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Facult de Mdecine dAnnaba

Dpartement de Pharmacie

Physiologie bactrienne II
Mtabolisme Bactrien
1. Introduction :
Le mtabolisme est lensemble des ractions chimiques qui se droulent dans les
cellules vivantes : il y a construction (anabolisme), dgradation (catabolisme) ou
modification de molcules, oxydation ou rduction de divers atomes.
La plupart de ces ractions font intervenir des catalyseurs protiques
spcifiques appels enzymes.
Une suite de ractions mtaboliques, au cours de laquelle une substance est
convertie en une ou plusieurs autres, constitue une voie mtabolique.
En parcourant une telle voie, le substrat est transform, souvent via un ou
plusieurs intermdiaires, en ce quon appelle des produits finaux.
Les ractions mtaboliques sont le plus souvent endergoniques c'est--dire
quelles requirent de lnergie.

2. La respiration :
La respiration est un type de mtabolisme convertisseur dnergie au cours
duquel le substrat est mtabolis avec intervention dun agent oxydant
exogne.
La respiration peut avoir lieu en prsence doxygne (agent oxydant externe)
mais elle peut aussi seffectuer en anarobiose (lorsque dautres agents
organiques ou inorganiques remplacent loxygne).
2.1. La respiration arobie :
Au cours de la respiration arobie des bactries, la production dATP partir
dADP et de Pi seffectue grce lnergie accumule par le fonctionnement de la
chane respiratoire localise dans la membrane cytoplasmique.
La chane respiratoire et phosphorylation oxydative:
Dans les chanes respiratoires, on trouve : des cytochromes, des protines fersoufre et des quinones. Ces constituants sont disposs de faon squentielle en
fonction de leurs potentiel redox de telle sorte que ce potentiel augmente
jusqu laccepteur final.
Le mouvement des lectrons ou de lhydrogne seffectue de faon graduelle
partir des constituants les plus lectrongatifs pour aller vers le composant le
plus lectropositif (loxygne chez les arobies).

Ce mouvement des lectrons et des ions hydrognes, cre une force proton
motrice ncessaire la production dATP.
Dans la respiration, loxydation du NADH+H + et du FADH2 forms lors des
ractions cataboliques sont utiliss pour produire de lATP dans la chane de
transfert dlectrons ; alors que dans le cas de la fermentation, la cellule doit se
dbarrasser du NADH+H+ en synthtisant un dchet comme lacide lactique.
La respiration arobie se droule en plusieurs tapes :
La glycolyse
Le cycle de Krebs ou cycle des acides tricarboxyliques
Chane de transfert des lectrons et phosphorylation oxydative.
2.2. La respiration anarobie :
La respiration anarobie est la mme que la respiration arobie, toutes deux
utilisent un agent oxydant externe. Dans des conditions danarobiose, des
agents oxydants tels que le nitrate, le sulfate et le fumarate remplacent
loxygne ; une chane respiratoire anarobie peut donner naissance une force
proton motrice.
Dans la respiration nitrique, le nitrate sert daccepteur final dlectrons. Il
est ainsi rduit en nitrite, en oxyde nitreux, en azote ou en ammoniac.
Les bactries rductrices de sulfates emploient le sulfate comme accepteur
final dlectrons et le rduisent en sulfure.
Dans la respiration fumarique, laccepteur final dlectrons est du fumarate
exogne qui est rduit en succinate.

3. La fermentation :
La fermentation est un type de mtabolisme convertisseur dnergie par lequel
un substrat est mtabolis sans intervention dun agent oxydant exogne.
La fermentation a lieu gnralement ; mais pas ncessairement ; en anarobiose
c'est--dire en labsence doxygne.
Puisquaucun agent oxydant externe nest utilis, les produits de fermentation
ont le mme degr doxydation que le substrat.
La fermentation du glucose commence par la glycolyse ou la voie dEmbdenMeyerhof. Au cours de ce processus, une molcule de glucose va donner deux
molcules de pyruvate, 2 ATP, 2NADH.
En fonction du devenir du pyruvate, on distingue :
La fermentation lactique: lorsque lacide lactique est le seul produit(ou
produit prdominant), on parle de fermentation homolactique ; tandis quune
fermentation htrolactique donne un mlange dacide lactique et dautres
produits.

La fermentation alcoolique: le pyruvate est dcarboxyl en actaldhyde,


celui-ci est alors rduit en thanol par lalcool dshydrognase.
La fermentation butyrique: qui conduit la production de quantits
importantes de lacide butyrique (anarobies+++).
La fermentation formique: le pyruvate est mtabolis en acide formique et
en dautres substances. Il y a deux types de fermentation formique :
La fermentation acide mixte: a lieu chez E.coli, Proteus, Salmonellan,
Shigella. Elle aboutit la production dthanol et dun mlange complexe
dacides, en particulier les acides actiques, lactique, succinique et
formique.
La fermentation butanediolique: est caractristique de Klebsiella,
Enteroabcter, Serratia. Le pyruvate est transform en actone qui est
ensuite rduite en 2,3-butanediol.

Application du Mtabolisme lIdentification


Bactrienne : Identification Biochimique des
Bactries
1. Etude du mtabolisme nergtique :
1.1. Dtermination du type respiratoire :
Le milieu dtude type est la glose VF (viande-foie). Le milieu est coul en
tubes.
Avant dtre ensemencs, les tubes doivent tre rgnrs par sjour dune
demi-heure au bain-marie bouillant (abaisser le potentiel redox des milieux).
Ensemencer la pipette Pasteur du fond jusqu la surface en dcrivant des
tours de spires serrs. Incuber ltuve 18-24h 37C.
Lecture :
Les bactries qui se dveloppent en surface sont des bactries arobies
strictes. Ex : Pseudomonas
Les bactries qui cultivent sur toute la hauteur du tube sont dites aroanarobies facultatives.
1.2. Recherche de la catalase :
La catalase empche laccumulation du peroxyde dhydrogne (H2O2) en le
dcomposant en eau et oxygne.
Dposer sur une lame une goutte deau oxygn 10 volumes et y dissocier une
ou quelques colonies de bactries prleves sur milieu solide (mais jamais
partir dune glose au sang).
Lecture :

Le dgagement immdiat de bulles gazeuses signe la prsence dune catalase.


1.3. Recherche de loxydase :
Le cytochrome oxydase (cytochrome C, aa3) a la proprit doxyder le dimthylou ttramthyl-paraphnylnediamine en une semi-quinone rouge.
Le test se fait sur disques imprgn de ractifs.
1.4. Recherche des nitrates-rductases :
Se fait par la mise en vidence des nitrites forms lors de la raction de
Griess : les nitrites,en milieu actique ou sulfurique, donnent une coloration
rouge en prsence dacide parasulfanilique(ractif Nit1) et dalpha
naphtylamine (ractif Nit2).
Le milieu utilis est le bouillon nitrat.
Toutefois, certaines bactries rduisent le nitrates au-del du stade nitrites ,
la raction doit tre complte par lpreuve de Zo-Bell, preuve qui consiste
ajouter un peu de poudre de zinc au milieu :
Si le zinc rduit les nitrates encore prsents en nitrites : la coloration rose
apparait, la raction est alors ngative (bactrie dpourvue de nitrates
rductase) ;
Si, au contraire la teinte du milieu reste inchange, le stade nitrite a t
dpass : bactries possdant une nitrate rductase trs active.

2. Etude du mtabolisme glucidique :


2.1. Dtermination du type du mtabolisme du glucose (voie fermentative ou
voie oxydative) :
Milieu utilis : le milieu MEVAG (milieu dtude de la voie dattaque des glucides).
Les tubes doivent tre rgnrs avant ensemencement (bullition).
Lensemencement se fait par piqre centrale de 02 tubes, partir dune
suspension riche du germe tudier : un tube est incub tel quel (appel tube
ouvert), tandis que lautre est recouvert dune couche de 1 1.5 cm de vaseline
strile (tube ferm).
Il est prudent de prvoir un tube tmoin ne renfermant pas de glucide et qui ne
devra jamais tre acidifi.
Incuber en ne revissant pas fond la capsule ou le capuchon des tubes.
Lecture :
a). bactries fermentatives ou fermentaires : acidification rapide et gale
dans les deux milieux qui deviennent jaunes sur toute la hauteur de la piqre
dinoculation.
b). bactries oxydatives : absence de culture dans le tube ferm et donc pas
dacidification (couleur inchange ou teinte orange) ; acidification modre et
lente dans le tube ouvert, dbutant la surface, en 24-48h.
2.2. Milieu TSI (tri-sugar-iron) :

Milieu complexe ; comportant une pente et un culot, de couleur rouge-brique ;


permettant de confirmer la fermentation du glucose, lattaque du lactose, du
saccharose, la production de gaz, la production dH2S.
Lensemencement se fait par stries serres sur la pente et piqre centrale dans
le culot.
Lecture :
a). la fermentation du glucose se traduit par une acidification du culot (virage au
jaune)
b). la dgradation du lactose et du saccharose se produit au niveau de la pente
avec virage au jaune.
c). la production de gaz se traduit par la prsence dun vide ou le dcollement de
la glose.
d). la production dH2S se traduit par un noircissement partiel ou complet de
tube.
2.3. Milieu KIA (Kligler-Iron-Agar) ou milieu Hajna Kligler :
Il sagit dun milieu TSI dpourvu de saccharose. La lecture se fait de la mme
faon pour les autres caractres.
2.4. Dgradation du mannitol : milieu mannitol-mobilit-nitrate :
Le milieu mannitol-mobilit-nitrate (milieu glos de couleur rouge) : permet de
rechercher simultanment la fermentation du mannitol (produit de rduction du
D-mannose), la mobilit, la rduction des nitrates en nitrites.
Ensemencer par piqre centrale partir de culture en milieu solide ou liquide.
Lecture :
a). la fermentation du mannitol entraine le virage au jaune du milieu.
b). les bactries mobiles diffusent partir de la ligne densemencement en
crant un trouble du milieu.
c). en versant la surface du milieu ensemenc quelques gouttes des ractifs de
Griess, on peut rechercher la rduction des nitrates en nitrites.
2.5. Eau peptone additionne de glucide et dindicateur de pH :
Milieu : eau peptone renfermant du rouge de phnol 0.2%.
Les glucides sont incorpors la concentration de 0.5 1 %( 7 gouttes dune
solution 30% par tube de 10 ml de milieu).
Ensemencer au moyen de 2 3 gouttes dune suspension dense de la bactrie
tudier dans de leau physiologique.
Lecture :
Le virage au jaune indique lutilisation du glucide.
2.6. Recherche de la bta-galactosidase ou test ONPG :
Ajouter une suspension dense laiteuse dune culture de la bactrie tudier
dans 0.5 ml deau physiologique (de prfrence prleve sur la pente dun milieu
TSI ou KIA) un disque dONPG (ortho-nitrophnyl--D-galactopyranoside).
Le test est positif lorsque la suspension se colore en jaune citrin.

2.7. Bouillon Clark et Lubs :


Bouillon de couleur jaune permettant dexplorer les modes de fermentation
formique : fermentation acide mixte et fermentation butanediolique.
Aprs ensemencement et incubation, le milieu est partage en deux fractions :
a. Raction au rouge de mthyle : ajouter 1 2 gouttes du rouge de mthyle :
Raction RM+ : teinte rouge
Raction RM- : teinte jaune
b. Recherche de la production dactone : 1ml de bouillon ajouter 0.5 ml
dune solution dalpha-naphtol(VP1) et 0.5 ml dune solution aqueuse de soude 4N.
Agiter et attendre 15 minutes.
La production dactone (actylmthylcarbinol) se manifeste par lapparition
dune coloration rouge en surface pouvant diffuser dans le milieu(raction VP+).

3. Etude du mtabolisme protidique :


3.1. Etude de la dgradation des acides amins :
3.1.1. Recherche des dcarboxylases : LDC,ODC,ADH :
LDC : lysine dcarboxylase
ODC : ornithine dcarboxylase
ADH : arginine dihydrolase
Milieu utilis : bouillon de Moeller-Falkow (coloration violette) ; milieu contenant
du glucose.
Le test requiert lutilisation de quatre tubes du milieu Moeller-Flakow : un tube
tmoin (sans acide amin) et 03 tubes renfermant chacun un acide amin :
arginine, lysine et ornithine.
Recherche chez les bacilles Gram ngatifs aro-anrobies facultatifs
mtabolisme fermentatif :
Lensemencement se fait partir dune suspension bactrienne dense prpare
dans de leau physiologique (2 3 gouttes) ou directement partir dune culture
en milieu glos.
Les milieux sont recouverts en surface avec de lhuile de vaseline strile.
Lecture :
1e temps : acidification de tous les tubes par attaque du glucose (virage au
jaune).
2e temps : dcarboxylation et libration de catabolites alcalins (virage au violet),
le tube tmoin doit rester jaune
Donc : Rsultat ngatif : virage au jaune.
Rsultat positif : virage au violet.
3.1.2. Recherche de la tryptophane dsaminase :
Voir milieu ure-indole.

3.2. Milieu ure-indole : mise en vidence dune urase,


recherche de la production dindole, dune tryptophane
dsaminase :
A partir dune culture sur milieu glos, raliser une suspension aussi dense que
possible dans le milieu ure-indole (bouillon de couleur jaune-orang).
Lecture :
Urase positive : virage du jaune-orange au rouge
Recherche de la production dindole :
Principe : La recherche est effectue sur milieux riches en tryptophane et
exempts dindole prform.
Ajouter quelques gouttes du ractif de Kovacs :
Raction indole positive : anneau en surface rouge vermillon
Raction indole ngative : anneau bruntre (teinte originelle du ractif).
Recherche de la tryptophane dsaminase :
Ajouter au milieu-ure indole, aprs incubation, 02 gouttes du ractif TDA
(perchlorure officinal) :
Rsultat TDA+ : coloration brun-rouge avec prsence frquente dun prcipit ;
Rsultat TDA- : coloration jaune-orang.

3.3. Eau peptone exempte dindole :


Bouillon de couleur jaune permettant la recherche de la production dindole.
Lecture :
Mme principe que le bouillon ure-indole : ajouter quelques gouttes du ractif
de Kovacs. Si anneau rouge en surface, raction indole positive.

4. Etude du mtabolisme lipidique :


Recherche dune lcithinase : glose au jaune duf :
Le jaune duf, source de lcithine, est incorpor dans la glose hauteur de
10%.
Lensemencement se fait par une strie longitudinale couvrant la largeur de la
boite de ptri. Incuber pendant 1 5 jours.
Lecture :
Rsultat lcithinase positif : halo opaque blanc jauntre bords nets.
Rsultat lcithinase ngatif : pas de halo de prcipitation.