Cromatografia de liquidos de alta resolucin (C.L.A.R.

)
Determinacion de cafeina en muestra de coca

INTRODUCCIN
La cromatografa engloba a un conjunto de tcnicas de anlisis basadas en la separacin
de componentes de una mezcla y su posterior deteccin. Las tcnicas cromatogrficas son
muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido,
o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra con un flujo constante de presin
proporcionado por una bomba, hasta llegar al punto donde es introducida la muestra.
Siguiendo el flujo de presin la lleva a una columna donde se encuentra la fase estacionaria
que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido.
Los componentes de la mezcla interaccionan de distinta forma con la fase estacionaria y
con la fase mvil. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas
velocidades y se van separando.
Despus de haber pasado los componentes por la fase estacionaria y haberse separado,
pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del
tipo del compuesto.

1 imgen-partes fundamentales en la que se compone el cromatografia de liquidos de alta

resolucin (C.L.A.R.).

El uso de la cromatografa ha demostrado ser muy significativo para el estudio un tipo de

cromatografa utilizado fue el HPLC-fase inversa porque trabaja con las polaridades de los
compuestos que se van analizar ya que la fase mvil es ms polar que la fase
estacionaria.La fase mvil es agua con un componente menos polar como puede ser:
agua/metanol

En este tipo de estudios, los proveedores recomiendan que se filtre y se desgasifique todo
componente antes de ser introducido a un sistema de HPLC, esto con el propsito de evitar
daos.
La cafena es un alcaloide del grupo de las xantinas, concretamente pertenece a la familia
de las metilxantinas. Las bases xnticas o pricas son alcaloides derivados de la purina.
Concretamente, provienen del anillo de la purina que se forma a travs de la condensacin
de una pirimidina con un imidazol. Poseen una estructura cristalina y su frmula molecular
es C3H4N2.
Existen otros mtodos de anlisis como:
Cromatografa de reparto o particin: se vale de una fase estacionaria lquida que forma
una pelcula sobre un soporte slido. La distribucin del soluto viene dada por el equilibrio
entre la fase estacionaria y mvil. Se utiliza para especies poco polares pero no inicas de
masa molecular menor de 104 g/mol.
Cromatografa de adsorcin o cromatografa lquido-slido: el soluto presente en una fase
mvil lquida o gaseosa se adsorbe a las partculas slidas de la fase estacionaria. La
separacin de los diferentes solutos se debe al equilibrio entre las fases estacionaria y
mvil. Se utiliza para especies no polares, ismeros estructurales y grupos de compuestos
de masa molecular menor de 104 g/mol.
Cromatografa de intercambio inico: consiste en hacer pasar una fase mvil lquida sobre
una fase estacionaria que presenta grupos inicos en su superficie de modo que los iones
de signo opuesto quedarn retenidos por fuerzas electrostticas. Se utiliza para especies
inicas de masa molecular menor de 104 g/mol.
Cromatografa de exclusin por tamao o cromatografa en gel: Se basa en la habilidad
de materiales de porosidad controlada para separar los componentes de una mezcla de
acuerdo al tamao y forma de las molculas. Se utiliza para solutos con masa molecular
mayor de 104 g/mol.
Cromatografa de afinidad: emplea interacciones especficas entre una clase de
molculas de soluto y una segunda molcula unida covalentemente a la fase estacionaria.
OBJETIVOS.
Utilizar la Cromatografa de lquidos de alta resolucin como mtodo de
separacin y cuantificacin de una muestra que contiene cafena obtenida de una
bebida de marca coca cola.
Analizar los factores que afectan a la cromatografa de lquidos de alta
resolucin .
OBJETIVOS PARTICULARES.
Conocer los componentes del cromatgrafo de la cromatografa lquida de
alta resolucin y saber la funcin.
Conocer las partes fundamentales de la cromatografa lquida de alta
resolucin.

METODOLOGA EXPERIMENTAL.

CLCULOS

De soluciones estndares.

50 ml de una solucin std de 1mg /1ml.

Peso real
0.052 g de cafena.
En 50 ml con 0.052g de cafena tengo una concentracin de 1040 ppm.

tabla 1: Soluciones estndares de cafena.

Sistemas

Conc. ppm

2.5

Vol. en(L)
real

Conc.ppm
ajustado

Vol. en (L)
a justado.

Aforo con
FM (ml)

120.19

2.6

125

10

96.15

5.2

100

10

7.5

72.11

7.8

75

10

10

48.07

10.4

50

10

12.5

24.03

13

25

10

1 solucion STD:

2 solucin STD: se midi en microlitros 120.19L

3 solucin STD:

4 solucin STD:

5 solucin STD:

De la solucin problema.

Bebida marca coca cola. 10:15=38.33ppm

Se prepar 25ml con una concentracin de 38.33 ppm se tomaron 10ml de coca con 15 ml
de FM.
Se realiz un dilucin de la muestra, se tomaron 5 ml de la solucin anterior y se afor a
25 mL quedando una concentracin de 7.66 ppm.

de la muestra .

RESULTADOS.

cromatograma de la muestra

1 imagen. cromatograma de la muestra.

CROMATOGRAMAS DE SOLUCIN ESTNDAR

2 imagen. cromatografa 1 solucion STD.

3 Imagen.cromatografa 2 solucion STD.

4 Imagen.cromatografa 3 solucion STD.

5 Imagen.cromatografa 4 solucion STD.

6 Imagen.cromatografa 5 solucion STD.

Tabla 1. Resultados obtenidos en el anlisis cualitativo de soluciones estndar.

sistemas

Conc.(Ppm)

tr

rea

2.6

3.202

246,730

5.2

3.15

502,607

7.8

3.115

725,595

10.4

3.091

855.093

13

3.045

1,329,213

7.666

3.177

muestra

ANLISIS DE RESULTADOS

932828

El mtodo de fase inversa es el modo ms ampliamente utilizado en el (C.L.A.R.) . Esta

tcnica es la que probablemente proporcionar retencin y selectividad ptimas cuando los
compuestos no tienen grupos para enlaces de hidrgeno o no tienen un carcter
predominantemente aliftico o aromtico que en este caso es la cafena . En la
cromatografa en fase reversa, la fase estacionaria es no polar, con frecuencia se trata de
un hidrocarburo, y la fase mvil es relativamente polar (como el agua y metanol ). La
cromatografa de fase inversa utiliza un empaque enlazado hidrofbico, usualmente con un
grupo funcional octadecilo (C-18) u octilo(C-8) y una fase mvil polar, frecuentemente una
fase mvil parcial o totalmente polar. Conforme aumenta el carcter hidrofbico de los
solutos, la retencin aumenta. El agua es el eluyente ms dbil. El metanol es un
disolvente popular porque tiene baja viscosidad y son fciles de conseguir con excelente
pureza. En cromatografa de fase inversa la fuerza de la retencin no es la interaccin
favorable del soluto con la fase estacionaria, sino el efecto del disolvente de la fase mvil
para forzar al soluto hacia dentro de la capa hidrocarbonada enlazada. Los rellenos de fase
enlazada se clasifican como de fase inversa cuando el recubrimiento unido qumicamente
tiene un carcter no polar, y de fase normal cuando el recubrimiento contiene grupos
funcionales polares.

Cuantificacin
La determinacin de cafena en el refresco de cola de marca Coca-Cola se realiz
mediante la construccin de una curva de calibracin de estndar externo la cual se
construy a partir de un reactivo analitico del cual se prepar una solucin estndar de
cafena y posteriormente se tomaron determinados volmenes de dicha solucin con la
finalidad de preparar un total de cinco sistemas de distintas concentraciones perfectamente
conocidas ( Las concentraciones experimentales son reportadas en la tabla No__)
posteriormente cada uno de los cinco sistemas se inyectaron en el cromatgrafo de
lquidos de alta resolucin por separado obteniendo parmetros cualitativos como el tiempo
de retencin y cuantitativos como el rea bajo la curva dicho parmetro es graficado en
funcin de la concentracin debido a que el rea bajo la curva es directamente proporcional
con la concentracin, y es as como se obtuvo la siguiente curva de calibracin

Al presentar una tendencia lineal tal y como se esperaba, se calculan los parmetros de
regresin lineal a fin de cuantificar el contenido de cafena en la muestra problema. Los
valores de la pendiente y la ordenada al origen estn dados por la siguiente ecuacin:

Es importante mencionar que si bien el coeficiente de correlacin no es el ideal, es muy

cercano a la unidad (0.9603) lo que indica la dependencia entre las dos variables. El valor
no ideal del coeficiente de correlacin se cree que se podra deber a una mala inyeccin del
sistema cuatro al cromatgrafo de lquidos de alta resolucin pues este punto de la curva de
calibracin es el que no guarda una relacin lineal con los dems puntos de la curva de
calibracin.
Una vez obtenida la ecuacin que relaciona la tendencia lineal de la curva de calibracin, se
despeja x a fin de conocer la concentracin de cafena en la muestra problema, donde y
es igual a el rea bajo la curva medida para la muestra problema, es importante mencionar
que en el cromatograma arrojado para la muestra problema se puede observar tres picos
gaussianos cada uno corresponde a un componente en la mezcla, por lo que cada pico
tendr un valor de rea bajo la curva, el valor de y ser el rea bajo la curva que
correspondiente al tiempo de retencin de la cafena es decir 932828 a TR igual a 3.177
min.
Despeje:

sustituyendo:

Sustituyendo los valores respectivos en la ecuacin se obtiene que hay 9.8757 ppm de
cafena contenidos en la muestra problema, sin embargo la muestra problema no fue la
coca cola pura, sino que se llevaron acabo varias diluciones para que esta pudiera ser
cuantificada mediante la curva de calibracin obtenida experimentalmente, por lo que para
conocer la concentracin de cafena en la coca cola se deben considerar las diluciones.

Segun la pagina oficial de coca cola el contenido de cafena por cada 250 mL es de 25 mg,
sin embargo experimentalmente se obtuvo que por cada 250 mL de coca cola hay 30.8615
mg de cafena.

con respecto a la eficiencia de la columna se calcul en primer lugar el numero de platos

toricos de acuerdo a lo siguiente

como se observa, el nmero de platos tericos es alto por lo que se puede decir que la
columna utilizada tiene un buen poder de separacin.
Se prosigui a calcular la eficiencia de la columna o altura equivalente de plato terico
(AEPT) de la siguiente manera:

como vemos la AEPT posee un valor relativamente bajo por lo que decimos que la eficiencia
de la columna es buena.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS