Vous êtes sur la page 1sur 10
 
11
Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 23 (1-4). 2007: 11-20 
BOLETÍN.
INSTITUTO ESPAÑOL DE OCEANOGRAFÍA 
ISSN: 0074-0195© Instituto Español de Oceanografía, 2007
Glucógeno sintasa del tejido del manto de
Mytilus galloprovincialis 
Lamarck, 1819
Y. Ruiz Muñoz, P. Suárez Alonso y F. San Juan Serrano 
Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo. Lagoas-Marcosende, s/n.E-36200 Vigo (Pontevedra), España. Correos electrónicos: yruiz@uvigo.es, psuarez@uvigo.es, fsanjuan@uvigo.es
Recibido en septiembre de 2005. Aceptado en junio de 2007.
RESUMEN
La enzima glucógeno sintasa del tejido del manto de
Mytilus galloprovincialis 
Lamarck, 1819 seencuentra principalmente en su forma dependiente (D) de G6P, con una actividad cuatro vecesmayor que la forma independiente (I) de G6P. Ambas formas presentan la mayor actividad apH:7, pero la forma D mantiene el 60% de su actividad a valores extremos de pH, donde la for-ma I disminuye la suya al 25%. La temperatura óptima está entre 30 y 35ºC en ambos casos, pe-ro la forma I es más estable entre 30 y 40ºC. Los datos cinéticos de ambas formas enzimáticas in-dican la existencia de efectos cooperativos respecto al sustrato y el efector. La constante deafinidad de la forma I para el sustrato UDPG es 1,9-2,3 mM y la de la D es 0,9-1,3 mM. La formaD muestra, además, una constante de activación de 5,2-5,6 mM para el efector G6P.
Palabras clave:
Mytilus galloprovincialis 
, glucógeno sintasa, características cinéticas.
 ABSTRACT Glycogen synthase in mantle tissue of 
Mytilusgalloprovincialis
Lamarck, 1819 
Glycogen synthase (GS) from 
Mytilusgalloprovincialis
Lamarck, 1819mantle tissue is primarily in G6P-dependent form, whose activity is four times that of the G6P-independent form. Both forms present high- er activity to pH: 7, but the D-form mantains 60% of its maximum activity at extreme pH values, whereas that of the I-form drops to 25%. The optimum temperature is 30-35ºC for both forms, but the I-form is more stable between 30 and 40ºC. Kinetic data on both enzymatic forms indicate the existence of cooperative effects with regard to the substrate and effector. The I-form affinity constant for the substrate UDPG is 1.9-2.3 mM and that of the D-form is 0.9-1.3 mM. Moreover, the D-form shows an activation constant for the efector G6P of 5.2-5.6 mM.
Keywords 
:
Mytilusgalloprovincialis
, Glycogen synthase, kinetic characteristics.
INTRODUCCIÓN
La reproducción y el engorde son aspectos claveen el cultivo de
Mytilus 
, y ambos están relacionadoscon la capacidad de almacenar sustancias de reser- va en el tejido del manto, principalmente en formade glucógeno (80% del peso seco).El tejido del manto de
Mytilus
tiene dos funcio-nes fisiológicas: la acumulación de sustancias de re-serva y el desarrollo de la gónada, por la que es in- vadido y que prolifera a sus expensas. Las célulasdel tejido de reserva siguen una evolución inversaal desarrollo gametogénico (Lubet, 1959; Lubet
et al.
, 1976; Lowe, Moore y Bayne, 1982; Villalba,
 
1995; Danton
et al 
., 1996) que indica una íntima co-ordinación entre el ciclo gonadal y el del tejido dereserva. De entre los metabolitos acumulados en eltejido del manto de
Mytilus 
, el glucógeno constitu- ye el principal soporte energético de la gametogé-nesis (Lubet, 1959; De Zwaan y Zandee, 1972;Gabbott, 1983; Suárez, 2002).En la ría de Vigo (Galicia, noroeste de España),la acumulación tiene lugar durante primavera-ve-rano, coincidiendo con los
bloom 
fitoplanctónicos.En invierno, la escasez de nutrientes en el medio y el inicio de la gametogénesis imponen la utiliza-ción del glucógeno almacenado como principalfuente energética y de precursores biosintéticos(Suárez, 2002). A principios de primavera, coinci-diendo con un periodo de intensa y rápida game-togénesis que da lugar a las principales puestas, seobservan sucesivos aumentos y caídas del conteni-do en glucógeno del tejido del manto que indicanque
Mytilus 
no utiliza directamente la glucosa inge-rida, sino que depende del glucógeno almacenadopara la maduración de los gametos (Suárez, 2002).Esto entraña la activación simultánea de rutasopuestas como la glucogenogénesis y la glucogeno-lisis, que en vertebrados están sometidas a un rigu-roso y antagónico control hormonal, covalente y alostérico.La enzima clave de la glucogenolisis es la glucó-geno fosforilasa. Su existencia en el tejido del man-to de
Mytilus 
, sus características moleculares y ciné-ticas y la variación durante la gametogénesis hansido documentadas por San Juan Serrano
et al 
.(1991, 1993, 1995a,b, 1998), San Juan Serrano,Sánchez López y García Martín (1995, 1998) y Suá-rez (2002).La responsable de la biosíntesis
de novo 
del glu-cógeno es la enzima glucógeno sintasa (GS; EC2.4.1.11), que utiliza como donador glucosídico laUDP-glucosa (UDPG).En vertebrados, la GS existe en dos formas inter-convertibles entre sí mediante reacciones de fosfo-rilación y desfosforilación: la forma fosforilada, oformaD, dependiente de glucosa-6-fosfato (G6P) y la forma desfosforilada, o forma I, independientede G6P. A su vez, la forma D se corresponde con laforma inactiva de la enzima, o forma b, mientrasque la forma I se corresponde con la forma activa,o forma a, de la enzima. La existencia de esta acti- vidad enzimática ha sido demostrada en
Mytilus edulis 
L., 1758 (Cook y Gabbott, 1978).En previsión de un posterior estudio sobre el es-pecial control que el metabolismo del glucógeneoparece ejercer en el tejido del manto de
Mytilus ga- lloprovincialis 
Lamarck, 1819 durante el desarrollogametogénico
,
el presente trabajo pone de mani-fiesto la actividad glucógeno sintasa en este tejido,optimiza el método de medida de las dos formas dela enzima y las caracteriza cinéticamente.
MATERIAL Y MÉTODOSReactivos
Los sustratos, enzimas auxiliares y coenzimasfueron obtenidos en Sigma Chemical Company.Las sales, tampones y otros productos químicos deanálisis eran de la firma Merck.
Material biológico
Se utilizaron ejemplares de
M. galloprovincialis 
recogidos directamente de bateas en la ría de Vigo en febrero de 2004, con tallas entre 8 y 10 cm(medida en su eje mayor) con el objetivo de evitarposibles diferencias debidas a la edad y grado decrecimiento. Los individuos recolectados fuerontrasladados al laboratorio. La disección del tejidodel manto se realizó tras la apertura de las valvasde 20 de los mejillones seleccionados, seccionan-do el músculo aductor posterior. Todos los hemi-mantos fueron escurridos en papel de filtro y reu-nidos para la obtención inmediata del extractoenzimático.
Obtención del extracto enzimático
Se partió de una cantidad de 30 g de tejido, quese homogeneizó con tampón Tris-acetato 40 mM,pH:7,0, conteniendo 5 mM de imidazol, 5 mM deEDTA, 5 mM de
-mercaptoetanol, 10 mM de NaF y 0,12 M de KCl, en una proporción 1/5 (peso/vo-lumen). El EDTA, como agente acomplejante deiones, es un inhibidor de la glucógeno sintasa qui-nasa y estabiliza la forma desfosforilada (forma I).El uso de iones F
tiene la finalidad de estabilizarla forma fosforilada de la glucógeno sintasa (for-ma D) por inhibición de la fosfoproteína fosfata-sa. El
-mercaptoetanol y el imidazol desempeñan
Y. Ruiz Muñoz, P. Suárez Alonso y F. San Juan Serrano Glucógeno sintasa de
Mytilus galloprovincialis
Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 23 (1-4). 2007: 11-20 
12
 
una función protectora de los restos sulfhidrilo delas estructuras proteínicas, evitando su oxidación, y el KCl se utiliza para mantener la isotonicidadcon el tejido del manto de
Mytilus 
. El homogenei-zado obtenido se centrifugó a 15400
g
av 
duran-te 30 min a 4ºC. El sobrenadante, conteniendo lafracción citosólica, fue filtrado a través de una ga-sa para eliminar grasas. El extracto bruto así obte-nido fue dividido en alícuotas de 1 ml y congela-das a
80ºC hasta su utilización. Previamente alos diversos análisis realizados cada alícuota de so-lución enzimática fue dializada frente a 30 volú-menes del mismo tampón de extracción durante30 min a 4ºC en agitación, con el fin de eliminarmetabolitos contenidos en la muestra que pudie-ran interferir en la medida de la actividad enzi-mática.
Determinación de la actividad glucógeno sintasa 
La determinación de la actividad GS se llevó a ca-bo siguiendo el método descrito por Passonneau y Rottenberg (1973), acoplando la liberación deUDP a su fosforilación a UTP vía piruvato quinasa(PK) y la producción de piruvato en esta reaccióna la oxidación de NADH vía lactato deshidrogena-da (LDH). La disminución de densidad óptica(DO) provocada por la desaparición de NADH semidió espectrofotométricamente a 340 nm en rela-ción con el tiempo. La mezcla de reacción emplea-da, en un volumen de 1 ml, contenía tampón Tris-acetato 40 mM, pH:7,0, imidazol 5 mM, EDTA 2mM,
-mercaptoetanol 1,4 mM, NaF 10 mM, aceta-to magnésico 5 mM, UDPG 5 mM, glucógeno 2mg/ml, G6P 10 mM, PEP 5 mM, NADH 0,15 mM,3 unidades internacionales (UI) PK, 5 UI LDH y 20
l de muestra. Preparada la mezcla de reacción, seincubó durante 20 minutos a 20ºC y posterior-mente se midió el descenso de absorbancia tam-bién durante 20 min.Se midió así la actividad conjunta de las dos for-mas presentes en el extracto enzimático (I
D). Laforma I se midió en las mismas condiciones en au-sencia de G6P. Posteriormente, la actividad de laforma D se calculó como la diferencia de la activi-dad conjunta (I
D) y la actividad de la forma I. Laactividad enzimática se expresó en UI, medida de-finida como la cantidad de enzima necesaria paracatalizar la formación de 1 mmol de glucógeno porminuto en las condiciones de ensayo.
Puesta a punto del método de medida de la actividad enzimática 
Para la puesta a punto del método se estableció laconcentración óptima de sustrato a la cual la enzimade
Mytilus 
alcanza la actividad máxima de reacción,así como la linealidad de la actividad enzimáticafrente al tiempo de reacción. Para determinar laconcentración saturante de sustrato se midió la re-acción de la enzima a concentraciones crecientesdel mismo (0,5-6 mM). Para determinar la concen-tración óptima de efector se midió la reacción de laenzima a concentraciones crecientes del mismo (4-14 mM). Para determinar la linealidad de la reac-ción y el tiempo necesario de incubación, se midiósu actividad a diferentes tiempos hasta 40 min.
Determinación del pH óptimo
El pH óptimo de la glucógeno sintasa fue deter-minado analizando el efecto de este parámetro so-bre la actividad de cada forma enzimática (I y D).Los ensayos se realizaron a 20ºC utilizando unamezcla de tampones tris-maleato y acético-acetatoen concentraciones variables para obtener el valorde pH deseado en cada medida. El rango de valo-res de pH utilizado fue de 3 a 5,5 con el tampónacético-acetato y de 5,5 a 9,5 con el tris-maleato.
Efecto de la temperatura 
Se estudió el efecto de la temperatura, tanto so-bre la estabilidad como sobre la velocidad de reac-ción de ambas formas enzimáticas. Para determi-nar la temperatura óptima se ensayó la actividadenzimática en un rango de temperaturas de 5 a 55ºC. Para el estudio de la termoestabilidad se incubaron las muestras durante 1 h a diferentestemperaturas entre 15 y 50ºC. Transcurrido estetiempo, se ensayó la actividad enzimática como sedescribe en apartados anteriores.
Propiedades cinéticas
Las variables y constantes cinéticas fueron anali-zadas bajo las condiciones óptimas de pH y tempe-ratura determinadas previamente, variando respec-tivamente las concentraciones de sustrato y efector
Y. Ruiz Muñoz, P. Suárez Alonso y F. San Juan Serrano Glucógeno sintasa de
Mytilus galloprovincialis
Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 23 (1-4). 2007: 11-20 
13

Satisfaites votre curiosité

Tout ce que vous voulez lire.
À tout moment. Partout. Sur n'importe quel appareil.
Aucun engagement. Annulez à tout moment.
576648e32a3d8b82ca71961b7a986505