Primera Prctica

Hidrlisis Qumica e hidrlisis Enzimtica

I.

INTRODUCCIN

Con la hidrlisis del almidn se obtienen azucares que son utilizados por los
microorganismos para producir alcohol y desarrollar aromas que aumentan la
calidad y valor nutritivo de las bebidas que son elaboradas mediante en el
proceso de fermentacin.
El proceso de fermentacin industrial utiliza materiales ricos en azcar o
sustancias capaces de hidrolizar el almidn en azcares, siendo afectado por
factores como concentracin de azcar, etanol, oxgeno, dixido de carbono,
pH y acidez

y componentes nitrogenados, de acuerdo a la composicin

qumica de los diferentes granos.

La hidrlisis del almidn es una reaccin qumica que rompe el enlace entre
azcares por accin del agua, siendo catalizado por cidos, lcalis o enzimas.
Debido a esto, en la prctica se realizaran dos tipos de hidrlisis: qumica y
enzimtica, teniendo como objetivos:

Comparar los dos procesos de hidrlisis utilizando como material

amilceo granos de arroz.

Identificar los factores a considerar en ambas hidrlisis.
Identificar los factores que rigen el proceso de una fermentacin
alcohlica.

II.

REVISIN DE LITERATURA

II.1.

Materia Primas para la produccin de alcohol

Materias Azucaradas
Sus componentes son principalmente disacridos (sacarosa, lactosa, maltosa) y
monosacridos (glucosa, fructosa, galactosa).
Mostos y jugos de diversas frutas (10% - 25% de azcares: sacarosa, glucosa,
fructosa).
Melazas de caa y de remolacha (45%-60% de sacarosa).
Miel de abeja (60%-70% de glucosa y fructosa).
Miel de algarrobo, suero de leche, etc.
(Hatta, 2008).
Materias Amilceas
Su componente principal es el almidn, dentro de estas tenemos:
Tubrculos y races: papa, camote, yuca (10%-25% de almidn).
Cereales: maz (60% almidn), cebada (65%), trigo (65%), arroz (60%) y sorgo
(80%).
Materias Celulsicas
Dentro de estas materias se tienen: madera no explotadas, paja, residuos
agrcolas y agroindustriales: cascaras de cereales, frutas y hortalizas, bagazo de
caa. Su componente principal es la celulosa, hemicelulosa y lignina (Hatta,
2008).
II.2.

Hidrlisis del Almidn

Para el caso de materias amilceas, Hatta (2008) menciona que es necesario

gelatinizar el almidn, lo cual ocurre en presencia de agua y calor, siendo el
rango de temperatura para la gelatinizacin: 60-80C.
Despus de este tratamiento se realiza la hidrlisis, la cual es un tipo de reaccin
qumica en la cual se rompe necesariamente un enlace entre dos tomos o
molculas mediante la intervencin del agua, reaccin que puede ser catalizada
mediante la accin de otros elementos tales como: cidos, lcalis o enzimas.
Para el caso del almidn, la hidrlisis permite romper los enlaces glucosricos
1,4 y 1,6, que mantienen a las unidades de glucosa unidas que conforman
tanto la amilosa (10%-20%) como la amilopectina (80%-90%) en la estructura
polisacarida del almidn, formando unidades de menor peso molecular tales
como : glucosa, maltosa, dextrinas, principalmente (Hatta, 2008).
Mera et.al. (2005) menciona que la hidrlisis del almidn se puede hacer por dos
vas: cida o enzimtica.
Hidrlisis cida

En la hidrlisis acida se suele emplear el acido sulfrico, los productos que han
de convertirse en azcar se maceran o se muelen y se mezclan con un cierto
volumen de agua en recipientes resistentes a los cidos. Se aade entonces una
cantidad dada de acido y se hidroliza la masa, empleando vapor a presin para
facilitar el proceso. Cuando la transformacin ha terminado puede neutralizarse
la masa por adicin de carbonato clcico o cal, separndose el mosto del
precipitado de sulfato clcico por sedimentacin y filtracin. Puede recuperarse
una cantidad adicional de azcar por extraccin del precipitado con agua
caliente (Prescott, 1962).
Es una tcnica que tiene muchas desventajas: formacin de productos no
deseables y flexibilidad muy pobre (el producto final slo se puede modificar
cambiando el grado de hidrlisis), por ltimo es necesaria que el equipo resista
el cido y las temperaturas requeridas durante el este proceso.
Hidrlisis enzimtica
En los ltimos 30 aos ha desplazado la hidrlisis cida, debido a que se dispone
de nuevas enzimas. Hoy en da la mayor parte de la hidrlisis de almidn se
realiza usando enzimas, ya que esta tcnica presenta ventajas como: control de
la formacin de productos no deseables y mayor flexibilidad del producto.
Hatta (2008) menciona que este tipo de hidrlisis es de alta especificidad, por lo
que no se producen reacciones secundarias.
Este procedimiento implica un mayor control de los parmetros, principalmente
la temperatura y el pH, y es ms costoso que la hidrlisis acida, pero ofrece un
mayor rendimiento y pureza en el producto final.
Las enzimas amiloliticas son:

La alfa-amilasa (Alfa 1,4-D- Glucan Glucano-hidrolasa)

Hidroliza los enlaces glucosdicos alfa-1,4 de los polisacridos que poseen 3 o ms

unidades de D-glucos en unin alfa-1,4. El ataque se hace en forma no selectiva
(tipo endoenzima) sobre varios puntos de la cadena simultneamente, aunque los
primeros productos de la hidrlisis son siempre oligosacridos de 5-7 unidades de
glucosa, o un nmero mltiplo (Mera et.al., 2005).

La amiloglucosidasa (Alfa-1,4- D-Glucan glucohidrolasa)

Es una exohidrolasa tambin conocida como glucoamilasa, que hidroliza los

enlaces glucosdicos alfa-1,4 y alfa-1,6 de la amilosa y la amilopectina separando
unidades de glucosa a partir del extremo no reductor de la cadena (Mera et.al.,
2005).

Hatta (2008) seala que otras enzimas utilizadas son: -amilasa, pululonasa y las
enzimas R.
En cualquiera de las dos vas el xito de una buena fermentacin depende:
- De la eficacia del tratamiento preliminar, en caso haberlo
- Del empleo de una concertacin optima de azcar
- De un pH y temperatura optimas
- De la diccin de sustancias nutritivas al mosto si este estuviera falto de un
constituyente esencia
- De la inhibicin del crecimiento bacteriano
- Del empleo de una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia
alcohlica y capaz, por tanto de producir grandes cantidades de alcohol
- Del mantenimiento de las condiciones anaerbicas durante la
fermentacin
- De la inmediata destilacin del mosto (Prescott, 1962).

III.

MATERIALES Y MTODOS

IV.1. Hidrlisis qumica

4.1.1. Materiales y Equipos

Autoclave
Erlenmeyers de 1lt (4u)
Probeta graduada de 250 ml (4u)
Potencimetro
Balanza
Almidn de arroz (100 g)
Agua
NaOH (80%)
Acido sulfrico
Bomba de jebe
Algodn
Hielo
Levadura
Papel
Pabilo
Pipetas de 10 ml (4u)

4.1.2. Metodologa

En un Erlenmeyer de 1L se puso 100 g de almidn con 500 ml de agua

potable y 2% de acido sulfrico. Se saco una muestra para hacer anlisis de
azcar reductor (AR1) y otro para hacer una prueba de yodo
Se tapo con un tapn de algodn, papel y se amarro con un pabilo
Se llevo al autoclave por un espacio de 1h a 121 C y 15 lb/pulg 2
Se enfri antes de sacarlo del autoclave
Se saco una muestra para hacer anlisis de azcar reductor (AR2) y prueba
de lugol
Se regulo el pH a 4-4.5. durante la fermentacin se controlo diariamente
los Brix hasta que se mantenga constante
Se activo la levadura a se dejo fermentar, al termino de la fermentacin
se saco una muestra para determinar la cantidad de azcar reductor (AR3)
Se destilo el fermentado y se guardo la muestra para hacer el control de
calidad del destilado
Figura 1 Hidrlisis qumica del almidn

Fuente: Elaboracin Propia (2008).

IV.2. Hidrlisis enzimtica
4.2.1. Materiales y Equipos

100g Almidn de Arroz

Agua
Cloruro de calcio (0.5g/Lt. Mosto)
BAN (alfa amilasa comercial)
AMG 400 (amiloglucosidasa)
Acido fosfrico
Lugol
Levadura
Autoclave
Vasos de 1Lt.
Baguetas
Probeta graduada de 250ml
Potencimetro
Termmetro
Refractmetro de baja
Cocina elctrica o un agitador con calentador
Pipetas de 1ml, 5ml.
Placas petri
4.2.2. Mtodos

Se colocaron 100g de almidn en un erlenmeyer de 1 litro con 500ml de

agua, CaCl2 y 0.5ml de BAN.

En esta mezcla se midieron los azucares reductores de la mezcla (AR1).

Se calent hasta llegar a la temperatura de 80C y se determino el tiempo

de gelatinizacin de la muestra (cuando la solucin cambie de opaco a
transparente). Posteriormente, se enfri hasta llegar a 65-70C y se
aadi 1.5ml de BAN, haciendo la prueba de lugol cada 5 minutos. Hasta
que todo el almidn se desagrego (prueba de lugol con resultado amarillo).

Se saco una muestra y se determino el contenido de azucares reductores

(AR2).

Se dej enfriar hasta llegar a 60C y se aadi 1.5ml de AMG 400,

determinndose los Bx cada 10 minutos por cerca de 1hr hasta que se
hicieron constantes.

Se inactivaron las enzimas sometindolas a ebullicin por 1 minuto y se

dejo enfriar, separando una muestra para hacer el anlisis de azucares
reductores (AR3).

El mosto fue acondicionado activando la levadura para proceder a

fermentar, realizando controles diarios de Bx. Hasta que la medida fue
constante, sacndose una muestra para realizar la determinacin de
azucares reductores (AR4).

Se determin el contenido de alcohol de la muestra fermentada mediante

el mtodo de destilacin.
4.3.

4.4.

Destilacin
Se coloco 200 ml de muestra en un baln de destilacin y se lavo dos
veces la fiola utilizada en la medicin con 50ml de agua destilada.
Se prendi la cocinilla y se inicio con la destilacin, cuyo condensado
fue depositado en una fiola de 200ml.
Se destilo la muestra hasta tener aproximadamente 140ml de destilado
y se enraso con agua destilada.
Se determin el grado alcohlico (%volumen) en una probeta de 250ml
con el alcoholmetro Gay-Lussac.
Se corrigi el valor obtenido utilizando tablas.
Determinacin de azcares reductores con Fehling
Se filtro la muestra y se coloco en una bureta.
Se colocaron 10ml de Fehling en un matraz y se aadieron 50ml de
agua destilada.
Se llevo a punto de ebullicin y se titul hasta color amarillo.
g / Lt

glu cos a

Titulo de licor
x1000
Vol . muestra

El titulo del licor fue determinado titulando el licor de Fehling con

glucosa.

Figura 2. Hidrlisis enzimtica del almidn

Fuente: Elaboracin Propia (2008).

4.5.

Clculos

Eficiencia de la hidrlisis:
EH

Eficiencia de la fermentacin

EF

V.

g azucar
x100
g almidn

( ARiniciales AR finales )
GL

x100

RESULTADOS Y DISCUSIONES

En el Cuadro 1 se muestran los gastos obtenidos en la titulacin de las muestras

de almidn de arroz en las diferentes etapas que se realizaron para su hidrlisis
qumica y enzimtica.
Cuadro 1. Determinacin de Azucares Reductores
AR

H. Qumica

AR1
AR2
AR3

Gasto (ml)
>11.2
0.
2

AR4

H. Enzimtica

AR (g/Lt) Gasto (ml) AR (g/Lt)

<2.8
>11.2
<2.8
42.86
4.6
6.52
15
3.1
9.68
-

Fuente: Elaboracin Propia (2008).

La determinacin de los azucares reductores se hizo utilizando el licor de
Fehling, el cual presento un gasto de 6ml de glucosa, equivalente a 0.03g de
glucosa/Litro.
Aplicando la ecuacin del apartado 4.4. se obtuvieron los AR expresados en g de
glucosa/Litro.

En la hidrlisis qumica, las muestras para determinar azucares reductores

fueron tomados en las etapas inicial (AR1), despus del autoclavado (AR2) y al
final de la fermentacin (AR3)
Mientras que en la hidrlisis enzimtica, la determinacin de azucares
reductores se realizo al inicio, despus de la gelatinizacin (una vez frio), luego
de inactivar la enzima AMG y al final de la fermentacin.

Para realizar la hidrlisis enzimatica del almidn se tuvo que gelatinizar

previamente la muestra. Este procedimiento se dio durante 45 minutos, tiempo
en el cual la prueba del lugol dio negativo indicando que el almidn se haba
gelatinizado.
Sin embargo, el control de la temperatura no fue bueno debido a que superaba
los 80C y segn Mera (2004), las condiciones optimas para la enzima BAN se da
a 70C, por lo que se puede decir que las altas temperaturas pudieron haber
inactivado la enzima.

Cuadro 2. Caracterizacin de las Enzimas BAN y AMG

Fuente: Mera (2004).

Respecto a la determinacin de los azucares reductores, como se puede observar
en el Cuadro 1, los AR iniciales no pudieron determinarse debido a que no se
dispona de muestra para seguir titulando ya que el volumen inicial disponible de
muestra fue poco, obteniendo un gasto mayor a 11.2ml, por lo que se puede
decir que la cantidad de glucosa en la muestra fue significante (menor a 2.8
gramos por litro)
En la hidrlisis qumica los AR despus de efectuado el autoclavado aumentaron
a 42.86 g/lt (4.86%), sin embargo la eficiencia de la hidrlisis resulto baja
(71.42%) lo cual pudo deberse a que no se llego al pH optimo para una buena
hidrlisis. Segn indica Hatta (2008) una hidrlisis qumica eficiente depende del
tipo de almidon, la relacin almidn: agua, la temperatura y la presion y tiempo
de trabajo, as como el pH del medio.
Segn Palacios (1956), afirma que es conveniente el empleo de cido sulfrico en el agua
de remojo de la maizena antes de que se autoclavea, pues este ejerce una accin
disolvente de las materias nitrogenadas t de las gomas que recubren los grnulos de
almidn de la maizena, y de esta forma es posible efectuar la hidrlisis a una
temperatura ms baja. Hatta (2008) menciona que segn el tiempo de calefaccin se
obtiene una hidrlisis ms o menos completa pero con un tiempo de calefaccin
demasiado largo, se degradan azcares y pardea la solucin.

Adems se observa que los solidos solubles en la muestra luego del autoclavado
fue de 21% (Brix), sin embargo los azucares reductores de la muestra fueron solo
de 4.86%, el resto de solidos solubles estara formado por otros azucares no
reductores, as como pectinas, gomas no solubles Despus de la fermentacion los
azucares reductores disminuyeron a 15g/lt debido al consumo de estos por parte
de la levadura
Por otro lado en la hidrlisis enzimtica, Los azucares reductores en la tercera
etapa fueron mayores respecto a la segunda, esto se dio debido a que al
incorporar la enzima (AMG) se desdoblan los azucares a glucosa, obtenindose
mayor cantidad de esta en la muestra.

La actividad de las enzimas BAN y AMG se muestran en el Cuadro 2, en donde se

puede observar que el pH ptimo es 6 para la BAN y 5.5 para la AMG. En la
prctica el pH del mosto para que acte la primera enzima fue de 5.2, por lo que
se puede decir que no estuvo en su ptimo de funcionamiento.
En el Cuadro 1 se observa tambin, que los azucares disminuyeron despus de la
fermentacin, pero no muy significativamente.
La poca formacin de azucares reductores pudo haberse originado a que las
enzimas no estuvieron en sus condiciones ptimas de funcionamiento, pudiendo
haber sido desnaturalizadas al haber pasado la temperatura y haber sometido a
un medio poco acido a la enzima BAN.
De acuerdo a estos procesos, Mera (2004) menciona que la dextrinizacin se
produce por la reaccin con la -amilasa; mientras que la hidrlisis, por
reaccin con glucoamilasa.
Se realizo la determinacin de lo grados brix de la muestra durante una hora en
intervalos de diez minutos hasta que permanezca constante. Estos resultados se
presentan a continuacin en el Cuadro 3.
Cuadro 3. Control de Bx en la muestra de almidn de arroz
Tiempo (min)
Bx

10

20

30

40

50

60

13.8

14

14.5

14.6

14.8

15.2

15.2

Fuente: Elaboracin Propia (2008).

Para analizar la eficiencia de la hidrlisis se utiliz como gramos de almidn en
muestra el valor de 60g debido a que Hatta (2008) menciona que el arroz tiene
60% de almidn. Respecto a los gramos de azcar, estos correspondieron a los AR
determinados al final de la hidrlisis (inicio de la fermentacin) en cada caso.
Segn Hatta (2008) la hidrlisis enzimtica ofrece un mayor rendimiento que la
qumica, sin embargo en nuestro caso se obtuvo que la eficiencia de la hidrlisis
qumica (71.43%) resulto mayor a la enzimtica (5.3%) debido que en la segunda
hubo inactivacin de la enzima por un calentamiento excesivo.
Segn Jorgensen (1959) se conocen cuatro hexosas fermentescibles: glucosa,
fructosa, manosa y galactosa. Las tres primeras siempre son fermentescibles
mientras que las ltimas solo pueden ser fermentadas por ciertas especies de
levaduras. Por otro lado menciona que de los polisacridos, el glucgeno puede
ser fermentado en algunos casos por la levadura, a veces tambin la dextrina,
pero casi nunca el almidn.

Debido a esta limitacin de la levadura es que se debi optar por hidrolizar el

almidn, para que se puedan convertir fcilmente en alcohol. La fermentacin se
realiz durante un tiempo prolongado, en los que se realizaron controles de Bx.,
los cuales se muestran en el Cuadro 4.
Cuadro 4. Control de la Fermentacin de las muestras hidrolizadas de almidn
de Arroz

Hidrolisis

Inicial

3er Da

5to Da

6to Da

Final

Qumica

21Bx

17.2Bx

14.6Bx

14Bx

13Bx

Enzimtica

15.2Bx

8Bx

7Bx

6Bx

4Bx

Fuente: Elaboracin Propia (2008).

Figura 2. Velocidad de Fermentacin dela almidn de Arroz

Fuente: Elaboracin Propia (2008).

Como se puedo observar en la Figura 2 conforme fueron pasando los das, los Bx
fueron disminuyendo, lo cual se debe a una disminucin de concentracin de
azcar fermentecible en el mosto, debido a que las levaduras la utilizan como
fuente energtica y nutricional.

La velocidad de fermentacin pudo determinarse a travs de la lnea de

tendencia de las muestras con hidrlisis qumica y enzimtica:
Hidrlisis Qumica: Y = -1.92X + 21.72
Hidrlisis Enzimtica: Y = -2.44X + 15.36
Los ndices de correlacin de las lneas de tendencia del grfico de la Figura 2
fueron bajos debido a la dispersin de los datos lo cual se explica debido a que
los controles no pudieron realizarse diariamente debido a problemas de
disponibilidad de materiales de laboratorio.
Respecto a la velocidad de fermentacin, se puedo observar que la muestra de
hidrlisis enzimtica presento una mayor velocidad debido a que presento un
mayor pendiente respecto de la fermentacin de la muestra de almidn
hidrolizada qumicamente.
Debido a esto se puede decir que la muestra hidrolizada enzimticamente
termin de fermentar los azucares en un tiempo menor que la hidrolizada
qumicamente.
Segn Ognio (1980), mediante las operaciones de destilacin y rectificacin, se
busca separar el alcohol producido en la fermentacin de los otros compuestos
presentes en el mosto, tales como cidos orgnicos, glicerol, aldehdos y esteres
que se den en el proceso, as como los otros compuestos propios del mosto que
no han sido asimilados por la levadura como azcares residuales, sustancias
nitrogenadas, fosfatos y otros. Debido a esto se realizo la destilacin de las
muestras antes de determinar el grado alcohlico, obtenindose los datos que se
presentan en el Cuadro 5.
Cuadro 5. Datos para el clculo del ndice de Transformacin

H. Qumica

H. Enzimtica

AR iniciales

18.75

9.68

AR finales

8.33

0.5

27.86

9.36

GL
EF

La eficiencia de la fermentacin o ndice de transformacin fue 27.86% para la

muestra con hidrlisis qumica y 0.0936% para la muestra con hidrlisis
enzimtica. Segn Hatta (2008) en condiciones optimas una levadura necesita 17

g de azcar para producir 1 GL de alcohol, pero debido a que no es posible dar

las condiciones optimas a la levadura es que esta necesita cantidades mayores de
azcar para trasformarla a alcohol por eso es que en el primer caso (hidrlisis
qumica) se obtuvo un mayor valor de ndice de transformacin, en el caso de la
hidrlisis enzimtica se obtuvo un valor de 0.5 debido posiblemente a un error en
el destilado
VI.

VII.

CONCLUSIONES

Para obtener una buena eficiencia de la hidrlisis enzimtica se debe

tener en cuenta los factores de temperatura y pH

En el caso de la hidrlisis qumica es importante controlar la

concentracin materia prima:solvente, pH del medio, temperatura, y
presin del autoclave

Las condiciones de operacin de las enzimas AMG y BAN estn limitadas

por las propiedades de cada una.

La hidrlisis enzimtica en la prctica realizada fue menos eficiente que la

hidrlisis qumica debido a que en la primera la enzima fue inactivada, en
la hidrlisis qumica se obtuvo una eficiencia de hidrlisis baja pero mayor
a la enzimtica

La velocidad de la fermentacin de la hidrlisis enzimtica fue mayor que

la qumica.

La eficiencia de la hidrlisis qumica fue 71.43% y de la hidrlisis

enzimtica fue 5.26%

La eficiencia de la transformacin en la hidrlisis quimica fue de 27.86

g/LxGL
RECOMENDACIONES

Realizar controles diarios en la fermentacin, no solo de Bx sino

tambin de temperatura y densidad.
Encontrar los valores ptimos de pH, relacin materia prima:
solvente, Presin de trabajo para obtener una mejor eficiencia de
hidrlisis qumica
Emplear una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia
alcohlica y capaz por tanto de producir grandes cantidades de
alcohol

VIII.

BIBLIOGRAFA

MERA, I.; CARRERA, J. 2004. Obtencin de glucosa a partir de almidn de

Yuca. Disponible en:
http://www.unicauca.edu.co/biotecnologia/ediciones/vol3/Art38.pdf.
Consultada el 17 de Julio del 2008.

HATTA, B. 2008. Curso de Tecnologa de Alcoholes. UNALM. Per.

PRESCOTT, D. 1962. Microbiologa Industrial. Editorial Aguilar S.A

JORGENSEN, A. 1959. Microbiologa de las Fermentaciones Industriales.

7ma Edicin. Editorial Acribia S.A. Espaa.

OGNIO, S. 1990. Obtencin del alcohol a partir de yuca. Tesis UNALM.

Per.