1350-Tese CCD Dias Nelson Aranha 2005

Nelson Aranha Dias
ESTUDO SISTEMTICO DA REDUO DE NITRATO POR

HIDRAZINA PARA DETERMINAO DE NITRATOS EM
GUAS E ADITIVOS ALIMENTCIOS, EM FLUXO.
Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em

Cincias da Coordenadoria de Controle de Doenas da
Secretaria de Estado da Sade de So Paulo, para obteno
do ttulo de Mestre em Cincias.
rea de concentrao: Pesquisas Laboratoriais em Sade

Pblica
Orientador: Prof. Dr. Jaim Lichtig
SO PAULO
2005
FICHA CATALOGRFICA
Preparada pelo Centro de Documentao Coordenadoria de Controle de Doenas/SES
reproduo autorizada pelo autor
Dias, Nelson Aranha

Estudo sistemtico da reduo de nitrato por hidrazina para determinao de nitratos em
guas e aditivos alimentcios, em fluxo / Nelson Aranha Dias So Paulo, 2005.
Dissertao (mestrado)Programa de Ps-Graduao em Cincias da Coordenadoria de
Controle de Doenas da Secretaria de Estado da Sade de So Paulo.
rea de concentrao: Pesquisas Laboratoriais em Sade Pblica
Orientador: Jaim Lichtig
1. Nitratos/anlise 2. Nitritos/anlise 3. Aditivos alimentares 4. gua 5. Cdmio
6.Anlise de injeo de fluxo
SES/CCD/CD-090/05
3
SUMRIO
1. INTRODUO............................................................................................... 2
1.1. OCORRNCIA NATURAL........................................................................... 2
1.2. UTILIZAO DOS NITRITOS E NITRATOS COMO ADITIVOS
ALIMENTCIOS................................................................................................... 3
1.2.1. Sabor.............................................................................................. 4
1.2.2. Cor ................................................................................................ 4
1.2.3. Atividade antibacteriana................................................................. 5
1.3
ASPECTOS TOXICOLGICOS DOS NITRATOS E NITRITOS............. 5

1.3.1. Metemoglobinemia......................................................................... 5
1.3.2. Nitrosaminas.................................................................................. 6
2. OBJETIVOS................................................................................................... 9
2.1. OBJETIVO GERAL...................................................................................... 9
2.2. OBJETIVO ESPECFICO............................................................................ 9
3. REVISO DA LITERATURA.......................................................................... 11
3.1. MTODOS PARA A DETERMINAO DE NITRITOS E NITRATOS........ 11
3.2. O MTODO ESPECTROFOTOMTRICO.................................................. 18
3.2.1 Reao de diazotao...................................................................
19
3.2.2. Reao de copulao.................................................................... 19

3.3. AS ETAPAS ................................................................................................ 20
4
3.3.1. As reaes colorimtricas.............................................................. 20
3.3.1.1. Reao de diazotao com sulfanilamida........................ 20
3.3.1.2. Reao de copulao com NED...................................... 21
3.3.1.3. A nitrosao do cido sulfanlico...................................... 23
3.3.1.4. A nitrosao do 1-naftilamina..........................................
24
3.3.2. As reaes de reduo de ons nitrato.......................................... 28

3.3.3. As interferncias............................................................................ 36
3.3.3.1. Nas reaes colorimtricas.............................................. 36
3.3.3.2 Nas reaes de reduo................................................... 39
4. MATERIAIS E MTODOS.............................................................................. 42
4.1. MTODO COM O USO DA COLUNA DE CDMIO.................................... 42
4.1.1. Reagentes e solues.................................................................... 42
4.1.2. Aparelhos e materiais acessrios.................................................. 45
4.1.3. Coluna de Cdmio......................................................................... 46
4.1.3.1. Preparo da Coluna de Cdmio........................................
46
4.1.4. Determinao da capacidade redutora da coluna de cdmio ....... 47

4.1.5. Regenerao da coluna de cdmio............................................... 48
4.1.6. Curva de calibrao do nitrito........................................................ 48
4.1.7. Determinao do nitrito em amostras de aditivos.......................... 49
4.1.8. Determinao do nitrato em amostras de aditivos......................... 49
4.2. MTODO COM SULFATO DE HIDRAZINA................................................ 50
4.2.1. Reagentes e Solues................................................................... 50
4.2.2. Aparelhos e materiais acessrios.................................................. 53
4.2.3. Programa FIA LAB for windows-nitrito........................................... 53
5
4.2.4. Programa FIA LAB for windows-nitrato.......................................... 55
4.2.5. Curva de calibrao do N- nitrito (N-NO2-)..................................... 57
4.2.6. Curva de calibrao do N-nitrato(N-NO3-)...................................... 58
4.2.7. Avaliao da taxa de converso.................................................... 58
4.2.8. Determinao do N-nitrito (N-NO2-)............................................... 59
4.2.9. Determinao do N- nitrato (N-NO3-)............................................. 59
4.2.10. Amostras...................................................................................... 59
4.2.10.1. guas (AG)..................................................................... 60
4.2.10.2. Aditivos (AD - sais de cura) formulaes declaradas
pelos fabricantes........................................................................... 60
5 - RESULTADOS E DISCUSSO.................................................................... 64
5.1. OTIMIZAO DO MTODO....................................................................... 64
5.2. INFLUNCIA DA TEMPERATURA NA PORCENTAGEM DE
CONVERSO..................................................................................................... 70
5.3. ESTABILIDADE DA SOLUO REDUTORA............................................. 71
5.4. DETERMINAO DA CAPACIDADE REDUTORA DA COLUNA DE
CDMIO............................................................................................................. 72
5.5. DETERMINAO DA TAXA DE CONVERSO DE NITRATO A NITRITO
COM SULFATO DE HIDRAZINA/ SULFATO DE COBRE................................. 73
5.6. CURVAS DE CALIBRAO........................................................................ 74
5.6.1 Curva de calibrao do nitrito de sdio Mtodo com a coluna
de cdmio ................................................................................................ 74
5.6.2. Curvas de calibrao mtodo com sulfato de hidrazina/sulfato
de cobre (SIA).......................................................................................... 76
5.6.2.1. Curva de calibrao do N-NO2- em condies no
6
redutoras....................................................................................... 76
5.6.2.2. Curva de calibrao do N-NO2- em condies redutoras 78
5.6.2.3 Curva de calibrao do N-NO3- em condies redutoras
80
5.7. LINEARIDADE, LIMITE DE DETECO E LIMITE DE QUANTIFICAO 81

5.7.1. Linearidade.................................................................................... 81
5.7.2.Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ)............... 83
5.8 DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM GUAS..........................
84
5.9. DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM ADITIVOS...................... 86

5.10.ESTUDO DE RECUPERAO.................................................................. 90
6. CONCLUSES............................................................................................... 92
7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.............................................................. 94
8. ANEXOS......................................................................................................... 107
ANEXO 1: SIAGRAMA DA CURVA DE CALIBRAO DO N-NO2- NO
PROGRAMA FIALAB FOR WINDOWS
109
NITRITO...........................................
ANEXO 2:PARTE 1- SIAGRAMA DA CURVA DE CALIBRAO DO N-NO2- 111
NO PROGRAMA FIALAB FOR WINDOWS
NITRATO....................................
112
ANEXO 2:PARTE 2- SIAGRAMA DA CURVA DE CALIBRAO DO N-NO3NO PROGRAMA FIALAB FOR WINDOWS NITRATO..
................................
ANEXO 3: FOTOS ILUSTRATIVAS DA APARELHAGEM DE ANLISE
113
7
POR INJEO SEQENCIAL (SIA).
114
.........................................................................
Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial
114
(SIA), destacando o aparelho, o espectrofotmetro, o registrador

e acima o computador.
115
............................................................................................
115
Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial

(SIA), destacando o pisto, a seringa e a vlvula rotatria seletora.
................
Foto ilustrativa do computador destacando na tela do monitor o
programa FIALAB for
windows................................................................
Foto ilustrativa da coluna de cdmio........................................................
8
Lista de Tabelas
Tabela 1: Limites mximos permitidos de nitritos e nitratos em alimentos,

segundo a legislao brasileira. ........................................................................
Tabela 2: Variao da absortividade a com o pH no intervalo 1,0 4,4.......................................................................................................................
23
Tabela 3: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o

tempo de reao, por SIA ..................................................................................
65
Tabela 4: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em

relao ao tempo inicial de 40s (em.%).............................................................. 66
Tabela 5: Comparao da altura de pico para avaliao do desempenho do
mtodo por SIA a dois tempos de reao;40 e 60 s........................................... 67
tempo de reao por SIA....................................................................................
68
Tabela 7: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em

relao ao tempo inicial de 40s (em %)............................................................. 68
Tabela 8: Acrscimo da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o
tempo de reao por SIA....................................................................................
69

tempo de reao entre 39,5o e 40,5o C por SIA.................................................
70
Tabela 10: Avaliao da estabilidade da soluo redutora de sulfato de

hidrazina/ sulfato de cobre com o tempo por SIA...............................................
71
Tabela 11: Avaliao da capacidade redutora das colunas de

cdmio.................................................................................................................. 72
9
Tabela 12: Avaliao da taxa de converso de nitrato a nitrito com sulfato de
hidrazina/ sulfato de cobre por SIA..................................................................... 73
Tabela 13: Anlise de Varincia para modelo de regresso da
concentrao de nitrito total e absorbncia
75
lida.........................................................................
Tabela 14: Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres
75
utilizados na curva de calibrao da Figura

4.....................................................
77

concentrao de nitrognio/nitrito (mg.L-1)e absorbncia
77
lida..................................................
78
utilizados na curva de calibrao da Figura

5.....................................................
79

concentrao de nitrognio /nitrito (mg.L-1) e absorbncia
80
lida.................................................
80
utilizados na curva de calibrao da Figura 6.....................................................

Tabela 19: Anlise de Varincia para modelo de regresso da concentrao
82
de nitrognio /nitrato (mg.L-1) e absorbncia lida................................................

83

84

Tabela 22: Limites de deteco e quantificao calculados para o mtodo
84
10
com sulfato de hidrazina/ sulfato de cobre (SIA)................................................

Tabela 23: Limites de deteco e quantificao calculados para o mtodo
86
com a coluna de cdmio......................................................................................

Tabela 24: Teores de N-NO2- total nas amostras de guas (AG) obtidos pelos
88
2 mtodos : coluna de cdmio e hidrazina(SIA)..................................................

Tabela 25: Teores de N-NO2- total nas amostras de aditivos (AD) obtidos
89
pelos 2 mtodos : coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA)....................... 90

Tabela 26: Teores de N-NO2- nas amostras de aditivos (AD) obtidos pelos 2
mtodos: coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA)....................................
mtodos: coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA)....................................
Tabela 28: Resultados dos estudos de recuperao..........................................
11
Lista de Figuras
Figura 1: Diagrama esquemtico do Sistema de Injeo Sequencial (SIA)........ 55

Figura 2 : Representao grfica do aumento na porcentagem de converso
de nitrato a nitrito segundo a Tabela 4................................................................. 66
Figura 3: Representao grfica do aumento na porcentagem de converso
de nitrato a nitrito segundo a Tabela 7. ............................................................... 69
Figura 4: Curva de calibrao da concentrao de nitrito em mg.L-1 e
absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio (IP) 76
Figura 5: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrito em mg.L-1
e absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio
(IP)........................................................................................................................ 78
Figura 6: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrito em mg.L-1
(IP)....................................................................................................................... 79
Figura 7: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrato em mg.L-1
(IP)........................................................................................................................ 81
Figura 8: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrato em mg.L-1
(IP)........................................................................................................................ 82
Figura 9: Representao grfica da correlao entre os resultados de N/nitrito

total obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de hidrazina
para amostras de guas...................................................................................... 85
12
Figura 10: Representao grfica da correlao entre os resultados de
N/nitrito total obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de
hidrazina para amostras de
87
aditivos.....................................................................
Figura 11: Representao grfica da correlao entre os resultados de
N/nitrito obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de
hidrazina para amostras de
aditivos.....................................................................
88
13
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeo a Deus pela vida
a meus pais por terem-na continuado
e aos que me cercam por terem-na enriquecido.
14
Agradecimentos
s bancas de qualificao e defesa, pelas excelentes sugestes
apresentadas
que, na medida do possvel, foram aqui incorporadas.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Jaim Lichtig pelo tema, por ter acreditado nele
nos momentos mais difceis, que no foram poucos e por seu imenso
conhecimento transmitido.
Ao diretor da Diviso de Bromatologia e Qumica do IAL, Prof. Dr. Odair
Zenebon
e ao diretor do Servio de Qumica Aplicada, mestre Paulo Tiglea, pelo
insistente
incentivo, sem o qual esta dissertao provavelmente no existiria.
Ao Prof. Dr. Jorge C. Masini da USP, pela cesso de seu laboratrio,
equipamentos e todo seu conhecimento sobre FIA/SIA, partes integrantes
deste
trabalho.
chefe da Seo de guas do IAL, Maria Anita Scorsafava, pelo
fornecimento
das amostras de gua empregadas nesta dissertao, evitando assim o
trabalho
da coleta.
chefe e s colegas da Seo de leos do IAL, pelo emprstimo de uma
coluna
de cdmio, o que permitiu fazer as replicatas simultaneamente.
chefe da Seo de Laticnios do IAL, mestra Marilda Duarte, pelo
fornecimento
de farto material sobre validao de metodologias.
colega Dra. Cristiane Bonaldi Cano, pelo espontneo e muito til auxlio
no
tratamento estatstico dos dados.
15
s mestras Maria de Ftima Henriques Carvalho e Viviane Emi Nakano
Fukasawa, muito mais que colegas do IAL, pelo auxlio no trabalho de
digitao,
formatao de tabelas e grficos que deixaram a apresentao, no mnimo,
muito
bonita.
colega Iracema de Albuquerque Kimura, tambm mestra, pelo auxlio no
espectrofotmetro e no computador, toda vez que a urgncia exigiu.
s bolsistas Alexandra Hissae Rocha Shoshima e Priscila Martin Biegun por
terem dedicado com eficincia vrios sbados, domingos e feriados s
anlises
das amostras pelo mtodo da coluna de cdmio, o que apressou muito a
concluso da parte prtica.
colega Clia Maria Pompeu Mome, chefe da Seo de Desenho, pelo
excelente
e paciente trabalho de computao grfica nos siagramas das curvas de
calibrao.
Finalmente, sem citar nomes, a todos os colegas do IAL que incentivaram,
torceram e acreditaram na existncia desta dissertao, s vezes contra
minhas
prprias expectativas.
16
Resumo
Os nitratos e nitritos so substncias que entram no corpo
humano atravs de alimentos de origem animal, vegetal ou da gua.
Tambm so introduzidos como aditivos alimentcios (conservadores)
que, apesar de evitarem o desenvolvimento do Clostridium botulinum
em produtos crneos, apresentam os riscos de ocorrncia de
metemoglobinemia e formao de nitrosaminas cancergenas. Isto tudo
justifica o seu controle analtico pelas autoridades sanitrias.
O mtodo oficial (AOAC) recomenda o uso da reao de
diazotao/copulao de Griess com deteco colorimtrica para o
nitrito, sendo o nitrato reduzido a nitrito em coluna de cdmio e
detectado como on nitrito. Este mtodo gera ons Cd+2
altamente
txicos com implicaes sade ocupacional e ambiental.

O mtodo proposto visa substituir o redutor Cd pelo sulfato de
hidrazina/sulfato de cobre. A tcnica empregada com o redutor
investigado foi a anlise por injeo seqencial (SIA).
Foram analisadas amostras de guas e aditivos alimentcios para
a comparao da eficincia dos dois mtodos de reduo.
Os resultados analticos mostraram boa correlao entre os dois
mtodos tanto para as amostras de guas como para os aditivos.
Os estudos de eficincia da reduo revelaram equivalncia
entre os redutores Cd e sulfato de hidrazina.
Alm
desses
resultados,
foram
realizados
estudos
de
recuperao do mtodo proposto em guas e aditivos, com valores

prximos de 100 %.
17
O mtodo apresentou linearidade at 3,5 mg.L-1 de N-NO3-
limites de deteco (L.D.) 0,06 e 0,08 mg.L-1 para o N-NO2- e N-NO3respectivamente. Os limites de quantificao (L.Q.) foram 0,08 e 0,25
mg.L-1 para o N-NO2- e N-NO3- respectivamente.
18
Abstract
Nitrate and nitrite ons are present in the human bodies through
foods and water, and as additives, added to some foods with the
purpose to avoid the development of Clostridium botulinum in meats
products, but they bring the risk of nitrosamines formation and of
methemoglobinemie. Considering these factors, there is the need of an
analytical control of nitrite and nitrate ions added to the foods.
The official method recommends the use of the diazotization
(Griess method), using cadmium as reductor of nitrate, resulting nitrite,
which is determined.
Our method has the purpose to use hydrazine sulfate as reductor
instead of cadmium which results Cd+2
extremely toxic to human
beings and to the environment.

The use of hydrazine sulfate was made by SIA (sequential
injection analysis) in waters and food additives. The analyses were
compared with those using cadmium reductor and the results showed
good correlation between the two methods.
The reduction step with cadmium column and hydrazine sulfate
showed good efficiency. The recovery tests showed results near 100 %
for both methods.
The method using SIA showed linearity to 3.5 mg.L-1 N-NO3- and
detection limits 0.06 and 0.08 mg.L-1 for N-NO2- and N-NO3-, respectively.
The quantification limits found were 0.08 and 0.25 mg.L-1 for N-NO2- and
N-NO3-, respectively.
19
1 - INTRODUO
20
1.
INTRODUO
A determinao de nitritos e nitratos realizada quase sempre conjuntamente

devido a suas propriedades qumicas estarem muito ligadas, ou seja, um raramente
encontrado sem o outro. De fato, a sua interconverso, particularmente a reduo
qumica do nitrato ao mais reativo nitrito freqentemente o nico modo no qual o
relativamente inerte on nitrato pode ser detectado. A deteco e especiao
simultnea desses ons tm ganho crescente interesse em processos ambientais.
1.1 OCORRNCIA NATURAL
Os nitratos e nitritos presentes em nossa dieta podem se originar

de vrias fontes, entrando na cadeia alimentar atravs de alimentos de
origem vegetal, animal ou da gua.
Com relao aos produtos de origem vegetal, a concentrao de nitratos em
vegetais como repolho, couve-flor, espinafre, cenoura, alface, etc., alta, atingindo
at 5800 mg.Kg-1, enquanto que o teor de nitritos normalmente encontrado bem
menor, alcanando at 100 mg.Kg-1 (1).
Entre os produtos de origem animal, o leite outra fonte de nitrato, embora
com valores baixos, normalmente no ultrapassando 5 mg.L-1. A concentrao de
nitrato em soros bem maior que a do leite atingindo 2800 mg.L-1, podendo ocorrer
tambm a presena de nitritos chegando a 140 mg.L-1; nos queijos os nitratos e
nitritos aparecem como aditivos (2).
21
A adio de nitritos e nitratos em queijos evita o chamado estufamento tardio,

defeito este que aparece depois de duas ou trs semanas de fabricao. causado, na
grande maioria, por Clostridium tyrobutyricum cuja presena causa a fermentao do
lactato na massa do queijo produzindo cido butrico, gs carbnico e hidrognio,
alterando, tambm, o odor e o sabor.
A gua tambm outra fonte destes dois nions, sendo a gua de poos a que
contm os maiores teores de nitratos atingindo concentraes maiores que 200 mg.L1
(3). O nvel de nitrato em gua poder ser um indicativo de poluio, pois sua
presena est condicionada ao estgio final da oxidao de compostos orgnicos

nitrogenados, sugerindo que ela esteve em contacto com material protico em
decomposio.
Quanto gua tratada, apenas nitrato pode ser encontrado, uma vez que o
nitrito destrudo pela adio do cloro.
1.2 UTILIZAO DOS NITRITOS E NITRATOS COMO ADITIVOS

ALIMENTCIOS
So tambm utilizados como aditivos alimentcios (categoria conservadores)

na forma de seus sais de sdio ou potssio em produtos crneos curados e em
queijos.
O emprego usual como aditivo alimentcio se d como sais de cura simples
que so formados por cloreto de sdio, nitrito e nitrato de sdio, ou misturas destes
sais, estabilizantes (fosfatos, polifosfatos) e antioxidantes (cido ascrbico, seus
ismeros ou seus sais).
22
De acordo com a legislao brasileira, os limites mximos permitidos em

alimentos encontram-se na Tabela 1:
Tabela 1: Limites mximos permitidos de nitritos e nitratos em alimentos, segundo a
legislao brasileira.
Alimentos em que podem ser tolerados
Limite mximo (mg.Kg-1)/(mg.L-1)
Produtos crneos curados (4)
150 NO2- em NO2300 NO3- em NO2-
Queijos (5)
50 em NO3-
guas (6)
10 NO3- em N
1 NO2- em N
A adio de nitratos e nitritos em alimentos est relacionada com a obteno

de sabor, cor, e tambm com a atividade antibacteriana.
1.2.1 Sabor
A base qumica do sabor de carnes curadas ainda desconhecida. Acredita-se
que a inibio de oxidao dos lipdeos, que ocorre na presena de nitritos, seja
importante no sabor caracterstico de carnes curadas.
1.2.2 Cor
Com a adio de nitrito a carnes, a mioglobina (vermelho prpura) que d a
colorao caracterstica de carnes frescas, transformada em nitrosomioglobina
(vermelha), responsvel pela cor caracterstica das carnes curadas.
A nitrosomioglobina insolvel em gua. O aquecimento converte a
nitrosomioglobina em nitroso-hemocromo (rosa), responsvel pela colorao rsea
caracterstica de carnes cozidas (7).
23
1.2.3 Atividade antibacteriana

Os nitritos so de grande importncia na conservao de alimentos porque eles
podem ajudar a evitar o crescimento da bactria que causa o botulismo (Clostridium
botulinum) freqentemente fatal. O nitrato, por si s no tem nenhuma ao inibitria
contra estas bactrias, tendo um papel incerto. Acredita-se que possa ser um
reservatrio de nitrito proveniente da reduo do nitrato pelos microorganismos
presentes em alimentos.
O mecanismo preciso da inibio de bactrias por nitritos desconhecido: sabese que no evita a germinao dos esporos, mas evita o crescimento dos esporos
germinados (7).
1.3 ASPECTOS TOXICOLGICOS DOS NITRATOS E NITRITOS
Os maiores riscos provenientes da ingesto dos nitratos e nitritos so de

ocorrncia da metemoglobinemia e a formao de nitrosaminas.
1.3.1 Metemoglobinemia
O nitrito, ingerido ou formado no intestino por bactrias, pode
passar para a corrente sangunea, convertendo a hemoglobina das
clulas sanguneas metemoglobina (por oxidao do on ferroso
frrico), que incapaz de transportar oxignio. A proporo normal de
metemoglobina e hemoglobina no sangue humano de 1:99%
respectivamente. Com a absoro dos nitritos, ocorre um aumento no
teor de metemoglobina. Atingindo 10% pode aparecer cianose
24
assintomtica, entre 20% e 30% h o aparecimento de cianose, com

sinais de hipoxia, astenia, dispnia de esforo, cefalia, taquicardia e
inconscincia. Concentraes superiores a 50% podem ser fatais.
As crianas so bem mais susceptveis a metemoglobinemia do que os
adultos, devido a menor acidez gstrica que favorece a proliferao de
microrganismos redutores de nitratos a nitritos (7).
1.3.2 Nitrosaminas
O cido nitroso formado em meio cido pode reagir com aminas secundrias
que ocorrem naturalmente em alimentos. As reaes so as seguintes:
H+
NO2
Nitrito
H+
HNO2
cido nitroso
R2NH + HNO2
amina secundria
R2 N N = O + H2O
nitrosamina
Muitas das nitrosaminas so carcinognicas. Algumas podem induzir a

formao de tumor, mesmo aps uma nica dose. Outras so teratognicas, isto ,
podem cruzar a barreira da placenta, produzindo tumores em fetos. Traos de
nitrosaminas foram detectados em carnes curadas, peixes curados e bacon frio.
Pesquisas em vrios laboratrios estabeleceram que a adio de antioxidantes como
tocoferol, cido ascrbico e seus sais ismeros, podem inibir a formao de
nitrosaminas(4).
A Organizao Mundial de Sade (FAO/WHO) (8) fixou uma ingesto diria
aceitvel (IDA) de 0-5 mg.Kg-1 de peso corpreo para o NaNO3 e de 0-0,2 mg.Kg-1
peso corpreo para o NaNO2 .
25
Tendo em vista os riscos apontados, da ingesto de nitritos e nitratos, os

valores relativamente baixos dos limites mximos de uso, permitidos pela legislao
brasileira e os valores igualmente baixos de suas IDAs, pode-se perceber a
importncia da fiscalizao pelos rgos pblicos competentes.
26
2 - OBJETIVOS
27
2.
OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho tem por objetivo o estudo da reduo de ons nitrato por
hidrazina em substituio ao uso da coluna de cdmio.
2.2 OBJETIVO ESPECFICO
Implementao desta substituio atravs da determinao de nitratos e

nitritos em aditivos alimentcios e guas, validao e comparao dos resultados
analticos dos mtodos de reduo com coluna de cdmio e com hidrazina.
28
3 - REVISO DA LITERATURA
41
3.
REVISO DA LITERATURA
3.1 MTODOS PARA A DETERMINAO DE NITRITOS E NITRATOS
Diversos mtodos foram desenvolvidos para a determinao de nitritos e

nitratos em alimentos e outras matrizes.
As tcnicas mais utilizadas foram:
EspectrofotometriaUV/VIS (9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23)
Cromatografia gasosa (24,25,26,27)
Cromatografia
lquida
de
alto
desempenho
(HPLC)
(28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43)
Cromatografia de ons (44,45,46,47)
Potenciometria (eletrodo seletivo) (48,49,50,51,52,53)
Eletroforese capilar (54,55,56)
Amperometria (57,58,59,60)
Anlise por injeo em fluxo (FIA) (61,62,63,64,65,66,67,68,69,70,71)
Anlise por injeo seqencial (SIA) (72,73,74)

A tcnica mais amplamente utilizada dentre estas, a espectrofotometria na
regio do visvel, devido aos excelentes limites de determinao obtidos, a facilidade

de procedimentos e baixo custo, havendo cerca de 52 mtodos utilizando esta tcnica
(75).
O mtodo espectrofotomtrico no UV empregado na anlise de sais de cura
simples, formados por cloretos, nitritos e nitratos, nos quais os primeiros no
42
absorvem nos mesmos comprimentos de onda dos ltimos (23). de fcil e rpida
execuo, porm limitado s amostras citadas.
A cromatografia gasosa (CG) tambm utilizada, recorre etapa da derivao,
atravs da reao do nitrato com benzeno formando o nitrobenzeno (24), ou com 2,4xilenol formando o 6-nitro-2,4-xilenol (27). O nitrito oxidado a nitrato atravs da
reao com permanganato de potssio ou perxido de hidrognio e submetido
mesma derivao. O derivado produzido extrado com solvente orgnico
apropriado e injetado no cromatgrafo.
Outra variao desta tcnica a reao do nitrito com hidralazina (1hidroxiftalazina) para formar a tetrazolftalazina (25,26), tambm extrada com
solvente orgnico e injetada. Nesses casos o nitrato reduzido nitrito antes da
derivao.
Alm da introduo da etapa da derivao, a cromatografia gasosa tem a
desvantagem da necessidade de uso de detectores muito especficos, como captura de
eltrons (ECD) (24,25,27) ou analisador de energia trmica (TEA) (24).
A cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC) comparada ao mtodo
espectrofotomtrico, apresenta as seguintes vantagens:
embora a
deteco seja no UV, o risco de interferncias de outras
espcies absorventes menor devido separao dos picos.
o tempo de anlise menor por HPLC; numa nica corrida determina-se

simultaneamente nitrito e nitrato, no havendo a necessidade da etapa de
reduo, o que ocorre na espectrofotometria onde so determinados
individualmente em anlises separadas.
43
a cromatografia lquida aplicvel para rotina com grande nmero de

amostras; a espectrofotometria limitada ao nmero de colunas redutoras
disponveis.
na espectrofotometria, a coluna de cdmio perde a eficincia aps a

passagem de vrias amostras, necessita ser regenerada e testada com
padres, o que consome tempo. Na cromatografia basta lavar a coluna
com a prpria fase mvel.
As desvantagens que a cromatografia lquida apresenta so a utilizao de um

aparelho de alto custo e reagentes de alta pureza, grau HPLC, mais caros.
Outra variante cromatogrfica, a cromatografia de ons (CI), emprega colunas
de troca inica (46,47) no processo de separao, e deteco no UV (44,46,47), com
seletividade e sensibilidade comparveis anlise por injeo em fluxo (FIA). A
sensibilidade ser alta, especialmente se for acrescentada coluna pr-concentradora.
A vantagem da cromatografia de ons sobre a gasosa est em no requerer
qualquer pr-tratamento de derivao da amostra; a desvantagem est no emprego de
colunas muito caras e tempo de corrida maior que o de outras tcnicas, como por
exemplo a eletroforese capilar (EC).
A potenciometria faz uso de eletrodos que, embora chamados seletivos,
tambm respondem ao on cloreto, um interferente comum. O eletrodo cerca de 100
vezes mais sensvel ao nitrato do que ao cloreto; ocorre que s vezes esta
sensibilidade insuficiente para baixos teores de nitrato, sendo necessrio adicionar
sulfato de prata para precipitar o cloreto. O eletrodo cerca de 100.000 vezes menos
sensvel ao on sulfato introduzido. O on nitrito tambm interfere e eliminado com
adio de cido sulfmico (50,52).
44
Pode ser efetuada a determinao simultnea de nitrato e nitrito; o potencial

da soluo medido antes e depois do nitrito ser oxidado a nitrato com
permanganato de potssio (53). A tcnica apresenta simplicidade, maior rapidez que
o mtodo colorimtrico com a coluna de cdmio, requerendo apenas um tratamento
prvio da amostra. A interferncia do on cloreto ocorre para concentraes maiores
que 50 g.m L-1, quando aplicado o mtodo em guas minerais (49).
A eletroforese capilar (EC) uma tcnica de separao baseada na migrao
diferenciada de compostos inicos ou ionizveis, em um campo eltrico. Utiliza
coluna capilar de slica fundida, soluo de eletrlitos, modificador de fluxo
eletrosmtico e deteco no UV. Sua alta resoluo resulta em um tempo de anlise
menor, sendo mais rpido que a cromatografia de ons (CI).
Apresenta ainda um custo muito mais baixo, tanto do equipamento quanto da
coluna e dos reagentes.
Porm, apresenta falta de sensibilidade e especificidade, no sendo indicado
na presena de concentraes altas de cloretos, que nesses casos necessita ser
removido (54,56).
Na amperometria o mtodo baseado na oxidao do on iodeto pelo on
nitrito formando o on I3- (58,59,60), sendo a corrente proporcional quantidade do
on I3- formado, conforme a equao:
2 HNO2 + 3 I- + 2 H+
2 NO + I3- + 2 H2O
A deteco pode ser biamperomtrica em fluxo, com dois eletrodos de platina

polarizados a 100 mV em excesso de iodeto (58), ou amperometricamente em fluxo
com eletrodos de grafite teflonizado ou fio de platina polarizada com voltagem de
100 mV (60).
45
O on nitrato pode ser fotoreduzido pela radiao UV com lmpada de

mercrio (58), e o nitrito total (inicial + fotoreduzido) empregado na reao acima.
Pode ser tambm reduzido a nitrito em coluna de cdmio cobreado (60) e detectado
da mesma forma. O mtodo simples, de baixo custo e seletivo.
O grande interferente neste mtodo o oxignio, que pode reagir com o
monxido de nitrognio segundo a equao:
2 NO + O2
2 NO2
O dixido de nitrognio formado pode desproporcionar em cido nitroso

(HNO2) e cido ntrico (HNO3) ou reagir, posteriormente, com excesso de iodeto
formando, outra vez, o monxido de nitrognio, segundo a equao:
2 NO2 + 6 I- +4 H+
2 I3- + 2 NO +2 H2O
Em vista disso, as condies precisam ser estritamente controladas.

Um outro modo de deteco emprega eletrodo de carbono vtreo revestido
com um filme eletrostaticamente preparado de cobalto porfirina tetrarutenada / mesotetra(sulfonatofenil)porfirinato de zinco(II) (57). O revestimento impede o
envenenamento da superfcie do eletrodo e a estabilidade dura vrias semanas. O
mesmo detector utilizado para a determinao do nitrato aps a reduo a nitrito
em coluna redutora de cdmio cobreado. Os maiores interferentes neste eletrodo
modificado para nitrito so os nions capazes de serem oxidados neste potencial de
trabalho, entre eles, brometo e iodeto. Uma vez que o nitrato e o oxignio no so
eletroatrativos nas condies do mtodo, no causam interferncia na anlise do
nitrito.
A anlise por injeo em fluxo (FIA) um mtodo baseado na injeo de uma
amostra lquida em um fluxo contnuo no segmentado de um lquido adequado. A
46
amostra injetada forma uma zona, que , ento, transportada por meio de um detector
que, continuamente, registra a absorbncia, o potencial de eletrodo ou qualquer outro
parmetro fsico,
que
muda, continuamente, como resultado da passagem da
amostra pela clula de fluxo. Utiliza, na maioria dos casos, a reao de reduo do
nitrato a nitrito com coluna de cdmio cobreado. O nitrito total (inicial + reduzido)
determinado, colorimetricamente, pela reao de desenvolvimento de cor ou de
decrscimo de cor.
Como exemplos do primeiro caso, temos a clssica reao de diazotao e
copulao de Griess (65,66), reao do nitrito com o floroglucinol (67), a nitroanilina
(70), o sulfato de proflavina (71).
Como exemplos do segundo caso, temos o efeito cataltico do nitrito na
oxidao do violeta cristal pelo bromato de potssio, cujo decrscimo da absorbncia
monitorado espectrofotometricamente (68) ou pelo mesmo efeito do nitrito na
oxidao da galocianina pelo mesmo bromato (61), do verde de naftol B com o
bromato (62) ou do nitrito com o molibdnioVI (69). A frequncia varia de 20 a 90
amostras por hora, dependendo do mtodo, com amostras de guas, carnes, farinhas e
queijos.
A anlise por injeo seqencial (SIA), mantm os mesmos princpios do
FIA, como controle da disperso, controle do tempo e injeo da amostra, porm, o
sentido do fluxo pode ser programadamente invertido. Tambm emprega a reao de
reduo do nitrato e o nitrito total (inicial + reduzido) determinado atravs da
clssica reao de Griess.
47
O mtodo de reduo emprega a coluna de cdmio cobreado (72,73) ou

reduo com sulfato de hidrazina/sulfato de cobre (74), que o tema central deste
trabalho, ou seja, a comparao da eficincia dos dois mtodos de reduo.
Com relao ao redutor utilizado, a coluna de cdmio cobreado pode ser
recondicionada durante o processo para a redeposio do cobre sempre que
necessrio.
Porm, apresenta problemas de desativao devido ao envenenamento da
coluna pelos componentes de algumas amostras como gua de esgoto (matria
orgnica, on fosfato,etc.), recomendando-se outros redutores (73).
O redutor sulfato de hidrazina/sulfato de cobre alm de no necessitar
manuteno da coluna, no tem problemas de interferncia de alguns componentes
da amostra como o on fosfato, apresentando boa recuperao at com gua de
esgoto (74).
As vantagens da injeo seqencial (SIA) sobre a injeo em fluxo (FIA) so
a reduo do consumo de reagentes, estimado em um dcimo, reduo conseqente
do volume de descarte, importante no caso de produtos qumicos caros e/ou txicos.
Pode ser automatizado, sendo empregado para diferentes anlises sem
necessidade de mudana na configurao fsica do sistema; para alterar os volumes
dos reagentes ou da amostra basta mudar o percurso do pisto e, para alterar a
seqncia da mistura ou da reao, basta mudar a posio da vlvula seletora, que
controlado por computador.
Uma aparente desvantagem apresentada que a injeo seqencial (SIA)
possui freqncia de amostragem inferior injeo em fluxo (FIA), mas, mesmo
assim, bem atraente.
48
3.2 O MTODO ESPECTROFOTOMTRICO
O mtodo clssico para a determinao colorimtrica de nitrito deve-se a

Griess (76), por meio da reao deste on com o cido sulfanlico (cido 4-aminobenzenosulfnico) e naftilamina (1-aminonaftaleno) em cido sulfrico. O mtodo
foi modificado posteriormente por Ilosvay (77) com a substituio do cido sulfrico
por cido actico, que aumenta muito a velocidade de desenvolvimento de cor.
As reaes envolvidas podem ser representadas pelas seguintes equaes:
3.2.1 Reao de diazotao

NH2
N+
+ NO2- + 2H+
SO3H
SO3H
cido sulfanlico
on diaznio
3.2.2 Reao de copulao
N+
+ H+
SO3H
NH
2
+
on diaznio -naftilamina
SO3H
NH2
azocomposto
(cido alfa-
naftilamina- p-azobenzeno-psulfnico)
49
O conjunto dessas duas reaes chamado de diazoconjugao. Vrios pares

de reagentes, seguindo ou no o modelo de diazoconjugao de Griess-Ilosvay,
foram testados conforme levantamento realizado por Sawicki et al. (75).
Reagentes como o -naftol e -naftilamina por serem carcinognicos (78)
tem sido substitudos por outros reagentes.
Bratton
Marshall
(79),
investigando
novos
reagentes
para
diazoconjugao encontraram o par sulfanilamida (4-amino-benzenosulfonamida) e

NED [dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina] como o mais satisfatrio, sendo
este ltimo (NED) citado por Sen e Donaldson (80) por no ter sido encontrado
nenhum relato sobre efeitos txicos dos mesmos.
Este par, sulfanilamida/NED, o adotado pela Comunidade Europia (81) e
tambm foi o utilizado no presente trabalho.
3.3 AS ETAPAS
A quantificao de nitritos e nitratos passa por duas etapas igualmente

importantes, as reaes de reduo de ons nitrato e as reaes colorimtricas.
3.3.1 As reaes colorimtricas

O mecanismo de reao de Griess a nitrao do cido sulfanlico para
formar o sal de diaznio do cido sulfanlico o qual copula com -naftilamina para
formar o azo composto rosa brilhante, conforme mostram as equaes dos itens 3.2.1
e 3.2.2.
50
Substituindo o par cido sulfanlico/ -naftilamina pelo par sulfanilamida/NED,

as equaes das reaes ficam assim escritas:
3.3.1.1 Reao de diazotao com sulfanilamida
N+
NH 2
+ NO-2 + 2H +
SO2 NH2
N
+2H O
2
SO2 NH2
3.3.1.2 Reao de copulao com NED

N
+
+ H+
SO2 NH2
H-N-CH 2-CH2-NH2-2HCl
SO2NH2
H-N-CH 2-CH2-NH2-2HCl
Como podemos verificar, apesar dos radicais serem diferentes, o mecanismo da

reao o mesmo e nele vemos a importncia do pH.
Alta acidez aumenta a velocidade de diazotao e diminui a velocidade de
copulao. Baixa acidez diminui a velocidade de diazotao e aumenta a velocidade
de copulao. Este fato previsto pela lei da ao das massas na primeira equao na
qual o on H+ um reagente e na segunda equao o mesmo um dos produtos.
Rider e Mellon (82) estudaram detalhadamente esta reao de diazoconjugao
para determinar o efeito de vrios fatores, como concentrao dos reagentes, ordem
de adio dos reagentes, pH, temperatura, luz, concentrao de nitrito, alm de ons
interferentes. Eles chegaram a quatro concluses principais:
I. A diazotao deve ser efetuada em soluo fortemente cida (pH=1,4).
51
II. A diazotao deve ser efetuada em soluo to fria quanto praticvel (~20C).
III. A copulao no deve ser tentada antes da diazotao estar completada.
IV. A copulao deve ser efetuada em uma acidez to baixa (pH=2,0-2,5) quanto
for consistente com a estabilidade colorimtrica.
Davis et al. (81) estudaram especificamente o efeito do pH na absorbncia do
azo corante formado na reao entre o nitrito e o par sulfanilamida/NED.
A justificativa do estudo foi que vrios corantes indicadores so dependentes
do pH, ento o azo composto tambm deveria ser. Assim sendo, poderiam surgir
resultados errados se a curva padro fosse desenvolvida em um determinado pH e
empregada na anlise de uma amostra em um pH diferente.
Foi desenvolvida, por estes autores, uma equao que relaciona absortividade e
pH:
a= B + C . 10E
. (pH D)
1 + 10E . (pH D)
onde a= absortividade efetiva mxima, B, C, D e E so constantes para um dado
comprimento de onda cujos valores so: B= 0,7818; C= 0,3568; D= 2,713 e E=
1,164.
Com esses dados foi construda a Tabela 2 a seguir:
52
Tabela 2: Variao da absortividade a com o pH no intervalo 1,0 - 4,4 (81).

pH
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
a
0,778
0,776
0,775
0,772
0,770
0,766
0,761
pH
1,7
1,8
1,9
2,0
2,1
2,2
2,3
a
0,755
0,748
0,739
0,727
0,713
0,696
0,676
pH
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3,0
a
0,654
0,628
0,601
0,573
0,545
0,517
0,491
pH
3,1
3,2
3,3
3,4
3,5
3,6
3,7
a
0,468
0,447
0,430
0,415
0,403
0,393
0,385
pH a
3,8 0,379
3,9 0,374
4,0 0,370
4,1 0,367
4,2 0,365
4,3 0,363
4,4 0,361
Davis et al (81) sugeriram ento: a) medir o pH da soluo colorida final e

utilizar a absortividade a correspondente para calcular a concentrao de nitrito. b)
ajustar o pH da soluo colorida final no intervalo 1,2-1,3 para a mxima
sensibilidade. A segunda alternativa por ser mais simples foi a recomendada.
Nicholas e Fox (83) tambm investigaram essa reao para determinar se a
adio de nitrito aos reagentes de Griess separadamente ou em mistura produziria
resultados diferentes.
Mostramos abaixo as duas possibilidades de primeira etapa de reao, por eles
considerada:
3.3.1.3 A nitrosao do cido sulfanlico
-O3S
NH3+ + HONO
N+
-O3S
on diaznio
3.3.1.4 A nitrosao do 1-naftilamina
NH +
3
N
+ HONO
N
+ 2H2O
2 H2O
53
A prxima etapa seria a copulao do on diaznio com 1-naftilamina para

formar, ou 1-sulfanilazonaftilamina ou 1-naftilazonaftilamina. O primeiro um
produto colorido rosa com um mximo de absoro a 525 nm; o segundo insolvel
em gua. Desde que ou o cido sulfanlico ou 1-naftilamina podem reagir com nitrito
na mistura, a quantidade relativa de intermedirios e conseqentemente, os produtos
finais, dependem da velocidade relativa de reao e da concentrao.
Se a segunda opo fosse predominante, a quantidade do produto rosa deveria
ser reduzido, isto a segunda reao deveria interferir com o desenvolvimento
normal de cor. Tal interferncia deveria ser reduzida pela pr-incubao do cido
sulfanlico com nitrito seguido pela adio de 1-naftilamina.
O nitrito foi adicionado ao cido sulfanlico e a mistura foi deixada em
repouso por 20 minutos antes de ser adicionado a 1-naftilamina. A quantidade
resultante de azo corante foi a mesma que aquela formada quando o nitrito foi
adicionado mistura de cido sulfanlico e 1-naftilamina.
Ficou claro que a velocidade da reao do item 3.3.1.3 muito mais rpida
que a reao do item 3.3.1.4 nas condies de anlise dos reagentes de Griess.
Esta constatao importante foi aplicada na determinao de nitritos e nitratos
atravs da anlise por injeo seqencial (SIA) em que os reagentes sulfanilamida e
NED so adicionados na forma de soluo nica.
Nicholas e Fox (83) estudaram tambm o efeito da diluio do reagente de
Griess adotada no mtodo oficial. Nesta diluio, 1:25, para uma concentrao acima
de 5g N-NO-2/50 mL (7,14 M) onde ainda havia absoro a concentrao de cido
sulfanlico era 326M (~45vezes) e a de 1-naftilamina era 87,2M (~12vezes).
54
Os mesmos autores observaram, experimentalmente, que nesta diluio a

reao era incompleta, alm de requerer mais tempo e havendo o risco do azo
composto descolorir. Sugeriram, ento, a diluio 1:10, com maior rendimento e
menor tempo de reao.
Fox Jr., (84) estudando a cintica e mecanismo da reao de Griess,
enumerou uma seqncia de reaes crticas para a formao do produto final, aqui
apresentada:
a.
R*
R*
+HNO2
N
N+
b.
R
N
+
NH2
N+
NH2
c.
HNO2 + RdH
RdNO (nitroso)
55
d.
R
R
+
Rd H
OxRd +
NHNH2
N+
e.
NO
R
+
HNO2
NH2
NH2
f.
N
R
R
+
R
N
N+
NH 2
NH 2
Onde R= -SO2H; SO2NH2; Cl; NH2OH e qualquer combinao deles, Rd=redutor,

OxRd= forma oxidada.
Fox Jr. (84) concluiu que a quantidade de diazopigmento formado da
reao de uma variedade de anilinas e derivados da anilina com nitrito
dependente de uma srie de fatores, a saber:
I. Tipo e concentrao dos reagentes usados, incluindo a posio dos
substituintes do anel.
II. Combinaes especficas e concentraes relativas das espcies nitrosveis e
reagentes copulantes.
56
III. Reao do nitrito com outros substituintes do anel alm do grupo amino.
IV. Reao do nitrito com o reagente copulante.
V. Formao de mais de um pigmento.
VI. Oxidao do on diaznio intermedirio.
VII. Oxidao do pigmento.
VIII. xidos de nitrognio no ar.
IX. Reduo do on diaznio pelos redutores residuais.
X. Formao de intermedirios nitroso-redutores semiestveis.
XI. Pr reao da espcie nitrosada e o nitrito.
A reao de diazoconjugao para o on nitrito tem sido indicada como tendo
especificidade qumica, minimizando o efeito de interferncias, sendo deste modo
explicada a grande popularidade do mtodo de Griess.
Todas as referncias at aqui foram para o nitrito, no tendo sido considerado
o on nitrato. Este por sua vez, por falta de uma reao to especfica e sensvel, tem
sido determinado como nitrito, aps uma reao de reduo.
3.3.2 As reaes de reduo de ons nitrato
O mtodo espectrofotomtrico para a determinao simultnea de nitritos e

nitratos baseia-se em trs etapas:
I. Reao direta do nitrito presente na amostra com os reagentes colorimtricos
e leitura espectrofotomtrica contra um branco, utilizando-se a curva de
calibrao.
57
II. Reduo
do
nitrato
por
ao
de
um
redutor
determinao
espectrofotomtrica do nitrito total (nitrito inicialmente presente + nitrito

proveniente do nitrato reduzido).
III. Determinao do nitrato por diferena (nitrito total- nitrito inicialmente
presente = nitrato).
Do exposto percebe-se que estamos determinando sempre nitrito, que o nion
que desenvolve cor com os reagentes colorimtricos, uma vez que o nitrato no reage
com eles.
comum nos trabalhos consultados expressar o resultado em nitrognio
colocando-se ao lado a sua fonte, como N-NO-3 e N-NO2-evitando-se assim fatores de
converso.
Embora, no caso do nitrato, a etapa da reduo preceda a determinao
espectrofotomtrica, deixamos este item para depois em virtude de ser o ponto
central deste trabalho, isto , a substituio do agente redutor.
O mtodo oficial para a determinao de nitrato {AOAC(1984)24.044-24.045}
baseia-se nas trs etapas j descritas (I, II, III) atuando como redutor a coluna de
cdmio, preparada pela reao entre o sulfato de cdmio em soluo e o zinco em
basto.
As reaes do item II so:
Cd - 2eH2O + NO3- + 2e-
H2O + Cd + NO3-
Cd 2+
NO2- + 2 OH-
Cd 2+ + NO2- + 2 OH-
58
Durante o funcionamento esta coluna libera ons Cd2+, altamente txicos,

alm de problemas com o descarte.
Estes ons permanecem em soluo, j que o mtodo oficial recomenda a
adio de EDTA para complexar os ons Cd2+, evitando que reaja com os ons OHprovenientes da reduo do nitrato e conseqentemente precipitao de Cd(OH)2 na
superfcie da coluna, reduzindo a sua eficincia (85).
A reao pode ser assim representada:
NO3- + H2O + (EDTA)-4 + Cd
NO2- + 2 OH- + Cd(EDTA)-2
(EDTA)-4
=(OOCCH2)-2N(CH2)2N(CH2COO)-2
(EDTA)-2 =(HOOCCH2)2N(CH2)2N(CH2COO)-2
A produo de ons Cd2+ na coluna redutora muito maior que aquela
causada somente pela reduo do nitrato.
Nydall (85) chamou a ateno para o fato de que o oxignio dissolvido rpida e
quantitativamente reduzido de acordo com a reao:
2Cd + O2 + 4H+
2Cd+2 + 2H2O
De acordo com o autor, mesmo a uma elevada vazo na coluna de 33

volumes-leito por minuto, 98,5% do oxignio reduzido.
Como visto na equao desta reao, a reduo do oxignio deve remover
dois ons H+ para cada tomo de oxignio. Isto corresponde adio de 1 meq de
base por litro de soluo, assim deve ocorrer um aumento do pH em solues no
tamponadas.
59
Ento, deve-se tambm considerar que a reduo do nitrato dependente do

pH.
Isto pode ser verificado atravs das equaes:
a. NO3- + 2H+ + 2e-
NO2- + H2O
b. HNO2 + 5H+ + 4 e-
NH3OH+ + H2O
hidroxilamina
c. HNO2 + 7H+ + 6 e-
NH4+ + 2H2O
Uma certa concentrao hidrogeninica necessria para a reduo

quantitativa do nitrato a nitrito (reao a); concentraes hidrogeninicas muito
elevadas podem causar a reduo do nitrito formado (reaes b e c).
Segundo experimentos do mesmo autor, o nitrato rapidamente reduzido pelo
cdmio a hidroxilamina e pequenas quantidades de amnia a baixo pH (1,0-3,0). No
intervalo de pH 3,0 a 5,0 a velocidade desta reao decresce ntida e rapidamente e a
reduo tende a parar na formao do nitrito.
Com respeito ao pH adequado, Nydall (85) cita vrios outros autores que
observaram que o pH do tampo cloreto de amnio empregado podia variar entre 5,0
e 10,0 sem efeito na reduo do nitrato a nitrito. Alguns recomendam o pH 9,6 (86).
A reduo do nitrato a nitrito pode ser obtida pelo emprego de vrios agentes
redutores, tais como cobre, zinco, cdmio em p, cdmio esponjoso, cdmio
cobreado, cdmio prateado, cdmio amalgamado, cdmio eletroliticamente
precipitado e sulfato de hidrazina (78,85).
60
O cdmio eletroliticamente precipitado, devido ao seu mtodo de preparao,

tem porcentagem baixa de impurezas metlicas; o cdmio em p e o esponjoso tm
essa porcentagem de impurezas maior.
Quando o cdmio preparado pela reao de precipitao entre uma soluo
de sulfato de cdmio e zinco metlico h a possibilidade de formao de clulas
galvnicas pelos metais mais nobres que podem estar presentes no zinco (impurezas)
e no so removidos.
Este fato foi aproveitado para intencionalmente tratar o cdmio com uma
soluo de sulfato de cobre; este precipitado e parcialmente adere ao cdmio como
uma camada porosa. Uma cela galvnica formada com o cobre como ctodo.
O potencial padro de reduo do par Cd/Cd2+ 0,403V, o do par Cu/ Cu2+
+0,337V e o potencial da cela resultante ser 0,740V; seu poder redutor muito
maior que o do cdmio sozinho.
Cerd et al (73) utilizaram uma coluna de cdmio cobreado na determinao
de nitratos e nitritos empregando a tcnica de anlise por injeo seqencial (SIA).
Se a coluna redutora contm partculas de diferentes tamanhos, as menores,
empacotadas nos interstcios entre as maiores, so consumidas primeiro e a rea
superficial do leito redutor diminuda. Esta pode ser uma causa que contribui para o
decrscimo gradual de eficincia da coluna observada por vrios autores. Outra causa
e provavelmente a principal pode ser a precipitao de partculas de hidrxido de
cdmio na superfcie.
Alm de homogeneidade das partculas, para um bom rendimento da coluna
redutora necessrio um controle da vazo ou tempo de escoamento.
61
Quando a coluna utilizada em vrias redues sucessivas e assumindo que o

sistema deve ser lavado com duas vezes seu volume livre entre as amostras, o tempo
t em minutos, requerido por cada amostra, obtido pela equao:
t = (1/ F) x (Vs/Vb + 2Vf/Vb)
Onde
F= velocidade de fluxo em volume-leito/min.
Vs=volume da amostra
Vb=volume do leito
Vf=volume livre da coluna
Bajic e Jaselkis (87) empregaram uma coluna redutora de zinco amalgamado
(redutor de Jones) para determinar nitratos e nitritos em guas. O mtodo baseia-se
na formao de hidroxilamina, resultante da reduo inicial do nitrato ou nitrito, a
qual reage com o Fe3+ e ferrozina [sal disdico do cido 3-(2-piridil)5,6-difenil1,2,4-triazinap,p-disulfnico, trihidratado] para formar o complexo fortemente
colorido Fe2+ -ferrozina cuja intensidade proporcional quantidade de nitrato ou
nitrito.
A absortividade molar aparente do complexo 4,21 x104 L.mol-1.cm-1. No
intervalo de pH 3,2-3,5 tanto nitrato como nitrito so reduzidos primariamente a
hidroxilamina e em alguma extenso amnia. A hidroxilamina, nesta determinao,
oxidada pelo Fe3+ a xido nitroso enquanto que a amnia no oxidada. Em pH
elevado a reduo do nitrato incompleta, em pH baixo a formao de amnia
favorecida; por esta razo o pH tem que ser mantido no intervalo citado.
Para a determinao do nitrato adicionado azida sdica amostra para
eliminao do nitrito e este obtido por diferena.
62
Lambert e Zitomer (88) tambm utilizaram o zinco para a reduo do nitrato.

A reao efetuada em soluo amoniacal de pH 10,8 em presena de hidrxido
manganoso.
De acordo com esses autores, menos de 70% de recuperao obtida quando
a reao efetuada na ausncia de hidrxido manganoso. Provavelmente, a poro
no recuperada posteriormente reduzida estados de oxidao mais baixos do
nitrognio e possivelmente amnia.
A funo do hidrxido manganoso pode ser a de formar um complexo de
nitrito que estvel a posterior reduo nesta temperatura. A reduo a temperaturas
maiores, evidentemente, vai alm do estgio nitrito.
Para a determinao colorimtrica emprega-se a reao de diazoconjugao
com o on (4-aminofenil) trimetil amnio como diazotante e N, N-dimetil-1naftilamina como copulante. A absortividade molar do corante formado 26,2 x103.
As reaes so as seguintes:
NO3- + Zn + 4NH3 + H2O
HNO2 + H+ + (CH3 )3 N+
NH2
NO2- + Zn (NH3)42+ + 2 OH-
+
N
(CH3 )3 N+
N + 2H2 O
N (CH 3 )2
(CH3 )3 N+
+
N
(CH3 )3 N+
N (CH 3)2 + H 2O
63
A injeo de um lquido redutor na amostra pode parecer intuitivamente ser

prefervel ao contato da amostra com um slido redutor, cuja atividade poderia
mudar com o tempo e com a composio da amostra.
Um promissor lquido redutor encontrado foi a soluo de hidrazina. Mullin e Riley
(89) mostraram que a hidrazina em soluo alcalina produzia um bom rendimento de
nitrito a partir do nitrato.

Quando este reagente foi aplicado na determinao de nitrato em gua
destilada, verificou-se que o rendimento de nitrito variava de dia para dia. Esta
conduta irregular foi investigada e verificou-se a presena de quantidades variveis
de ons cobre na gua destilada utilizada.
O efeito do cobre na reduo foi investigado realizando a reao na presena
de quantidades conhecidas de ons cobre.
Os resultados indicaram que na ausncia de cobre no ocorria a produo de nitrito.
A presena de somente 0,025 mg. L-1 de cobre era suficiente para iniciar a reao.
Com concentraes de cobre superiores a 0,5 mg.L-1 ocorria visvel precipitao de
xido cuproso.
Kamphake et al. (90) tambm verificaram experimentalmente que o on cobre
necessrio para a reao de reduo.
A reduo baseada na converso do nitrato a nitrito pelo sulfato de
hidrazina, na presena de Cu2+, sob condies alcalinas e a temperaturas elevadas.
As reaes provveis do item 3.3.2. II, so:
N2H4.H2SO4 + 6OH4Cu+2 + 4e-
N2 + SO4-2 + 6H2O + 4e4Cu+
64
N2H4.H2SO4 + 6OH- + 4Cu+2
4Cu+
N2 + SO4-2 + 6H2O + 4Cu+
4Cu+2 + 4e-
2NO3- + 2H2O + 4e-
2NO2- + 4OH-
2NO3- + 2H2O + 4Cu+
2NO2- + 4OH- + 4Cu+2
Uma vez que a reduo deve ser efetuada em meio alcalino, torna-se obvio
que essencial controlar o pH, j que o on H+ liberado do sulfato de hidrazina
durante a reao pode diminuir o pH para abaixo de 7, nessas condies o nitrito
rapidamente destrudo pela hidrazina (90).
O primeiro uso da hidrazina para reduo do nitrato foi o relatado por Mullin
e Riley (89). Aps este, vrios outros autores, entre eles Kamphake et al (90),
desenvolveram e automatizaram o mtodo manual original para diminuir a
inconfiabilidade da reao devido s variaes de rendimento acima citadas.
Os fatores responsveis por essas variaes tais como concentrao dos
reagentes, o pH, tempo de reduo e temperatura, que influenciam fortemente a taxa
de converso, foram examinados por vrios pesquisadores tendo sido encontradas
grandes variaes entre eles.
Segundo Cerd et al. (73, 74) os resultados na determinao de ons nitrato
com hidrazina e Cu
++
foram bons para amostras de guas. Porm, no foram
reprodutveis em nosso laboratrio.
65
3.3.3 As interferncias
3.3.3.1 Nas reaes colorimtricas
As reaes colorimtricas so comuns a ambos os mtodos. Norwitz e

Keliher (91) realizaram um estudo com 82 possveis interferentes na determinao
espectrofotomtrica utilizando 3 pares de reagentes: sulfanilamida/NED, cido
sulfanlico/NED e 4-nitroanilina/NED. Evidentemente, o de maior interesse o
primeiro par por ter sido o empregado neste trabalho.
Os autores classificaram as substncias inorgnicas segundo o limite de
tolerncia (limite alm do qual a substncia produzia um erro maior que 0,015
unidades de absorbncia) em 5 tipos de interferncias:
Interferncia devido ao efeito salino:
A razo para o efeito dos sais vem ser as diferentes dependncias das
velocidades de diazotao e copulao com a fora inica.
Interferncia pela mudana da acidez da soluo (hidrlise) ou pela sua ao

tamponante:
A interferncia calculada na base do sal total ao invs do nion.
Interferncia pela precipitao:
Prata e mercrio (I), interferem pela precipitao como cloretos. A fonte de

cloreto o cido clordrico do reagente sulfanilamida que dissovido neste
cido. O bismuto (III) tambm precipita como oxicloreto.
66
Interferncia de ons coloridos
Cromo (III), nquel e especialmente cobalto interferem em razo da cor de seus

ons. Este efeito pode ser eliminado pela adio destes ons ao branco, na mesma
quantidade que contem a amostra, o que pode ser problemtico.
Interferncia de substancias oxidantes e redutoras.

Embora este efeito seja complexo, certamente deve envolver a oxidao ou
reduo do nitrito.
Todavia a oxidao ou a reduo do nitrito usualmente no ocorre em soluo

neutra; requer a presena de cido ou base. possvel que no ocorra em grande
extenso at que os reagentes sulfanilamida e NED sejam adicionados.
Norwitz e Keliher (92) realizaram tambm o mesmo estudo com interferentes
orgnicos, agrupados em aminas alifticas, aminas aromticas, compostos fenlicos e
miscelnea de compostos orgnicos.
Destes ltimos, o que mais tem merecido ateno o cido ascrbico, em
razo de ser comumente empregado em sais de cura com a inteno de reduzir a
quantidade de nitrito necessrio para a cura e diminuir a probabilidade de formao
de nitrosaminas carcinognicas (93).
Norwitz e Keliher (93) publicaram um trabalho especialmente dedicado a
interferncia do cido ascrbico na determinao do nitrito.
Citando outros autores que investigaram a reao do cido ascrbico e o
nitrito no intervalo de pH 0,1-5, eles estabeleceram que dentro desta faixa de pH,
ocorre a reao:
67
HO
O
HO
2 HNO2
HC
HC
HOCH
HOCH
CH2OH
cido L-ascrbico
CH2OH
cido L-dehidroascrbico
A pH 0,1, a etapa determinante da velocidade envolve o cido ascrbico no

dissociado e o on H2NO2+ (HNO2 + H+
H2NO2+)
A pH 2 a etapa determinante a reao de uma concentrao de equilbrio de

trixido de dinitrognio (2HNO2
N2O3 + H2O) com cido ascrbico no
dissociado e o on ascorbato, sendo este ltimo muito mais reativo.

No intervalo de pH 35, a etapa determinante da velocidade de reao a
formao de trixido de dinitrognio e a velocidade independente da concentrao
de cido ascrbico, predominantemente na forma de nion.
Riise e Berg-Nielsen (94) propuseram a adio de enzima ascorbato oxidase
para diminuir a interferncia deste cido na determinao do nitrito.
3.3.3.2 Nas reaes de reduo
A principal interferncia em ambos os mtodos de reduo de ons nitrato o

oxignio do ar. O redutor cdmio reage com o oxignio segundo a reao:
2Cd + O2 + 4H+
2Cd+2 + 2H2O
Alm de o oxignio consumir o cdmio necessrio para a reduo do nitrato,

competindo com ele, ocorre uma interferncia no pH pelo consumo de H+.
68
Kempers e Luft (95) tambm investigaram a possibilidade de interferncia do

oxignio na reduo do nitrato pela hidrazina.
Segundo os autores, em solues aquosas a hidrazina reage com o oxignio
para formar perxido de hidrognio o qual ento reduzido:
N2H4 + 2O2
N2H4 + 2H2O2
2 H2O2 + N2
N2 + 4H2O
A presena de ons metlicos catalisa esta reao (96).
4 - MATERIAIS E MTODOS
63
4.
MATERIAIS E MTODOS
4.1 MTODO COM O USO DA COLUNA DE CDMIO
4.1.1 Reagentes e solues

Utilizar reagentes grau analtico.
Utilizar gua destilada (destilador Marconi MA 078/5) ou desionizada
no preparo das solues a seguir:
Soluo de tetraborato de sdio decahidratado (Na2B4O7.10H2O) (Riedelde Han ou Merck) a 5% m/v.
Soluo de EDTA (C10H14N2Na2O8.2H2O) (Mallinckrodt) a 5% m/v.
Soluo tampo pH 9,6-9,7.
Diluir 20 mL de cido clordrico em 500 mL de gua. Adicionar 50 mL de

hidrxido de amnio, acrescentar gua at prximo de 1000 mL e homogeneizar.
Medir o pH ajustando para 9,6-9,7 com HCl ou NH4OH se necessrio e completar
o volume para 1000,0 mL com gua destilada ou desionizada.
Soluo tampo pH 9,6-9,7 diluda (1+9)
Tomar 100,0 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e diluir para 1000,0 mL.
64
Soluo de sulfanilamida (C6H8N2O2) (Mallinckrodt) a 5% m/v
Dissolver 1,25 g de sulfanilamida em soluo de HCl (1:1) completando para

250,0 mL com esta ltima. A soluo estvel por 1 a 2 meses.
Soluo
de
dicloridrato
de
N-(1-naftil)
etilenodiamina
(NED)
(C12H16Cl2N2) (Merck) a 5% m/v

Dissolver 0,5 g de NED em gua suficiente para 100,0 mL. Armazenar em
frasco mbar sob refrigerao. Desprezar quando apresentar alterao de colorao.
A soluo estvel pelo menos por uma semana.
Soluo padro de nitrito de sdio (NaNO2) (Merck)
Pesar, exatamente, 0,2000 g de nitrito de sdio previamente seco por 1hora a

105C, transferir para balo volumtrico de 1000,0 mL e completar o volume. Esta
soluo estvel pelo menos por 2 semanas se mantida a 4C.
Soluo de trabalho de nitrito de sdio
Transferir 10,0 mL da soluo padro de nitrito de sdio para balo

volumtrico de 250,0 mL e completar o volume; 1,0 mL desta soluo contem 8,0 g
de NaNO2.
Soluo padro de nitrato de sdio (NaNO3) (Merck)
Pesar, exatamente, 0,1000 g de nitrato de sdio previamente seco por 1h a

105C, dissolver em gua, adicionar 50 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e
65
completar para 100,0 mL. Esta soluo estvel pelo menos por 2 semanas se
mantida a 4C.
Soluo de trabalho de nitrato de sdio.
Transferir 1,0 mL da soluo padro de nitrato de sdio para balo volumtrico

de 100,0 mL e completar o volume; 1,0 mL desta soluo contm 10,0 g de NaNO3.
Preparar no momento da anlise.
Soluo de cido clordrico 0,1 M.
Diluir 8,3 mL de cido clordrico d=1,19 a 37% em gua e completar o volume

at 1000,0 mL.
Soluo de cido clordrico 2,0 M
Diluir 166 mL de cido clordrico d=1,19 a 37% em gua e completar o volume

at 1000,0 mL.
Soluo de sulfato de cdmio (3CdSO4.8H2O) a 20% m/v.
Zinco metlico em basto.
4.1.2 Aparelhos e materiais acessrios
Espectrofotmetro UV/VIS Hitachi U2000
pHmetro Micronal B474 com solues tampo para acerto de pH
Balana analtica Mettler AE 200
66
Balana semi-analtica Mettler P-1200
Estufa Fanem 315/2
Coluna de vidro afilada na extremidade inferior (110 x 11 mm)
Funil de separao de 60 mL com haste comprida e rolha de silicone

afilada
Peneira de 20-40 mesh
Liquidificador
Papel de filtro qualitativo 18,5cm de dimetro
Balo volumtrico de 50,0; 100,0; 200,0; 250,0 e 1000,0 mL
Pipeta volumtrica de 1,0; 2,0; 3,0; 5,0; 10,0 e 20,0 mL
Bureta de 10,0 mL
Provetas de 25 e 50 mL
Bquer de 100 e 200 mL
Erlenmeyer de 250 e 500 mL
Funil
Pipeta graduada de 5 mL
4.1.3 Coluna de Cdmio

4.1.3.1 Preparo da Coluna de cdmio
Colocar trs bastes de zinco em um bquer de 250 mL contendo 100 mL

da soluo de sulfato de cdmio.
Remover o depsito esponjoso de cdmio que se forma aps 2 a 3 horas

de imerso, com um basto de vidro ou esptula plstica, transferindo
para outro bquer contendo gua destilada.
67
Transferir o cdmio formado com 200 mL de gua destilada para um

liquidificador e triturar por aproximadamente 5 segundos.
Passar o triturado em peneira de 20 a 40 mesh, tomando o cuidado de

mante-lo sempre em contato com gua.
Transferir o cdmio para um bquer com cido clordrico 2,0 M e deixar

repousar por 2 minutos.
Retirar o cido clordrico e substituir por gua destilada.
Colocar um chumao de l de vidro na extremidade afilada da coluna,

seguido de 1 cm de areia.
Transferir o cdmio com gua at que este atinja a altura de

aproximadamente 6 cm. Completar at o topo com gua.
Adaptar imediatamente o funil de separao de 60 mL coluna atravs da

rolha de silicone, evitando a entrada de ar na coluna e mantendo-a sempre
com gua.
4.1.4 Determinao da capacidade redutora da coluna de cdmio
Misturar em bquer de 100 mL; 20,0 mL da soluo de trabalho de

nitrato de sdio (10 g/mL), 5 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e 2
mL da soluo de EDTA a 5%.
Passar pela coluna de cdmio a uma vazo no superior a 5 mL/minuto
recolhendo diretamente em balo volumtrico de 100,0 mL.

Lavar o bquer com 3 pores consecutivas de 15 mL de gua, passando-
as pela coluna de cdmio.
68
Continuar a passagem de gua pela coluna at completar o volume de
100,0 mL no balo. Homogeneizar.

Pipetar 10,0 mL para um balo volumtrico de 50,0 mL.
Adicionar ao balo 5,0 mL da soluo de sulfanilamida a 0,5% e agitar.
Aps 3 minutos adicionar 3,0 mL da soluo de NED a 0,5% e completar
o volume com gua. Homogeneizar.

Aps 15 minutos fazer a leitura espectrofotomtrica a 542nm contra um
branco dos reagentes, utilizando a curva de calibrao.

Se a recuperao for inferior a 90%, deve-se rejeitar a coluna de cdmio.
Se a recuperao for inferior a 95%, deve-se regenerar a coluna de
cdmio.
4.1.5 Regenerao da coluna de cdmio
Regenerar a coluna de cdmio no incio de cada dia de utilizao e aps at 4

redues.
Adicionar coluna, com vazo aproximada de 10 mL/minuto, pela ordem:
25 mL de HCl 0,1 M
50 mL de gua destilada
25 mL de soluo tampo pH 9,6-9,7 diluda (1+9)
Reavaliar a capacidade redutora da coluna de cdmio como no item anterior

(4.1.4).
69
4.1.6 Curva de calibrao do nitrito
Tomar com bureta, alquotas de 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 6,0 mL da soluo de
trabalho de nitrito de sdio a 8,0 g/mL para bales volumtricos de 50,0 mL.
Adicionar a cada um, 5,0 mL de solues de sulfanilamida a 0,5% e agitar.

Aguardar 3 minutos e adicionar 3,0 mL de soluo de NED a 0,5%, completar o
volume com gua e homogeneizar.
Aps 15 minutos, ler espectrofotometricamente a 542nm contra um branco dos

reagentes.
Construir a curva de calibrao absorbncia x concentrao (g/50,0 mL).

Figura 4.
4.1.7 Determinao do nitrito em amostras de aditivos

Pesar, exatamente, cerca de 0,5 g se for aditivo formulado, dissolver em gua e
completar para 200,0 mL.

Retirar uma alquota de 10,0 mL para balo volumtrico de 50,0 mL.
Adicionar 5,0 mL de soluo de sulfanilamida a 0,5% e deixar reagir por 3
minutos.
Adicionar 3,0 mL de soluo de NED a 0,5%. Completar o volume com gua e
homogeneizar.
Deixar em repouso por 15 minutos e ler no espectrofotmetro a 542nm contra
um branco dos reagentes, utilizando a curva de calibrao. Se a absorbncia

obtida estiver fora do intervalo da curva de calibrao, efetuar as diluies
necessrias.
70
4.1.8 Determinao do nitrato em amostras de aditivos

Retirar uma alquota de 20,0 mL do balo volumtrico de 200,0 mL do item
anterior (4.1.7) para um bquer de 100 mL.

Adicionar 5,0 mL da soluo tampo pH 9,6-9,7 e 2,0 mL de soluo de EDTA
a 5%.
Passar pela coluna de cdmio a uma vazo no superior a 6 mL/minuto
recolhendo diretamente em balo volumtrico de 100,0 mL.

Lavar o bquer com 3 pores consecutivas de 15 mL de gua, passando as
pela coluna de cdmio.

Continuar a passagem de gua pela coluna at completar o volume de 100,0 mL
no balo. Homogeneizar.
Pipetar 10,0 mL para um balo volumtrico de 50,0 mL.
Adicionar ao balo 5,0 mL da soluo de sulfanilamida a 0,5% e agitar.
Aps 3 minutos adicionar 3,0 mL da soluo de NED a 0,5% e completar o
volume com gua. Homogeneizar.

Aps 15 minutos fazer a leitura espectrofotomtrica a 542nm, contra um branco
dos reagentes, utilizando a curva de calibrao. Se a absorbncia obtida

estiver fora do intervalo da curva de calibrao, efetuar as diluies
necessrias.
O resultado refere-se ao teor de nitritos totais e deste deve ser subtrado o teor
de nitrito encontrado no item anterior (4.1.7) para obter-se o teor de nitrato.
71
4.2 MTODO COM SULFATO DE HIDRAZINA
4.2.1 Reagentes e solues
Utilizar reagentes grau analtico.

Utilizar gua destilada ou desionizada no preparo das solues a seguir:
Soluo de hidrxido de sdio NaOH 0,1 M (20 g.L-1)
Soluo de sulfato de hidrazina/sulfato de cobre
Pesar, exatamente, 0,0200 g de sulfato de cobre CuSO4.5H2O em um bquer

de 250 mL adicionando gua destilada ou desionizada suficiente para sua dissoluo.
Pesar em outro bquer de 250 mL, 3,0 g de sulfato de hidrazina N2H4.H2SO4
e adicionar gua destilada ou desionizada suficiente para sua dissoluo.
Juntar as duas solues para um balo volumtrico de 1000,0 mL. Completar
o volume com gua e homogeneizar. Manter em geladeira e utilizar dentro de 30
dias.
Soluo de sulfanilamida/NED
Pesar 10 g de sulfanilamida (C6H8N2O2) em um bquer de 250 mL, adicionar

50 mL de gua e em seguida 62 mL de cido clordrico (HCl) agitando at dissoluo
total. Acrescentar 0,25 g de dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina (NED)
(C12H16Cl2N2) levar para um balo volumtrico de 500,0 mL, completar o volume e
homogeneizar.
Soluo padro de nitrito de sdio (NaNO2) 25 mg.L-1 expresso em

N
72
Pesar, exatamente, 0,1232 g de nitrito de sdio

previamente seco por 1h a 105C, transferir para um
balo volumtrico de 1000,0 mL, completar o volume
com gua e homogeneizar. Manter em geladeira e
utilizar dentro de 30 dias.
Solues de trabalho de nitrito de sdio
Transferir, com pipetador automtico, 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 e 1,1 mL da
soluo padro de nitrito de sdio para bales volumtricos de 25,0 mL,
completar o volume com gua e homogeneizar. Estas solues contm,
respectivamente, 0,10; 0,30; 0,50; 0,70; 0,90 e 1,10 mg.L-1 de nitrito de sdio
expresso em N. Conservar e utilizar como na soluo padro.
Soluo padro de nitrato de sdio (NaNO3) 25,0 mg.L-1 expresso

em N.
Pesar, exatamente, 0,1518 g de nitrato de sdio previamente seco por 1h a

105C, transferir para um balo volumtrico de 1000,0 mL, completar o volume
com gua e homogeneizar. Manter em geladeira e utilizar dentro de 30 dias.
Solues de trabalho de nitrato de sdio
Transferir, com pipetador automtico, 0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 0,9 e 1,1 mL da
soluo padro de nitrato de sdio para bales volumtricos de 25,0 mL,
completar o volume com gua e homogeneizar. Estas solues contm,
73
respectivamente, 0,10; 0,30; 0,50; 0,70; 0,90 e 1,10 mg.L-1 de nitrato de sdio
expresso em N.
4.2.2 Aparelhos e materiais acessrios
Sistema automatizado FIALAB 3500(Alitea USA, Medina,WA) para

anlise por injeo seqencial (SIA)
Espectrofotmetro UV/VIS Micronal modelo B382
Registrador XT Hitachi modelo 56
Balana analtica Mettler AE 200
Balana semi-analtica Mettler P-1200
Estufa Fanem 315/2
Balo volumtrico de 25,0; 500,0 e 1000,0 mL
Pipetador automtico de 1000 e 5000 L com respectivas ponteiras.
Proveta de 100 mL
Bquer de 250 mL
Balo volumtrico de 500,0 e 1000,0 mL.
4.2.3 Programa FIA LAB for windows-nitrito
Para a determinao de nitritos, a amostra analisada na ausncia do agente

redutor e, a concentrao deste analito calculada pela curva de calibrao. O
programa FIA LAB for windows-nitrito consiste em mistura sandwich dos
reagentes e amostra, programada por computador, na seqncia a seguir:
74
Fixar vazo (L.seg-1)
200
Aspirar (L)
2500
Fixar posio da vlvula
200
Aspirar (L)
500
Dispensar (L)
1000
100
Aspirar (L)
100
Aspirar (L)
50
Aspirar (L)
100
100
As posies da vlvula correspondem aos seguintes terminais:

Posio
Terminal
Espectrofotmetro UV/VIS
Sol. Sulfato de hidrazina/sulfato de cobre
gua, ou solues de trabalho de nitrito

ou amostra
75
Sol. de hidrxido de sdio 0,5 M
Sol. de sulfanilamida/NED
Bobina reatora
Descarte
Figura 1: Diagrama esquemtico do Sistema de Injeo Sequencial (SIA).
4.2.4 Programa FIA LAB for windows-nitrato
Para a determinao de nitratos, a amostra analisada na presena do agente

redutor e a concentrao deste analito calculada pela curva de calibrao. O
programa FIA LAB for windows-nitrato consiste em uma mistura sandwich dos
reagentes e amostra, programada por computador, na seqncia a seguir:
Fixar vazo(L.seg-1)
200
76
Aspirar (L)
4300
100
Aspirar (L)
400
Dispensar (L)
1000
Aspirar (L)
40
Aspirar (L)
20
Aspirar (L)
40
Aspirar (L)
40
Aspirar (L)
20
Aspirar (L)
40
Aspirar (L)
40
Aspirar (L)
20
Aspirar (L)
40
77
Dispensar (L)
350
Espera (seg.)
60
Aspirar (L)
160
Aspirar (L)
300
Aspirar (L)
160
Dispensar (L)
2500
250
As posies das vlvulas correspondem aos mesmos terminais do programa

FIA LAB for windows-nitrito.
4.2.5 Curva de calibrao do N-nitrito (N-NO2-)
Esta curva de calibrao realizada dentro do programa FIA LAB for

windows-nitrito atravs da introduo no aparelho, pela ordem, de gua (branco) e
solues de trabalho de nitrito de sdio nas concentraes de 0,10; 0,30; 0,50; 0,70;
0,90 e 1,10 mg.L-1. As injees do branco e dos padres so efetuadas em triplicata e
78
computada a mdia aritmtica delas. , ento, construda a curva de calibrao

absorbncia x concentrao N-NO2-. Esta curva utilizada exclusivamente para a
determinao do teor de N- nitrito (Figura 5 e Anexo 1).
4.2.6 Curva de calibrao do N-nitrato (N-NO3-)
Esta curva de calibrao realizada dentro do programa FIA LAB for

windows-nitrato atravs da introduo no aparelho, pela ordem, de gua (branco) e
solues de trabalho de nitrato de sdio nas concentraes de 0,10; 0,30; 0,50; 0,70;
0,90 e 1,10 mg.L-1. As injees do branco e dos padres so efetuadas em triplicata e
computada a mdia aritmtica delas. , ento, construda a curva de calibrao
absorbncia x concentrao N-NO3-. Esta curva utilizada para a determinao do
teor de N- nitrato e para avaliao da taxa de converso ( Figuras 6 e 7 e Anexo 2).
4.2.7 Avaliao da taxa de converso
A taxa de converso deve ser analisada periodicamente com o propsito de

verificar a eficincia da soluo redutora de sulfato de cobre/sulfato de hidrazina.
realizada dentro do programa FIA LAB for windows-nitrato utilizando-se as
solues de trabalho de nitrito e nitrato de sdio nas concentraes especificadas
anteriormente. Cada soluo de nitrato deve produzir um sinal de mesma intensidade
da soluo de nitrito de mesma concentrao, indicando taxa de converso ideal
de100%. Se esta estiver abaixo de 90% deve-se preparar nova soluo redutora.
79
4.2.8 Determinao do N-nitrito (N-NO2-)
A determinao do nitrito realizada dentro do programa FIA LAB for

windows-nitrito atravs da introduo, no aparelho, da amostra preparada na forma
de soluo aquosa cuja concentrao deve ser convenientemente ajustada para situarse no intervalo da curva de calibrao. So injetadas concomitantemente as solues
de trabalho de nitrito, construda a curva de calibrao e, pelo sinal produzido pela
amostra, calculado o teor de nitrito.
4.2.9 Determinao do N-nitrato (N-NO3-)
A determinao do nitrato realizada dentro do programa FIA LAB for

windows-nitrato, semelhantemente determinao do nitrito. Porm, deve-se
observar que vamos determinar o teor de nitrito total e deste, deve ser subtrado o
teor de nitrito encontrado no item anterior (4.2.8).
4.2.10 Amostras
Para a realizao da parte pratica do presente trabalho foram utilizadas

amostras de guas e aditivos alimentcios (sais de cura) recebidos para anlise no
Instituto Adolfo Lutz.
As amostras foram assim especificadas:
4.2.10.1 guas (AG)
AG1 gua de mina

AG2 gua de poo
AG3 gua de poo
80
AG4 gua de poo

AG5 gua de poo
AG6 gua de abastecimento
AG7 gua de poo
AG11 gua de poo
4.2.10.2 Aditivos (AD - sais de cura) formulaes declaradas pelos
fabricantes
AD1 Sal refinado 90%

Nitrato de sdio 6,0%
Nitrito de sdio 4,0%
AD2 Sal refinado 96,0%



81


AD7 Tripolifosfato de sdio 80,00%

Hexametafosfato de sdio 15,16%
Eritorbato de sdio 0,14%

Tetrapirofosfato de sdio 27,00%
Hexametafosfato de sdio 23,00%
Acar 9,00%
Glucose 6,00%
82
AD9 Acar refinado 59,5%

Pirofosfato tetrasdico 25,0%
Malto-dextrina 10,0%
83
5 - RESULTADOS E DISCUSSO
91
5.
RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 OTIMIZAO DO MTODO
A parte prtica deste trabalho utilizando sulfato de hidrazina como redutor,

foi iniciada com a tcnica de anlise por injeo em fluxo FIA (Flow Injection
Analysis). Porm, os resultados no foram satisfatrios devido ao grande nmero de
bolhas formadas, o que crtico em FIA, e que no foi possvel retir-las nem com
auxlio de dispositivos tangenciais. As bolhas so formadas durante a reao do
sulfato de hidrazina, o qual, atuando como redutor, produz nitrognio.
Passou-se ento a utilizar a tcnica de analise por injeo seqencial SIA
(Sequential Injection Analysis). Nesta tcnica a produo de bolhas durante a etapa
da reduo no foi observada, provavelmente porque o contacto entre a soluo de
hidrazina e os demais reagentes s ocorre no momento da anlise, sendo descartada
logo em seguida, no havendo tempo para formao de bolhas. Na tcnica por FIA,
aps a confluncia, especificamente no reator e no detector as solues ficam em
contacto durante todo o tempo. Segundo Cerd et al.(74) o motivo deve-se ao baixo
volume dos reagentes envolvidos (sulfato de hidrazina e hidrxido de sdio), e
devido sobreposio das zonas dos reagentes ser incompleta.
Na otimizao do mtodo, seguimos inicialmente as condies estabelecidas
por Cerd et al. (74). Porm, observamos que na prtica no obtnhamos as mesmas
taxas de converso de nitrato a nitrito encontradas por esses autores.
Tentou-se ento, alterar algumas das condies estabelecidas a fim de obter
um maior rendimento na converso.
92
A primeira alterao efetuada no programa FIA LAB for windows-nitrato foi

o aumento dos volumes de hidrazina, amostra e hidrxido de sdio, mantendo-se as
mesmas propores iniciais. No obteve-se qualquer aumento nas taxas de
converso.
A segunda alterao foi, alm de manter o aumento dos volumes, empregar a
soluo de sulfato de hidrazina/sulfato de cobre preparada com gua fervida e
desaerada com nitrognio imediatamente antes do uso. O intuito desta modificao
foi o de minimizar o possvel efeito interferente do oxignio dissolvido na gua,
conforme j citado no item 3.3.3.2. Tambm no houve acrscimo na porcentagem
de converso.
A terceira tentativa foi, voltando-se ao programa FIA LAB for windowsnitrato original, aumentar o tempo da reao de reduo na serpentina: as
porcentagens de converso passaram a aumentar.
Os resultados podem ser visualizados na Tabela 3 a seguir:
Tabela 3: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o tempo de
reao, por SIA.
Tempo (s) / % converso
Concentrao
-1
mg.L
40
60
90
120
0,10
93,0
97,6
97,6
95,1
0,30
92,1
100,0
103,3
107,1
0,50
79,8
87,8
94,9
95,9
No de rplicas n = 3
atenuao = 50 mV
O tempo de 40 s foi o utilizado por Cerd et al. (74).
Os resultados expressos em aumento na porcentagem de converso de nitrato

a nitrito, em relao ao tempo inicial de 40 s, podem ser visualizados na Tabela 4 a
seguir:
Tabela 4: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em relao ao
tempo inicial de 40 s (em %).
Concentrao
Tempo (s) /aumento na % converso
93
mg.L-1
0,10
0,30
0,50
No de rplicas n = 3
40
-
60
4,9
8,6
10,0
90
4,9
12,2
18,9
120
2,2
16,3
20,2
Converso NO3 a NO2 (%)
120
0,3
100
0,1
80
0,5
60
40
0
50
100
150
Tempo (s)
Figura 2: Representao grfica do aumento na porcentagem de converso de nitrato

a nitrito segundo a Tabela 4.
Foi observado que o aumento no tempo de reao produzia uma diminuio

na magnitude do sinal, ou seja, uma altura de pico menor. Porm, comparando-se os
desvios padres das alturas mdias de pico, houve at uma diminuio daqueles,
conforme podemos ver na Tabela 5:
Tabela 5: Comparao da altura de pico para avaliao do desempenho do mtodo
por SIA a dois tempos de reao:40 e 60 s.
Tempo (s)
40
60
Concentrao
x D.P.
% converso
x D.P.
% converso
mg.L-1
n=10
n=8
Branco 0,00
3,34 0,08
1,50 0,05
N- NO2- 0,10
4,08 0,15
1,79 0,04
N- NO2- 0,30
6,12 0,15
2,42 0,01
N-NO2- 0,50
8,08 0,10
3,25 0,05
N- NO3 0,10
3,80 0,07
93,1
1,65 0,05
92,2
N- NO3- 0,30
5,65 0,10
92,3
2,39 0,04
98,8
N- NO3 0,50
6,54 0,02
80,9
3,11 0,04
95,7
94
x= mdia das alturas de pico (cm)

D.P.= desvio padro
n= n de replicatas
atenuao= 50 mV
A diminuio do desvio padro pode ser atribuda ao aumento do tempo de
reao causar uma homogeneizao maior da amostra.
A diminuio da magnitude do sinal pode ser atribuda ao tempo maior de reao
causar maior disperso da amostra.
Esse aumento no tempo de reao com o conseqente aumento na
porcentagem de converso no acarretou nenhum prejuzo ao mtodo.
Foi tambm estudado o aumento da porcentagem de converso com o tempo
de reao para concentraes maiores. Os resultados esto na Tabela 6, a seguir:
reao, por SIA.
Concentrao
Tempo(s)/% converso
N-NO3mg.L-1
40
60
90
120
1,00
81,5
88,0
91,3
95,2
3,00
77,4
81,4
87,5
92,4
5,00
70,3
77,3
81,4
91,4
n= 3
atenuao: 200 mV
Os resultados expressos em aumento na porcentagem de converso de nitrato

a nitrito em relao ao tempo inicial de 40 s podem ser visualizados na Tabela 7 a
seguir:
Tabela 7: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em relao ao

tempo inicial de 40 s (em %).
Concentrao
Tempo(s)/aumento na % converso
N-NO3mg.L-1
40
60
90
120
95
1,00
3,00
5,00
8,0
5,2
10,0
12,0
13,0
15,8
16,8
19,4
30,0
n= 3
Converso NO3-NO2 (%)
100
1,0
3,0
5,0
80
60
40
0
50
100
150
Tempo (s)
Figura 3: Representao grfica do aumento na porcentagem de converso de nitrato

a nitrito segundo a Tabela 7.
Tentou-se, tambm, aumentar mais um pouco o tempo de reduo para

verificar se haveria ainda acrscimo na porcentagem de converso. Os resultados
esto na Tabela 8:
Tabela 8: Acrscimo da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o tempo
de reao, por SIA.
Tempo (s) / % converso
Concentrao N-NO3-1
mg.L
120
150
0,10
102,9
96,8
0,30
95,4
100,0
0,50
102,0
102,4
n=3
atenuao: 50 mV
96
Verificou-se que, estendendo o tempo de reduo, os acrscimos nas

porcentagens de converso j no so to vantajosos, uma vez que j estavam
prximos de 100%, contribuindo apenas para tornar a anlise mais demorada.
Comparando-se os resultados das tabelas anteriores, observou-se que para
mesmas condies de tempo de reduo, atenuao do registrador, solues de
mesma concentrao de N-NO3- produziam porcentagens de converso diferentes.
Essas oscilaes na porcentagem de converso foram atribudas a oscilaes na
temperatura do banho termosttico que variou de 37,5o a 41,5o C aproximadamente.
5.2 INFLUNCIA DA TEMPERATURA NA PORCENTAGEM DE

CONVERSO
Para minimizar as oscilaes na porcentagem de converso devido variao

na temperatura, substituiu-se ento, o banho termosttico anterior, por um banho
termosttico com homogeneizao por barra magntica agitadora, obtendo-se um
controle mais rgido do intervalo de temperatura entre 39,5o e 40,5o C
aproximadamente. As porcentagens de converso encontradas esto na Tabela 9 a
seguir:
reao entre 39,5o e 40,5o C, por SIA.
Tempo (s) / % de converso
Concentrao N-NO3mg.L-1
40
60
0,10
100,0
100,0
0,50
98,6
101,6
0,90
98,9
102,4
n=3
atenuao: 50 mV
97
Esses resultados no esto totalmente de acordo com Cerd et al. (74) cujos
dados mostram que a porcentagem de converso mantinha-se constante entre 35o e
45o C, tendo eles selecionado a temperatura de 40o C.
Os dados aqui encontrados mostram que:
1- deve haver um controle mais rgido da temperatura, o mais prximo de 40o C.
2- o tempo de reao de 60 s foi o escolhido por apresentar maior porcentagem
de converso.
5.3 ESTABILIDADE DA SOLUO REDUTORA
Foi testada tambm a estabilidade da soluo redutora de sulfato de hidrazina/

sulfato de cobre. A estabilidade foi avaliada atravs da porcentagem de converso de
NO3- a NO2- de solues padro de N-NO3- de vrias concentraes. A soluo
redutora foi testada aps 4 dias, 1 ms e aps aproximadamente 5 meses de
preparao. Os resultados esto na Tabela 10.
Tabela 10: Avaliao da estabilidade da soluo redutora de sulfato de hidrazina/
sulfato de cobre com o tempo, por SIA.
% Converso
Concentrao N-1
NO3 mg.L
4 dias
1 ms
~ 5 meses
0,10
100,0
98,3
74,6
0,50
98,6
84,3
63,0
1,00
98,9
77,9
66,0
n=3
tempo de reduo: 40 s
atenuao: 50 mV
Verifica-se que aps 1 ms e 5 meses a soluo de sulfato de
hidrazina/sulfato de cobre perde significativamente seu poder redutor,
sendo por isso recomendado no item 4.2.1 seu uso at 1 ms aps o
preparo.
98
5.4 DETERMINAO DA CAPACIDADE REDUTORA DA COLUNA DE

CDMIO
Foram utilizadas duas colunas de cdmio, uma para cada replicata. A

regenerao da coluna de cdmio (4.1.5) era realizada todos os dias, antes de cada
avaliao da capacidade redutora (4.1.4) e esta, realizada imediatamente antes da
anlise das amostras.
Os resultados da avaliao da capacidade redutora das colunas de cdmio esto
apresentados na Tabela 11.
Tabela 11: Avaliao da capacidade redutora das colunas de cdmio.
Coluna
Concentrao
de nitrato
adicionado
mg.L-1
N de
rplicas
Mdia
recuperao
(%)
Desvio
padro
0,40
20
101,5
2,8
0,40
20
101,9
1,8
Valor
mnimo
Valor
mximo
(%)
96,6
109,0
98,2
104,4
Coeficiente
de variao
%
2,7
1,7
As duas colunas de cdmio, avaliadas numa concentrao de nitrato situada

no ponto mdio da curva de calibrao, apresentaram capacidades redutoras muito
prximas e satisfatrias, garantindo confiabilidade dos resultados entre as replicatas.
99
5.5 DETERMINAO DA TAXA DE CONVERSO DE NITRATO A

NITRITO COM SULFATO DE HIDRAZINA/ SULFATO DE COBRE
A taxa de converso foi avaliada dentro do programa FIA LAB for windowsnitrato (4.2.7) com as solues de trabalho de nitrato e nitrito de sdio no intervalo
de concentraes da curva de calibrao, apresentando os resultados na Tabela 12 a
seguir:
Tabela 12: Avaliao da taxa de converso de nitrato a nitrito com sulfato de
hidrazina/ sulfato de cobre por SIA.
Concentrao
de nitrato
adicionado
mg.L-1
0,10
0,30
0,50
0,70
0,90
1,10
No de
rplicas
Mdia
(%)
8
8
8
8
8
8
92,3
98,7
95,8
100,3
101,1
100,2
Valor
Valor
mnimo mximo
(%)
(%)
88,9
85,2
93,9
97,5
98,0
98,3
94,4
104,4
97,0
102,6
104,2
103,5
Desvio
padro
Coeficiente
de variao
(%)
2,8
5,7
1,5
2,1
1,9
1,4
3,0
5,8
1,6
2,1
1,9
1,4
100
Este experimento equivalente a avaliao da capacidade redutora

da coluna de cdmio (item 5.4), porm aplicado soluo redutora de
sulfato de hidrazina/sulfato de cobre, para as devidas comparaes. A
diferena entre os experimentos que aqui foi efetuado menor nmero de
rplicas, porm extensivas a todos os pontos da curva de calibrao,
portanto mais representativo. Os resultados tambm apontam para uma boa
porcentagem de converso, com desvios padres de mesma magnitude do
mtodo anterior, concluindo-se que os dois redutores so equivalentes,
sendo que a soluo redutora de sulfato de hidrazina/sulfato de cobre
apresenta menor toxicidade ao meio ambiente.
5.6 CURVAS DE CALIBRAO
5.6.1 Curva de calibrao do nitrito de sdio Mtodo com a coluna de

cdmio
Foram realizadas 12 curvas de calibrao, conforme o item 4.1.6, durante o

perodo do trabalho e os resultados submetidos anlise estatstica.
A curva de calibrao mdia final foi realizada atravs da regresso linear e
analisados de forma estatstica para checagem se o modelo era adequado (Tabela 13).
Conforme sugerido pela ANOVA Fobs muito significativo em relao ao Fcrit no
nvel de 5% de significncia que tambm pode ser observado pelos valores
R2exp(99,9%) e R2ajus(99,9%), que a absorbncia lida depende do nvel de
concentrao de nitrito (mg.L-1).
Toda anlise estatstica foi realizada utilizando-se o pacote estatstico
101
MINITAB for windows,[ Minitab- Inc, USA.] Verso. 13.31.2000. CD-ROM.
Tabela 13: Anlise de Varincia para modelo de regresso da concentrao de nitrito

total e absorbncia lida.
Soma
Mdia
Graus de
Fonte de Variao
Fobs
p
Liberdade
Quadrtica
Quadrtica
Regresso
Resduo
Total
1
82
83
4,5737
0,0028
4,5765
4,5737
0,0000
131657,83
0,000
Fcrit(1; 82; 0,05)= 4,00
O modelo gerado pela curva de calibrao parte da origem conforme os

resultados expressos pelos valores t, conforme equao a seguir:
y = 0,005 + 0,738 x
( 0,001) ( 0,002)
Tabela 14: Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres utilizados na
curva de calibrao da Figura 4.
NO-2 mg.L-1
Abs.
Desv.Padr.
0,08
0,063
0,003
0,16
0,124
0,003
0,32
0,244
0,005
0,48
0,364
0,005
0,64
0,483
0,004
0,96
0,706
0,004
102
0.7
0.6
Abs
0.5
0.4
0.3
0.2
Regressao
0.1
95% IC
95% IP
0.0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
Conc. de Nitrito (mg/L)
Figura 4: Curva de calibrao da concentrao de nitrito em mg.L-1 e absorbncia

com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio (IP).
5.6.2 Curvas de calibrao mtodo com sulfato de hidrazina/sulfato

de cobre (SIA)
5.6.2.1 Curva de calibrao do N-NO2- em condies no redutoras
Foi realizada uma curva de calibrao, conforme o tem 4.2.5, no programa

FIA LAB for windows-nitrito com 6 pontos (0,10; 0,30; 0,50; 0,70; 0,90 e 1,10
mg.L-1), com 10 replicatas de cada ponto e os resultados submetidos anlise
estatstica.
Tabela 15: Anlise de Varincia para modelo de regresso da concentrao de

nitrognio /nitrito (mg.L-1) e absorbncia lida.
Fonte de Variao
Graus de
Fobs
Soma
Mdia
Liberdade
Quadrtica
Quadrtica
103
Regresso
Resduo
Total
1
68
69
0,82779
0,00623
0,83402
0,82779
0,00009
9034,28
0,000
Fcrit(1; 68; 0,05)= 4,00

resultados expressos pelos valores t, conforme equao.
y = 0,0125 + 0,287 x
( 0,002) ( 0,003)
Conforme descrito em 4.2.5 esta curva utilizada para a determinao do teor de NNO2-.
Tabela 16:Concentraes, respectivas absorbncias e desvios padres utilizados na

N-NO-2 mg.L-1 Abs.
Desv.Padr.
0,00
0,028 0,001
0,10
0,038 0,000
0,30
0,088 0,001
0,50
0,148 0,004
0,70
0,208 0,002
0,90
0,267 0,004
1,10
0,339 0,002
0.3
ABS
0.2
0.1
Regression
95% IC
95% IP
0.0
0.0
0.5
1.0
conc. nitrognio/nitrito (mg/L)
Figura 5: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio /nitrito em mg.L-1 e

absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e predio (IP).
104
Foi realizada uma curva de calibrao, com solues de trabalho de NNO2-, semelhante a 5.6.2.1 no programa FIA LAB for windows-nitrato e os
resultados submetidos anlise estatstica.
nitrognio /nitrito (mg.L-1) e absorbncia lida.
Fobs
Fonte de Variao
Graus de
Soma
Mdia
Liberdade
Quadrtica
Quadrtica
Regresso
Resduo
Total
1
54
55
0,04913
0,000396
0,049530
0,049133
0,000007
6694,99
0,000
Fcrit(1; 54; 0,05)= 4,00

y = 0,0255 + 0,0780 x
( 0,0006) ( 0,0009)
Conforme descrito em 4.2.6 esta curva utilizada para avaliao da taxa de
converso de nitrato a nitrito.
N-NO-2 mg.L-1 Abs.
Desv.Padr.
0,00
0,028
0,001
0,10
0,034
0,001
0,30
0,046
0,002
0,50
0,063
0,001
0,70
0,078
0,001
0,90
0,094
0,002
1,10
0,115
0,001
105
0.12
0.11
0.10
0.09
Abs.
0.08
0.07
0.06
0.05
0.04
Regression
0.03
95% IC
0.02
95% IP
0.0
0.5
1.0
Conc. Nitrognio/Nitrito (mg/L)
Figura 6: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio /nitrito em mg.L-1 e

Foi realizada uma curva de calibrao semelhante a 5.6.2.1, no programa FIA

LAB for windows-nitrato e aos resultados submetidos a anlise estatstica.
nitrognio /nitrato (mg.L-1) e absorbncia lida.
Fobs
Fonte de Variao
Graus de
Soma
Mdia
p
Liberdade
Quadrtica
Quadrtica
Regresso
Resduo
Total
1
54
55
0,051313
0,000468
0,051781
0,051313
0,000009
5920,22
0,000
Fcrit(1; 54; 0,05)= 4,00

y = 0,0238+0,0798 x
( 0,0006) ( 0,0010)
Conforme descrito em 4.2.6, esta curva utilizada para a determinao do
teor de N-NO3- e para avaliao da taxa de converso.

N-NO-3
-1
mg.L
Abs.
Desv.Padr.
106
0,00
0,10
0,30
0,50
0,70
0,90
1,10
0,028
0,031
0,046
0,060
0,078
0,095
0,115
0,000
0,001
0,001
0,001
0,001
0,002
0,002
Abs.
0.12
0.07
Regression
95% IC
0.02
95% IP
0.0
0.5
1.0
Conc. Nitrognio/Nitrato (mg/L)
Figura 7: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/ nitrato em

mg.L-1 e absorbncia com seus respectivos intervalos de confiana (IC) e
predio(IP).
5.7 LINEARIDADE, LIMITE DE DETECO E LIMITE DE

QUANTIFICAO
5.7.1 Linearidade
Foi realizada uma curva de calibrao de N-NO3- no programa FIA LAB for
windows-nitrato com 7 pontos (0,50; 1,00; 1,50; 2,00; 2,50; 3,00; 3,50 mg.L 1) com
10 replicatas de cada ponto e os resultados submetidos a anlise estatstica. Esta
107
curva foi um prolongamento daquela anterior (5.6.2.3) para verificar at que ponto
era linear.

N-NO-3 mg.L-1
Abs.
Desv.Padr.
0,00
0,040
0,002
0,50
0,070
0,002
1,00
0,101
0,002
1,50
0,132
0,004
2,00
0,165
0,002
2,50
0,195
0,003
3,00
0,226
0,003
3,50
0,258
0,004
y = 0,0390 + 0,0625 x
Figura 8: Curva de calibrao da concentrao de nitrognio/nitrato em mg.L-1 e

No foi adotado o mesmo procedimento para o N-NO2- porque os sinais

obtidos por este ltimo (altura dos picos) foram muito grandes e teria que alterar a
108
atenuao do registrador. Um outro motivo foi que o on mais importante no presente

trabalho o nitrato e no o nitrito.
5.7.2 Limite de Deteco (LD) e Limite de Quantificao (LQ)
Para o clculo destes limites, foram analisadas 10 rplicas do branco (gua

destilada), calculada a mdia e o desvio padro. O limite de deteco foi calculado
como o sinal do branco mais 3 vezes o desvio padro e o limite de quantificao o
sinal do branco mais 10 vezes o desvio padro, segundo orientao do
INMETRO(DOQ-CGCRE-008 Reviso:01-maro/2003). Os resultados encontramse na Tabela 22.
Tabela 22: Limites de deteco e quantificao calculados para o mtodo com
sulfato de hidrazina/ sulfato de cobre (SIA).
Analito
LD (mg.L-1)
LQ (mg.L-1)
N-NO20,06
0,08
N-NO3
0,08
0,25
Os limites de deteco obtidos esto prximos aos encontrados por Cerd et

al.(74), que so:
N-NO2-
0,07 mg.L-1
N-NO3-
0,20 mg.L-1
Para comparao, acrescentamos aqui os resultados obtidos para o mtodo

com a coluna de cdmio, na Tabela 23.
Tabela 23: Limites de deteco e quantificao calculados para o mtodo com a
coluna de cdmio.
Analito
LD (mg.L-1)
LQ (mg.L-1)
109
N-NO2N-NO3-
0,004
0,004
0,015
0,012
5.8 DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM GUAS
As amostras de gua foram analisadas em duplicata por ambos os mtodos e

os resultados encontram-se na Tabela 24.
Tabela 24: Teores de N-NO2- total nas amostras de guas (AG) obtidos pelos 2
mtodos: coluna de cdmio e sulfato de hidrazina(SIA).
Coluna de Cdmio
Sulfato de hidrazina
Desvio N-NO2- total Desvio
N-NO2 total
o
N da amostra
Mdia
Mdia
Padro
Padro
-1
-1
-1
mg.L
mg.L
mg.L
mg.L-1
AG1
16,40
0,28
18,66
0,87
AG2
30,80
0,19
32,78
0,00
AG3
20,58
0,00
21,34
0,29
AG4
2,65
0,08
2,69
0,14
AG5
4,02
0,13
3,12
0,07
AG6
1,38
0,00
1,48
0,03
AG7
4,36
0,08
4,23
0,00
AG8
1,32
0,00
1,23
0,03
AG9
1,48
0,07
1,41
0,00
AG10
2,44
0,06
2,61
0,00
AG11
8,32
0,03
9,08
0,00
n=2
As amostras AG1,AG2 e AG3, analisadas por ambos os mtodos,
apresentaram teores de N-NO2- total acima do permitido pela legislao brasileira

(Tabela 1). As amostras sofreram diluies convenientes a fim de permitir leitura
espectrofotomtrica dentro do intervalo da curva de calibrao.
-1
N-NO2 total (mg.L ) - Hdz
110
y = 0,9249x + 0,2372
R2 = 0,997
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
-1
N-NO2 total (mg.L ) - Cd
Figura 9: Representao grfica da correlao entre os resultados de N/nitrito total

obtidos dos mtodos com a coluna de cdmio e com sulfato de hidrazina para
amostras de guas.
Os resultados mdios das anlises de nitritos e nitratos em guas foram

tratados estatisticamente pela anlise de varincia e a comparao de mdias foi feita
pelo teste-t, utilizando o programa estatstico GraphPad Instat Software TM
V.02.01,1990-1993. O nvel de significncia foi fixado em 5 %, sendo tobs= 0,1018
(p=0,9199), no havendo diferenas estatsticas significativas entre os dois mtodos.
Quanto aos resultados do N-NO2- todas as amostras de gua analisadas
apresentaram resultados de N-NO2- abaixo do limite de quantificao de ambos os
mtodos. Portanto, o teor de N-NO2- total aqui encontrado corresponde tambm ao
teor de N-NO3-.
5.9 DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM ADITIVOS
As amostras de aditivos foram analisadas em duplicata por ambos os mtodos

e os resultados de N-NO2- total, N-NO2- e N-NO3- encontram-se nas Tabelas 25, 26 e
27, respectivamente.
111
Tabela 25: Teores de N-NO2- total nas amostras de aditivos (AD) obtidos pelos 2
mtodos: coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA).
Coluna de Cdmio
Sulfato de Hidrazina
N-NO
total
Desvio
Padro
N-NO
Desvio Padro
2
2 total
No da amostra
-1
Mdia
mg.Kg
Mdia
mg.Kg-1
mg.Kg -1
mg.Kg-1
AD1
15,90
1,26
18,63
0,36
AD2
6,84
0,00
6,94
0,11
AD3
2,81
0,09
3,00
0,18
AD4
7,52
0,14
7,55
0,70
AD5
31,27
0,61
31,13
1,20
AD6
15,37
0,20
16,63
0,70
AD7
10,95
1,21
9,29
0,35
AD8
3,70
0,15
4,60
0,08
AD9
5,59
0,17
4,46
0,08
n=2
As amostras sofreram diluies convenientes a fim de permitir leitura

espectrofotomtrica dentro do intervalo da curva de calibrao.
y = 0,9637x + 0,1683
R2 = 0,9806
-1
N-NO2 total (mg.L ) - Hdz
35
30
25
20
15
10
5
0
0
10
20
30
40
-1
N-NO2 total (mg.L ) - Cd
Figura 10: Representao grfica da correlao entre os resultados de N/nitrito total

amostras de aditivos.
Os resultados mdios das anlises de nitritos e nitratos em aditivos foram

tratados estatsticamente pela anlise de varincia e a comparao de mdias foi feita
pelo teste-t, utilizando o programa estatstico GraphPad Instat Software TM
112

Coluna de Cdmio
N-NO2
Desvio Padro
N-NO2Desvio Padro
No da amostra
Mdia
mg.Kg-1
Mdia
mg.Kg-1
-1
-1
mg.Kg
mg.Kg
AD1
7,36
0,01
6,22
0,20
AD2
1,72
0,20
1,20
0,00
AD3
0,84
0,07
0,44
0,00
AD4
4,89
0,02
3,23
0,10
AD5
27,84
5,47
19,38
0,01
AD6
0,01
0,00
1,23
0,20
AD7
0,11
0,00
0,68
0,20
AD8
1,62
0,02
1,82
0,03
AD9
4,37
0,03
2,24
0,20
n=2
As amostras sofreram diluies convenientes a fim de permitir
leitura espectrofotomtrica dentro do intervalo da curva de calibrao.
113
y = 1,4452x - 0,4177
R2 = 0,988
N-NO2 (mg.L-1) - Hdz
30
25
20
15
10
5
0
0
10
15
20
25
-1
N-NO2 (mg.L ) - Cd
Figura 11: Representao grfica da correlao entre os resultados de N/nitrito

amostras de aditivos.
Os resultados mdios das anlises de nitritos em aditivos foram tratados

estatisticamente pela anlise de varincia e a comparao de mdias foi feita pelo
teste-t, utilizando o programa estatstico GraphPad Instat Software TM
Os teores de N-NO3- indicados na Tabela 27 foram obtidos pela subtrao dos
valores da Tabela 25 e da Tabela 26, sabendo-se que os desvios padres so
somados.
Coluna de Cdmio
N-NO3
Desvio Padro
N-NO3Desvio Padro
No da amostra
Mdia
mg.Kg-1
Mdia
mg.Kg-1
-1
-1
mg.Kg
mg.Kg
AD1
8,54
1,27
12,41
0,56
AD2
5,12
0,20
5,74
0,11
AD3
1,97
0,16
2,56
0,18
AD4
2,63
0,16
4,32
0,80
AD5
3,43
6,08
11,75
1,21
114
AD6
AD7
AD8
AD9
15,36
10,84
2,08
1,22
0,20
1,21
0,17
0,20
15,40
8,61
2,78
2,22
0,90
0,55
0,11
0,28
n=2
5.10 ESTUDO DE RECUPERAO
Foram escolhidas uma amostra de gua (AG 11) e uma amostra de aditivo (AD
3) para o teste de recuperao. Ambas as amostras foram analisadas pelos 2 mtodos
com adio de padres de N-NO3- nas concentraes de 0,04; 0,16 e 0,30 mg.L-1 para
a amostra de gua e nas concentraes de 0,15; 0,35 e 0,55 mg.L-1 para a amostra de
aditivo.
As amostras foram analisadas em 7 replicatas de cada concentrao, e tambm
sem adio de padro. Os resultados, calculados pelo mtodo da regresso linear,
esto apresentados na Tabela 28, a seguir:
Tabela 28: Resultados dos estudos de recuperao.
Amostra
Coluna de cdmio
Sulfato de hidrazina
(% recuperao)
(% recuperao)
AG 11
107,3
96,9
AD 3
98,2
100,4
115
6- CONCLUSES
116
6.
CONCLUSES
Os resultados at aqui obtidos permitem-nos concluir:
As amostras analisadas por ambos os mtodos apresentaram resultados

compatveis, aps avaliao estatstica.
Os estudos de recuperao mostraram que o mtodo em estudo apresenta

recuperao equivalente ao mtodo oficial (prxima de 100%).
O mtodo em estudo apresentou um tempo de anlise menor que o

mtodo oficial, viabilizando maior nmero de anlises no mesmo
perodo.
O mtodo em estudo apresentou menor consumo de reagentes.
117
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
118
7.
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131
8 - ANEXOS
132
Anexo 1:
Siagrama da curva de calibrao do N-NO2- no programa FIALAB for
windows nitrito.
Anexo 1
Siagrama da curva de calibrao do N-NO2- no programa FIALAB for windows nitrito. 133
.
134
Anexo 2:
Parte 1: Siagrama da curva de calibrao do N-NO2- no programa
FIALAB for windows nitrato.
Parte 2: Siagrama da curva de calibrao do N-NO3- no programa
FIALAB for windows nitrato.
135
136
137
Anexo 3:
Fotos ilustrativas da aparelhagem de anlise por injeo seqencial
(SIA).
138
Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial (SIA),

destacando o aparelho, o espectrofotmetro, o registrador e acima o
computador.
Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial (SIA),

destacando o pisto, a seringa e a vlvula rotatria seletora.
139
Foto ilustrativa do computador destacando na tela do monitor o

programa FIALAB for windows.

1350-Tese CCD Dias Nelson Aranha 2005

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Nelson Aranha Dias

ESTUDO SISTEMTICO DA REDUO DE NITRATO POR

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em

rea de concentrao: Pesquisas Laboratoriais em Sade

reproduo autorizada pelo autor

Dias, Nelson Aranha

ASPECTOS TOXICOLGICOS DOS NITRATOS E NITRITOS............. 5

3.2.2. Reao de copulao.................................................................... 19

3.3.2. As reaes de reduo de ons nitrato.......................................... 28

4.1.4. Determinao da capacidade redutora da coluna de cdmio ....... 47

5.7. LINEARIDADE, LIMITE DE DETECO E LIMITE DE QUANTIFICAO 81

5.9. DETERMINAO DE NITRATO E NITRITO EM ADITIVOS...................... 86

(SIA), destacando o aparelho, o espectrofotmetro, o registrador

Foto ilustrativa do aparelho de anlise por injeo seqencial

Tabela 1: Limites mximos permitidos de nitritos e nitratos em alimentos,

Tabela 2: Variao da absortividade a com o pH no intervalo 1,0 4,4.......................................................................................................................

Tabela 3: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o

Tabela 4: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em

Tabela 7: Aumento na porcentagem de converso de nitrato a nitrito em

Tabela 9: Variao da porcentagem de converso de nitrato a nitrito com o

Tabela 10: Avaliao da estabilidade da soluo redutora de sulfato de

Tabela 11: Avaliao da capacidade redutora das colunas de

utilizados na curva de calibrao da Figura

Tabela 15: Anlise de Varincia para modelo de regresso da

utilizados na curva de calibrao da Figura

Tabela 17: Anlise de Varincia para modelo de regresso da

utilizados na curva de calibrao da Figura 6.....................................................

de nitrognio /nitrato (mg.L-1) e absorbncia lida................................................

utilizados na curva de calibrao da Figura 7.....................................................

utilizados na curva de calibrao da Figura 8.....................................................

com sulfato de hidrazina/ sulfato de cobre (SIA)................................................

com a coluna de cdmio......................................................................................

2 mtodos : coluna de cdmio e hidrazina(SIA)..................................................

pelos 2 mtodos : coluna de cdmio e sulfato de hidrazina (SIA)....................... 90

Figura 1: Diagrama esquemtico do Sistema de Injeo Sequencial (SIA)........ 55

Figura 9: Representao grfica da correlao entre os resultados de N/nitrito

Agradeo a Deus pela vida

a meus pais por terem-na continuado

e aos que me cercam por terem-na enriquecido.

txicos com implicaes sade ocupacional e ambiental.

recuperao do mtodo proposto em guas e aditivos, com valores

O mtodo apresentou linearidade at 3,5 mg.L-1 de N-NO3-

extremely toxic to human

beings and to the environment.

A determinao de nitritos e nitratos realizada quase sempre conjuntamente

1.1 OCORRNCIA NATURAL

Os nitratos e nitritos presentes em nossa dieta podem se originar

A adio de nitritos e nitratos em queijos evita o chamado estufamento tardio,

presena est condicionada ao estgio final da oxidao de compostos orgnicos

1.2 UTILIZAO DOS NITRITOS E NITRATOS COMO ADITIVOS

So tambm utilizados como aditivos alimentcios (categoria conservadores)

De acordo com a legislao brasileira, os limites mximos permitidos em

Limite mximo (mg.Kg-1)/(mg.L-1)

Produtos crneos curados (4)

150 NO2- em NO2300 NO3- em NO2-

A adio de nitratos e nitritos em alimentos est relacionada com a obteno

1.2.3 Atividade antibacteriana

1.3 ASPECTOS TOXICOLGICOS DOS NITRATOS E NITRITOS

Os maiores riscos provenientes da ingesto dos nitratos e nitritos so de

assintomtica, entre 20% e 30% h o aparecimento de cianose, com

Muitas das nitrosaminas so carcinognicas. Algumas podem induzir a

Tendo em vista os riscos apontados, da ingesto de nitritos e nitratos, os

2.1 OBJETIVO GERAL

2.2 OBJETIVO ESPECFICO