Mtodo de purificacin de ADN separndolo de sustancias hmicas

coextraidas a partir de muestras de suelo, con el uso de columnas de

exclusin molecular.
Lic. Manuel Oliveros Omaa
Resumen
En la actualidad los laboratorios de microbiologa de suelos y biotecnologa, encuentran
una barrera al momento de estudiar las poblaciones autctonas de un suelo agrcola, debido
a que al momento de realizar la extraccin de ADN total de las muestras, se coextraen otros
elementos a los que conocemos como sustancias hmicas. Dichas sustancias hmicas,
como los cidos hmicos y flvicos, poseen un gran tamao (5000Da hasta 1.000.000Da y
500-5000Da respectivamente). A su vez estas sustancias hmicas interfieren el momento de
realizar PCR y cuantificacin al ADN total proveniente de muestras de suelo. Basndonos
en trabajos que proponen la cromatografa de exclusin molecular usando resinas de
sephadex G-200 y G-50, el uso de las resinas de sefarosa CL-4b y CL-6b para realizar un
paso de purificacin de las muestras de suelo antes de someterse a la PCR. El suelo
utilizado es proveniente de la Estacin Experimental del INIA, en San Juan De Lagunillas,
Mrida, Venezuela, en una plantacin de cacao (Theobroma cacao). Obtuvimos que la
resina CL-6b (tamao de poro 10.000-1.000.000m), retiene con mayor eficiencia los
cidos hmicos, permitiendo que estos sean separados de las muestras de ADN por
separacin de las fracciones que se recuperan de la columna de exclusin. Los resultados
quedan evidenciados al momento de realizar electroforesis a las muestras de ADN total de
suelo, obteniendo bandas bien definidas e intensas, que sugieren la pureza y concentracin
del ADN luego del tratamiento.
Palabras clave: cidos hmicos, cidos Flvicos, cromatografa de exclusin molecular,
sephadex G-200 y G-50, sefarosa CL-4b y CL-6b.
Introduccin
Anteriormente al momento de realizar un
anlisis detallado de los microorganismos
del suelo, los investigadores tendan a
disear medios de cultivo, mediante los
cuales haran crecer los microorganismos
en el laboratorio logrando finalmente la
identificacin de los mismos. Debido a
que solo cerca del 1% de las bacterias son
cultivables en condiciones de laboratorio
(Atlas, 1984), se han desarrollado
tcnicas moleculares, que permiten el
reconocimiento de la flora microbiana en
su totalidad y su potencial metablico
(Amorim,
2008),
analizando
las
secuencias de ADN extrado. Cuando se

quiere realizar una extraccin de ADN

total en el suelo, se siguen protocolos ya
bien establecidos (Moran, 1993; Zhou,
1996; Yeates, 1997), que en su gran
mayora se ven afectados al momento de
la amplificacin usando PCR, por la
presencia de sustancias contaminantes
coextraidas (cidos hmicos), (Yates y
col.,1998).
Muchas de las metodologas para
separacin de ADN y sustancias hmicas
son dependientes de los niveles
diferenciales
de
enlazamiento
de
materiales hmicos y cidos nuclicos a
matrices o del tamao de dichas
molculas (Yeates y col., 1997).

En 1997 Jackson y colaboradores

proponen una metodologa eficiente y
simple para la separacin del ADN de
dichas sustancias hmicas. Para ese
experimento los investigadores contaban
con tres columnas de exclusin
(Sepharose 4B, Sephadex G-200, and
Sephadex G-50), concluyendo que la
Sefarosa 4B lograba una mayor
separacin del ADN y las sustancias
hmicas, y a su vez el ADN sometido al
protocolo de purificacin, mostr
consistentemente
una
mejor
amplificacin, en comparacin a los otros
materiales usados.
Para esta investigacin nos propusimos
incluir nuevos materiales que permitan
una mejor y mayor separacin del ADN y
sustancias hmicas, asegurndonos de
esta manera que las muestras de ADN
proveniente
del
suelo,
queda
suficientemente pura para la realizacin
de cualquier anlisis molecular posterior,
que generalmente depende en gran
medida de la amplificacin mediante PCR
del material inicial.
Materiales y Mtodos
El suelo que se somete a tratamiento es
proveniente de cacaotales localizados en
la estacin experimental del INIA en San
Juan de Lagunillas, Estado Mrida,
Venezuela, Ubicada a 8 o 31 latitud
Norte, 71 o 21 longitud oeste, 1110
m.s.n.m., temperatura promedio de 27 o C,
precipitacin promedio anual 500mm,
bosque seco pre montano subtropical.
Tipo de suelo Cambortid tpico (actual
Haplocambid tpico), franco fino (ez y
Vsquez, 2005).
Se tienen seis muestras compuestas
(aproximadamente 4kg) de 4 submuestras, tomadas al azar entre 0-10 cm
de profundidad (Rivero, 2010). Dos de las

muestras provienen de un compost

realizado con residuos de cacao y suelo
de la misma parcela experimental, uno
conservado a 25C y otro a -10C.
La extraccin del ADN total fue realizada
por una modificacin del mtodo
empleado por Yeates y col. (1998). A 10g
de cada muestra de suelo fresco, se aadi
10 ml de solucin amortiguadora TrisEDTA-NaCl pH 8 y Ananasa al 20% m/v.
Se agit durante 2 minutos en vortex. Se
aadi 1ml de solucin de SDS al 20% y
se incub a 65C durante 1 hora. Se
centrifug por 20min a 3000xg. Se
colect el sobrenadante y al pellet se le
realiz nuevamente el procedimiento
anterior.
Los sobrenadantes fueron transferidos a
tubos limpios y estriles, que contenan
volumen de polietilenglicol en NaCl y se
incub durante 2 horas a temperatura
ambiente. Se centrifug a 3000xg por 30
minutos. El pellet se resuspendi en 2 ml
de buffer Tris-EDTA (TE) y se le aadi
140l de acetato de potasio 7,5M. Se
incub luego en hielo por 5 minutos y se
centrifug por 1 hora a 4C. Se realizaron
extracciones con cloroformo/alcohol
isoamlico
(1:24)
y
luego
cloroformo/fenol/alcohol
isoamlico
(25:24:1). Se precipit con 2,5 volmenes
de etanol absoluto frio y se incubaron 1
hora a -20C. Se centrifug 30 min a
3000xg. Se descart el sobrenadante y el
pellet se resuspendi en 100l de buffer
TE.
Para armar las columnas se utilizaron
macrogoteros, a los cuales se les agreg
3cm de resina hidratada. Se utiliz
sepharose CL-6b (tamao de poro
10.000-1.000.000m), Sepharose CL-4b
(Tamao de poro 30.000-5.000.000m),
Sephadex G-200 (tamao de poro5000

600,000m) y Sephade G-100 (tamao de

poro 4000150,000m) (Sambrook y col.
1989) Se dej correr buffer TE pH 8 por
cada una de las columnas para
estabilizarlas. Alcuotas de 100l de cada
muestra fueron cargadas en las columnas,
lavando con buffer y colectando 16
fracciones de 100l. Cada muestra se le
midi la densidad ptica a 260m, que se
relaciona con la aparicin de las
sustancias hmicas (Yeates, 1997).
Adems cada muestra se hizo correr en
geles de agarosa al 1% para determinar la
intensidad de bandas con el uso del
programa ImageJ. La cuantificacin del
ADN por mtodos espectofotomtricos
no fue posible debido a que los valores
necesarios para realizar la relacin
DO260/280
se
ven
afectados
directamente por la presencia de los
cidos hmicos.
A la solucin de ADN extrado se le
realizaron diluciones de 1:50, 1:100,
1:300, 1:500 y 1:1000, con el fin de
determinar a cual dilucin se lograba la
amplificacin del ADN (Armado, 2011;
Yeates y col., 1997) De cada una de las
diluciones se tom 1l para realizar la
PCR en un volumen de reaccin de 25l,
utilizando iniciadores especficos para los
fragmentos del gen ADNr 16s de
Bacterias (Wilson y col., 1990; Yeates y
col., 1997). Se us pFD1 y pK2R, para
obtener fragmentos de aproximadamente
500pb. El programa trmico de PCR fue
de 95C por 3min; 35 ciclos de 94C por
1min; 55C por 1min, 72C durante 2min
y finalmente 72C por 3min (Yeates y
col., 1997). Los resultados fueron
observados en geles de Agarosa al 1,5%
baados con bromuro de etidio, con el
uso de una cmara electrofortica y luz
UV.

Resultados y discusin
Se logr mejorar la intensidad de banda
(concentracin de ADN), proveniente de
las muestras de ADN total de suelo,
usando columnas de exclusin molecular,
para luego ser amplificado el gen ARNr
16s y mostrar los resultados en geles de
agarosa al 1,5%. Los valores que solo
llegaban hasta 35% son mejorados hasta
obtener hasta un 79% con el uso de
Sepharose CL-6b. La densidad ptica
medida a 260m, se atribuye a la
presencia de cidos hmicos y las
intensidades de banda nos muestran
verdaderamente,
la
pureza
y
concentracin de los amplicones (Jackson
y col., 1997).
La mayor efectividad se logr obtener
cuando usamos la columna Sepharose
CL-6b (figura 1a), los picos de intensidad
de banda y DO 260nm pueden separarse
fcilmente gracias a la distancia en cuanto
a volumen de muestra colectada que
tienen uno de otro. A medida que
reducimos el tamao de la columna, se
comienzan a solapar ambas grficas,
disminuyendo a su vez la intensidad de
banda. La figura 1c y 1d, nos permiten
observar claramente como la retencin de
las sustancias hmicas, que absorben a
260nm, es mnima, mientras en la figura
1b se logra ver el comienzo de la deseada
separacin.
Todo esto es ms fcil de observar en
fsico, es decir, la diferencia que existe en
el tamao y la intensidad de banda es
fcil de percibir en un gel de agarosa.
Dado a esto los resultados nos muestran
la diferencia entre las bandas de ADN
cuando son sometidas al proceso de
purificacin mediante las columnas de
exclusin molecular (Figura 2a), en este
caso la de mayor efectividad, Sepharose
CL-6b. A muestras salidas de dicha

columna se le realiz PCR, logrando

obtener bandas bien definidas y del peso
correcto (figura 2b).

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa 1% de las

muestras de ADN total, proveniente de suelo cacaotero,
pasadas por las distintas columnas de exclusin (a).
Amplicones de muestras de ADN total proveniente de
suelo luego de la purificacin con sepharosa CL-6b, en
gel de agarosa 1,5% (b).

Figura 1. Separacion de ADN (visto como intensidad

de banda en geles de agarosa, diamantes azules) y
sustancias hmicas (determinado como DO260, cuadros
rojos), de muestras de suelo cacaotero tratados con
distintas resinas: Sepharose CL-6b (a), Sepharose CL-4b (b),
Sephadex G-200 (c) y Sephadex G-100 (d). Cada punto
representa una fraccin octenida luego de lavar la columna con
100l de Buffer TE.

Asumimos que el mayor tamao de poro,

retiene en mayor parte los cidos
hmicos. Estos cidos contenidos en el
humus poseen un peso molecular que
flucta entre 5000Da hasta 1.000.000Da,
siendo mucho ms grandes que otras
sustancias hmicas como los cidos
flvicos (500-5000Da) (Snchez, 2002).
Las estructuras de los cidos hmicos son
ms complejas que las de los cidos
flvicos, al igual que la naturaleza
anfiflica (Yates III y Wandruszka, 1999).
Nosotros podemos establecer que esas
caractersticas qumicas hacen que queden
atrapados en las columnas del tipo CL-6b,
siendo esto de gran utilidad al poseer
muestras de ADN contaminadas con
sustancias hmicas, que sern sometidas
luego a PCR.
Para poder realizar el anlisis del ADN
proveniente del suelo es necesario que
est en gran medida puro, evitando la
interferencia de sustancias hmicas tanto
al momento de la PCR como de la

cuantificacin, dado a que los valores de

densidad ptica pueden verse afectados
por la interferencia de dichas sustancias
(Jackson y col. 1997).
Por otra parte nuestros resultados son
similares a los encontrados por Jackson y
col. (1997), que aseguran la separacin de
las sustancias hmicas con el uso de
cromatografa de exclusin (G-200).
Mejoramos esta separacin cuando
utilizamos las columnas cargadas con la
resina CL-6b.

Conclusiones
El ADN extrado de muestras de suelo
cacaotero, se puede purificar utilizando la
cromatografa de exclusin molecular,
particularmente usando la resina CL-6b.
La intensidad de banda que aumenta hasta
un 80% respecto al fondo seala el alto
grado de pureza del ADN y a su vez su
concentracin.

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