semble diminuer, toutefois
lanalyse de variance invite rester prudent sur ce point. En revanche, le rendement massique
aprs 12 h dhydrolyse est nettement amlior, avec 26,4 g/100 g, il gagne 4,3 g/100 g par
rapport lextraction de 6 h. Cette perte de masse est-elle lie une augmentation de la puret
en chitine ou une perte de chitine ? Le degr de puret en chitine est estim via le lavage au
NaOH 88,1 2,0 %, ce qui correspond une quantit de chitine de 22,9 g/100 g. Le bilan
massique indique une quantit de chitine de 24,3 0,2 g/100 g. Dans les deux cas, ces valeurs
sont significativement plus faibles que celles atteintes aprs 6 h dhydrolyse. Le rapport C/N
est de 6,33 0,04, peu diffrent du rapport C/N aprs 6 h dhydrolyse. Ceci semble aller dans
le sens dune faible augmentation de la puret en chitine mais dune perte possible de chitine.

V. Modlisation
V.1. Introduction
Les cintiques du plan dexprience et celles hors du plan dexprience (25 et 41 % de
pepsine) sont exploites pour modliser la dminralisation et la dprotinisation. Les
expriences sans enzymes sont galement utilises. Ceci reprsente au total 316 rsultats par
rponses tudies. Lensemble de ces donnes est trait laide du logiciel MATLAB 6,5.
Les simulations et estimations paramtriques sont crites par des routines spcifiques. Des
exemples de modles de rfrence, qui peuvent inspirer notre tude, vont tre dcrits
maintenant.
(a) Modle de rfrence
Le modle classique, gnralement admis pour les cintiques enzymatiques, est lquation de
Michalis-Menten (III.7) :
v max * S
(III.7)
vi
Km S
vi : vitesse initiale, vmax : vitesse maximale, S : concentration en substrat, Km : constante de Michalis-Menten

(b) Modlisation en fonction de la temprature


La loi dArrhnius exprime linfluence de la temprature (T) et de lnergie dactivation (E)
sur la cintique (III.8)
-E1
-E 2
(T) = a 2 e RT a1e RT b

(III.8)

o b est une constante, a1 et a2 sont des constantes particulires, dite pr-exponentielles ou


facteurs de frquence, car elles tiennent compte de la frquence de collision et des effets
striques. R est la constante des gaz parfait. Daprs cette loi, les ractions dont les nergies
d'activation sont les plus faibles ont les cintiques les plus rapides et inversement.

120

V. Modlisation

(c) Modlisation en fonction de la taille des fragments


La taille des fragments du substrat peut galement tre modlise. Le rapport surface/volume
(S/V) des fragments est dterminant car le rendement de conversion est dautant plus lev
que la surface de contact est accessible aux enzymes. Par un mcanisme dadsorption, les
enzymes se fixent prs du site lyser avant dtre active (Fig.III.26). Movagarnejad et al.
(2000) expliquent comment ce rapport influence lvolution de la taille des particules (III.9) :

1 S
dTaille des fragments
Ke *Vr * Cs
dt
s V P

(III.9)

Ke est une constante, Vr est le volume du racteur, Cs et s sont respectivement la concentration et la densit

Gnralement, la taille des fragments diminue progressivement au cours de la raction.


Vauchel (2007) a tudi lvolution de la taille des morceaux dalgues L. digitata pendant
lextraction de lalginate. Elle propose une cintique du 1er ordre (III.10) :

dD
KD( D D min)
dt

(III.10)

D reprsente le diamtre moyen des morceaux dalgues (en mm), Dmin et D0 sont les diamtres moyens finaux et
initiaux respectivement. KD est le facteur associ la cintique de dstructuration des algues.

Dans ces deux exemples, la taille est une variable en rponse la raction et non un facteur. Il
est galement possible de modliser la rduction des DP des polysaccharides. Il faut
distinguer le rapport S/V et laccs aux sites de coupures, les deux sont lis et ont
gnralement un effet sur la cintique. De plus, pour lhydrolyse des polymres, telle que la
chitine, on sait que des zones amorphes et cristallines se rpartissent dans la matire premire.
Les zones amorphes sont davantage accessibles aux enzymes et donc plus rapidement
hydrolyses. Lorsque cette zone est hydrolyse, lindice de cristallinit augmente. Puis les
enzymes hydrolysent les zones cristallines (Bansal et al. 2009). Par consquent, le temps
dadsorption entre lenzyme et son substrat (Fig.III.26) est diffrent pour ces deux tapes et
complexifie la modlisation.

Adsoption
E-S

Hydrolyse

Adsorption

Dsorption

H2O

ES

Fig.III.26 : tapes du mcanisme dhydrolyse enzymatique (Hosseini et al. 2011)

(d) Modlisation en fonction de la dure dhydrolyse


Le modle classique de la dure de la raction est gnralement dcrit par lquation (III.11) :
dS
kS
dt

(III.11)

S est la concentration en substrat, k la constante reprsentative de la vitesse de cintique et t le temps

121

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Cette quation sadapte en fonction des spcificits des ractions. Daprs Bansal et al. (2009)
les hydrolyses enzymatiques constituent un systme de ractions htrognes qui rpondent
une combinaison de cintiques. Cest gnralement le cas pour des hydrolyses enzymatiques
appliques une matire premire complexe telle que lexosquelette de crustacs. Bansal et al
(2009) rapportent que ces systmes constituent un ensemble de cintiques qui respectent un
ordre n, dont les constantes de vitesse dpendent du temps et dont la production nest pas
uniforme. La nature fractale de ces systmes augmente mesure que les obstacles laccs
aux sites de coupures apparaissent. Valjamae et al. (2003) modlisent la production de P
(III.12) :
1 h

P(t ) = P0 (1 e kt )

(III.12)

h reprsente lexposant de la cintique fractale, h et k sont des constantes empiriques.

V.2. Modlisation de la dminralisation


Pour tablir le modle adquat, la dmarche consiste composer une quation qui tient
compte des principes dcrits ci-dessus. Elle est ensuite confronter aux rsultats obtenus. Le
sse (sum square error) et le rmse (root-mean-square error) sont des indicateurs relatifs
de validation du modle par les rsultats observs. Soit M la quantit de minraux (en
g/100g). Les valeurs des rponses ont t normalises pour cette modlisation (Cf. Tab.III.2).
La cintique de dminralisation peut scrire :
dM
km(T , Pep, Ta) M
dt

(III.13)

Daprs les prcdentes observations, deux phases semblent caractriser la cintique de


dminralisation. Par consquent, lquation est compose de deux compartiments, M1 et M2 :

M M1 M 2
dM 1
km1(T , Pep, Ta) M 1
dt

et

dM 2
km 2(T , Pep, Ta) M 2
dt

(III.14)
(III.15)

Le premier modle propos, nomm MA, (Fig.III.27) tient compte de tous les facteurs
(taille des fragments, concentration, temprature), travers deux compartiments (III.16). Les
valeurs exploites ont t normalises :

Km1 16.8 5.2 Ta 2.57 T 2.03 [ Pep]


Km2 1.24 0.98 Ta 0.09 T 0.01 [ Pep]
M 1(0) 18.45 et M 2(0) 6.55

(III.16)

Facteurs
Cintique rapide (M1)
Cintique lente (M2)
Taille des fragments
0,31
0,79
Temprature
0,15
0,07
Concentration en pepsine
0,13
0,01
Tab.III.11 : Impact relatif des variables sur les deux composantes du modle M A

Ce modle explique que la vitesse de disparition des minraux est suprieure au cours de la

122

V. Modlisation

premire tape M1, par rapport la seconde M2. Par exemple, pour les expriences aux
conditions intermdiaires (0,0,0), le km1 est suprieur km2, soit 16,8 et 1,2 h-1 respectivement.
De plus, le tableau III.11 montre que la taille des fragments agit sur les cintiques de faon
marque. Son impact relatif domine ceux des autres facteurs, avec 31 % et 79 % pour les
composantes M1 et M2 respectivement. linverse, limpact relatif de la concentration en
pepsine est trs faible, 13 % et 1 % respectivement.

Fig.III.27 : Confrontation entre le modle MA et les mesures observes, sse = 136 et rmse = 1,01

Sur la figure III.27, laxe des abscisses reprsente la dure dhydrolyse enzymatique. Pour
cinq cintiques (sans enzyme, lexprience VII et intermdiaire du plan dexprience, avec 25
et 41 % de pepsine), le modle MA est compar aux valeurs observes. On observe une bonne
concordance entre les deux. Elle se rvle plus leve pour lexprience VII (petite taille de
fragments, forte concentration et temprature 43 C) et lorsque la concentration en pepsine
atteint 41 %.

Ce modle peut tre perfectionn en considrant une transition plus progressive entre
la composante rapide et la composante lente de la dminralisation. Pour dcrire ce
phnomne, il est possible de retenir un modle du premier ordre (III.17) :

Km 0.46 (1 0.99 Ta 0.48 Ta ) M

(III.17)

Ce modle, MB, prsente un sse et un rmse plus levs, 205 et 1,21 respectivement. La figure
III.28 montre une meilleure concordance entre le modle et les mesures rellement observes.
Pour ce modle, les cinq expriences tmoins ne semblent pas tre reprsentatives de
lensemble des donnes traites. Par ailleurs, ce modle ne fait intervenir que le facteur taille
car le prcdent modle indiquait leur faible impact.
Enfin, la structure modle MB est lie lvolution de la quantit de minraux dans le milieu.
Par consquent, la courbe associe au modle MB dcrot moins rapidement que celle du
modle MA, du fait de la rarfaction de la quantit de minraux.

123

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Fig.III.28 : Confrontation entre le modle MB et les mesures observes, sse = 205, rmse = 1,21

Un autre modle, MC, est tabli en intgrant nouveau lensemble des facteurs. La
structure conserve le principe du polynme associ la quantit de minraux. En ralit il
sagit de trois polynmes, un par facteur tudi. Le dernier terme M indique galement
que la cintique de dminralisation est lie la quantit de minraux prsents (III.18) :
dM
0.05 (1 4.53M ) (1 1.65 Ta 0.89 Ta 0.19 T 1.33 T 0.02 [ pep] 0.68 [ pep]) M
dt

(III.18)

La figure III.29 compare le modle de prdiction aux valeurs mesures. Le sse et le rmse sont
meilleurs, respectivement 118 et 0,93. Cependant, les cintiques observes sont davantage
loignes du modle par rapport au prcdent modle MB, pour les cinq cintiques tmoins.

Fig.III.29 : Confrontation entre le modle C et les mesures observes, sse = 118 et rmse = 0,93

124

V. Modlisation

Lquation III.18 et le tableau III.12 montre le poids de chaque facteur. La taille initiale des
fragments est le facteur dominant, suivi de la temprature. Linfluence de la concentration est
trs faible. Tous sont directement dpendants de la quantit de minraux prsents. Lorsquelle
diminue, la cintique ralentie.
Facteurs
Pondration
Taille des fragments
2,54
Temprature
1,33
Concentration en pepsine
0,70
Tab.III.12 : Impact relatif des variables sur le modle MC

Pour conclure, le meilleur modle pour prdire la dminralisation semble tre le modle MC.
Il confirme les conclusions apportes par lanalyse statistique du plan dexprience
concernant limpact ngligeable de la concentration en pepsine et le faible impact de la
temprature. La taille initiale des fragments constitue le principal effet sur la cintique de
dminralisation.

V.3. Modlisation de la dprotinisation


La mme dmarche est pratique pour dterminer le modle optimal de la dprotinisation.
Soit P la quantit de protines (en g/100 g). Les variations de mesures des protines se sont
rvles importantes et constituent une difficult majeure pour construire le modle prcis.
La cintique de dprotinisation devrait respecter la formule gnrale suivante :
dP
km(T , Pep, Ta) P
dt

(III.19)

La vitesse km peut tre affine par des fonctions spcifiques cette raction. Les modles
simples un seul compartiment ont prsents des sse trs levs, autour de 2 130 (Tab.III.13).
Des fonctions sigmodes ont t ajoutes. Ce type de fonction, de forme xn/(xn+an) et dordre
n, est souvent li au comportement denzymes allostriques. Ces enzymes sont sensibles
une modulation de leurs activits par des molcules appels des effecteurs. Le sse est alors
amlior, il atteint 1 585. Par la suite, les recherches se sont orientes vers un modle deux
compartiments P1 et P2 :

P P1 P2

(III.20)

Enfin, la fonction sigmode, associe au comportement allostrique, est intgre dans la


structure en deux composantes. Le sse atteint alors 1073. Notons que les valeurs exploites
ont t normalises pour faciliter la modlisation, exceptes la concentration en pepsine
lorsquelle intgre la fonction sigmode. Le tableau III.13 prsente la progression de la
dmarche vers le modle adquat et leur sse, en fonction des simulations :

125

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Conception du modle
Sse
1 compartiment : f polynomiales (T, [pep] et Taille)*P
2133
1 compartiment : f polynomiales (T, Taille) et f ([pep] et P) dordre 1
2135
1 compartiment : f polynomiales (T, Taille) et f sigmodes ([pep] et P) dordre 0,5 2,7 pour P
2126 1276
2 compartiments : f linaires (T, [pep] et Taille)*P
1796
2 compartiments : f linaires (T et Taille)*P et sigmodes ([pep]) dordre 1
1443
2 compartiments : f polynomiales (T et Taille)*P et sigmodes ([pep]) dordre 1
1108
2 compartiments : f polynomiales (Taille)*P et sigmodes ([pep]) dordre 1
1127
2 compartiments : f polynomiales (Taille)*P, sigmodes [pep] (n=1) et P (n1=2,5 et n2=1,6)
1087
2 compartiments : f polynomiales (Taille)*P, sigmodes [pep] (n=1) et P (n1=1,1 4,3 et n2=0)
1072
Tab.III.13 : Description dtaille des recherches de modlisation de la dprotinisation

Le tableau III.13 montre une amlioration du sse par des modles deux compartiments et par
lintroduction des fonctions sigmodes, appliques la concentration en pepsine et la
quantit de protines. Le tableau III.13 ne montre quun chantillon des modles tests
partir de nos observations, qui ont permis de prciser les constantes des fonctions sigmodes.
Le modle retenu comporte deux compartiments, chacun constitu :
- dune fonction polynomiale, associe la taille,
- dune fonction de type Monod, associe la concentration en pepsine,
- dune fonction sigmodes dordre n1=1,5 et n2=1,6, associe la quantit de protines.
Soit (III.21) :
2 .5
dP1
[Pep]
0.35 0.33 Ta 0.10 Ta
2 .5 P1 2 .5 P1
dt
[Pep] 0.45 P1 5.88
1.6
dP2
[Pep]
10.91 10.73 Ta 0.80 Ta
1.6 P1 1.6 P 2
dt
[Pep] 0.10 P1 5.88
P1(0) 20.05 , P2( 0 ) 12.24 , donc P(0) 32.29
(III.21)
La temprature sest rvle tre ngligeable pour cette modlisation. La quantit de protines
linstant t0 de lhydrolyse enzymatique est estime 32,29 g/100 g par le modle, tandis que
les mesures observes en laboratoire se situent entre 29 et 38 g/100 g. Le modle semble donc
satisfaisant. Il est illustr par la figure III.30 :

Fig.III.30 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1087 et rmse = 3,14

126

V. Modlisation

Le modle slectionn dpend principalement de la taille initiale des fragments de matire


premire et il est modul par la concentration en pepsine. La temprature nintervient pas,
comme lavait conclue lanalyse statistique de la section IV. Enfin, une allostrie ngative
semble limiter la dprotinisation. Elle est lie la quantit de protines et plus exactement
aux liaisons peptidiques, substrats de la pepsine. Elle est lie soit au manque daccessibilit
des liaisons peptidiques rsiduelles, soit une rtro-inhibition des peptides librs.
La prsence de sites allostriques sur les enzymes a t mise en vidence ds 1963 par
Monod, Changeux et Jacobs. Les effecteurs qui agissent sur ces sites ont soit un effet
coopratif, soit inhibiteur (Monod et al. 1965). On distingue les effecteurs homotropes19 et
htrotropes, dont la nature diffrente du substrat implique une affinit infrieure (Koshland,
1970). Ils affectent les cintiques enzymatique comme lillustre les figures III.31.a et III.31.b :

Fig.III.31 : Effets inhibiteur et activateur selon laffinit avec les effecteurs forte (a) ou faible (b)

Fig.III.32 : Interaction et formation du complexe ENZYME-SUBSTRAT-EFFECTEUR

Lexistence de sites modulateurs proximit du site actif est illustre par la figure III.32.
Lorsque leffecteur comble le site modulateur, des changements de conformation modifient
lactivit de lenzyme. Atkins (2005) dcrit la reprsentation classique de la vitesse de
raction enzymatique en fonction de la concentration en substrat comme tant une hyperbole.
En prsence deffecteurs allostriques, la cintique est reprsente par une sigmode. Bien que
certains inhibiteurs de la pepsine soient connus, telle que la globuline-11S (Rassam et Laing,
2006) et la pepstatine (Fruton, 1976), peu dtudes font part des effets allostriques. Turk
(2006) voque le rle des glycosaminoglycanes sur la rgulation de protases telle que
lhparine sur des thrombines20. Or ces composs sont galement des polysaccharides.
19
20

De mme nature que le substrat


Protases responsables de la coagulation du sang

127

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Daprs la comparaison entre nos rsultats et les modles classiques, nous sommes en
prsence deffets allostriques faibles lencontre de la protolyse. Nous ne connaissons pas
la nature des effecteurs. Lhypothse la plus vraisemblable est dtre en prsence deffecteurs
de nature protique. Leur conformation partagerait des similitudes avec les acides amins
aromatiques reconnus par la pepsine. Par consquent, le modle slectionn parmi tous les
modles tudis est celui qui favorise leffet allostrique associ la quantit de protines P,
dans les deux compartiments. En poursuivant les investigations, un nouveau modle bas sur
la prsence de lallostrie uniquement dans le premier compartiment, a prsent un meilleur
sse. Notons, lorsque la concentration en pepsine augmente de 15 % 41 %, que le degr de
dprotinisation, aprs 6 h dhydrolyse, augmente peu, de 91,3 % 92,8 %. Ceci confirmerait
lhypothse selon laquelle lajout de pepsine, au-del dun seuil, ne permette plus damliorer
la dprotinisation. Le modle scrit alors :
2 .1
dP1
[Pep]
P
1
12.96 14.9 Ta 6.54 Ta

P1
dt
[Pep] 9 P12 .1 5.882 .1
dP 2
[Pep]
20.74 19.68*Ta
P2
dt
[Pep] 2
P1(0) 21.28 , P2(0) 11.01, donc P(0) 32.29

(III.22)

La figure III.33 illustre la confrontation entre le modle et les valeurs observes :

Fig.III.33 : Confrontation entre la dprotinisation prdite et les mesures observes, sse = 1072 et rmse = 3,08

Lquation III.22 savre conforme aux mesures observes (rmse = 3,08), notamment lorsque
la concentration en pepsine augmente (Fig.III.33). Au regard des incertitudes de mesures, la
dprotinisation est donc correctement modlise par une structure qui repose sur deux
composantes. Chacune tient compte de leffet de la taille des fragments de matire premire
daprs une structure polynomiale du 1er et du 2nd ordre, et de la concentration en pepsine,
daprs une structure de type Monod. La fonction allostrique apparat uniquement dans la
premire composante.

128

VI. Choix des conditions optimales

VI. Choix des conditions optimales


Le choix des conditions de production de la chitine est guid par un double objectif : atteindre
les caractristiques du polymre exiges par le cahier des charges dune part, et maximiser la
rentabilit du procd dautre part. On distingue plusieurs critres pour caractriser la qualit
de la chitine. En premier lieu, ils concernent directement ou indirectement le degr de puret
de la chitine :
- couleur apparente du produit extrait
- teneur en minraux rsiduels
- teneur en mtaux lourd
- teneur en humidit
- rapport C/N
- teneur en fraction insoluble
Par exemple, le grade mdical correspond aux teneurs rsiduelles en minraux et mtaux
lourds minimales (respectivement < 0,3 % et < 10 ppm). La couleur du produit doit tendre
vers le blanc et le pH se situer autour de 7 (Annexe B). Les autres critres qualitatifs sont
principalement :
- le degr dactylation
- le degr de polymrisation (paramtre li la viscosit)
- lindice de polymolcularit
- lindice de cristallinit
Ces critres ont une importance variable en fonction du domaine dapplication (Cf. Chapitre
1.III). Nos produits ont tous prsent des degrs dactylation et de polymrisation levs.
Nous nous concentrerons donc sur le degr de puret en chitine. Les impurets sont en
majorit des minraux et des protines. Or, nous disposons des modles doptimisation des
degrs de dminralisation et de dprotinisation, tablis la section prcdente.
Les facteurs utiliss pour optimiser le degr de puret en chitine modulent galement le cot
du procd. Il sagit de la consommation en enzyme, en nergie pour chauffer le temps de
lhydrolyse et celle lie au broyage des coproduits pour rduire leur taille. Dautres
contraintes conomiques affectent la rentabilit du procd, telles que le prix de la matire
premire et les consommables (ractifs).
Un compromis entre le degr de puret maximal et le cot minimal doit tre dtermin. Un
modle a donc t dvelopp pour optimiser les conditions opratoires en tenant compte de
lensemble des contraintes de rentabilit et de productivit. Ce modle se dcline en deux
fonctions.

Lune est lie au prix de vente de la chitine, D, qui dpend de son degr de puret.
Cette fonction repose sur les deux modles de dminralisation et de dprotinisation
slectionns prcdemment (quations III.18 et III.22).

La seconde fonction, C, est lie au cot du procd.


Le rapport des deux aboutit la fonction J :

129

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

D
fD[( fdmin fdprot) frdt]

C fC[ fdure f [enz] fTa autres]

(III.23)

O fdmin et fdprot correspondent aux modles slectionns prcdemment ; R = 25 + P + M


correspond au rendement massique de chitine. P et M correspondent respectivement la masse
de protines et de minraux rsiduels :
%P

P
100
R

%M

M
100
R

(III.24)

C est la somme des termes associs chaque cot : elle tient compte de la dure dhydrolyse,
de la concentration en enzyme, de la granulomtrie des fragments de matire premire et le
reste des paramtres est regroup en un terme global (comprenant le prix des ractifs, de la
matire premire, des diverses consommations, etc.). D correspond deux fonctions arctangentes, associes la dminralisation et de la dprotinisation. Lensemble est multipli
par le rendement en chitine (Equation III.23). La fonction J est dcrite par le graphique
suivant:

Fig.III.34 : Reprsentation du prix de vente de la chitine en fonction du cot de production (J)

Nous avons fait le choix doptimiser directement le paramtre taille en slectionnant les
fragments de cuticule infrieurs 1 mm. La figure III.34 illustre en rouge les conditions pour
optimiser la fonction J. Par consquent, les conditions qui concilient les deux objectifs,
requirent 6 h dextraction enzymatique par 25 % de pepsine 40 C (temprature non
illustre ici). Cette hydrolyse enzymatique servira de rfrence pour la suite de ltude.

VII. Composition de la phase liquide et balance massique


VII.1. Bilan massique global des minraux
130

VII.Composition de la phase liquide et balance massique

lissue de lhydrolyse enzymatique, la phase liquide est filtre, neutralise par de la soude
pure, lyophilise et stocke. Lanalyse de la composition des produits rvle une teneur en
humidit comprise entre 2 et 7 %. Lextrait sec est essentiellement compos de minraux et
des drivs protiques. La composition est analyse partir des produits issus de lhydrolyse
de rfrence (25 % de pepsine, 40 C, fragments infrieurs 1 mm). La part de sels minraux
dcrot au cours du temps de 75 65 %. Celle des protines, estime galement par le dosage
des acides amins par CPG, crot de 7 13 % (Fig.III.35). Le reste est compos de glucides et
de lipides.

Fig.III.35 : Cintique de la composition de la phase soluble Hydrolyse de rfrence

Les minraux dissous lors de la raction sont lorigine dune partie de la part minrale.
Lajout de soude pour la neutralisation de la phase soluble, constitue une seconde source de
sels minraux. Daprs les quations des ractions chimiques (III.24 a c), partir de lacide
phosphorique et du carbonate de calcium, se forme soit du bis-dihydrognophosphate de
calcium (Ca(H2PO4)2), du phosphate de calcium de formule CaHPO4 (brushite) ou Ca3(PO4) 2
(tricalcium phosphate).
CaCO3 + 2H3PO4 Ca(H2PO4)2 + CO2 + H2O

(III.25.a)

CaCO3 + H3PO4 CaHPO4 + CO2 + H2O

(III.25.b)

3CaCO3 + 2H3PO4 Ca3(PO4) 2 + 3H2O + 3CO2

(III.25.c)

Les deux premires ractions aboutissent la formation de composs solubles, contrairement


la dernire quation III.24.c. La premire raction est privilgie afin de maintenir stable le
pH acide. En effet, le pKa du couple H3PO4/ H2PO4 est proche de 2. La quantit de H3PO4 est
introduite en lger excs (de lordre de 0,5 ml) par rapport aux conditions stchiomtriques
de la premire quation.
lissue du procd dextraction enzymatique, la phase soluble est neutralise par ajout de
NaOH pur (10 N). La raction de neutralisation scrit de la manire suivante :
Ca(H2PO4)2 + NaOH CaHPO4 + Na2HPO4 + 2H2O

(III.26)

131

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

Quantit de minraux (g)

Lorsque 1 g de CaCO3 est initialement prsent dans la matire premire, la quantit despces
minrales atteint 2,6 g aprs neutralisation. Pour cette quantit de CaCO3, seulement 0,1 ml/g
de NaOH est ncessaire pour accomplir la raction III.25. La quantit de soude ajoute est
gnralement suprieure, de lordre de 0,4 0,8 ml/g. Lexcs de NaOH se trouve galement
dans la phase liquide. La quantit des minraux accumuls dans la phase soluble (produits par
lhydrolyse enzymatique, la neutralisation et lexcs de NaOH), est largement suprieure la
celle des minraux rsiduels dans la phase insoluble. La figure III.36 illustre dune part lcart
dordre de grandeur entre les deux phases et dautre part, la diffrence de comportement des
quantits de minraux au fur et mesure de lextraction.
5

minraux
rsiduels

minraux
solubiliss

0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure d'hydrolyse (min)


Fig.III.36 : Quantits de minraux dans les phases solubles et insolubles au cours de la raction

La figure III.36 montre un facteur 40 entre la quantit de minraux dans la phase soluble et
insoluble. Elle semble stable, autour de 4,1 g. Les apports en minraux lis aux diffrentes
ractions masquent lvolution lie lhydrolyse enzymatique.
Toutefois les quantits mesures en minraux dans la phase soluble sont en accord avec les
quantits attendues. Pour une prise dessais de lordre de 5 g, soit prs de 4,3 g sec, on attend
0,9 1,1 g de CaCO3 dissoudre dans la phase soluble. Dautre part, lapport en minraux
associs lacidification du milieu et la neutralisation, est estim prs de 3,1 g, si les
conditions stchiomtriques sont respectes. Enfin, lexcs de NaOH pur (10 N) sajoute au
bilan des minraux. Il est gnralement de lordre de 0,8 1,1 g. Par consquent, la quantit
accumule de minraux dans la phase soluble devrait tre comprise entre 3,9 et 4,2 g. Les
valeurs observes corroborent celles calcules.

VII.2. Bilan massique global des protines


Le bilan massique concernant les protines est galement tudi. La figure III.37 prsente les
quantits massiques de protines dans chaque phase pour 5 g de matire premire, soit 4,3 g
en poids sec. Ces rsultats concernent la cintique de rfrence, par 25 % de pepsine 40 C.

132

VII.Composition de la phase liquide et balance massique

Quantit d'acides amins (g)

1,5

1,5

acides amins
rsiduels
acides amins
solubiliss

0,5

0,5

0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure d'hydrolyse (min)


Fig.III.37 : Quantits de protines dans les phases solubles et insolubles au cours de la raction

La quantit de protines dans la phase soluble, estime par CPG, augmente avec la dure de
lextraction enzymatique de la chitine. Tandis que la quantit de protines dans le rsidu
insoluble suit lvolution inverse, elle dcrot avec la dure de la raction (Fig.III.37). La
somme des deux parts protiques est relativement constante et correspond approximativement
la quantit de protines prsentent dans la matire premire. Pour la quantit de prise dessai
introduite, la quantit totale de protines devrait tre autour de 1,7 g. Les rsultats observs
sont proches de cette valeur.

VII.3. Bilan massique global des autres composs


Les autres composs tudis sont les rsidus glycosidiques et les lipides. Leur quantit a t
mesure uniquement dans la phase soluble du produit de 6 heures dhydrolyse enzymatique
(triplicat). Les rsultats obtenus sont reports dans la figure III.38, au cot des quantits de
protines et de minraux. Ainsi, le bilan massique de la phase soluble peut tre vrifi :
80

Minraux
Protines

Composition (%)

65,27

Lipides

60

Sucres
40

23,52

20

2,71

5,65

Fig.III.38 : Composition de la phase soluble aprs 6 h dextraction enzymatique (cintique de rfrence)

133

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

La figure III.38 montre que la part la plus importante est celle des minraux, qui atteint
65,3 %. Suit celle des acides amins avec 23,5 1,0 %. La teneur en rsidus glycosidiques
totaux atteint 5,7 0,8 %. La composition exacte de ces rsidus a t dtermine par
chromatographie et leur rpartition sera discute dans le chapitre 4 (section IV.3). La quantit
totale de rsidus glycosidiques serait trois fois suprieure dans la phase soluble aprs 6 h
dhydrolyse, par rapport la quantit prsente dans la matire premire. Dautres mesures par
dosage de Dubois, non illustres ici, indiquent que cette quantit doses est produite ds les
premires minutes de lextraction enzymatique, puis demeure stable. Enfin, la proportion de
lipides reprsente 2,7 0,3 %. Lanalyse dtaille de la part lipidique est galement
approfondie dans le chapitre 4 (section IV.4).
La somme des quantits mesures dans la phase soluble prsente un cart de prs de 2,8 %
avec le poids observ. Cette valeur est considre comme inclue dans lincertitude, ce qui
signifie que le bilan sur la phase soluble est vrifi.

VIII. Extension une autre enzyme et un autre acide


Afin dtendre nos connaissances sur le potentiel de lextraction enzymatique de la chitine en
une seule tape, le mme principe est appliqu un nouvel acide associ une nouvelle
enzyme. Il sagit de lacide formique (appel galement thanoque), HCOOH, et lenzyme
est lAcide Stable Protase, nomme ASP. Elle est fournie par Bio-Cat Inc et drive dune
enzyme extraite dAspergillus niger. Ses caractristiques sont dcrites par la figure III.39 :

Fig.III.39 : Caractristiques techniques de lAcide Stable Protase, analyses par Bio-Cat Inc

la diffrence de la pepsine, lactivit de lASP est optimale autour de pH 3 et vers 55 C.


ce pH, lacidit est galement importante. 55 C, daprs les tudes sur la chitosanolyse par
dautres protases (Fig.III.6), le chitosan est dpolymris. La temprature slectionne pour
mener lextraction enzymatique est donc lgrement infrieure, elle est fixe 45 C.

134

VIII. Extension une autre enzyme et un autre acide

Le mme principe deffet tampon entre le carbonate de calcium prsent dans le substrat et
lacide est exploit pour stabiliser le pH du milieu. Lacide formique qui ragit avec le CaCO3
est un acide faible, contrairement lacide phosphorique qui tait un acide fort. Pour tablir la
quantit dacide formique ncessaire, on utilise la formule III.27 :
(III.27)

pH = pKa + log [base]/[acide]

La formule III.27 sert calculer la concentration dacide formique introduire pour obtenir le
pH souhait. En effet, le pKa de la raction III.28 se situe autour de 3,8. Par consquent, nous
ne cherchons pas atteindre les conditions stchiomtriques. Un pH plus acide pour favoriser
la dminralisation est recherch.
CaCO3 + 2HCOOH Ca(HCO2)2 + CO2 + H2O

(III.28)

Le pH vis est de 2,7 et la concentration en base est assimile la quantit de CaCO3 dans
la matire premire. La mise en uvre de lextraction enzymatique est identique au protocole
antrieur. Pour la mme prise dessai de 5 g, la concentration en HCOOH est de 2,7 M (pour
rappel, elle tait de 0,9 M pour lacide phosphorique).
Leffet de lacide seul, sans incorporation denzyme, est dabord valu et compar celui de
lacide phosphorique, de 7 360 min (Fig.III.40. a, b et c).
a)

c)

Qt de minraux rsiduels (g/100g)

25

50

H3PO4
HCOOH

20

15

10

0
0

100

200

Dure d'acidification (min)

300

Qt de protines rsiduelles (g/100g)

b)

40

30

20

10

0
0

100

200

300

Dure d'acidification (min)

Fig.III.40 : Comparaison du rendement massique (a), de la quantit de minraux rsiduels (b) et des protines
rsiduelles (c) en fonction de lacide employ

135

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

La masse finale aprs traitement par lacide formique est similaire celle obtenue par le
traitement lacide phosphorique, 58,2 et 59,5 g/100 g de matire premire respectivement.
Cependant les cintiques observes sont diffrentes.
Pour lacide formique, la vitesse de perte de masse est plus rapide. 7 min dacidification, la
masse limine par le H3PO4 est de 27,6 % tandis que le HCOOH limine 38,2 % de la
matire. Cette diffrence est due llimination des minraux daprs la figure III.40.b.
7 min dacidification, les quantits rsiduelles de minraux sont de 10,2 et 1,0 g/100 g
respectivement par H3PO4 et HCOOH. Pour 360 min dhydrolyse, les valeurs observes sont
proches (0,5 et 0,6 g/100 g respectivement). Au contraire les pertes de protines, dtermines
galement par CPG, prsentent des cintiques similaires. 7 min dacidification, les produits
contiennent respectivement 28,7 g/100 g et 30,7 g/100 g. Cependant, le traitement par lacide
formique semble favoriser davantage la dprotinisation ( 20 g/100 g de protines
rsiduelles) contrairement lacide phosphorique qui semble stabiliser la quantit de
protines autour de 28 g/100 g.
Les meilleurs rsultats offerts par lacide formique sont probablement lis sa forte
concentration. En effet, elle est trois fois suprieure la concentration en acide phosphorique
(2,7 M contre 0,9 M). La composition des produits 7 min sert de point de dpart pour
ltude de la cintique dhydrolyse (t = 0).

Qt de matire en g/100g

Les rendements massiques et les compositions des produits issus de la cintique dhydrolyse
enzymatique, par 25 % dASP en milieu maintenu acide par HCOOH, sont illustrs par la
figure III.41. La raction a t applique aux fragments de matire premire < 1 mm, 45 C,
pH 2,7 :
100

Rdt massique

90

Qt minraux

80

Qt protines

70

D chitine

60
50
40
30
20
10
0
0

50

100

150

200

250

300

350

Dure d'hydrolyse (min)

Fig.III.41 : Composition des rsidus solides de lhydrolyse par 25 % dASP 45 C, pH 2,7

Le rendement massique dcrot en deux heure de 61,8 30,7 g/100 g. Puis la perte de matire
devient extrmement lente, jusqu atteindre 27,0 g/100 g aprs 360 min dhydrolyse. La
dminralisation est extrmement rapide, ds 10 min dextraction, la quantit rsiduelle de
minraux est infrieure 1 g/100 g. La cintique de dprotinisation est plus lente et limite

136

VIII. Extension une autre enzyme et un autre acide

donc celle du rendement massique. La quantit rsiduelles de protines est de 1,0 g/100 g
aprs 360 min dextraction enzymatique. Par le lavage chimique la soude, lestimation du
degr de puret montre une augmentation au fur et mesure de lextraction, pour atteindre
90,4 % 360 min. La figure III.42 compare cette composition celle obtenue par son
hydrolyse homologue, par 25 % de pepsine. Chaque exprience a t ralise en triplicat.
100

b)
Quantit en g/100g

Degr d'limination (%)

a)

80
60
40
20
0

60

H3PO4

50

HCOOH

40
30
20
10
0

Minraux limins

Protines limines

Rdt massique

Qt chitine

Fig.III.42 : Comparaison des performences dextraction enzymatique selon lacide employ, de part les degrs
de dminralisation et de dprotinisation (a), le rendement massique et la quantit de chitine (b), n=3

La figure III.42.a montre que la dminralisation nest pas significativement diffrente par
lacide phosphorique et lacide formique, aprs 6 h dextraction enzymatique, elle atteint
respectivement 98,9 0,3 % et 98,8 0,3 %. La dprotinisation aboutit une meilleure
performance par le HCOOH avec 97,4 0,5 % des protines soutires de la phase insolubles,
contre 93,9 0,8 % par le H3PO4. On constate galement une diffrence de rendement
massique en fonction de lacide employ. Elle peut sexpliquer par la diffrence de degr de
dprotinisation et par une ventuelle perte de chitine. Selon la figure III.42.b, la quantit de
chitine dans le produit de 6 h, estime par le lavage chimique, est lgrement infrieure par
lacide formique, avec 25,2 0,2 g/100 g, contre 26,8 0,2 g/100 g par laction de lacide
phosphorique. Pour approfondir ltude de limpact de lacide formique, lextraction est
prolonge jusqu 12 heures (Tab.III.14).
Produits
Dhydrolyse
pep25%
6h
pep25%
12 h
ASP25%
6h
ASP25%
12 h

- H3PO4
- H3PO4
HCOOH
HCOOH

Rdt massique
%

(g)

Minraux

% limin

(g)

Protines

% limin

Degr de puret
Bilan
NaOH

30,7

0,4

0,3

0,3

98,9

3,3

0,8

91,7

88,0 %

87,2 %

1,5

26,4

0,5

0,4

0,3

98,5

1,0

0,1

95,0

94,5 %

88,1 %

2,0

27,9

0,7

0,3

0,1

98,8

1,0

0,5

97,4

95,2 %

90,4 %

1,2

27,3

0,9

0,2

0,0

99,3

0,9

0,1

97,7

95,2 %

91,7 %

1,9

Tab.III.14 : Comparaison des caractristiques des produits insolubles obtenus par hydrolyse enzymatique, par
la pepsine et par lASP, aprs 6 h et 12 h de raction

La diffrence de rendement massique entre laction de H3PO4 et HCOOH est rattrape lorsque
la dure de lhydrolyse est poursuivie 12 h. Le rendement massique 12 h, par le H3PO4, avec
26,4 g/100 g, demeure infrieur celui obtenu par le HCOOH, qui atteint 27,3 g/100 g.
La dminralisation nest pas amliore par laugmentation de la dure dhydrolyse de 6 h
12 h lorsque lacide phosphorique est utilis. En revanche avec lacide formique,
137

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

laugmentation de la dure de protolyse acide semble amliorer lgrement le degr de


dminralisation, qui atteint 99,3 % 12 h.
La dprotinisation par la pepsine est amliore par le prolongement de la protolyse acide.
Elle augmente de 91,7 95,0 % lorsque la dure est allonge de 6 h 12 h. La
dprotinisation par lASP avec lacide formique se maintient autour de 97,4 % au-del de 6 h
de protolyse acide. De plus, ses performances demeurent plus intressantes par rapport
lemploi de la pepsine avec lacide phosphorique.
Lestimation du degr de puret par au lavage chimique, ne semble pas tre amlior
significativement par laugmentation de la dure dhydrolyse 12 h. Par ailleurs, le tableau
III.14 permet de comparer cette mthode celle du bilan de masse. Le rsultat est
systmatiquement infrieur par la mthode de nettoyage chimique par le NaOH. Ceci
indiquerait que cette mthode est trop drastique pour ces produits et entrainerait une partie de
la chitine. Quelle que soit la mthode, le degr de puret est amlior par lemploi de lacide
formique et dASP, pour un mme temps dhydrolyse.
Pour conclure, lutilisation de lacide formique avec lASP est avantageuse par rapport
lacide phosphorique avec la pepsine lorsque la protolyse acide dure 6 h. Le rendement
massique, la dprotinisation et le degr de puret sont amliors. Cet avantage samenuise
lorsque la dure dhydrolyse se poursuit jusqu 12 h. Par ailleurs, au regard de la cintique,
lutilisation de lacide formique se rvle intressante pour rduire davantage la dure du
procd.

138

IX. Conclusions du chapitre 3

IX. Conclusions du chapitre 3


Lobjectif de ce chapitre tait dtudier les paramtres susceptibles dinfluencer les cintiques
de purification de la chitine. Leffet du milieu acide a dabord t suivi seul, en guise
dexprience tmoin. Les fragments dexosquelette de crevettes de taille intermdiaire ont t
immergs dans lacide phosphorique (H3PO4) pendant 6 h, sous agitation 40C. Puis, pour
mener la dprotinisation, la pepsine a t ajoute. Linfluence de sa concentration, ainsi que
celle de la temprature et de la taille initiale des fragments de matire premire, ont t tudi
dans le cadre dun plan dexprience.
Les rsultats ont mis en vidence le rle de lacide phosphorique seul sur la dminralisation,
avec 98,1 % des minraux limins aprs 6 h, et trs faiblement sur la dprotinisation, avec
28,2 % des protines limines ds les premires minutes. Lajout de pepsine amliore plus
ou moins la dminralisation tandis que la dprotinisation est nettement amliore. Les
meilleures performances du plan dexprience sont obtenues lorsque les tailles des fragments
de matire premire sont les plus rduits et que la concentration en enzyme est la plus leve
(Tab.III.15). Toutefois, les carts mesurs suite la rptition des conditions intermdiaires
sont importants et une analyse plus approfondie a t mene.
Lanalyse statistique a confirm le rle prdominant de la taille des fragments de matire
premire sur la dminralisation et la dprotinisation. Daprs Marquis-Duval (2008), une
rduction infrieure 1 mm nentrane plus de modification notable de la cintique de
dminralisation. Cependant, lexprience pourrait tre mene pour estimer son impact sur la
cintique de dprotinisation. De plus, une analyse de la morphologie et de la surface de
contact des fragments nous conduirait une meilleure matrise de laccessibilit des sites
hydrolyser aux protases.
Par rapport ce facteur taille, linfluence de la concentration en pepsine sur la
dprotinisation et celle de la temprature sur la dminralisation sont moindres. Ces rsultats
montrent la difficult dprotiniser compltement la chitine. Le domaine dtude a t
tendu pour amliorer les performances de dprotinisation (Tab.III.15).
Plan d'exp
(intermdiaire)

Plan d'exp
(15%; <1mm)

Hors plan d'exp

Hors plan d'exp

(40C; 25%; <1mm)

(40C; 41%; <1mm)

Rdt massique

37,9 1,5 %

32,9 - 33,5%

30,7 %

28,0 %

Dminralisation

97,2 1,8 %

99,5 - 98,5 %

98,9 %

99,3 %

Dprotinisation

85,5 3,3 %

86,3 - 92,4 %

91,7 %

92,8 %

68,9 2 %

76,5 - 83,9 %

87,2%

93,1 %

5,1 0,3

5,8 - 5,9

5,7

6,2

Degr de puret (NaOH)


Rapport C/N

Tab.III.15: Rcapitulatifs des performances atteintes aprs 6 h de protolyse acide

Laugmentation de la concentration en pepsine permet dliminer davantage les impurets


lies la chitine. Cependant, la quantit de pepsine ajoute au-del de 25 % devient trs
importante par rapport la faible amlioration des performances. La dure dhydrolyse a
galement t allonge jusqu 12 h. Le degr de puret en chitine est alors estim via le
139

Chapitre 3 Lhydrolyse enzymatique en une seule tape par protolyse acide

lavage au NaOH 88,1 2,0 % et le rendement massique est de 26,4 g/100 g. La puret en
chitine est donc faiblement amliore par rapport lhydrolyse de 6 h, tandis que la perte de
matire est plus importante. Les protines semblent tre davantage limines, daprs le degr
de dprotinisation qui est de lordre de 95 %.
partir de lensemble des donnes, un travail de modlisation a t entrepris pour affiner les
tendances indiques par les prcdents rsultats. La dmarche a consist construire des
modles partir de nos connaissances et les confronter aux rsultats rellement mesurs.
Le modle retenu pour la dminralisation est une addition de structures polynomiales
associe chaque facteur, multiplie par la quantit de minraux et par une fonction linaire
associe aux mmes minraux :
dM
0.05 (1 4.53M ) (1 1.65 Ta 0.89 Ta 0.19 T 1.33 T 0.02 [ pep] 0.68 [ pep]) M
dt

(III.18)

Le modle retenu pour la dprotinisation est divis en deux compartiments. Chacun


comprend une fonction de type Monod associ la concentration en pepsine. Linfluence de
la taille des fragments de matire premire est formalise par une fonction polynomiale du
2me ordre dans le premier compartiment et du 1er ordre dans le second. Enfin, une fonction
allostrique intervient dans le premier compartiment. Elle traduit une opposition la
dprotinisation mesure que la dure de protolyse acide scoule :
2 .1
dP1
[Pep]
P
1
12.96 0.50 Ta 6.54 Ta

P1
dt
[Pep] 9 P12 .1 5.882 .1
dP 2
[Pep]
20.74 19.68*Ta
P2
dt
[Pep] 2
P1(0) 21.28 , P2(0) 11.01 , donc P(0) 32.29

(III.22)

partir de ces modles et en tenant compte des contraintes conomiques du procd, un outil
a t dvelopp pour dterminer ses conditions optimales. Elles consistent trouver un
quilibre entre la purification maximale de la chitine et le cot minimal de sa production.
J

D
fD[( fdmin fdprot) frdt]

C fC[ fdure f [enz] fTa autres]

(III.23)

Les conditions retenues pour la suite de cette tude correspondent donc lhydrolyse conduite
par 25 % de pepsine 40C partir de taille de fragment infrieurs 1 mm. La phase liquide
rcupre aprs 6 h dhydrolyse contient 65,3 % de minraux, 23,5% de protines, 2,7 % de
lipides et 5,7 % de sucres.
Devant la difficult dprotiniser, une nouvelle enzyme a t teste, lAcide Stable Protase.
Un autre acide a t employ pour obtenir galement un pouvoir tampon proche du pH
dactivit optimale de lASP. Il sagit de lacide formique. Leffet de lacide seul aboutit des
cintiques de dminralisation et dprotinisation plus rapides. La protolyse acide de 6 h
permet datteindre un degr de puret en chitine de 90,4 % daprs le lavage au NaOH et un
degr de dminralisation de 98,8 %. Ces performances sont proches de celles obtenues par la

140

IX. Conclusions du chapitre 3

pepsine la mme concentration. En revanche, la dprotinisation semble tre amliore, elle


atteint 97,4 %. En allongeant la dure de protolyse acide 12 h, le degr de dprotinisation
demeure du mme ordre de grandeur.

141

Chapitre 4 Comparaison entre


lhydrolyse enzymatique
acide et les autres voies
dextraction

I. Performances de dminralisation et de dprotinisation


I.1. Comparaison avec lextraction chimique
Lhydrolyse enzymatique est compare lextraction chimique, selon le protocole dtaill au
chapitre 2 II.1, en guise de rfrence. Pour rappel, il sagit dune heure de dminralisation
par HCl 1 N temprature ambiante, suivie de deux heures de dprotinisation par NaOH
1,25 N 90 C. Dautre part, les caractristiques de la composition de la chitine commerciale
taient dcrites par le tableau II.8. Par exemple, les teneurs en minraux et en protines
atteignent respectivement 0,5 % et 0,3 % pour le produit de haut degr de puret fourni par
Sigma, et 4,2 % et 0,9 % pour le produit fourni par Mahtani.
Le produit de la dminralisation chimique (par traitement au HCl) est caractris par une
teneur en minraux rsiduels de 0,4 %, puis de 25,3 % et 32,3 % de protines et chitine
respectivement. Le produit de la dprotinisation chimique (par traitement au NaOH) se
caractrise par une faible teneur en protines rsiduelles, 0,5 %, puis 26 % et 31,6 % de
minraux et chitine respectivement (Fig.IV.1).
chitine

40

40

Quantit du compos en g/100 g

32,3

30

protines

31,6

minraux

28,2

25

25,3

26,0

20

10

0,4

0
Matire initiale

Dminralisation

0,5

Dprotinisation

Fig.IV.1 : Consquence de la dminralisation et dprotinisation chimique sur la composition des produits

La figure IV.1 exprime les quantits des principaux composs (chitine, protines et minraux)
dtermines suite lapplication de chacune des deux tapes de lextraction chimique,
ralises indpendamment. Le traitement acide seul, par HCl 1 M temprature ambiante,
dminralise 98,5 0,1 % des minraux initialement prsents. cette tape, 36,8 4,3 % des
protines sont galement limines. Le traitement alcalin chimique seul, par NaOH 1,25 M
90 C, est responsable de la perte de 98,8 0,3 % des protines et 8,9 1,6 % des minraux.
La composition finale, suite aux deux tapes successives, se caractrise par des degrs de
dminralisation et de dprotinisation de 99,6 0,1 % et 99,5 0,4 % respectivement.

145

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

I.1.1. Degr de dminralisation


La comparaison des performances de dminralisation entre les diffrentes hydrolyses
enzymatiques et lextraction chimique est illustre par la figure IV.2 :

Degr de dminralisation (%)

100

99

98

97

96

95
10% pep
H3PO4 6h

15% pep
H3PO4 6h

25 % pep
H3PO4 6h

41% pep
25% pep
25% ASP
25 % ASP extraction
H3PO4 6h H3PO4 12h HCOOH 6h HCOOH 12h chimique

Fig.IV.2 : Comparaison des degrs de dminralisation en fonction des procds dextraction

La figure IV.2 montre que toutes les conditions dhydrolyse permettent datteindre un degr
de dminralisation lev. La dminralisation la plus faible est observe avec lhydrolyse
enzymatique de 6 h par 10 % de pepsine, dont le degr de dminralisation est de 97,2 %.
linverse, lextraction chimique prsente le meilleur degr de dminralisation, avec 99,6 %.
Cette performance constitue un objectif pour nos procds, cependant une tolrance peut tre
accorde. Au regard de la littrature et de cahiers des charges de chitine commerciale, le seuil
est de 1 % de minraux rsiduels. Pour nos produits, cette quantit correspond un degr de
dminralisation de 99,0 0,2 %.
Compte tenue des incertitudes, presque toutes les hydrolyses remplissent cet objectif,
exception faites des extractions par 10 % et 15 % de pepsine. Lhydrolyse de 12 h par 25 %
de pepsine affiche galement une faible dminralisation, 98,3 %, par rapport aux autres
hydrolyses, notamment par rapport son homologue de 6 h. Ceci semble contradictoire et
montre que la comparaison entre ces performances est limite par les incertitudes de mesures
et les faibles carts entre les hydrolyses.
Le tableau IV.2 souligne galement le potentiel de lhydrolyse par lASP en acide formique.
Les degrs de dminralisation atteignent 98,8 % et 99,3 %, aprs 6 h et 12 h dextraction
enzymatique respectivement. Lexprience de lhydrolyse par la pepsine en acide formique a
galement t mene. Cependant, les rsultats (non dcrits ici) se sont rvls moins
intressants.

146

I. Performances de dminralisation et de dprotinisation

I.1.2. Degr de dprotinisation


La mme dmarche est applique pour comparer les degrs de dprotinisation des produits
de rfrence (Fig.IV.3) :

Degr de dprotinisation (%)

100

95

90

85

80
10% pep
H3PO4 6h

15% pep
H3PO4 6h

25 % pep
H3PO4 6h

41% pep
25% pep
25% ASP
25 % ASP extraction
H3PO4 6h H3PO4 12h HCOOH 6h HCOOH 12h chimique

Fig.IV.3 : Comparaison des degrs de dprotinisation en fonction du procd dextraction

La figure IV.3 prsente des degrs de dprotinisation compris entre 89,3 et 97,7 % lorsque
lextraction de la chitine est mene par voie enzymatique. Tandis que lextraction chimique
aboutie 99,5 % de protines limines. Contrairement la dminralisation, le seuil de 99 %
nest atteint par aucune hydrolyse enzymatique.
Comme les modles prcdemment tablis le soulignaient, la dprotinisation est favorise
par laugmentation de la concentration en enzyme. La figure IV.3 illustre ce phnomne avec
une volution du degr de dprotinisation de 89,3 94,7 lorsque la concentration en pepsine
varie de 10 41 %.
Les degrs de dprotinisation de trois hydrolyses se dtachent nettement des autres. Il sagit
de lhydrolyse de 12 h par 25 % de pepsine et les deux hydrolyses par lASP. Elles ne
prsentent pas de diffrences significatives entre elles et offrent les meilleures performances
de dprotinisation, suprieures 97 %. Nanmoins, les contraintes de cots invitent viter
les longues dures de production (Chapitre 3.VI). En effet, le doublement de la dure
dhydrolyse double galement la consommation nergtique. Par consquent, lhydrolyse de
6 h par lASP est la plus intressante et la plus proche des performances de lextraction
chimique.
Lacide formique est galement autoris comme additif alimentaire. Il est nomm E 236 dans

147

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

la nomenclature europenne. Comme pour lacide phosphorique, le contact avec une matrice
alimentaire est autoris. Par exemple, des fournisseurs chinois et indiens proposent de lacide
phosphorique et formique des prix de lordre de 850 1000 USD/tonnes et de 100 800
USD/tonnes respectivement (Source Web, comparaison de plusieurs fournisseurs).
Pour les hydrolyses de 12 h par 25 % de pepsine et de 6 h et 12 h par lASP, la quantit de
protines rsiduelles est infrieure 6 %. Bien que cette quantit soit au-dessus des seuils
gnralement fixs pour commercialiser la chitine, elle est relativement faible. De plus, le
chitosan et la glucosamine sont davantage commercialiss que la chitine. Or ils subissent
dautres ractions, au cours desquelles il est possible dabaisser encore la charge protique.

I.2. Comparaison avec dautres procds dextraction biologique


La section prcdente met en vidence des performances mdiocres en dprotinisation de
lhydrolyse enzymatique par la pepsine par rapport lextraction chimique. Quen est-il vis-vis des performances obtenues par des procds biologiques similaires ? Parmi ces procds,
on distingue lensilage, de la fermentation et de lhydrolyse enzymatique directe. Lensilage
est un mode de fermentation naturel. Les conditions de pH et de temprature y sont libres,
contrairement aux autres fermentations dont les paramtres sont davantage contrls. Le
chapitre 1.VI dcrit des exemples de fermentation, lesquels vont tre compars aux rsultats
de cette tude.
Nous avons regroup diffrentes performances dextractions biologiques dans le tableau
IV.11. Elles sont principalement extraites de ltude de Xu et al. (2008) et compltes par des
tudes postrieures. Quand ils sont connus, leur degr de dminralisation, de dprotinisation
et la dure du traitement sont compars. De surcrot, le tableau classe les procds en fonction
du type et du nombre dtape. En effet, la plupart des procds biologiques sont complts par
un traitement chimique afin de purifier la chitine. Or, le nombre dtapes impacte directement
le rendement de production.
Source

Ractifs, enzyme,
microorganismes

Dure

Littrature

7 jours

Healy et al
(1994)

85 %

87,6 %

6 jours

Cira et al
(2002)

Lactocobacillus plantarum 541

75 %

86 %

Procambarus clarkii Lactobacillus paracasei A3


(langouste prtraite)
Procambarus clarkii Lactobacillus pentosus 4023
immobiliss
TMA
Nephrops norvegicus Sil-Al x 4 , S. faecium M74, L.
plantarum, L. salivarius, P.
acidolactici

94 %

97,2 %

3 jours

81,5 %

91,2%

2,1 jours

93,8 %

7 jours

Rao et al.
(2000)
Cremades et
al. (2001)
Bautista et
al. (2003)
Healy et al.
(2003)

ENSILAGE
Nephrops norvegicus Stabsil,
dminralis
S. faecium M74
P. acidilactici,
Penaeus sp.
Lactobacillus sp. B2
FERMENTATION
Shrimp

148

Degr dlimination
Dprotinisation

Dminralisation

40 %

I. Performances de dminralisation et de dprotinisation

Chionoecetes
japonicus
Penaeus monodon

L. paracasei sp. tolerans KCTC3074


Bacillus licheniformis

52,6 %

97,2 %

7 jours

Jung et al.
(2006)
Waldeck et
al. (2006)
Bhaskar et al.
(2006)
Sini et al
(2007)

98,1 %

98,9 %

2 jours

Penaeus monodon

P. acidolactici CFR2182

97,9 %

72,5 %

3 jours

Metapenaropsis
dobsoni

Bacillus subtilis

84 %

72 %

15 jours

Chionoecetes
japonicus

L. paracasei sp. tolerans KCTC3074, Serratia marscens FS-3

68,9 %

94,3 %

12 jours

Jung et al.
(2007)

Penaeus monodon

97,4 %

99,6 %

4,8 jours

Crangon crangon
prtait

Enrichissement culture GM, L.


casei MRS1
Enrichissement culture GM, L.
casei MRS1

90,8 %

99,7 %

4 jours

Xu et al.
(2008)
Xu et al.
(2008)

Penaeus vannamei

Bactries lactiques

91 %

94 %

6 jours

PROTEOLYSE
+ chimie
Penaeus vannamei

Papane

Pacheco et
al. (2009)

Gartner
(2010)
Tab.IV.1 : Comparaison des performances dextraction de la chitine par voies biologiques, Xu et al. 2008

Les meilleurs degrs de dminralisation et dprotinisation cits par Xu et al (2008) sont


ceux obtenus par Waldeck et al. (2006). Cette extraction est le fruit dune fermentation de
deux jours, par des bactries extraites de coproduits de crevettes et slectionnes pour leur
activit protolytique. Le degr de dprotinisation atteindrait 98,1 %, mesur par le dosage
de Lowry. Puis, suite une tape complmentaire dacidification, par lajout dacide lactique
0,9 %, le degr de dminralisation atteindrait 98,9 % aprs 3 h. Cependant, la lecture de
la dite rfrence, ces valeurs semblent correspondre un autre mode opratoire. De plus, le
degr de puret en chitine, estim via la teneur en nitrogne, est de 87 %, par consquent les
bilans massiques de ces expriences ne semblent pas vrifis (Waldeck et al. 2006).
La fermentation lactique exprimente par Bhaskar et al. (2006) est efficace sur le plan de la
dprotinisation, avec 97,9 % de protines limines. Cependant, la dminralisation, aide
par aucun complment acide, ne dpasse pas 72,5 % de minraux limins. Les meilleures
performances semblent tre celles obtenues par Xu et al (2008), dont le principe est bas sur
une fermentation anarobie suivie dune fermentation lactique. Le degr de dminralisation
atteint son plus haut niveau lorsque le pH descend au plus bas. Par exemple, 80 % du calcium
est dissout lorsque le pH diminue jusqu 3,9, avant la seconde tape de fermentation. Les
teneurs en protines sont mesures par la mthode de Kjeldahl, aprs soustraction de lazote
thorique associ la chitine. Ce rsultat est ensuite confirm par comparaison avec le dosage
de Bradford (Cf. chapitre 2). La quantit de chitine est galement dtermine par purification
chimique. Les degrs de dminralisation et de dprotinisation atteignent jusqu 99,6 % et
97,4 % respectivement. La dure du procd est infrieure 5 jours, ce qui place ce traitement
dextraction biologique parmi les plus courts. De plus, le degr de puret en chitine obtenu est
de lordre de 94 %, ce qui constitue la meilleure performance de degr de puret parmi les
procds biologiques dextraction de chitine.

149

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

Au regard des variations des quantits de protines mesures en fonction de lanalyse


employe, la comparaison des degrs de dprotinisation est une dmarche dlicate et doit
rester prudente. La comparaison des degrs de dminralisation repose sur des donnes plus
solides. Cette opration atteint facilement le seuil de 99 % ds lors o ltape dacidification
est mene, soit en mme temps que la dprotinisation, soit en complment. Parmi les
procds en une seule tape, laction des bactries lactiques permet datteindre des degrs de
dminralisation levs grce la production dacide lactique. Cependant, elles atteignent ces
performances avec des dures de fermentation suprieures 48 h, tandis que le procd de
protolyse acide offre la mme performance de dminralisation en 6 h seulement. La dure
du procd peut tre lie au cot de production quand elle ncessite un apport nergtique.
Ainsi, une rduction du temps de traitement peut constituer un avantage industriel. De mme
pour la dprotinisation, notre procd atteint une limination de 94 % 97 % des protines
en 6 h 12 h de traitement tandis que cette performance sacquiert en plusieurs jours par les
procds biologiques comparables, daprs le tableau IV.1.
Par ailleurs, lintroduction directe denzyme pour conduire lextraction enzymatique constitue
un avantage technique par rapport la mise en uvre de microorganismes. Comme tout
matriel vivant, leurs conditions optimales de croissance et dactivit sont sensibles de
nombreux paramtres (T, pH, sels et apports nutritifs, etc.). linverse, le contrle des
enzymes exognes est plus ais maitriser. Le risque de prsence denzymes endognes, pour
notre tude, est fortement rduit par les tapes de prparation de la matire premire. En
revanche, la dure du procd dvelopp dans cette tude est suprieure celle de lextraction
chimique. Ceci pourrait se rvler tre un avantage dans le cas o la production de chitine doit
tre adapte en cours de traitement, pour rpondre un cahier des charges prcis. En effet, le
suivi de la production par des indicateurs, tel que le pH, permet dadapter les paramtres de
procd, afin datteindre les caractristiques du produit fini vises.

II. Qualit physico-chimique des produits


II.1. Degr dactylation
Le degr dactylation est lune des principales caractristiques qui dtermine le type
dapplication destin aux drivs de chitine (Aranaz, 2010 ; Annexe B). Les DA des
principaux produits dextraction enzymatique sont mesurs par RMN 1H et compars dans la
figure IV.4 :

150

II. Qualit physico-chimique des produits

100

95,1

Degr d'actylation (%)

95

95,6

95,2

95,5

95,5

Sigma

Mahtani

93,8

90

85

80

15% pep H3PO4 25 % pep H3PO4 41% pep H3PO4 25% ASP HCOOH
6h
6h
6h
6h

Fig.IV.4 : Degr dactylation des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique

Comme lexplique le chapitre 2 IV.5, la RMN 1H seffectue sur des produits sans protines,
pour viter quelles ninterfrent sur la mesure de DA. Cest la raison pour laquelle le DA de
la matire premire nest pas prsent. La plupart des tudes lestime suprieur 95 % dans
les coproduits de crustacs (Aranaz, 2010).
Les degrs dactylation des produits dextraction enzymatique ne sont pas significativement
diffrents entre eux, ni diffrents des chitines commerciales. Les DA sont de lordre de 95 %,
sauf pour lhydrolyse par 15 % de pepsine. Elle prsente un degr dactylation infrieur, soit
93,8 %. Les conditions du procd sont pourtant plus douces. On peut alors supposer que ce
rsultat est le fruit dune interfrence avec des protines rsiduelles ou linverse dun
nettoyage chimique trop drastique.
Au regard de ces rsultats, les DA de la chitine dextraction chimique comme enzymatique ne
prsentent pas de diffrences significatives. Ceci permet de conclure que les deux procds
ont le mme impact sur le degr dactylation de la chitine.
Rares sont les tudes qui analysent les qualits physico-chimiques de la chitine produite par
extraction biologique, ce qui limite la possibilit de comparer les qualits de notre produit.
Gartner et al. (2010), mesurent le DA du chitosan obtenu suite lextraction enzymatique de
la chitine par la papane. Le DA est mesur par titration 19,1 % tandis que le chitosan
obtenu par extraction chimique prsente un DA de 31,4 % (estim par RMN). La papane
semble donc avoir un fort pouvoir de dsactylation. La chitine obtenue par laction de la
pepsine na pas t convertie en chitosan et ne peut donc pas tre compare ces rsultats.

151

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

II.2. Degr de polymrisation


La production de rsidus glycosidiques, mesure dans la phase soluble (Cf. chapitre 3, section
VII) suggre que la dpolymrisation est initie ds le dbut de lextraction enzymatique, puis
se stabilise. Pour le confirmer, les mesures de viscosit intrinsque traduisent lvolution de la
masse molaire, directement lie au degr de polymrisation. Nanmoins, cette mthode sest
rvle peu prcise pour nos produits. De surcrot, la difficult dissoudre intgralement les
chantillons dans le DMAC peut induire des erreurs de mesures (Cf. chapitre 2.III.2.1). Les
incertitudes associes ces rsultats sont de lordre de 5*104 g/mol. Les rsultats des
principaux produits sont prsents par la figure IV.5 :
6.E+05

Poids molculaire moyen (g/mol)

5.E+05

5.7E+05

5.6E+05

5.4E+05

4.4E+05

4.3E+05

5.7E+05

4.2E+05

4.E+05

3.E+05

2.E+05

1.E+05

0.E+00
15% pep
H3PO4 6h

25 % pep
H3PO4 6h

41% pep
H3PO4 6h

25% pep
H3PO4 12h

25 % ASP
HCOOH 12h

extraction
chimique

Mahtani

Fig.IV.5 : Degr de polymrisation des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique

Comme pour le degr dactylation, la mesure du poids molculaire na pas dintrt sur la
matire premire car la chitine doit tre purifie pour tablir la mesure. La prsence de tout
autre compos perturbe la mesure de la viscosit, ainsi que la prsence dhumidit.
Quel que soit le produit, la masse molaire se situe entre 4,2 et 5,8*105 g/mol. Celle des
chitines de rfrence varient entre 4,2 et 5,7*105 g/mol pour la chitine extraite au laboratoire
et celle fournie par Mahtani respectivement. Cette dernire est produite par une longue
extraction chimique, plus de 24 h, une temprature plus faible que celle fixe au laboratoire
(90 C contre 50 C par Mahtani). Ceci illustre bien limportance des conditions de
production sur la qualit de la chitine finale et rend difficile la comparaison entre les
diffrents modes de production.
Les poids molculaires des chitines issues des trois hydrolyses de 6 h, par 15, 25 et 41 % de
pepsine en acide phosphorique, sont de 5,4*105 ; 4,3*105 et 5,6*105 g/mol respectivement. La
concentration en enzyme ne semble donc pas responsable de la diminution du degr de
polymrisation. Aprs 6 h et 12 h dhydrolyse par 25 % de pepsine, le poids molculaire de la
chitine atteint respectivement prs de 4,3 et 4,4*105 g/mol. Ces valeurs sont proches. On ne

152

II. Qualit physico-chimique des produits

peut donc pas conclure que laugmentation de la dure dhydrolyse entrane une diminution
du degr de polymrisation. Enfin, lemploi de lenzyme ASP en acide formique confirme son
potentiel pour la production de chitine. Le poids molculaire demeure lev et similaire
celui de la chitine fournie par Mahtani. ce niveau, le procd enzymatique ne prsente donc
pas davantage par rapport son homologue chimique.

II.3. Degr de cristallinit


Lindice de cristallinit a une incidence sur laccessibilit des groupes amines du chitosan,
donc sur les proprits rhologiques du polymre. Dans le domaine du traitement de leau, un
faible indice de cristallinit est recherch (Aranaz, 2010). La figure IV.6 prsente les
diffrences de cristallinit entre les principaux produits :
60
53,9

Indice de cristallinit (%)

50
41,6

40
33,1

34,9

30

20

10

0
Matire premire

25 % pep H3PO4 6h

41% pep H3PO4 6h

Mahtani

Fig.IV.6 : Indice de cristallinit des principales chitines produites par voie enzymatique et chimique

La chitine commerciale, telle que celle fournie par Mahtani, prsente un indice de cristallinit
lev par rapport la cristallinit de la matire premire. Ces indices atteignent 53,9 et 33,1 %
respectivement pour la chitine commerciale et la matire premire (exosquelettes de crevette).
Les produits des hydrolyses par la pepsine en acide phosphorique sont nettoys au NaOH, 1 h
90 C. la suite de cette tape, les indices de cristallinit mesurs sont de 34,9 % et 41,6 %
pour 25 % et 41 % de pepsine respectivement. Laugmentation de la concentration en pepsine
semble augmenter lindice de cristallinit de la chitine. Les mesures sur les autres produits
nont pas t effectues, ce qui limite les conclusions sur limpact de lhydrolyse enzymatique
sur ce critre de qualit. Au regard de ces rsultats, il serait intressant de les approfondir afin
de valider ce qui semble tre un avantage de lextraction enzymatique par rapport la voie
chimique.
Gartner et al. (2010) ont compar les degrs de cristallinit du chitosan issu de la conversion
153

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

de chitine chimique et enzymatique (par la papane). Ils montrent que lindice de cristallinit
du chitosan biologique est plus bas que son homologue chimique, mais suprieur la
rfrence commerciale. Les conditions dextraction de la chitine ont un impact important sur
son indice de cristallinit, y compris au sein dun mme procd. Ds lors, il est difficile
dopposer la voie enzymatique la voie chimique.

II.4. Stabilit thermique


Lanalyse thermogravimtrique est gnralement utilise pour mesurer le degr dhydratation
des polymres. Celui de la chitine extraite par voie chimique est compris entre 5 et 8 %
daprs lanalyse de nos produits, ce qui concide avec le degr dhydratation de la chitine
commerciale et ceux cits par la littrature. En effet, le degr dhydratation de la chitine est de
lordre de 7 % selon Belamie (1998) et de 8 % pour la chitine fournie par Mahtani.
Pour cette tude, lanalyse thermogravimtrique a t exploite dune part pour estimer le
degr de puret, en complment des autres mthodes, et dautre part pour qualifier les
comportements thermiques des produits dextraction enzymatique. LATG est applique la
chitine commerciale (fournie par Mahtani) et au produit de 6 h dextraction enzymatique
selon les conditions modles et la chitine (Fig.IV.6). Avant lanalyse, le produit a t
nettoy par le traitement chimique au NaOH.
100
Chitine par protolyse acide
Chitine commerciale

Perte de masse (%)

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0

150

200

250

300

350
400
450
500
550
600
650
700
Temprature (C)
Fig.IV.7 : Profils dATG de la chitine commerciale (Mahtani) et du produit de lextraction enzymatique modle

La figure IV.7 illustre les similitudes et les diffrences de stabilit thermique entre les deux
produits. Jusqu prs de 300 C, les deux profils ne prsentent pas de diffrences. La perte de
masse est ngligeable jusqu 210 C. Puis une dgradation thermique importante est
constate. Ainsi plus de 68 % de la masse sont perdus entre 325 C et 335 C pour le produit
de lextraction enzymatique et chimique respectivement. ce stade de la temprature, les

154

II. Qualit physico-chimique des produits

carts de pertes de masse entre les deux produits sont minimes. Ensuite, le produit
dextraction enzymatique prsente une stabilit plus importante, sa dgradation thermique est
lente jusqu 620 C. Tandis que son homologue est compltement dgrad avant 450 C.
Seule persiste la masse rsiduelle des minraux. La mme dmarche a t applique par
Gartner et al. (2010) pour comparer leur produit dextraction chimique celui de lhydrolyse
par la papane. La perte de masse de la chitine enzymatique ncessite galement une
augmentation plus importante de la temprature. On constate galement une moindre quantit
de minraux rsiduels.
Cette meilleure stabilit thermique du produit enzymatique pourrait sexpliquer par leur
diffrence de cristallinit. Pour des applications industrielles, le critre dterminant est
principalement la temprature initiale de dgradation thermique. ce titre, les deux produits
ne prsentent pas de nettes diffrences.

III. Comparaison des mcanismes dextraction


Lvolution de la structure du substrat aprs lextraction enzymatique peut tre observe par
microscopie lectronique. La littrature fournit des microghaphies de MEB (microscopie
balayage lectronique) de la structure dexosquelette de crustacs. Certains clichs sont
dcrits au chapitre 1, section IV.2 (Pillai, 2009). Dautres concernent lexosquelette de crabes
dcalcifis. Ils sont compars aux micrographes de MEB appliqus aux produits dextraction
enzymatique. De fortes similarits sont observes, telles que la structure en nids dabeille et la
prsence de canules transversaux (Fig.IV.8). Ces canaux protiques ont un rle dans le
transport des composs qui transitent dune extrmit lautre de lexosquelette.

Fig.IV.8 : Micrographies de MEB du produit de 6 h dhydrolyse par 25 % de pepsine 40 C

Sur la figure IV.8, la zone encadre dsigne une structure en nids dabeille comparable celle

155

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

dcrite dans la littrature (Raabe et al. 2007). Lorganisation semble donc tre maintenue
malgr la raction enzymatique. Cependant les produits issus de la protolyse acide prsentent
une rgularit des angles de rotation des plans de chitine-protines moins ordonne que celle
dcrite dans les cuticules (Fig.IV.9).

Fig.IV.9 : Organisation schmatique de la cuticule de homard, coupe transversale, Raabe et al. 2006

On peut galement observer une zone o la structure des plans de chitine-protines nest plus
maintenue (zone encercle). En revanche, on y observe toujours la prsence de fibres (en
clair) davantage allonges, probablement des fibres de chitine. Bien quaucune donne ne
prcise le degr de reprsentativit de cet chantillon, lorganisation de la structure de la
cuticule semble donc partiellement maintenue par la protolyse acide. titre de comparaison,
Gartner et al. (2010) ont conclu une dstructuration complte de la matrice par lhydrolyse
la papane. Daprs leurs prises de microscopie lectronique balayage, la dstructuration de
la cuticule des crevettes est plus importante par laction de la papane 2 % (w/w de
coproduits humide) que par lextraction chimique. Nous nous sommes galement intresss
limpact des deux tapes cl de lextraction chimique sur la structure des cuticules de
crevettes (Fig.IV.10).

a)

b)

Fig.IV.10 : Micrographes de MEB dexosquelettes soit dminraliss (a) ou dprotiniss (b) par traitement
chimique

Bien que les micrographes prsents par la figure IV.10 soient de qualit moyenne, ils
permettent dapprcier les consquences des diffrents traitements chimiques sur les cuticules
de crevettes.

156

III. Comparaison des mcanismes dextraction

Dune part, suite la dminralisation par lacide chlorhydrique temprature ambiante, le


pavage spcifique des coupes longitudinales est reconnu (Fig.IV.10.a). Cette structure est
galement schmatise par la figure IV.11 pour faciliter la comparaison. Les contours des
pavs sont dlimits par les fibres de chitine-protines, prsentent malgr le traitement
chimique.

Fig.IV.11 : Schma de la cuticule des crustacs, ep = picuticule, pi = couche pigmentaire, pr = couche


principale, E = cellules pithliales, p.c. = canaux de ports transversaux, i.s. = septum interprismatique,
Giraud-Guille, 1984

Dautre part, aprs dprotinisation chimique par lhydroxyde de sodium 90 C, on


distingue une multitude de microfibrilles de chitine, parsemes de microcristaux de carbonate
(Fig.IV.10.b). Le manque de nettet des micrographies invite la prudence quand cette
analyse. De plus, il est ncessaire de connatre la part de reprsentativit de cette zone.
Nanmoins, il est vident que le traitement chimique altre diffremment la structure de la
matire premire, compar lextraction enzymatique (Fig.IV.8).

IV. Valorisation de la phase soluble


IV.1. Analyse du poids molculaire des peptides solubles
La protolyse libre les protines et rduit leur taille en peptides. Aprs la filtration, ils sont
concentrs dans la fraction liquide. Le profil de distribution de leur poids molculaire est
dtermin par chromatographie dexclusion molculaire haute performance (HPLC).
La sparation a t obtenue laide dune colonne (Superdex peptide 10/300Gl). La colonne a
t calibre laide des standards suivants: Ribonuclease (13 700 Da), Aprotinin (6 500 Da),
Renin (1 760 Da), Vasopressine (1 084 Da) et Leucine (294 Da). Lchantillon est prpar
partir dune solution 2 mg/ml et dilu dans 20 ml de solution tampon de NaCl 50 mM
contenant 5 % dactonitrile et 0,1 % dacide trifluoroactique (TFA). Cette solution tampon
constitue la phase mobile. Aprs 15 min de traitement aux ultra-sons, lchantillon est filtr
157

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

(filtre de 0,45 l). Le volume inject dans la colonne est de 80 l et le dbit dlution est de
0,5 ml/min. Les composs sont dtects par une lecture de la densit optique 214 nm.
La colonne employe est spcifique aux peptides dont le poids molculaire est compris entre
7000 et 100 Da, ce qui couvre une large gamme de peptides prsents dans la phase solubles.
Bien quelle ne soit pas complte, cette couverture suffit estimer limpact de la protolyse.
Le graphique suivant illustre lvolution de la rpartition des catgories de poids molculaires
selon la dure dhydrolyse enzymatique pour la cintique de rfrence (25 % de pepsine et
40C) :
10 min
20 min
30 min
60 min
120 min
180 min
240 min
360 min
720 min

20
18
16
14

Quantit de peptides
(%)

12
10
8
6
4
2
0
> 7200

7200 - 5400

5400 - 3000

3000 - 2100

2100 - 1000

1000 - 460

460 - 260

< 260

Poids molculaire en Dalton

Fig.IV.12 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par
25 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse

La lgende de la figure IV.12 exprime laugmentation des dures dhydrolyse par lintensit
de couleur dcroissante. Les peptides volumineux tels que ceux dont le poids molculaire est
suprieur 5400 Da, diminuent au fur et mesure que la dure dextraction enzymatique
augmente. linverse, les catgories de peptides de 3000 2100 Da et 2100 1000 Da
stoffent mesure que le temps dhydrolyse sallonge.
Les quantits de peptides des catgories poids molculaires de 1000 460 Da et 460 260 Da
nvoluent quasiment pas. On peut nanmoins remarquer une tendance leur augmentation
lorsque la dure dhydrolyse est de 12 h. Enfin, lvolution des catgories de poids
molculaires de 5400 3000 Da et infrieurs 260 Da nest pas constante. Elle suggre une
rduction de taille des peptides dabord vers la catgorie de 5400 3000 Da, jusqu 120 min
dhydrolyse. Puis, au-del de 180 min, la rduction des peptides enrichie les catgories de
3000 1000 Da.

158

IV. Valorisation de la phase soluble

La masse molaire de la pepsine est de lordre de 34,5 kDa (Chapitre 3, III.1) c'est--dire dans
la premire catgorie. Elle est responsable de la protolyse et par consquence sa masse
molaire ne devrait pas voluer. La prsence de pepsine ninterfre donc pas lvolution des
catgories de poids molculaires tudis.
Lactivit antimicrobienne des peptides est reconnue pour ceux dont les poids molculaires
sont gnralement compris entre 5 et 1 kDa (Zo, 2011). Pour nos produits, ces catgories
couvrent entre 33 et 48 % des peptides, ce qui renforce le potentiel de valorisation de la phase
soluble. Le poids molculaire des pnaedines, protines de crevettes P. vannamei, forte
activit antimicrobienne (Destoumieux et al. 2000), est de lordre de 6 kDa. Cette catgorie
est estime entre 4,3 et 6,9 % des peptides. Un test dactivit antimicrobienne a t ralis sur
une gamme de microorganismes qui est dcrite dans le tableau suivant :
Rfrences

Espces

Conditions

RF 151
RF 173
RF 174
RF 182
RF 186
RF 36
EU 2183
EU 2185
EU 2189
EU 2206
EU 2202

Listeria monocytogenes
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Vibrio parahaemoliticus
Salmonella
Carnobacterium divergens
Photobacterium phosphoreum
Shewanella putrefaciens
Pseudomonas
Brochothrix thermosphacta
Lactobacillus sakei

BHI, 20 C
BHI, 37 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
BHI+2,5 % NaCl, 15 C, 48 h
BHI, 25 C
BHI, 20 C
BHI, 20 C
MRS, 26 C

Tab.IV.2 : Liste des bactries utilises par les tests dactivits antimicrobienne de la phase soluble

Quantit de peptides
(en %)

Pour prparer la solution, la prise dchantillon est dilue au 1:2 (poids/volume). Des spots de
10 l ont t dposs sur les boites de ptri o les bactries se dveloppent. Aucune activit
antibactrienne na t observe.
20

30 min

18

1h

16

2h
3h

14

4h

12

6h

10
8
6
4
2
0
> 7200

7200 - 5400

5400 - 3000

3000 - 2100

2100 - 1000

1000 - 460

460 - 260

< 260

Poids molculaire en Dalton

Fig.IV.13 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par
41 % de pepsine, en acide phosphorique, 40 C) selon la dure dhydrolyse

La figure IV.13 prsente lvolution des poids molculaires lorsque lhydrolyse enzymatique
159

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

est mene par 41 % de pepsine. On observe galement une domination des catgories de
peptides de poids molculaire compris entre 2 100 et 460 Da, avec puis de 5 400 3 000 Da.
la diffrence de la prcdente analyse, les poids molculaires sont assez stables en fonction
de la dure dhydrolyse enzymatique. On note une faible diminution de 16 % 14 % pour la
catgorie de 5 400 3 000 Da, tandis que celle de 460 260 Da prsente une augmentation de
6 % 7 %. Ces faibles variations semblent indiquer que la protolyse exerce par la pepsine
est limite. Ceci confirmerait leffet dallostrie ngative voque au chapitre 3, section V.3.
Par ailleurs, la part des peptides potentiel dactivit antimicrobienne, de 5400 1000 Da,
atteint prs de 45 % en moyenne.
Les poids molculaires des peptides de la phase soluble issue de lhydrolyse enzymatique par
lASP en acide formique ont galement t observs au cours du temps (Fig.IV.14).
10 min

40

20 min
35

30 min
60 min

Quantit de peptides
(en %)

30

120 min
180 min

25

240 min
360 min

20

15

10

0
> 7200

7200 - 5400

5400 - 3000

3000 - 2100

2100 - 1000

1000 - 460

460 - 260

< 260

Poids molculaire en Dalton

Fig.IV.14 : volution des poids molculaire des peptides solubles produits par lextraction enzymatique (par
25 % dASP en acide formique 40 C) selon la dure dhydrolyse

Cette volution des poids molculaires se distingue nettement de la prcdente hydrolyse. On


observe une diminution des peptides de poids molculaires de 1000 plus de 7200 Da en
fonction de la dure dhydrolyse. Le produit dune heure dhydrolyse est singulier par rapport
aux autres produits de la cintique. La protolyse par lASP semble rduire davantage les
peptides par rapport lutilisation de la pepsine.
Une augmentation des peptides, en fonction du temps dhydrolyse, est observe pour les
catgories de poids molculaire infrieur 1000 Da. Par rapport la prcdente hydrolyse, les
peptides produits prsentent donc un poids molculaire infrieur. La protolyse semble plus
active par lASP par rapport la protolyse par la pepsine. Ds 10 min, les produits solides de
lhydrolyse prsentent des peptides de poids molculaires trs faibles. La part des peptides
infrieurs 1000 Da couvre 59 % 78 %, pour 10 min 6 h dhydrolyse respectivement.

160

IV. Valorisation de la phase soluble

La part des peptides susceptibles de prsenter une activit antibactrienne varie de 26 %


11 % selon la dure dhydrolyse enzymatique. La diffrence de rpartition des poids
molculaires en fonction des deux enzymes montre que leur mode de protolyse est diffrent
et suggre que les activits des peptides librs soient galement diffrentes.

IV.2. Evolution de llimination des acides amins dans le rsidu solide


La dprotinisation peut tre suivie acide amin par acide amin grce leur dosage par CPG.
Cest le cas de la cintique dhydrolyse enzymatique par 25 % de pepsine en acide
phosphorique (Fig.IV.15).
ALA
GLY
VAL
LEU
ILE
THR
SER
PRO
ASP
MET
GLU
PHE
LYS
HIS
TYR
C-C

Quantit d'acide amins (g/100g)

0
0

50

100

150

200

250

300

350

400

Dure d'hydrolyse (min)


Fig.IV.15 : Quantits dacides amins rsiduels dans les produits insolubles de lextraction enzymatique par
25% de pepsine 40C (petite taille) en fonction de la dure dhydrolyse

La figure IV.15 montre que la part respective de chaque acide amin semble converger vers
zro sans latteindre. On nobserve pas de phase de stabilisation et la plupart des cintiques
semblent prsenter une vitesse constante diffrente en fonction de lacide amin.
Les regroupements acide glutamique/glutamine dune part et acide aspartique/asparagine
dautre part, sont majoritaires. La serine, la lysine, lhistidine et la tyrosine sont les moins
reprsents. La cystine et la mthionine sont toujours faiblement dtectes. Lanalyse de la
matire premire prsentait les mmes caractristiques (Chapitre 2, Fig.II.1). Ces
comparaisons traduisent que la pepsine limine indiffremment les acides amins prsents
initialement dans la matire premire, sans prfrence pour les acides amins aromatiques.
Les acides amins essentiels prsents dans la phase soluble reprsentent en moyenne 36,3
0,7 % du total des acides amins doss (daprs la cintique modle 25 % de pepsine). Il est
difficile de comparer ce rsultat aux autres tudes dextraction biologique de la chitine car les
modes opratoires sont trs diffrents. partir de coproduits de P. vannamei, Armenta et
Gueretto-Lagarreta (2009) ont mesur une composition en acides amins essentiels de 46,6 %

161

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

et 48,7 % respectivement dans la matire premire non fermente et fermente par des
bactries lactiques. Lanalyse a t ralise par HPLC. Dans une autre tude, Rao et al. (2005)
mesurent 32,1 % dacides amins essentiels dans les hydrolysats de coproduits de crevettes
(ttes et carapace).

IV.3. Rsidus glycosidiques


Les rsidus glycosidiques comprennent ici tous les oses simples, initialement prsents dans le
substrat ou issus de la dcomposition de la chitine ou des glycoprotines sous laction de
lextraction enzymatique. Une telle dcomposition se traduirait principalement par une
augmentation de N-actyl-glutamine. Ils sont dabord doss par la mthode de Dubois. Elle
est complte par une analyse qualitative et quantitative par chromatographie en phase
gazeuse (Cf. Chapitre 2, I.6.3). Les rsultats sont dtaills ci-dessous (Fig.IV.16) :
NacGlu

50

Composition en sucres (g/100g)

Glucose
Galactose

40

30

20

10

0
25%Pepsine-H3PO4-6h

41%Pepsine-H3PO4-6h 25%Pepsine-H3PO4-12h

25%ASP-HCOOH-6h

Fig.IV.16 : Rpartition des catgories de rsidus glycosidiques dans la phase soluble des extractions
enzymatiques

Dans le cas de lextraction modle, la teneur totale en rsidus glycosidiques atteint 5,7 0,8 g
pour 100 g de la phase soluble. Ils se dclinent en 2,6 g/100 g de galactose, 3,0 g/100 g de
glucose et 0,1 g/100 g de glucosamine, actyles ou non. Ceci reprsente respectivement prs
de 46 %, 53 % et 1 % des rsidus glycosidiques. La part des glucosamine et N-actylglucosamine est trs faible, ce qui indiquerait une absence de dpolymrisation.
Daprs la figure IV.16, suite laugmentation de la concentration en pepsine jusqu 41 %,
la teneur totale en rsidus glycosidiques atteint 6,3 0,2 g/100 g de phase soluble. Bien que
lgrement suprieure la teneur en rsidus glycosidiques de lhydrolyse par 25 % de
pepsine, cette augmentation est comprise dans lincertitude des mesures. La composition en
rsidus glycosidiques se rpartit entre 59 % de galactose, prs de 40 % de glucose et moins de
1 % de glucosamine actyle ou non.
La mme rpartition est constate lorsque la dure dextraction est allonge jusqu 12 heures.

162

IV. Valorisation de la phase soluble

La teneur total en rsidus glycosidiques atteint alors 5,8 0,5 g/100 g de phase soluble. Cette
quantit est similaire aux prcdents rsultats. La part de glucosamine/N-actyl-glucosamine
demeure toujours trs faible, infrieure 1 %.
Lextraction par 25 % dASP 6 h, produit une teneur totale en rsidus glycosidiques de 46,0
1,1 g/100 g de phase soluble. Elle comprend plus de 98 % de glucose puis prs de 1 % de
galactose et Glu/NacGlu chacun. Ceci montre que lemploi du couple ASP/acide formique
une action diffrente du couple pepsine/acide phosphorique sur la dprotinisation. Par
consquent, la composition de la phase soluble est compltement modifie.

IV.4. Pigments
IV.4.1. Quantit de lipides et dastaxanthine dans la phase soluble
Parmi les pigments dorigine marine (Chapitre 1, VIII.1.2), les carotnodes sont majoritaires
dans les exosquelettes des crustacs, dont principalement lastaxanthine (Babu et al, 2008).
La proportion de lipides dans la phase soluble, rcupre aprs 6 heures dextraction par 25 %
de pepsine, reprsente 2,7 0,3 %. Cette quantit correspond plus de 100 % de la quantit
de lipides initialement prsente dans la matire premire. Compte tenu des incertitudes lies
aux mesures, ceci signifie que tous les lipides passent en phase soluble.
Daprs Aurioles-Gamboa et al. (2004), la quantit dastaxanthine est corrle celle des
lipides totaux dans lexosquelette de crabe selon la relation suivante :
[Astaxanthine] = - 0,9849 + 0,08499*[Lipides]

(IV.1)

Lanalyse qualitative des carotnodes a t ralise par le laboratoire Agrobio (Rennes), par
HPLC couple la spectrophotomtrie UV/VIS (Fig.IV.17). La quantit dastaxanthine a t
mesure 8,0 g par gramme de phase soluble lyophilise. Lastaxanthine est le carotnode
majoritaire, cependant dautres sont visibles sur le spectre de la figure IV.17, certainement des
xanthophylles. Les autres lipides nont pas t identifis, ils peuvent tre des phospholipides
ou des acides gras complexs sous forme de glycolipidiques et lipoprotiques. Gartner et al.
(2010) font part de la prsence de palmitate, olate, linolate et esthrate de mthyle. Par
ailleurs, la teneur total en lipide, mesure dans cette tude, est suprieur celle dtermine
dans notre matire premire, 8 % contre 3,3 % respectivement.

163

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

Fig.IV.17 : Carotnodes prsents dans la phase soluble de lhydrolyse 25 % de pepsine, 6 h 40 C.

La teneur en astaxanthine observe correspond 1,17 g/g de substrat initial. Cette teneur est
faible compare celle obtenue par Gildberg et al. (2001). Leur hydrolyse enzymatique par
alcalase (pendant 2 h 40 C) partir de crevettes nordiques, Pandalus borealis, est suivie
dune centrifugation. Dans le culot, 1 500 g dastaxanthine est rcupr. Ainsi, leur
rendement en astaxanthine atteint prs de 40 %. Pour comparer le rsultat de Gildberg et al.
(2001) au ntre, une centrifugation de la phase soluble devrait tre applique.
La teneur en astaxanthine de nos coproduits de crevette na pas t mesure, cependant, la
littrature offre cette donne. Dans les exosquelettes de crevettes, selon lespce, la teneur en
carotnodes totaux varie de 59,8 104,7 g/g (Sachindra et al. 2005). Ce qui nous mnerait
un rendement autour de 1 2 % lissue de lextraction par 25 % de pepsine 40 C.
La comparaison avec les autres tudes similaires est difficile due aux diffrences de procds
dextraction. Lhydrolyse, par la pepsine, de quatre coproduits de crevettes diffrentes (P.
monodon sauvage et daquaculture, P. indicus et P. monocerous), mene par Babu et al.
(2008), aboutie des quantits de 120 jusqu 705 g/g de carotnodes totaux rcuprs. Les
conditions dhydrolyse taient de 45 C et le pH proche de 4. La fermentation lactique
exprimente par Bhaskar et al. (2006) partir de coproduits de P. monodon atteint jusqu
78,5 2,3 % de rendement en astaxanthine. Ils montrent galement Daprs Armenta et al.
(2009), sur Pandalus borealis, lastaxanthine libre reprsente seulement 4 % du total des
astaxanthines, tandis que les mono-esters et di-esters constituent respectivement 20 et 76 %.
Des mesures complmentaires nous sont donc ncessaires pour identifier tous les carotnodes
de nos produits.
No et al (1989) montrent que la rduction de taille de fragment de matire premire rduit le
degr de rcupration de lastaxanthine lors de lextraction chimique de la chitine partir de
164

IV. Valorisation de la phase soluble

coproduits de crabe. Leurs expriences portaient sur des fragments compris entre 2 et 0,2 mm.
Ces rsultats nous invitent poursuivre lanalyse de la composition en astaxanthine de nos
produits en fonction de la taille initiale des fragments dexosquelette de crevettes.
La teneur en astaxanthine dans la phase soluble issue de lextraction par 25 % dASP en acide
formique a t mesure 4,2 g/g. Cette quantit est quasiment la moiti de la celle obtenue
par la prcdente hydrolyse. Cependant, dans les deux cas, les teneurs en astaxanthine sont
suprieures celle observes dans la phase soluble issue de lextraction chimique. Dans le cas
du procd traditionnel, la teneur en astaxanthine est infrieure 2 g/g. Ces donnes sont
rsumes dans le tableau IV.3 :
Extraction

Teneur en astaxanthine (/g)

Extraction chimique

8,0

Pepsine + H3PO4

4,2

ASP + HCOOH

<2

Tab.IV.3 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction

IV.4.2. La couleur des rsidus insolubles


La phase insoluble, qui contient la chitine, doit tre le plus blanc possible pour rpondre au
cahier de charge. Dune part, le visuel constitue un premier indicateur. Plusieurs observations
ont t faites et elles sont rsumes dans le tableau IV.4 :
Extraction
Extraction chimique
Pepsine + H3PO4
ASP + HCOOH

Couleur

Aspect / texture du produit

Blanc

Plastique, lectrostatique

Rose ple

Rugueux, friable

Rose-orange

Rugueux, friable

Tab.IV.4 : Comparaison des caractristiques visuelles des rsidus insolubles selon le procd dextraction

Laspect du produit dextraction chimique prsente les caractristiques de rfrence conforme


cahier des charges de la chitine commerciale.
Les produits dhydrolyse enzymatique prsentent une coloration plus ou moins prononce,
lie la prsence des protines et pigments rsiduels. Cependant leur couleur se distingue
nettement en fonction de lenzyme employe. Par la pepsine, la chitine est de couleur roseple, tandis que la couleur de la chitine obtenue par lASP est plus fonce, dans les teintes
orange dor. Lenzyme tant elle-mme de cette couleur, on peut supposer quune partie de
ses pigments se lient la chitine.
De surcrot, lintensit de la coloration des produits a t observe par spectrocolorimtrie
(Cf. Chapitre 2.III.6) les facteurs de rflexions L*, a* et b* sont mesurs et compars pour trois
produits :

165

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

la chitine obtenue aprs lavage chimique

la chitine obtenue par voie enzymatique, par la pepsine


la chitine obtenue par voie enzymatique, par lASP

L* traduit la clart de la lumire (L* = 0 pour le noir et L* =100 pour le blanc). Les valeurs a*
et b* indiquent respectivement lintensit vers le rouge et de jaunes lorsquelles sont positives.
Le facteur WI indique galement lintensit vers le blanc. La comparaison entre ces facteurs
est illustre par la figure IV.18 :

70

Intensit

20
L*(D65)

a*(D65)

b*(D65)

WI (CIE)

-30

-80

chitine purifie par voie chimique


chitine par pepsine
chitine par ASP

-130

Fig.IV.18 : Comparaison des coefficients de spectrophotomtrie

La figure IV.18 confirme et complte les observations du tableau IV. Le coefficient L* est
plus lev pour la chitine chimique, avec 84,8 0,2. Puis il diminue, dans lordre, pour la
chitine obtenue par la pepsine et lASP. Les valeurs observes sont de 75,5 0,4 et 72,0 0,3
respectivement. Le facteur a*, qui exprime lintensit vers le rouge, est plus lev lorsque la
chitine est extraite par la pepsine, 8,4 0,5, puis par lASP, 7,4 0,2. Aprs le traitement
chimique, la chitine les facteurs a* et b* sont plus faibles. En revanche, elle prsente le
coefficient WI le plus lev, de lordre de 37,1 0,7. Lorsque la voie enzymatique est
emprunte, ce facteur est ngatif, ce qui exprime que la couleur des produits sloigne du
blanc. Ces caractristiques sapprcient visuellement sur les photographies de la figure IV.19 :

Fig.IV.19 : Chitine obtenue par lavage chimique, par hydrolyse par la pepsine et par lASP (de gauche droite)

166

V. Valorisation de la phase soluble

V. Conclusions du chapitre 4
Les tapes du procd dextraction de la chitine partir des coproduits de crevettes P.
vannamei et les analyses qui suivent sont rappeles dans le schma IV.20 :
Matire premire

Acide

-Nettoyage
-Schage
-Broyage
-Stockage

-Concentration en
fonction de la teneur en
minraux

Enzyme
-Solubilisation dans leau
-Concentration en fonction
de la teneur en protines

Prparation
Homognisation

Inoculation

Protolyse acide
Raction
Filtration/ rinage

soluble
Phase insoluble
Voie fermentation
Extraction chimique Phase

Analyses

Compose de
CHITINE
principalement

Compose de rsidus
glycosidiques,
protines, minraux
et de pigments

Protolyse acide

GLUCOPEPTIDES
CHITOSAN
CALCITES
OLIGOProduits
ASTAXANTHINE
CHITOSAN
Fig.IV.20 : Schma rcapitulatif
des tapes du procd de protolyse acide et des analyses conscutives
Les performances de ce procd sont compares celle de lextraction chimique et aux
meilleures performances proposes par la littrature avec la voie fermentaire (Cf. Tab.IV.5).
Pour liminer les minraux, la protolyse acide est quasiment aussi performante que
lextraction chimique. Cette conclusion est valable ds lors o la concentration en pepsine et
en ASP dpasse 25 %. La voie fermentaire donne des rsultats variables selon le nombre
dtapes et les microorganismes slectionns. Xu et al. (2008) obtiennent moins de 1 % de
minraux rsiduels aprs 4 jours de fermentation lactique. En termes de dprotinisation, ils
atteignent une teneur en protines rsiduelles de lordre de 6 %. La protolyse acide a permis

167

Chapitre 4 Comparaison entre lhydrolyse enzymatique acide et les autres voies dextraction

dobtenir un rsidu solide contenant prs de 9 % 3 % de protines rsiduels, avec la pepsine


et lASP respectivement. La dure des protolyses acide nexcde pas 12 h tandis que celle de
la fermentation est au moins 48 h. Par consquent, au regard de la dure, la protolyse est
avantageuse (Cf. Tab IV.5).

Minraux rsiduels (%)

<1%

<1%

<1%

Protines rsiduelles (%)

<1%

~6%

~9%

6 30 h

> 48 h

6 12 h

Dure

Tab.IV.5 : Comparaison des performances en purification de chitine en fonction du procd

Les caractristiques physico-chimiques des chitines obtenues sont galement compares


(Tab.IV.6). Pour la voie fermentaire, les rsultats prsents sont issus des travaux de Pacheco
et al. (2009), contrairement aux deux autres voies, tudies au laboratoire. Lunique paramtre
qui semble se dmarquer est lindice de cristallinit.

Degr d'actylation (%)


Masse molculaire (g/mol)
Indice de cristallinit

Extraction chimique

Voie fermentation

Protolyse acide

95,5 1%

94%

95,1 1%

4,2 5,7x105

1,2x106

4,3 5,7x105

53 %

86%

35%

Tab.IV.6 : Comparaison des performances en purification de chitine en fonction du procd

Lun des objectifs de ltude consistait mettre en uvre un procd plus respectueux des
enjeux environnementaux. La production deffluents chimiques de la protolyse acide est
compare lextraction chimique (Tab.IV.7).

Consommation en eau (w/v)


Concentration en ractif

Extraction chimique

Protolyse acide

1 :10
1 1,5 N (rpt 2 fois)

1 :5
<1N

Tab.IV.7 : Comparaison de la production deffluents chimique en fonction du procd

Le chapitre 4 met galement en vidence la diffrence entre la protolyse acide et lextraction


chimique sur la destructuration de la matire premire. Daprs les micrographies de MEB,
lexosquelette des crevettes est moins dnatur par la voie enzymatique. Des diffrences de
couleur entre les produits finaux sont galement notes entre les deux voies de purification et
entre les deux couples enzyme-acide. Enfin, lanalyse des poids molculaires des peptides des
phases solubles a montr que la pepsine et lASP ne prsentent pas le mme mode daction.
168

Conclusion & Perspectives

169

Conclusion & Perspectives

Rappel des objectifs de la thse


Ce travail de thse a t centr sur lapplication de la protolyse acide pour purifier la chitine
partir de coproduits de crevettes, classiquement ralise par voie chimique.
Le principe dvelopp repose sur lemploi dune protase active en milieu acide pour raliser
simultanment la dminralisation et la dprotinisation. Les objectifs ont port sur :
La mise en uvre du procd. Pour favoriser cette protolyse, la concentration en acide
apport au milieu doit tre en quilibre avec le carbonate de calcium du substrat, conduisant
une stabilisation du pH par effet tampon.
La mise en uvre de la stratgie analytique. Pour comparer les performances du procd, il
est important de qualifier le substrat initial est les produits de lhydrolyse enzymatique. Une
analyse complte de leur composition est alors ncessaire. Lun des objectifs a donc t de
comparer et de discuter de la pertinence des mthodes de caractrisation desdits produits.
Loptimisation du procd a ensuite t conduite en tudiant limpact de plusieurs facteurs
au cur de cintiques : la taille des fragments de substrat, la temprature et la concentration
en enzyme.
Enfin le positionnement du procd a t tablit par rapport aux procds existants et
lidentification des composs solubles librs par lhydrolyse enzymatique a t initie.

Principal obstacle rencontr


Les coproduits de crevettes sont caractriss par un rseau dense de protines et de chitine qui
interagissent avec les minraux pour former lexosquelette. Par ailleurs, les composs
impliqus sont gnralement des complexes carotno-protiques et gluco-protiques. Les
liaisons covalentes mises en jeu sopposent alors la sparation de ces composs. Elle savre
dlicate et gnralement incomplte ou excessive. Or la majorit des mthodes danalyse de
composition reposent sur une sparation pralable de ces derniers.
Les bilans de masse, appliqus aux substrats comme aux produits des hydrolyses, ont mis en
vidence cette difficult analytique. Remdier cette problmatique a donc constitu un point
important de ce travail de thse.
La mthode retenue consiste, dans un premier temps, estimer la quantit de protines par le
dosage des acides amins totaux. Par rapport aux autres mthodes, cette technique nexige pas
de sparation pralable de la chitine et des protines. Puis, la quantit de chitine est estime.
La technique slectionne repose sur le nettoyage chimique des produits. Une seconde
mthode consiste utiliser les bilans massiques. Lanalyse lmentaire et lanalyse
thermogravimtrique sajoutent aux prcdentes mthodes pour recouper et valider ou
corriger lestimation de la teneur en chitine.
De manire gnrale, plus le degr de puret en chitine augmentait, plus les rsultats obtenus
par les diffrentes mthodes convergeaient. Une seule mthode ne suffit donc pas

171

Conclusion & Perspectives

dterminer la quantit de chitine. Pourtant, cest une pratique courante qui se traduit par des
diffrences de teneurs dcrites dans la littrature, y compris pour une mme espce
biologique. Certains auteurs font le choix de ne prsenter quune seule catgorie de composs
incluant la chitine et les protines. Pour notre tude, cette distinction est ncessaire. Il savre
donc important dappliquer un recoupement dau moins deux mthodes distinctes

Principaux facteurs pour amliorer les performances du procd


Un effort important a t apport ltude des facteurs ayant un impact sur les cintiques de
dminralisation et de dprotinisation.
La taille initiale des fragments de substrat sest rvle tre le facteur dterminant sur les deux
cintiques. Les vitesses de dminralisation et de dprotinisation sont augmentes par une
rduction de la taille des fragments. La surface de contact offerte aux enzymes crot mesure
que la taille des fragments est rduite. Ce paramtre permet donc doptimiser la purification
de la chitine tout en rduisant le temps du traitement.
Nos observations ont montr que les cintiques obtenues ne rpondent pas des relations
exponentielles simples. Un effort de modlisation a permis de proposer une formalisation des
deux cintiques. Le modle exprime la vitesse de dminralisation laide dune fonction
polynomiale des facteurs environnementaux, multiplie par une fonction linaire de la
quantit des minraux rsiduels. Par consquent, la vitesse de dminralisation est dautant
plus rapide que la quantit de minraux est importante.
Les meilleurs modles de dprotinisation ont fait intervenir des fonctions sigmodes. Elles
expriment linfluence probable de phnomnes dallostrie, c'est--dire dinhibition de la
raction par la fraction protique.
Par rapport la taille des fragments, la temprature et de la concentration en enzyme ont un
impact plus faible. Laugmentation de la temprature favorise la solubilisation des minraux
alors quaugmenter la concentration denzyme favorise la solubilisation des protines.

Extension vers de nouvelles enzymes et dautres conditions opratoires


Loptimisation du procd a permis d'obtenir une puret en chitine intressante : la quantit de
minraux rsiduels est trs faible, de lordre de 1 %. Celle des protines rsiduelles est plus
leve, de lordre de 10 %. Le rendement en chitine est de lordre de 28 % par rapport au
poids initial de matire premire. Ces performances sont satisfaisantes au regard des autres
procds biologiques, pour lesquels les teneurs en impurets sont gnralement plus leves
et les dures de traitement plus longues. En revanche, le procd chimique permet dobtenir
une puret en chitine plus leve. Les caractristiques physico-chimiques de la chitine
obtenue par voie enzymatique et chimique ne prsentent pas de diffrences significatives.
Ces protolyses acides ont t conduites par la pepsine, dans un milieu maintenu pH 2 par
lacide phosphorique. Nous avons explor lemploi dun nouveau couple enzyme/acide,
savoir lASP et lacide formique. Les premiers rsultats prsents dans cette thse savrent
172

Conclusion & Perspectives

prometteurs. Par consquent, nous pouvons supposer quune tude oriente vers le potentiel
de ce couple puisse augmenter les performances du procd.
Enfin, ce procd biologique prsente un potentiel accru en raison dune valorisation de la
phase soluble. Ce point a galement t explor dans ce manuscrit.

Principales perspectives
Ce procd peut tre tendu dautres couples denzyme et dacide. De plus, il pourrait tre
appliqu dautres substrats tels que les cphalopodes (seiches et calamars), dont la chitine
est de nature diffrente, dautres crustacs (comme les crabes et les crevisses), et aux
insectes.
De part la multiplicit des mthodes, nous disposons dun nombre important de donnes
cintiques. Il serait probablement enrichissant dapprofondir lexploitation de leur
recoupement par lemploi de la thorie de rconciliation des donnes dynamiques. Une telle
approche devrait alors contribuer affiner simultanment la prcision des mesures et des
modles proposs.
En dernier lieu, une tude conomique approfondie permettrait de comparer la rentabilit de
ce procd par rapport lextraction chimique traditionnelle.

173

Valorisations scientifiques associes cette tude


Brevet
Extraction de chitines en une seule tape par hydrolyse enzymatique en milieu acide , 24
mai 2011, FR 11 54580
Communication orales
Le Roux K., Arhaliass A., Baron R., Berg J.P., Leroy E., Chitin extraction from marine byproducts by enzymatic hydrolysis , 2009, Colloque Polymerix

Communication orales avec actes de publication

Le Roux K., Berg J.P., Arhaliass A., Baron R., New enzymatic extracction of chitin from
crustacean by-product , 2011, 9th Asian Pacific Chitin & Chitosan Symposium.
Posters
Application de lhydrolyse enzymatique pour lextraction de la chitine , 2010, Doctoriales
Le Roux K., Arhaliass A., Baron R., Berg J.P., Leroy E., 2009, Application de lhydrolyse
enzymatique pour le traitement des coproduits marins. Exemple des protases pour
lextraction de la chitine , Colloque Gen2Bio

174

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198

Annexes

Annexes

A.

Extrait du journal officiel europen concernant la chitine et le chitosan

Dnomination INCI
CHITIN
CHITIN GLYCOLATE
CHITOSAN
CHITOSAN ASCORBATE
CHITOSAN FORMATE
CHITOSAN GLYCOLATE
CHITOSAN LACTATE
CHITOSAN PCA
CHITOSAN SALICYLATE
CHITOSAN SUCCINAMIDE
SODIUM CARBOXYMETHYL CHITIN

Numro CAS Nom chimique


1398-61-4 215-744-3
Chitine, hydroxyactate
9012-76-4 Chitine, dsactyle
135322-32-6
chitosane + acide L-ascorbique
66267-52-5, Formiate de chitosane
(sel)
Hydroxyactate de chitosane
66267-50-6, Chitosane, sel d'hydroxy2-propanoate
117522-93-7 Chitosane, sel de l'acide
pyrrolidonecarboxylique
84563-67-7 Chitosane, sel de
l'hydroxy-2-benzoate
N-(3-carboxypropanoyl)+ chitosane

Fonctions
Agent de foisonnement
Entretien de la peau
Agent filmogne
Antioxydant/agent filmogne/
entretien de la peau
Agent filmogne
Antioxydant/ agent
entretien de la peau
Agent filmogne

filmogne/

Humectant
Antioxydant/agent filmogne/
entretien de la peau
Agent filmogne
Agent de foisonnement
Humectant/conditionneur
capillaire/
agent filmogne

201

Rfrences bibliographiques

B. Recommandations en termes de caractristiques physico-chimiques


pour diffrentes applications des drivs de la chitine

Aranaz et al. 2009

202

Annexes

C.

Exemples de fiches techniques de produits commerciaux drivs de chitine


Produit 1 www.dalwoo.tripod.com
Technical
Appearance

White

or

Yellow

Produit 2 www.tootoo.com (ALIBABA)

Pharmaceutical

Food industry

Technical

Pharmaceutical

Food industry

White

White

Translucent/pale -

White

White

flake/powder

flakes/powder

flakes/powder

12%

8%

8%

or

Yellow

or

Yellow,

translucent

translucent

Powder

Powder or flake

Powder or flake

Density

Pass 25 - 200 Mesh

Pass 25 - 200 Mesh

Pass 25 - 200 Mesh

Moisture Content

10%

10%

10%

Protein Content

0,3%

0,2%

0,2%

Ash Content

0,5%

0,3%

0,3%

2%

1%

1%

DA

70 - 100%

70 - 100%

70 - 100%

80 95%

95 99%

85 95%

Viscosity

50-500cps

5 cps and less

5 cps and less

5 50 mpa.s :low

50 800 mpa.s

5 300 mpa.s

0,72%

50-300 :middle
>800 mpa.s :high
Insolubles

1%

1%

1%

2%

0,32%

Heavy metals(As)

10 ppm

10 ppm

10 ppm

< 0,0005%

< 0,0005%

Heavy metals(Pb)

10 ppm

10 ppm

10 ppm

pH

7-9

7-9

7-9

7-8

7-8

7-8

Odor

No taste and smell

No taste and smell

No taste and smell


<3000 ufc/g

<1000 ufc/g

<1000 ufc/g

Total bacterial
Salmonelle

none

E.coli

40

203

Purification de la chitine par hydrolyse enzymatique partir de coproduits de crevette


Penaeus vannamei. Caractrisation des produits et optimisation du procd
Lobjectif de ltude porte sur loptimisation de lextraction de la chitine par protolyse acide.
Loriginalit du procd repose sur la stabilisation du pH grce lquilibre entre la composition du
substrat et le solvant acide. Ce principe permet de raliser simultanment la dminralisation et la
dprotinisation, les deux principales ractions associes la purification de la chitine. Pour valuer
les performances de cette purification, la composition du substrat et des produits est caractrise.
Diffrentes mthodes de quantification de la chitine et des protines sont compares. Contrairement
aux dosages traditionnels, une mthode directe de dosage des acides amins est slectionne pour
estimer la quantit de protines. Lestimation de la quantit de chitine repose sur des mthodes
indirectes, principalement la gravimtrie, lanalyse lmentaire et lanalyse thermogravimtrique
(ATG). Les cintiques de dminralisation et de dprotinisation sont tudies en vue doptimiser la
purification de la chitine. Les bilans massiques confirment la cohrence des rsultats. Les
caractristiques physico-chimiques de la chitine obtenue par voie enzymatique, le degr dactylation,
le degr de dpolymrisation et lindice de cristallinit, sont compares la chitine obtenue par voie
chimique. La structure de la chitine a galement t observe par microscopie lectronique balayage
(MEB). Enfin, les composs solubiliss par lhydrolyse enzymatique sont identifis et quantifis.

Mots-cls : coproduits de crustacs, hydrolyse enzymatique, protolyse, chitine, extraction, cintique,


dminralisation, dprotinisation.

Purification of chitin by enzymatic hydrolysis from shrimp Penaeus vannamei byproducts. Products characterization and process optimization
The objective of this study was to optimize the extraction of chitin by acid proteolysis. The novelty of
the method is based on the stabilization of pH by the balance between substrate composition and the
acid solvent. This principle allows a simultaneous demineralization and deproteinization, the two main
reactions associated with the purification of chitin. To evaluate the performance of this purification,
the composition of the substrate and products was characterized. Different methods of quantification
of chitin and proteins have been compared. As traditional assays were not satisfaying, a direct method
of amino acids determination by gaz chromatography was selected to estimate the amount of protein.
The estimate of chitin amount was based on indirect methods, mainly gravimetry, elemental analysis
and thermogravimetric analysis (TGA). Kinetics of demineralization and deproteinization were
examined to optimize the purification of chitin. Mass balances confirmed the consistency of results.
The quality of chitin extracted by enzymatic or chemical techniques was compared with the degree of
acetylation and depolymerization and the crystallinity index of chitin. The structure of chitin was also
observed by scanning electron microscopy (SEM). Finally, compounds solubilized by enzymatic
hydrolysis were identified and quantified.
Key-words: crustacean by-products, enzymatic hydrolysis, proteolysis, chitin, extraction, kinetic,
demineralization, deproteinization.