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DETERMINACION DE PROTEINAS POR EL METODO DE KJEJDAHL

Francisco Santiago. Engineering Department.


INTRODUCCIN
El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla compleja de
protenas. Estas existen en una combinacin con carbohidratos o lpidos, que puede ser fsica
o qumica. Actualmente todos los mtodos para determinar el contenido protico total de los
alimentos son de naturaleza emprica. Un mtodo absoluto es el aislamiento y pesado directo
de la protena pero dicho mtodo se utiliza slo a veces en investigaciones bioqumicas
debido a que es dificultoso y poco prctico
En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el mtodo ms usado en la
actualidad para el anlisis de protenas (mtodo Kjeldahl) mediante la determinacin del
nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos
de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El
nitrgeno orgnico total se convierte mediante esta digestin en sulfato de amonio. La
mezcla digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El destilado se
recoge en una solucin de cido brico. Los aniones del borato as formado se titulan
con HCl (o H2SO4) estandarizado para determinar el nitrgeno contenido en la muestra.
El resultado del anlisis es una buena aproximacin del contenido de protena cruda del
alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no proteicos.
El mtodo Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utiliz permanganato
de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin (digestin), sin embargo, los resultados
no
fueron
satisfactorios,
de
manera
que
este
reactivo
se
descart.
En
1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la digestin utilizando cido sulfrico y
aadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso aadir sulfato de potasio que eleva el
punto de ebullicin del cido sulfrico utilizado en la digestin para disminuir el tiempo de la
reaccin.
En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado
CuSO4.5H2O como catalizador.
REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL

DIGESTIN
catalizadores

(1) n

protena

-NH2 +

mH2SO4 CO2 +

(NH4)2 SO4 +

SO2

2NH3 +
Na2SO4+
NH4 + H2BO3- (in borato)

2H2O

calor

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN
(2) (NH2)SO4 +
2
NaOH
(3) NH3 + H3BO3 (cido brico)

TITULACIN
El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con HCl (o
H2SO4)estandarizado:

(4) H2BO3- + H+
H3BO3
MATERIAL
J.P SELECTA suministra los equipos necesarios para la realizacin del procedimiento por el
mtodoKjeldahl.
-1 bureta electrnica Digitrate-Pro 50 resolucin 0.01 ml.
Cdigo 0182026

-1 balanza analtica de precisin FA-2204B resolucin 0,1mg.


Cdigo 5830039

-1 Unidad de digestin (Bloc Digest) para 6, 12 y 20 plazas.


Cdigos 4000629, 4000630, 4000631
-1 Unidad Scrubber.
Cdigo 4001611
-1 Bomba de circulacin de agua.
Cdigo 4001612

-1 Aparato destilador Kjeldahl (Pro Nitro M, S o A).


Cdigos 4002627, 4002851, 4002430

- Material diverso de laboratorio

REACTIVOS
Reactivos preparados:
Es aconsejable la utilizacin de reactivos ya preparados, especialmente el HCl (o H2SO4) de
valoracin. Cualquier error en su preparacin puede afectar directamente al resultado de la
determinacin.
Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas:

cido Brico (en polvo) 99.5%


PANREAC 141015

Indicador mixto 4.8 ( 5) RV PANREAC 283303


(Rojo metilo + Verde de Bromocresol)

Indicador mixto 4.4 RV PANREAC 282430


(Rojo metilo + Azul de Metileno)


HCl 0.1N SV PANREAC 171023

HCl 0.25N SV PANREAC 182318

H2SO4 0.1N SV PANREAC 181061

H2SO4 0.2N SV PANREAC 182011

Sodio Hidrxido 40% RE PANREAC 171220


(Para determinacin de N)

Acetanilida 99% (Patrn para validacin) PANREAC 151005

Amonio sulfato (Patrn para validacin) PANREAC 131140

Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8g PANREAC 174428


Preparacin de la solucin fijadora de amonaco
1.- Con indicador Mixto 4.8 ( 5)
Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora:

Pesar 10g de Acido Brico (en polvo) PANREAC 141015

Disolverlo en 1 litro de agua destilada.

Aadir 15ml de Indicador mixto 5. PANREAC 283303


2.- Con indicador mixto 4.4
Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora:

Pesar 10g de cido Brico (en polvo) PANREAC 141015


Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
Aadir 10ml de Indicador mixto 4.4. PANREAC 282430

PROCEDIMIENTO
REPARACIN DE LA MUESTRA
1.
2.
3.

Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.


Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.
En muestras con contenidos de nitrgeno muy pequeo, tomar la muestra
suficiente para que contenga como mnimo 5 mg de nitrgeno.

DIGESTIN
Aadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO4 96-98% y 1 tableta (8 gm) de catalizador.
(Para
el
tubo
micro,
el
mximo
de
H2SO4 es
5ml)

Montar un sistema para la extraccin de humos o scrubber con Na2CO3.


Realizar la digestin en tres pasos:
1. En funcin del contenido de agua de la muestra, empezar la digestin
evaporando
agua
a
150C
entre
15
y
30
minutos.
2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300C entre 15 o 30 minutos para
reducir
la
produccin
de
humos
blancos.
3. Continuar la digestin a 400C entre 60 y 90 minutos.
Algunos ejemplos:
Queso o carne:
Paso1: 150C / 30
Paso 2 : 270C / 30
Paso 3: 400C / 90
Cereales:
Paso1: 150C / 15
Paso 2 : 300C / 15
Paso 3: 400C / 60
Control Visual: El resultado es un lquido transparente ntido con coloracin azul claro,
verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar restos negros
adheridos a la pared de tubo.
Nota: Durante la digestin debe controlarse la produccin de espuma en las muestras. Si
esta es excesiva, debe alargarse el paso n 1.

DILUCIN
Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a T ambiente. (Puede forzarse
sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua).
Aadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo.
Aadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es necesario
calentar ligeramente el tubo (por ej. introducindolo en el bloque digestor todava caliente)
Dejar enfriar de nuevo hasta T ambiente.

Para evitar prdidas de nitrgeno y reacciones violentas no introducir el tubo todava


caliente
al destilador.

DESTILACIN
Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de cido Brico y
unas
gotas de indicador.
Programar una dosificacin de 50 a 75 ml de NaOH.
Introducir el tubo con la muestra en el destilador.
Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Brico + 200ml de destilado).
Control Visual: Una vez se ha aadido el NaOH, la muestra debe tomar una coloracin
azulada, de no ser as, aadir ms NaOH.

VALORACIN Y CLCULO
Valorar el destilado con HCl H2SO4 hasta el cambio de color. (punto final: pH 4.65)
Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra
Moles de H2SO4= 2Moles de NH3 = 2Moles de N en la muestra
Realizar el clculo:
mg N = N x V x 14
Donde:
N
= Normalidad
del
cido
de
valoracin
V
= Volumen
de
cido
consumido
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Para pasar a contenido de protenas corregir por el factor adecuado segn la naturaleza
de la
muestra. (6.25 por defecto)
Peridicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.
% Protenas =
Donde:
P2: Nitrgeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor protenico.
(6.25 por defecto)
Factor protico de algunos alimentos:
Almendras 5,18
Nueces 5,30
Nueces - cacahuetes 5,41
Gelatina 5,55
Soja 5,71
Cebada, avena, centeno 5.83
Trigo, harina entera 5,83
Harinas (no entera) 5,70
Arroz 5,95
Maz 6,25
Todos los otros alimentos 6,25
Salvado 6,31
Leche y lcteos 6,38

P2/P0 x 100 x F

VERIFICACIN DE LA RECUPERACIN CON AMONIO SULFATO


Esta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del destilador.
Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta se destila,
se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrgeno detectado.
El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperacin de
Nitrgeno.
Preparar la muestra:
Contenido de nitrgeno de una muestra de Amonio sulfato :
Formula: (NH4)2 SO4
Peso molecular: 132.14
Factor: 14 * 2 / 132.14 = 0.212
mg de Nitrgeno = 0.212 * mg de Amonio sulfato

Pesar unos 100mg de amonio sulfato. El peso exacto ser P0


La cantidad exacta de Nitrgeno es:
P1 (mg) = P0 x 0,212
Destilar aadiendo 25ml de NaOH
Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2
P2 = N x V
Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25)
V = Volumen de cido consumido
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Calculamos la recuperacin:

x 14

R(%) = P2 / P1 *100
La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.
Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras:
NormalidadMuestra de Amonio sulfato.
0,05
20 ... 40 mg
0,1

40 ... 90 mg

0,25

100 200 mg

0,5

200 400 mg

VERIFICACIN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA


Esta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del proceso
completo del anlisis del nitrgeno Kjeldahl que incluye las etapas de digestin, destilacin
y valoracin.
Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta se digiere,
se destila, se valora y se calcula el Nitrgeno detectado.
El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denomina recuperacin de
Nitrgeno.
Para realizar sta verificacin se utiliza la Acetanilida.
Preparar la muestra:
Contenido de nitrgeno de una muestra de Acetanilida :
Frmula: C8H9NO
Peso molecular: 135.17
Factor: 14 / 135.17 = 0.1035
mg de Nitrgeno = 0.1035 * mg de Acetanilida
Pesar alrededor de 250mg de acetanilida. El peso exacto ser P0
La cantidad exacta de Nitrgeno es:
P1 (mg) = P0 x 0,1035
Digestin de la muestra:
Colocar la acetanilida en un tubo, aadir 10ml de cido sulfrico 98% y una tableta de
catalizador Kjeldahl.
Digerir a 400C durante 1h. (El resultado debe ser un lquido transparente con coloracin
azul.)
Dejar enfriar y aadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones para
evitar
salpicaduras. La reaccin del agua sobre el cido sulfrico es violenta.
Destilar:
Destilar aadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N para la valoracin.
Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2

Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25).
V = Volumen de cido consumido.
14 = Peso atmico del nitrgeno.
P2 = N x V x 14
Calculamos la recuperacin:
R(%) = P2 / P1 *100
La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

FUENTES DE ERROR
Las principales fuentes de error son:
En el proceso de digestin:
1.- La inclusin de nitrgeno no protico (aunque la cantidad de este nitrgeno suele ser
despreciable comparada con la del nitrgeno protico);
2.- La prdida de nitrgeno durante la digestin. El exceso de sulfato de sodio o potasio que
se aade al cido para elevar el punto de ebullicin, puede producir una descomposicin por
calor y por lo tanto prdida de nitrgeno. Por otro lado, el exceso de catalizador (de cobre
generalmente) tambin puede producir prdidas de nitrgeno
3.- La digestin incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo de
reaccin o falta de cido sulfrico.
Durante la destilacin:
1.- Neutralizacin incompleta de la mezcla digerida. Es necesario aadir suficiente NaOH
para neutralizar el exceso de cido sulfrico resultante de la digestin as como transformar
todo el amonio formado en la digestin en amonaco.
2.- Perdida de amonaco por fugas en el circuito de destilacin.
3.- Perdida de amoniaco por refrigeracin insuficiente en el condensador.

BIBLIOGRAFA

A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Official Methods of Analysis.


Washington,
D.C.
Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed. Jones and Bartlett
Publishers.
U.S.A.
pp
209-212.
Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products. Ed. McGraw-Hill
Publishing
Co.
Ltd.
New
Delhi.
Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice. 2. Ed. AVI U.S.A. pp
753-758