By Heidi Marina Diego Sandoval

ESTERILIZACIN
Para poder llevar a cabo una fermentacin con xito es imprescindible y obligatoria tener en todas las
etapas cultivos libres de contaminantes, desde el cultivo preliminar hasta el fermentador de
produccin.
La esterilizacin es un mtodo de eliminacin total de todo tipo de organismo que asegura la ausencia
absoluta de cualquier forma viviente. Una esterilizacin deficiente o manipulacin incorrecta de
materiales y medios de cultivo conlleva a contaminaciones, resultados errneos o prdida del material
biolgico.
Esta definicin excluye por lo tanto cualquier tcnica que resulte solamente en un dao a los
microorganismos o atenuacin de la actividad de cualquier tipo.
Durante la fermentacin se deben observar dos puntos para asegurar la esterilidad:
- Esterilidad en el medio de cultivo
- Esterilidad del aire que entra y sale
Adems del inculo y el proceso de inoculacin, la adicin de nutrientes, antiespumantes, etc. durante
el proceso, el fermentador en s.
Para lo cual es necesaria una construccin apropiada del biorreactor que facilite la esterilizacin as
como la prevencin de la contaminacin durante la fermentacin.
Limpieza, asepsia, axenia y esterilizacin.
La palabra desinfeccin se aplica a la remocin o destruccin por cualquier va de organismos vivos que
pueden causar dao particular o infeccin. No significa por lo tanto la destruccin de todos los
microorganismos, sino solamente de aquellos que pueden producir un resultado no deseado.
Un antisptico es un desinfectante, o sea un agente qumico usado para destruir microorganismos
dainos. Se utiliza en general para agentes a ser aplicados en animales o humanos.
Asepsia es la exclusin continuada de microorganismos contaminantes. As por ejemplo el cultivo de
microorganismos en el laboratorio es llevado a cabo aspticamente como en muchas fermentaciones
industriales. El medio de cultivo es esterilizado para remover toda forma de vida y luego inoculado con
el cultivo requerido. Se dice entonces que el sistema se mantiene en condiciones aspticas.
Esterilizacin de medios de cultivo
El medio nutritivo que se prepara inicialmente contiene una variedad de clulas vegetativas diferentes
y de esporas que proceden de los constituyentes del medio, del agua y del recipiente. Estos

microorganismos deben ser eliminados por un procedimiento adecuado antes de la inoculacin.

Existen un conjunto de procedimientos para la esterilizacin, pero en la prctica, para instalaciones a
gran escala, el calor es el principal mecanismo utilizado.
Un conjunto de factores influyen en el xito de la esterilizacin por calor: el nmero y tipo de
microorganismos presentes, la composicin del medio de cultivo, el valor del pH y el tamao de las
partculas en suspensin.
Las clulas vegetativas son eliminadas rpidamente a temperaturas relativamente bajas, pero para la
destruccin de las esporas se necesitan temperaturas de 121 C.

Mtodos de esterilizacin: qumicos y fsicos

Los mtodos de esterilizacin pueden ser de 3 tipos:
a) Destruccin total de microorganismos; se entiende un proceso muy violento, que casi siempre
implica calentamiento apreciable del material.
b) Muerte o inactivacin; significa la eliminacin de microorganismos sin que exista necesariamente
desintegracin de las clulas. Se puede efectuar por calentamiento, seco o hmedo, por radiaciones o
por agentes qumicos.
c) Eliminacin con medios fsicos; est restringida a la esterilizacin de gases lquidos, y es
fundamentalmente llevada a cabo por filtracin mediante filtros absolutos o filtros fibrosos.

Esterilizacin por calor hmedo

Se necesitan de 2 a 3 horas para alcanzar la temperatura de esterilizacin (121C) lo que depende de la
conduccin del vapor y del tamao del fermentador. Una vez se ha alcanzado la temperatura correcta
se requieren otros 20 - 60 minutos para el proceso real de muerte, seguidos de enfriamiento durante
una hora. Para enfriar el fermentador, la energa que se requiere para el calentamiento debe ser
subsecuentemente retirada y, si el agua caliente que se obtiene durante el enfriamiento no se puede
aplicar a algn uso, la esterilizacin por calor se hace muy costosa.
Otra desventaja de la esterilizacin por calor (y desde el punto de vista de la Microbiologa el defecto
que resulta ms significativo) es que las fases de calentamiento, esterilizacin y enfriamiento no
solamente matan a los microorganismos, sino que tambin alteran severamente la solucin de
nutrientes. La decoloracin y los cambios en el valor del pH se originan como consecuencia de la
caramelizacin y la reaccin de Maillard. Las vitaminas se destruyen y la calidad del medio de cultivo se
deteriora. La extensin en la que es afectada la fermentacin subsecuente depende del organismo y
del proceso.
Cintica de muerte trmica
La destruccin de microorganismo por vapor (calor hmedo) puede ser descrita como una reaccin
qumica de primer orden:

:
= # . .
=
=

Constantes de velocidad de reaccin (K) y tiempos de reduccin decimal de diferentes esporas

bacterianas suspendidas en buffer a 121C.

Integrando la ecuacin:

:
= # . .
= " . .

Grfica de la ecuacin.
-La esterilizacin total nunca puede alcanzarse.
-Valores de < 1 se deben considerar en trminos de la probabilidad de que un microorganismo
sobreviva al tratamiento.
-En las grficas representadas slo se observa cuando se lleva a cabo la esterilizacin de un cultivo puro
bajo condiciones ideales de esterilizacin.
Otra forma de expresar la ecuacin:

Grfica de la ecuacin.
Ciclo y criterio de diseo de esterilizacin
No solamente debe ser esterilizado el medio nutritivo, sino tambin las uniones, vlvulas y electrodos
del propio fermentador. Por consiguiente, los tiempos de esterilizacin reales son significativamente
ms largos que los calculados y deben ser determinados empricamente para las soluciones especficas
de nutrientes presentes en el fermentador.
Esterilizacin por lote
En el proceso de esterilizacin por lote, el medio se coloca en el fermentador y el contenido se calienta a la
temperatura de esterilizacin asignada.

A.- Esterilizacin discontinua

La mayor parte de los medios de cultivo se esterilizan en la actualidad en volmenes discontinuos en el
biorreactor a 121C. Los tiempos de esterilizacin aproximados pueden ser calculados a partir de la
naturaleza del medio y del tamao del fermentador. Un mtodo de esterilizacin es inyectar vapor en
la camisa del fermentador o en los serpentines interiores (esterilizacin indirecta). Otro mtodo es
inyectar vapor en la propia solucin de nutrientes (procedimiento directo), en cuyo caso un prerequisito es tener vapor puro (libre de aditivos qumicos). Muchos suministros de vapor industrial
contienen productos qumicos txicos derivados de aditivos anticorrosivos utilizados en el proceso de
produccin del vapor. Adems, con la inyeccin directa de vapor el condensado se acumula dentro del
fermentador y de esta forma el volumen del lquido aumenta durante el proceso de esterilizacin.
B.- Esterilizacin contina

Las dos desventajas principales de la esterilizacin discontinua, dao al medio de cultivo y alto
consumo de energa, pueden ser evitadas en gran parte mediante el uso de un procedimiento de
esterilizacin continua. Mientras la esterilizacin discontinua se lleva a cabo en 30-60 minutos a 121 C,
la esterilizacin continua se lleva a cabo normalmente en 30-120 segundos a 140 C. Debido a la
formacin de condensados la solucin nutritiva se diluye; para corregir esto la solucin caliente se
bombea a travs de una vlvula de expansin a un vaporizador y el condensado se retira mediante
bombas de vaco de forma que la solucin esterilizada de nutrientes tiene la misma concentracin
despus del proceso de enfriamiento que antes. La desventaja de este proceso es la sensibilidad que
presenta a cambios en la viscosidad del medio y a variaciones en la presin.
Las soluciones que contienen almidn, que se hacen viscosas cuando se calientan, son difciles de
utilizar en procesos de esterilizacin continua. Antes de la esterilizacin real debe llevarse a cabo una
licuefacin e hidrlisis parcial mediante cidos o amilasas. Adems, si hay partculas en suspensin en
la solucin de nutrientes, los cortos tiempos de esterilizacin en el proceso continuo pueden ser
insuficientes para que el calor permanezca completamente a travs de ellas. El tiempo de
calentamiento para partculas de 1 mm es de 1 segundo; para partculas de 1 cm es de 100 segundos.
Por consiguiente el tamao de las partculas debera estar restringido a 1-2 mm en procesos continuos
de esterilizacin.

Fuente: Stanbury, Whitaker y Hall (2000) Principles of Fermentation Technology. ButterworthHeinemann,Gran Bretaa

Esterilizacin de diseo
El mismo grado de esterilizacin se puede obtener a partir de un gran nmero de combinaciones de
tiempo y temperatura.
La mayor parte de las fermentaciones industriales operan en condiciones de agitacin vigorosa y el aire
que se suministra al fermentador debe ser esterilizado. El nmero de partculas y microorganismos en
el aire vara en gran medida dependiendo de la localizacin de la planta, el movimiento del aire y el
tratamiento previo del aire. Como media, el aire exterior tiene 10 - 100.000 partculas por m3 y 5 2.000 microorganismos por m3. De estos, el 50% son esporas de hongos y el 40% son bacterias G (-).
Los fermentadores funcionan generalmente con velocidades de aireacin de 0,5 - 1,0 vvm (volumen de
aire/volumen de lquido por minuto). Un fermentador que tenga un volumen de trabajo de 50 m3 con
una velocidad de aireacin de 1 vvm necesita 3.000 m3 de aire estril por hora. La importancia crtica
de la esterilizacin del aire en la microbiologa industrial puede ser deducida a partir de estos valores.
Los mtodos existentes para la esterilizacin de los gases incluyen la filtracin, inyeccin de gas
(ozono), depuracin de gas, radiacin (UV) y calor. De todos estos, solamente la filtracin y el calor son
prcticos a escala industrial. Durante muchos aos el aire se esteriliz pasndolo sobre elementos
calentados elctricamente, pero debido al alto coste de la electricidad a partir de la crisis del petrleo
de los aos 70, este proceso ha sido reemplazado por la filtracin.

Mtodos de esterilizacin: aplicacin de calor y filtracin

La esterilizacin por filtracin se utiliza frecuentemente para todos los componentes de la solucin de
nutrientes que son sensibles al calor y que seran por tanto desnaturalizados durante el proceso de
esterilizacin por vapor utilizado normalmente en fermentacin industrial.
Las vitaminas, los antibiticos o los componentes de la sangre son ejemplos de compuestos lbiles al
calor que deben ser esterilizados por filtracin.
Actualmente, en los sistemas industriales el aire se esteriliza por filtracin. En los sistemas ms
antiguos se instalaban filtros en profundidad como los de lana de vidrio en los que las partculas son
atrapadas por una combinacin de efectos fsicos (inercia, bloqueo, difusin, gravedad y atraccin
electrosttica). Los dos ltimos mecanismos tienen un efecto mnimo sobre la eliminacin de las
partculas. Las desventajas de los filtros de lana de vidrio incluyen el arrugamiento y la solidificacin
durante la esterilizacin por vapor.
Los filtros absolutos son de materiales cermicos, de vidrio o de metal sinterizado con poros tan
pequeos que la penetracin de los microorganismos no es posible. Los filtros fibrosos no son
absolutos y el material filtrante puede ser lana de vidrio, amianto y esteres de celulosa, siendo las
fibras de un dimetro variable de 0.5 a 15 micrones. Actualmente estn siendo reemplazados por
filtros de cartuchos que utilizan membranas plegadas. Las ventajas de estos filtros es que son
sustancialmente ms pequeos, debido a la construccin de los cartuchos es fcil reemplazar los

elementos filtrantes utilizados, al poseer una estructura membranosa (steres de celulosa, polisulfona
o nylon) tienen un efecto de filtros absolutos. La desventaja de la mayor parte de los sistemas
instalados actualmente es que no existen todava, para uso industrial, filtros absolutos para
bacterifagos. Los bacterifagos pueden ocasionar el fallo total de un sistema como por ejemplo en la
produccin de cido glutmico por Corynebacterium glutamicum o al trabajar con Escherichia coli.
Limpieza y esterilizacin de recipientes y tuberas
La asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, garantizan que los procesos de bioconversin
se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraos. Para poder lograr la asepsia del biorreactor y
de las tuberas asociadas a l, se deben proponer desde la etapa de diseo, una geometra interna y
arreglos de tuberas, que eviten la acumulacin de substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos.
La asepsia se facilita mediante una limpieza efectiva del biorreactor y tuberas, lo que se alcanza al especificar
materiales de construccin con un acabado que evite el atrapamiento de partculas slidas con microorganismos. Las
partculas slidas eventualmente limitan la transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la
temperatura de esterilizacin y por lo tanto, dejndolos viables para generar una contaminacin.
Una vez lavado el biorreactor y las tuberas, el biorreactor se llena con medio de cultivo para proceder
a la esterilizacin. Para lograrlo, es necesario el buen funcionamiento del sello mecnico para mantener
una presin positiva que evite la entrada de microorganismos. Se requiere el ms alto aseguramiento posible
de la integridad y eficiencia de remocin del filtro para la esterilizacin del aire
Residuos: materias primas, microorganismo y productos
Los microorganismos contaminantes pueden competir con el microorganismo cultivado por el
substrato o pueden desplazarlo al tener una velocidad de crecimiento mayor, incluso pueden producir
substancias que daen al microorganismo cultivado o inactiven a las enzimas. Por lo tanto, la presencia
de microorganismos contaminantes ocasionan que los rendimientos y productividades de produccin
establecidos no se puedan alcanzar, ocasionando prdidas econmicas.
Normatividad y procedimientos de limpieza y esterilizacin

Operacin asptica de biorreactores

La asepsia se considera como el conjunto de procedimientos destinados a eliminar o retirar
microorganismos de un biorreactor y de todas las tuberas conectadas a l, con el propsito de
asegurar que nicamente estn presentes el o los biocatalizadores, microorganismos o enzimas,

responsables de efectuar la bioconversin de materias primas a un producto especificado. En

consecuencia, la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, garantizan que los procesos de
bioconversin se lleven a cabo sin contaminaciones por microorganismos extraos.
Para poder lograr la asepsia del biorreactor y de las tuberas asociadas a l, se deben proponer desde la
etapa de diseo, una geometra interna y arreglos de tuberas, que eviten la acumulacin de
substancias al llevar a cabo el vaciado de ellos. Las substancias acumuladas pueden propiciar una
contaminacin. Tambin, la asepsia se facilita mediante una limpieza efectiva del biorreactor y
tuberas, lo que se alcanza al especificar materiales de construccin con un acabado que evite el
atrapamiento de partculas slidas con microorganismos. Las partculas slidas eventualmente limitan
la transferencia de calor, evitando el calentamiento de los microorganismos a la temperatura de
esterilizacin y por lo tanto, dejndolos viables para generar una contaminacin.

Bibliografa
-MATEOS, Pedro. ESTERILIZACIN INDUSTRIAL
- S. Moreno Grau, BERNAL Bayo J. DISEO DE BIORREACTORES Y ENZIMOLOGA. Ed. EDITUM
-Lydersen B.K., D elia N.A., Nelson, K.M.L. 1994. Bioprocess engineering: systems, equipment and
facilities. John Wiley and Sons, Inc. New York.
-Johnston P.R. 2004. Fluid sterilization by filtration. Interpharm, CRC Press LLC.
-Jornitz. M.W. 2006. Sterile filtration. Springer-Verlag, Berlin.