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FACULTAD DE QUMICA, UNAM

M A N U A L D E P R C T I C A S D E L L A B O R ATO R I O
D E H E M ATO L O G I A

QFB EVA CALDERON GARCIDUEAS


QFB GUILLERMO GONZALEZ VARGAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
DIVISION DE BIOQUIMICA Y FARMACIA
FACULTAD DE QUIMICA
UNAM

INDICE

Pgina

1. Valores de referencia de la biometra hemtica......................................................


2. Anticoagulantes........................................................................................................
3. Determinacin de hemoglobina...............................................................................
4. Cuenta de eritrocitos..............................................................................................10
5. Hematocrito............................................................................................................13
6. Velocidad de sedimentacin..................................................................................16
7. Cuenta de reticulocitos..........................................................................................19
8. Cuenta de leucocitos.............................................................................................22
9. Cuenta de plaquetas..............................................................................................25
10. Frotis y tinciones....................................................................................................28
11. Morfologa normal..................................................................................................33
12. Morfologa anormal................................................................................................36
13. Hierro......................................................................................................................37
14. Capacidad de fijacin de hierro.............................................................................44
15. Hemoglobina fetal..................................................................................................52
16. Fragilidad osmtica................................................................................................55
17. Induccin de drepanocitos.....................................................................................59
18. Hemoglobina libre en plasma................................................................................61
19. Recomendaciones generales para realizar pruebas de coagulacin...................64
20. Cascada de la coagulacin....................................................................................65
21. Fragilidad capilar....................................................................................................66
22. Tiempo de sangrado..............................................................................................68
23. Retraccin del cogulo..........................................................................................71
24. Tiempo de coagulacin..........................................................................................73
25. Tiempo de protrombina..........................................................................................76
26. Tiempo de tromboplastina parcial..........................................................................80
27. Tiempo de trombina...............................................................................................83
28. Fibringeno............................................................................................................86
29. Lisis de euglobulinas..............................................................................................94
30. Sulfato de protamina..............................................................................................97
31. Gel de etanol........................................................................................................100

32. Hemolisinas y aglutininas....................................................................................102


33. Anticuerpos irregulares........................................................................................105
34. Reactivos..............................................................................................................110
35. Cmara de Neubauer...........................................................................................115
36. Tabla de % de transmitancia y absorbancia........................................................116

VALORES DE REFERENCIA BIOMETRIA HEMATICA


PARAMETRO

UNIDADES
CONVENCIONALES

UNIDADES
SI

Eritrocitos

Mujeres
4.3 5.0 X 106/mm3
Hombres
4.5-5.5 X 106/mm3

4.3 5.0 X 1012/L

Hemoglobina

Hematocrito

Mujeres
14.6 1.9 g/dl
Hombres
16.4 1.9 g/dl

4.5 5.5 X 1012/L

1.86 2.48 mmol/L


2.09 2.79 mmol/L

Mujeres
44 2.7 %
Hombres
2.6 %

0.44

0.027%

0.51 0.026%

Volumen
corpuscular
medio VCM

82 96 u3

82 96 fL

Hemoglobina
corpuscular
media HCM

27 31 uug pg

0.45 0.49 fmol

32 36 %

0.32 0.36

0.5 1.5%
25,000 75,000/mm3

25 75 x 109/L

Concentracin
corpuscular
media de Hb
CMHC
Reticulocitos

Leucocitos

4.0 11 X 103/mm3

4.0 11.0 X 109/L

Neutrofilos
segmentos
banda
Eosinfilos
Basfilos
Linfocitos
Monocitos

50 70% 1800-7000/mm3
1 3%
700/mm3
1 3%
450/mm3
0 1%
200/mm3
22 40% 1000-4800/mm3
3 8% 120 800/mm3

1.8 7.0 X 109/L


0.0 0.7 X 109/L
0.0-0.45 X 109/L
0.0 0.20 X 109/L
1.0 4.8 X 109/L
0.1 0.8 X 109/L

Plaquetas

150,000 450,000/mm3

0.15-0.40 X 1012/L

Velocidad
de
Sedimentacin

Mujeres
10 15 mm/h
Hombres
4 7 mm/h

AN TICOAGULANTES EMPLEADOS EN EL LABOR ATORIO


DE HEMATOLOGIA
PRINCIPITANTES

USO

VENTAJAS

Oxalatos de amonio y 3 partes de amonio y Barato, fcil


potasio (Mezcla de
2 partes de potasio.
de preparar
Paul Heller)
De esta mezcla usar 2 No afecta el VGM
mg/ml de sangre

DESVENTAJAS

Degeneracin de los
granulocitos. Utilidad
limitada a los primeros
minutos en
extensiones.

IONIZANTES
EDTA al 10%

Sal disdica ms
soluble
Citrato de sodio
3.8% (coagulacin)

1 2 mg/ml de sangre No altera la


morfologa, an
despus de 3 h. Evita
aglutinacin de
plaquetas
9 partes de sangre
por 1 parte de
anticoagulante.
0.5 ml de citrato 4.5
ml de sangre

Evita aglutinacin de
plaquetas, preserva
ms tiempo la sangre

0.1 0.2 mg/ml de


sangre

Seco evita ms la
hemlisis.
til en estudios de
anemias hemolticas

ANTITROMBINICOS

Heparina
Carbohidrato cido

MECANICO

Desfibrinizacin

Con perlas de vidrio y til para clulas LE


agitacin mecnica

Claro. Frotis teidos


con Wright toman
coloracin azul difusa

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA
1. INTRODUCCION
La hemoglobina es una protena conjugada la cual proporciona el color rojo de la
sangre. Se encarga de llevar el oxgeno a los tejidos y participa en el transporte
del CO2 para el equilibrio cido-base. La porcin porfirnica de la hemoglobina es
una protoporfirina IX, la cual combinada con Fe (II) constituye el grupo hem; ste
ms la parte proteca (globina) constituye la hemoglobina.
Existe una amplia variedad de tcnicas para cuantificar a la hemoglobina, entre las
que destacan: determinacin de su contenido de Fe, espectrofotometra,
refractometra, gasometra, etc.
El mtodo de cianometahemoglobina es el mtodo recomendado por el Comit
Internacional para la Estndarizacin en Hematologa y las ventajas que ofrece
este mtodo son:

Existen soluciones estndar certificadas de cianometa


hemoglobina (HbCN) con una estabilidad mayor a un ao.

El espectro de absorcin de (HbCN) permite efectuar lecturas en


la regin del visible en cualquier tipo de fotmetro ya que
presenta un mximo a 540 nm y las soluciones de (HbCN) siguen
la ley de Beer a esta longitud de onda.

FUNDAMENTO

El Fe (II) es oxidado a Fe (III) por accin del ferricianuro y por lo tanto la


hemoglobina se convierte en metahemoglobina, la cual se combina con cianuro
para producir la cianometahemoglobina (CNHb) que es estable y se puede medir
en la regin de 530-550 nm. La hemoglobina, oxihemoglobina, metahemoglobina y
carboxihemoglobina es decir todas las formas de hemoglobina presentes son
transformadas en cianometahemoglobina excepto la sulfohemoglobina.
2.- OBJETIVOS
Realizar una curva de calibracin de cianometahemoglobina
Valorar las concentraciones de hemoglobina en sangre total.
Distinguir valores normales de los patolgicos.

3- PROCEDIMIENTO
7

3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 X 100 mm
Pipetas de 1.0 ml
Pipetas de 5.0 ml
Pipetas de sahli (0.02 ml
Boquilla
Gradilla
Celdas de 1 cm de dimetro
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante.
3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro o fotmetro
3.4 REACTIVOS
Solucin de EDTA al 10%
Reactivo de Drabkin
Solucin estndar de cianometahemoglobina
80 mg/dl. Facultad de Qumica, UNAM
Etanol al 70%
3.5 TOXICIDAD DE SUSTANCIAS
El reactivo de Drabkin y la solucin estndar de (HbCN) contienen derivados de
cianuro los cuales son txicos; sin embargo las concentraciones de stos estn
por debajo de la dosis letal referido a un litro de solucin. Se recomienda utilizar
perillas de seguridad para pipetear estas soluciones y no ingerir alimentos durante
la prctica; al finalizar la determinacin es necesario lavarse las manos.

3.6 TECNICA
CURVA ESTANDAR

Solucin estndar de
(HbCN) (ml)
Reactivo de
Drabkin (ml)
Concentracin
g/dl
Mmoles/L

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

5.0

4.0

3.0

2.0

1.0

0.0

Agitar cuidadosamente despus de la adicin de cada reactivo, dejar reposar 10


minutos, leer la absorbancia o el % de transmitancia contra el blanco de reactivos
a 540 nm.
Trazar la grfica en papel milimtrico o semilogartmico segn sea el caso;
colocando en el eje de las abscisas la concentracin en g/dl mmoles/L y en el eje
de las ordenadas las lecturas de la absorbancia o % de transmitancia.

MUESTRA PROBLEMA

1.- Colocar en un tubo de 13 x 100 mm, 5 ml de reactivo de Drabkin.


2.- Homogenizar perfectamente la muestra.
3.- Empleando una boquilla, tomar con la pipeta de Sahli 0.02 ml de sangre, aforar
cuidadosamente y limpiar la sangre adherida en el exterior de la pipeta.
4.- Transferir el volumen de muestra al tubo que contiene el reactivo de Drabkin y
mezclar cuidadosamente. Enjuagar 3 veces la pipeta en la dilucin.

5.- Dejar reposar durante 10 minutos y leer contra un blanco de reactivos (reactivo
de Drabkin). Interpolar las lecturas en la curva de calibracin. La reaccin es
estable un mnimo de 2 horas.
4- CALCULOS
Es necesario aplicar la siguiente frmula para calcular la concentracin de cada
uno de los tubos de la curva de calibracin.
g/dl de
251
hemoglobina =

ml del estndar x conc. del estndar (g/dl)


ml totales

5- VALORES DE REFERENCIA
Hombres
Mujeres

15.4 17.6 g/dl


13.6 15.6 g/dl

2.38 2.73 mmol/L


2.10 2.42 mmol/L

6- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975.

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CUENTA DE ERITROCITOS
1. INTRODUCCION
El resultado de la eritropoyesis es la produccin de una clula eritrocito bien
diferenciada y capaz de ejercer su funcin principal, que es la de transportar
oxgeno y bixido de carbono.
Su falta de ncleo le da la capacidad de llevar el oxgeno sin consumir
prcticamente nada de l, su forma bicncava es la que mejor se presta para
afrontar la hemlisis; su membrana no admite la salida de la hemoglobina.

FUNDAMENTO

Se diluye una cantidad exacta de muestra con el lquido de Hayem, que es una
solucin isotnica y por lo tanto no altera la estructura de los eritrocitos; esta
mezcla se coloca en la cmara de Neubauer y se cuenta el nmero de clulas
localizadas en los cuadros indicados para elloc.
2.- OBJETIVOS
Practicar el recuento de eritrocitos
Reconocer a los eritrocitos
Manejar adecuadamente la cmara de Neubauer
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13X100 mm
pipetas de thoma para glbulos rojos
cmara de neubauer
boquillas
microscopios
gradilla
papel higinico
papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venenosa con anticoagulante.

11

3.3 EQUIPO
Microscopio
Agitador de pipetas
3.4 REACTIVOS
EDTA al 10%
Lquido de Hayem
3.4 TECNICA
Obtener sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA al 10% (un mg de
anticoagulante por cada ml de sangre)
a) Llenar con sangre bien mezclada, la pipeta de Thoma hasta la marca 0.5
b) Limpiar cuidadosamente la parte externa de la pipeta.
c) Completar con lquido de Hayem hasta la marca 101.
d) Sellar los extremos de la pipeta con papel parafilm.
e) Agitar durante 3 minutos, mezclar perfectamente.
f) Colocar el cubrehematmetro sobre la cmara.
g) Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y llenar la cmara por capilaridad
por uno de los bordes del cubrehematmetro.
h) Se deja que el lquido penetre lentamente entre la cuadrcula y el
cubrehematmetro, sin que se formen burbujas, ni huecos y sin sobrepasar los
canales de la cmara.
i) Dejar reposar de 3-5 min.
j) Con objetivo de 40X se cuentan los eritrocitos contenidos en 80 cuadros
pequeos (uno central y cuatro de los extremos del cuadro central de 1 mm 2).

12

4.- CALCULOS
Si consideramos que el cuadro central de 1 mm 2 tiene 400 cuadros, se realiza el
siguiente clculo:
N X 200 X 10 X 400
80

N x 10,000

Donde:
N = Nmero de eritrocitos contados
200
= Factor de dilucin
10= Correccin de l altura de la cmara
80= Nmero total de cuadros contados
400
= Nmero total de cuadros del cuadro central
5. VALORES DE REFERENCIA
Hombres.-

5.4 5.9 x 106 /mm3

Mujeres.-

4.7 5.3 x 106/mm3

5.4 - 5.9 x 1012/L


4.7 5.3 x 1012/L

6. BIBLIOGRAFIA
Cartwright, George E. El Laboratorio en el diagnstico clnico.4. edicin. Ed.
Cientfico Mdica. Barcelona, Espaa 1973

13

HEMATOCRITO
1.- INTRODUCCION
El hematocrito representa la proporcin de glbulos rojos en la sangre-circulante.
Este valor depende del nmero de hemates de sangre perifrica, de la forma y
tamao de los mismos. Al igual que la hemoglobina y la cuenta de eritrocitos, el
hematocrito es uno de los parmetros importantes para determinar los ndices
eritrocticos (VGM, CMHG).

FUNDAMENTO

El hematocrito es el volumen de eritrocitos expresada como un porcentaje del


volumen de sangre total existente en una muestra. Es determinado en sangre
anticoagulada por medio de centrifugacin y es expresado como el volumen de
eritrocitos por unidad de volumen.
2.-OBJETIVOS
Explicar los fundamentos de las tcnicas de hematocrito
Evaluar su importancia diagnstico.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 x 100 mm.
tubos de wintrobe graduado
pipetas Pasteur con bulbo
capilares
plastilina
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venenosa con anticoagulante
3.3 EQUIPO
centrfuga
disco lector de hematocrito

14

3.4 REACTIVOS
Anticoagulantes EDTA al 10% (Sal disdica).
3.4A TECNICA MACROHEMATOCRITO
a) Homogeneizar perfectamente la muestra de sangre.
b) Con una pipeta Pasteur llenar con sangre un tubo de Wintrobe hasta la marca
superior 10, evitar la formacin de espuma, no debe quedar ninguna burbuja
de aire dentro de la columna o en el fondo.
c) Centrfugar a 3600 rpm durante 30 minutos.
d) La lectura se realiza en la lnea de separacin superior de la columna de
glbulos rojos, donde empieza la de glbulos blancos, haciendo la referencia a
la escala ascendente del lado derecho. Cada lnea de la escala equivale a 1%.
3.4 TECNICA DE MICROHEMATOCRITO
a) Se llenan con sangre proveniente del tubo de la muestra, las 2/3 partes de dos
tubos capilares. Puede hacerse tambin a partir del punto de puncin con dos
capilares heparinizados.
b) El extremo vaco se cierra a la flama o con plastilina efectuando un movimiento
de rotacin.
c) Colocarlos en los canales o surcos radiales de la centrfuga (cabezal ranurado
con numeracin para colocar los capilares) con el extremo cerrado dirigido
hacia fuera, centrfugar a 12,000 rpm durante 5 minutos.
4. CALCULOS
Calcular el % del paquete eritrocitario midiendo la altura (M 2) con relacin al
volumen total de la muestra (M1).
M1 M2 -

100%
x%

15

5.- VALORES DE REFERENCIA

Varones

47%

2.5

Mujeres

42%

2.5

Nios

35%

5.0

Recin nacidos

56%

10.0

6.- BIBLIOGRAFIA
Gradwhol, R Clinical Laboratory Methods and Diagnosis. 7
edicin Vol. 3 de. Mosby Co. U.S.A. (1970)
Todd. Sanford- Davidsohn Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods. 16. Edicin W.B. Saunders Co. (1979)

16

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR


1.- INTRODUCCION
En una muestra de sangre, el descenso de los glbulos rojos causa
desplazamiento hacia arriba del plasma, lo cual produce una corriente ascendente
y una fuerza de retraso. En la sangre normal, las fuerzas descendente y
ascendente son casi iguales y hay poca sedimentacin
Cuando se aglomeran los eritrocitos, el aumento de peso de la masa tiene mayor
efecto para aumentar la velocidad de sedimentacin que el aumento de volumen
para retrasarla. En consecuencia, cualquier estado que cause aglomeracin de
eritrocitos o formacin de pilas de monedas aumentar la velocidad de
sedimentacin de los eritrocitos.
En estado normal los eritrocitos no se aglomeran, porque tienen carga negativa y
se repelen mutuamente. Se considera que un aumento de determinadas protenas
del plasma puede disminuir la carga negativa del hemate y originar su
aglomeracin. El aumento de fibringeno guarda estrecha relacin con el aumento
de la VSE, pero tambin puede guardar relacin con ella los aumentos de
globulinas y .
Las anemias, las infecciones bacterianas aumentan la VSE. A la inversa, la VSE
suele ser muy lenta en pacientes policitmicos. La mayor parte de las virosis se
acompaan de velocidad normal o con aumento mnimo. Las enfermedades de la
colgena, las neoplasias y muchos trastornos gastrointestinales y renales se
acompaan de aumento de la velocidad de sedimentacin, que tambin se
observa despus de ciruga, quemaduras o traumatismos importantes.

FUNDAMENTO

Los eritrocitos sedimentan porque su densidad es mayor que la del plasma, por lo
que la velocidad de sedimentacin es la distancia (en mm) que descienden los
eritrocitos por unidad de tiempo (generalmente una hora) desde la parte superior
de una columna de sangre hasta la parte superior de la capa de hemates.
2.- OBJETIVOS
Efectuar la tcnica de la velocidad de sedimentacin de los eritrocitos.
Analizar su importancia clnica.

17

3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13X100 mm
Tubos de Wintrobe de 11.5 cm de largo
por 3 mm de
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla de sedimentacin
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante.
3.3 EQUIPO
Centrfuga clnica
3.4 TECNICA
1.- Seguir todos los pasos de la tcnica del macrohematocrito para llenar un tubo
de Wintrobe.
2.- Despus de que el tubo de Wintrobe est lleno de sangre, colocarlo en
posicin vertical en una gradilla de sedimentacin por un lapso de 60 minutos.
3.- Leer en la escala descendente de la izquierda el nivel en que se encuentra la
zona de separacin entre el plasma y los eritrocitos sedimentados.
4.- Informar el resultado en milmetros en una hora.
4.- CALCULOS
Correccin por hematocrito
La velocidad de sedimentacin se corregir cuando el valor de Ht de la muestra se
encuentre por debajo de los valores de referencia. Utilizar la tabla de correccin.
5.- VALORES DE REFERENCIA
Nios
Mujeres
Hombres
6.- BIBLIOGRAFIA

0 20
0 20
09

mm/h
mm/h
mm/h

18

Dacie J.V., Lewis, S.M. Practical Hematology. 5th ed. Ed. Churchill
Livingstone. London (1975).
International Comittee for standardization in Hematology. Standard
techniques for the measurements of red cells of Hamatology. 25:801 (1973).
Jones, R.F. 1961. Determination of packed cell volume by centrifugation.
Journal of Clinical Pathology. 14, 198.

19

CUENTA DE RETICULOCITOS
1.- INTRODUCCION
Durante el proceso de maduracin eritroide se observa una serie de cambios
bioqumicos y morfolgicos orientados a la formacin de un elemento maduro apto
para realizar el transporte gaseoso (02, C02). El objetivo fundamental de dicha
maduracin es la sntesis de hemoglobina (Hb).
Una vez que el eritroblasto ha expulsado su ncleo, la clula conserva parte de su
maquinaria biosinttica constituida principalmente por mitocondrias y
polirribosomas, los cuales una vez cumplido su cometido (la sntesis de Hb
restante) son autodegradados con lo cual la clula pasa a estadio de hemate
maduro.
En tinciones policromatfilas el reticulocito presenta un volumen mayor que el
eritrocito, as como basoflia difusa, lo que indica su contenido variable de RNA
ribosomal. La fase de maduracin del reticulocito requiere de 2 a 4 das y se
realiza en la microcirculacin de la mdula sea.

FUNDAMENTO

Los organelos citoplasmticos y el RNA residual de los reticulocitos son


precipitados y teidos con una tincin supravital, con el azul de cresil brillante o
con nuevo azul de metileno. Se preparan frotis y se cuentan los elementos que
tienen un precipitado reticular (reticulocitos) teido. Las cifras obtenidas son
reportadas en valores porcentuales y absolutos.
2.- OBJETIVOS
Valorar de manera sencilla la produccin eritrocitaria.
Evaluar tempranamente en anemias carenciales la eficacia del
tratamiento.
Establecer el diagnstico diferencial entre anemias hemolticas y otro
tipo de anemias.
3. PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 10x75 mm
Pipetas Pasteur con bulbo
20

Portaobjetos
Cubreobjetos
Gradilla
Aplicadores
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulantes (EDTA)
3.3 EQUIPO
Microscopio
Contador de clulas
3.4 REACTIVOS
Solucin de nuevo azul de metileno
Solucin de azul de cresil brillante
Blsamo de Canad
Aceite de inmersin
Xilol
3.5 TECNICA
1.- Coloque en tubo de 10x75 mm un volumen de sangre del paciente.
2.- Agrega un volumen del colorante supravital recin filtrado
3.- Mezclar suavemente y dejar en reposo 15 min. A temperatura ambiente
4.- Tomar una gota de la mezcla y efectuar un extendido fino en el portaobjetos (o
cubreobjetos), dejar secar el frotis al aire.
5.- Observar en el microscopio con objetivo de 100.
6.- Contar las clulas que tienen grnulos azules o reticulares en un total de 1000
hemates los cuales no deben estar agrupados o apilados.

21

4.- CALCULOS Y RESULTADOS


Calcular los valores porcentuales (% de reticulocitos)
Clculo en valores absolutos (reticulocitos/mm 3)
Reticulocitos/mm3 = %reticulocitos x eritrocitos / mm3
100
Cifra corregida de reticulocitos = % reticulocitos x

hto paciente
hto. Normal

5.- VALORES DE REFERENCIA


% reticulocitos 0.5- 2-0%
Valores absolutos
Mujer

23,000 106,000/mm3

Hombre

27,000 118,000/mm3

6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El Laboratorio en el Diagnstico Hematolgico. 4. Edicin
Cientfico-Mdica (1973)
Rodrguez Moyado y Col. Procedimientos Bsicos para la seleccin de
Donadores de Sangre en la Cd. de Mxico. Rev. Med. IMSS Vol. VII, 131
(1968)
Todd Sanford- Davisohn. Clinical Diagnosis and Manegement by Laboratory
Methods. 16- Ed.W,B, Saunder Co. (1979)
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983)

22

CUENTA DE LEUCOCITOS
1.- INTRODUCCION
En la sangre normal pueden distinguirse los siguientes tipos de leucocitos:
Granulocitos.- neotrfilos, esinfilos, basfilos.
Agranulocitos.- linfocitos, monocitos.
La produccin de linfocitos es en sitios diseminados (bazo, ganglios linfticos y
otros tejidos linfticos organizados), pero la produccin de neutrfilos, monocitos,
eosinfilos y basfilos est limitada a la mdula sea en el ser humano normal.
El examen de los leucocitos comprende dos fases tcnicas. Una fase cuantitativa
que determina el nmero de leucocitos, las cifras absolutas y relativas de las
diversas formas de glbulos blancos, y la segunda, que determina la morfologa
celular.
En ocasiones basta su examen para formular un diagnstico especfico, por
ejemplo en las leucemias. Con ms frecuencia puede ser de ayuda diagnstica
para establecer un pronstico en relacin al curso de la enfermedad.

FUNDAMENTO

La sangre es diluida con una solucin hipotnica de cido actico glacial ms un


colorante como medio de contraste (lquido de Turk), que lisa los glbulos rojos
maduros pero, los leucocitos permanecen intactos. Su ncleo se tie ligeramente.
Los normoblastos no se destruyen, cuando se encuentran presentes; como es el
caso de algunas situaciones patolgicas, por lo que se deben tomar en cuenta
para no incluirlos en el valor verdadero de glbulos blancos.
2.- OBJETIVOS

Manejar adecuadamente la cmara de Neubauer

Distinguir y contar los glbulos blancos presentes en muestras normales y


patolgicas.

23

3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Pipetas de Thoma para glbulos blancos
Tubos de ensaye de 13 x 100 mm
Cmara de Neubauer
Boquillas
Gradilla
Papel parafilm
Papel higinico
3.2.-MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante
3.3.- EQUIPO
Microscopio
Agitadores de pipetas
3.4.- REACTIVOS
Solucin de EDTA al 10%
Lquido de Turk
Etanol al 70%
3.4 TECNICA
1.- Homogenizar perfectamente bien la sangre
2.- Con la pipeta de Thoma para glbulos blancos, aspirar sangre hasta la marca
de 0.5; secar cuidadosamente la parte exterior de la punta de la pipeta.
3.- Complementar con lquido de Turk hasta la marca de 11. (dilucin 1:20).
4.- Agitar 2 minutos.
5.- Desechar las primeras 4 5 gotas y se carga la cmara de Neubauer,
procedimiento descrito en el recuento de eritrocitos.
6.- Dejar reposar la cmara con la muestra durante 3 minutos.
7.- Observar con el microscopio utilizando el objetivo de 10 X.

24

8.- Se cuentan los leucocitos en cada uno de los cuatro cuadros de 1 mm 2 de las
esquinas de la cuadrcula de la cmara de Neubauer.
4.- CALCULOS
Para obtener la cifra de leucocitos por milmetro cbico se emplea la siguiente
frmula:
N x 20 x 10

= N x 50
= leucocitos/ mm3
= leucocitos/l

en dnde:
N = nmero de leucocitos contados
20 factor de dilucin
correccin por altura de la cmara
4 nmero de cuadros de 1 mm2 en los que se efectu el conteo de
leucocitos.
El factor de 50 variar si cambia la dilucin y/o el nmero de cuadros contados.
5.- VALORES DE REFERENCIA
4,500 10,000/mm3

4.5 10 X 109/L

4.- BIBLIOGRAFIA
Dacie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hamatology. Fifth
Edition, Churchill Livingstone, New York. 1975.

25

CUENTA DE PLAQUETAS
1.- INTRODUCCION
Las plaquetas se originan en la mdula sea a partir del megacariocito, son
redondas u ovaladas y miden de 1 a 3 micras de dimetro. Tienen una vida media
de 8 a 11 das, desempean una funcin crtica en la hemostasia que consiste en:
1) mantenimiento contino de la integridad vascular; 2) paro inicial del sangrado
por formacin del tapn plaquetario; 3) estabilizacin del tapn hemosttico por la
contribucin de factores plaquetarios en el proceso de formacin de fibrina.

FUNDAMENTO

En una dilucin con citrato de sodio adicionado de azul de cresil brillante, las
plaquetas se observan al microscopio como clulas con un movimiento browniano.
Las plaquetas se cuentan en una cmara de Neubauer utilizando tambin
microscopa de contraste de fases despus de que los eritrocitos han sedimentado
en solucin con oxalato de amonio al 1%
2.- OBJETIVOS

Comparar las diferentes tcnicas para la cuenta de plaquetas.

Evaluar las ventajas y limitaciones de cada una de ellas.

3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 X 100 mm
Pipeta de Thoma para glbulos rojos
Cmara de Neubauer con cubrehematmetro
Caja de Petri
Gradilla para tubos
Boquilla
Papel sanitario
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre capilar o venosa con anticoagulante (EDTA al 10%)

26

3.3 EQUIPO
Microscopio de campo claro
Microscopio de contraste de fases
Agitador de pipetas de Thoma
3,4 REACTIVOS
Solucin de EDTA al 10%
Lquido diluyente de plaquetas
Solucin de oxalato de amonio al 1%
3.6 TECNICA
1.- Cargar con la muestra de sangre una pipeta de Thoma para glbulos rojos
hasta la marca 1.0
2.- Limpiar cuidadosamente la sangre adherida al exterior de la pipeta.
3.- Completar el volumen hasta la marca de 101 con el lquido diluyente de
plaquetas o con oxalato de amonio al 1% (segn el mtodo a emplear) dilucin
1:100.
4.- Mezclar el diluyente y la sangre por agitacin durante 3 a 5 minutos.
5.- Descartar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y cargar la cmara de Neubauer.
6.- Preparar una caja de Petri con papel filtro humedecido y sobre ste unos
soportes de madera para dejar reposar la cmara durante 15 minutos.
7.- Al finalizar este perodo, realizar la cuenta de las plaquetas con el objetivo de
40 y el ocular de 10X. Debe trabajarse con buena iluminacin en el
microscopio para evitar confundir las plaquetas con levaduras, colorante
precipitado o artefactos. En la cmara las plaquetas aparecen como cuerpos
refrctiles ovales o elongados.
8.- Contar todos los cuadros del cuadro central (para glbulos rojos) que tiene una
superficie de 1 mm2.
Nota: Esta determinacin debe hacerse rpidamente para evitar que las plaquetas
se aglomeren.

27

4.- CALCULOS
Nmero de plaquetas/mm3 = N x 10 x 100
= N x 1000
N = nmero de plaquetas contadas
10 = correccin por la altura de la cmara
100 = Factor de dilucin.
5.- VALORES DE REFERENCIA
150,000 400,000 plaquetas/mm 3

150 400 x 109/L

6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975.

28

FROTIS Y TINCIONES
1.- INTRODUCCION
El examen cuidadoso del frotis sanguneo proporciona ms informacin que
cualquier otro parmetro de laboratorio, sin embargo la interpretacin solo se
adquiere con la prctica y el estudio constante. Es importante resaltar el hecho de
que la utilidad de esta prueba se ve correlacionada con una orientacin clnica
justificada por parte del mdico.
Por medio del examen del frotis de sangre perifrica teido con colorantes
policromatfilos, es posible detectar alteraciones morfolgicas en los hemates
como: Anisocitosis, macrocitosis, microcitosis, anisocromia, policromatofilia,
cuerpos de Howell Jolly, anillos de Cabot y otras variaciones en la forma, gracias a
lo cual es posible establecer un diagnstico presuntivo de algunos tipos de
anemia.
Asimismo, se puede realizar la identificacin de leucocitos en base a afinidades
tintoriales o morfolgicas y gracias a esto se pueden detectar trastornos
cuantitativos, mieloproliferativos y en ocasiones alteraciones cualitativas de los
leucocitos; la observacin de las plaquetas proporciona un valor semicuantitativo
de las mismas.
FUNDAMENTO

Los colorantes policromatfilos son mezclas de compuestos bsicos como el azul


de metileno y colorantes cidos como la eosina; estas mezclas presentan afinidad
por las estructuras celulares dependiendo de su carcter cido o bsico, as, los
componentes cidos se tien con el colorante bsico (basfilos) y viceversa
(eosinfilos); otras estructuras se tien con ambos colorantes (neutrfilos).
2.- OBJETIVOS
Identificar los diversos tipos celulares en el frotis de sangre perifrica en base
a sus caractersticas morfolgicas y tintoriales.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Portaobjetos
Cubreobjetos
Cmara de tincin
Piseta
Vaso precipitado de 250 ml
29

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Sangre capilar o venosa anticoagulante (EDTA)
3.3 EQUIPO
Microscopio
Contador de clulas
3.4 REACTIVOS
Metanol
Colorante de Wright
Colorante de Giemsa
Colorante de May-Grunwald
Solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.2
Xilol
Blsamo de Canad
Mezcla alcohol-acetona
Aceite de inmersin
3.5.- TOXICIDAD DE SUSTANCIAS
El metanol es un compuesto de notable inters toxicolgico. En el organismo es
transformado en formaldehdo y este en cido frmico, por lo que su ingestin da
lugar a un cuadro de acidosis con afectacin selectiva a las clulas retinianas.
Este reactivo debe ser pipeteado con perillas de seguridad.
3.6.- TECNICA
IA.- PREPARACION
PORTAOBJETOS)

DEL

FROTIS

DE

SANGRE

PERIFERICA

(METODO DEL

Se coloca una hoja de sangre anticoagulada en uno de los extremos de un


portaobjetos, se sujeta colocando los dedos pulgar e ndice en extremos
opuestos, con un segundo portaobjetos se toca la gota de sangre y por
capilaridad difunde; en un ngulo de 30 se desliza rpida y firmemente en
direccin opuesta.
IB.- PREPARACION
CUBREOBJETOS)

DE

FROTIS

DE

SANGRE

PERIFERICA

(METODO

DEL

Tomar un cubreobjetos por las esquinas adyacentes con los dedos pulgar e
ndice, colocar una gota de sangre anticoagulada en el centro del
cubreobjetos, con la mano contraria tomar otro cubreobjetos de manera que

30

en conjunto formen un ctagono, con lo cual la sangre se extender rpida y


uniformemente entre las dos superficies, los cubreobjetos se separan
mediante un tirn lateral y horizontal.
IIA.- TINCION DE WRIGHT

En la charola de tincin que tiene varillas en forma paralela, se colocan los


frotis en posicin horizontal.
Se aade colorante de Wright sobre el frotis de manera que quede totalmente
cubierta la superficie; se deja actuar el colorante 1 2 minutos (el tiempo
puede variar segn la madurez del colorante).
Agregar con piseta solucin amortiguadora, de manera que se forme una capa
metlica, tener cuidado de no sobrepasar el efecto de tensin superficial; con
una pipeta soplar suavemente para que la mezcla sea uniforme, se deja la
mezcla de 3 a 6 minutos (depende del lote de cada colorante).
Se lava la tincin con agua corriente, debe evitarse la precipitacin en la
superficie del frotis, las extensiones se dejan secar al aire.
IIB.- TINCION DE GIEMSA

Colocar los frotis en la charola de tincin.


Fijar los frotis con metanol de 10 a 20 minutos.
Se cubre luego con una mezcla recin preparada de 1 ml de colorante y 10 ml
de amortiguador de fosfatos, por 30 minutos.
Se lava la tincin con agua corriente, los frotis se dejan secar al aire.
IIC.- TINCION DE MAY-GRUNWALD

Se cubren los frotis con solucin de May-Grunwald sin diluir, dejar actuar
durante 3 a 5 minutos.
Se agrega la solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.2, evitar sobrepasar el
efecto de la tensin superficial, se deja la mezcla de 5 a 10 minutos.
Lavar con solucin amortiguadora pH 7.2 hasta que el frotis adquiera una
tonalidad rosa plido.

31

IID.- TINCION PAPNOTICA DE PAPPENHEIM

El frotis se fija por 3 minutos con solucin de May-Grunwald


Se agrega la solucin amortiguadora de fosfatos pH 7.2, evitar sobrepasar el
efecto de la tensin superficial, dejar por un minuto.
Se decanta (sin lavar) la solucin colorante y se adiciona la solucin de
Giemsa diluida, dejar actuar durante 15 minutos.
Se lava con solucin amortiguadora de fosfatos y secar al aire.

EXAMEN DEL FROTIS

El examen del frotis se efectua primero con el objetivo de (40X) con el fin de
observar la distribucin celular, as como las caractersticas de la tincin; se
selecciona un rea donde exista una monocapa de clulas (donde los eritrocitos
apenas se tocan).
Empleando ahora el objetivo de inmersin (100X) se realiza el examen del frotis.
La observacin incluye eritrocitos, los cuales son examinados en cuanto a tamao,
forma, color e inclusiones eritrocitarias.
Las plaquetas se aprecian en cuanto a cantidad y morfologa. Se observan los
leucocitos, determinando si el nmero esta normal, aumentado o disminuido,
posteriormente se efecta la cuenta diferencial evitando contar dos veces la
misma rea; para ello se sigue una rutina en greca de izquierda a derecha, bajar el
campo y si luego de derecha a izquierda, etc. se cuenta un mnimo de 100
leucocitos tambin deben ser reportadas.
4.- RESULTADOS
Informe de anormalidades cuantitativas y morfolgicas en las tres estirpes
celulares sanguneas, as como la cuenta diferencial leucocitaria en valores
porcentuales (relativos)

32

5.- VALORES DE REFERENCIA


Sin alteraciones en serie roja
Sin alteraciones en las plaquetas
Cuenta diferencial:
Valores relativos
Linfocitos
Monocitos
Eosinfilos
Basfilos
N. segmentados
N. banda

22 40 %
28
13
01
50 70
12

Valores absolutos
1100 4000/mm3
100 800
50 300
0 100
2500 7000
50 200

6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfico-Mdica (1973) Espaa.
Lynch-Raphael-Mellor. Mtodos de laboratorio. 2. Edicin.
Interamericana. (1972). Mxico
Todd Sanford Davisohn. Clinical Diagnosis and Manegament by Laboratory
Methods. 16- Ed.W.B. Saunder Co. (1979)
William J. William Hematology 3- Ed. McGraw-Hill Book Co.
(1983). USA.

33

MORFOLOGIA NORMAL
La informacin que se obtiene al examinar una extensin de sangre adquiere gran
importancia ya que mediante la morfologa del eritrocito se puede valorar:
a)
b)
c)
d)

La estimulacin de eritropoyetina
Hallazgos de anomalas de maduracin nuclear y citoplsmica.
Deteccin de trastornos en la mdula sea.
Transtornos hemolticos,

ERITROCITOS

El eritrocito presenta una forma bicncava con un rea central plida y mide
aproximadamente 7 en promedio. En cada laminilla pueden investigarse las
caractersticas generales de tamao, forma y color de los eritrocitos, as como de
los leucocitos. Las alteraciones en la maduracin nuclear se caracterizan por un
aumento en el tamao del eritrocito sin un cambio de la concentracin de
hemoglobina
A continuacin se definen las alteraciones ms comunes que es posible observar
en un frotis de sangre perifrica teido por las tcnicas habituales.
a)

Eliptocitos (ovalocitos).- Son fcilmente identificados por deformacin de


las clulas en forma elptica. Se presenta en pacientes con ovalocitosis
hereditaria.

b)

Esferocitosis.- Se reconocen como clulas microcticas, hipercromicas,


resultan de la prdida de la membrana del eritrocito y de electrolitos
intracelulares.

c)

Acantocitos.- Cuando se encuentra daada la membrana del eritrocito se


encuentran presentes; aparecen en enfermedad heptica, trastornos
lipdicos o enfermedad renal.

d)

Clulas en Diana.- Son el resultado de un aumento en la membrana del


eritrocito, sto ocurre en muchas hemoglobinopatas, talasemias y
enfermedades hepticas.

e)

Eritrocitos fragmentados (esquizocitos).- Pueden deberse a


traumatismos intravasculares o dao de los eritrocitos recientemente
formados al entrar en circulacin.

f)

Cuerpos de Howell-Jolly.- Algunas veces se ven en pacientes con


funcionamiento deficiente del bazo o en ausencia de ste.

34

g)

Punteado basfilo.- Un punteado denso se observa con anomalas del


estroma de la mdula sea y con estimulacin aumentada de eritropoyetina.
Un punteado muy denso se debe considerar un envenenamiento con
plomo.

h)

Parsitos paldicos intracelulares.- Se observa Plasmodium vivax en el


interior del eritrocito. Se presentan cuadros de fiebre y anemia hemoltica.

i)

Eritrocitos nucleados.- Pueden ser normoblastos tardos, pero formas


ms tempranas de eritrocitos, indican desorganizacin de liberacin del
eritrocito o ausencia de funcin esplnica.

j)

Anillos de Cabot.- Son restos de membrana nuclear, protenas o


lipoprotenas desnaturalizadas.

LEUCOCITOS

En la sangre humana pueden distinguirse los siguientes tipos de leucocitos:


Metamielocitos.- Estas clulas se encuentran rara vez en sangre
perifrica. El ncleo es ovalado o de forma de frijol pero sin segmentacin
inicial, la cromatina est aglutinada en forma diferente al neutrofilo
polimorfonuclear, el citoplasma tiene un color ms azulado, debido al mayor
contenido de RNA. Se observa sntesis de granulaciones definitivas.
Neutrfilos en banda.- Son una forma inmadura en comparacin de los
polimorfonucleares.
Neutrfilos maduros (Polimorfonucleares).- Tienen un ncleo
segmentado con los lbulos separados por un filamento. En las tinciones
con Wrihgt el ncleo es color azul oscuro y la cromatina esta densamente
aglutinada. El citoplasma abundante tiene color ligeramente rosa y oscuro,
hay presentes grnulos transparentes, as como de color rosa. Pueden
encontrarse de tres a cinco segmentos en el ncleo.
Eosinfilos y Basfilos.- Tienen las mismas caractersticas generales de
forma y secuencia de desarrollo de los neutrfilos. Sus grnulos
caractersticos de rojo brillante (eosinfilos) y azul intenso (basfilo)
aparecen en la etapa de mielocito. Los grnulos de este ltimo estn a
menudo sobre el ncleo y lo obscurecen.
Linfocitos.- Varan de tamao desde ligeramente mayores que un eritrocito
hasta tan grandes o mayores que los monocitos. Generalmente son
redondos, con ncleos esfricos, pero tanto la forma de la clula completa
como la del ncleo puede ser ovalada o ligeramente dentada.

35

El citoplasma tiene color azul claro, en algunas ocasiones puede


observarse de color azul oscuro; ste puede ser escaso siendo difcil
distinguirlo en los linfocitos pequeos y abundante en los linfocitos grandes.
Ocasionalmente pueden observarse grnulos rojo vino (azurfilos).
Monocitos.- La caracterstica ms importante es su cromatina, la cual esta
aglutinada, siendo sta de dimetro ms pequeo y ms alargada que en
los linfocitos y neutrfilos. La clula puede ser redonda y en algunas, el
lmite citoplsmico es ondulado o tiene seudpodos manifiestos. El
monocito tpico tiene citoplasma de color gris azulado y un ncleo en forma
de rin pudiendo ser tambin redondo u ovalado sin dentacin y en
ocasiones puede ser segmentado.
PLAQUETAS

Son los elementos formes ms pequeos, cuyo dimetro oscila entre 2-4 se
caracterizan por presentar una zona granular que se tie de manera semejante a
la de los ncleos de los leucocitos, rodeada por una zona hialina que le confiere
un aspecto difuso.

36

MORFOLOGIA ANORMAL
En esta prctica se presentar al alumno una serie de transparencias de las
anormalidades ms frecuentes que es posible observar en el laboratorio de
Hematologa.
A Continuacin se presenta la lista de las transparencias que integran el
programa.
MORFOLOGIA NORMAL Y ANORMAL
SERIE ROJA NORMAL

1.2.3.4.5.6.7.8.-

SERIE BLANCA NORMAL

Pronormoblasto
Normoblasto basfilo
Normoblasto basfilo
Normoblasto policromatfilo
Normoblasto policromatfilo
Normoblasto ortocromtico
Retculocito
Eritrocito normal

31.32.33.34.35.36.37.38.39.-

SERIE ROJA ANORMAL

Mieloblasto
Mieloblasto y promielocito
Mielocito
Metamielocito
Banda
Neutrofilo bilobulado
Neutrlo multilobulado
Eosinfilo
Basfilo
SERIE BLANCA NORMAL

9. Poiquilcitosis
10. Hipocroma
11. Hipocroma
12. Macrocitosis
13. Codocitos
14. Esferocitos
15. Ovalocitos
16. Drepanocitos
17. Esquizocitos
18. Esquizocitos
19. Acantocito
20. Punteado Basfilo
21. Cuerpo de Howell-Jolly
22. Anillos de Cabot
23. Anillos de Cabot
24. Cuerpos de Heinz
25. Alfa talasemia
26. Beta talasemia
27. Beta talasemia
28. Eritroblastosis fetal
29. Eritroleucemia
30. Sideroblastos en anillo

40.41.42.43.44.45.46.47.48.49.50.51.52.53.54.55.-

Anomala de Pelger
Netrfilo multilobulado
Clula LE
Leucemia mieloblstica
Tincin de Sudn negro
Tincin de PAS
Linfocito
Linfocito
Clula plasmtica
Linfocito plasmocitoide
Linfocito atpico
Linfocito atpico
Tincin de PAS
Tincin de PAS
Monocito
Monocito vacuolado

SERIE MEGACARIOCITICA

56.57.58.-

Promegacariocito
Megacariocito
Megacariocito anormal

VARIOS

59 y 60.- Paludismo

37

HIERRO SERICO
1. INTRODUCCION
El hierro es un elemento que se combina con protoporfirina para formar el grupo
hem y con diversas protenas para originar enzimas importantes como catalasa,
citocromo y peroxidasa. La absorcin del hierro es mxima en el duodeno y
disminuye progresivamente en las partes distales del intestino; debido a que la
capacidad del cuerpo para excretar hierro es muy limitada, su absorcin en el
intestino debe ser controlada para que no se acumule en los tejidos y no alcance
niveles txicos.
La determinacin de hierro srico junto con la capacidad total de combinacin y
saturacin de la transferrina permiten evaluar los niveles de este elemento en el
organismo.

FUNDAMENTO

El Fe3x unido a la transferrina es separado de ella por la adicin de una solucin


amortiguadora (Ph 1.9) y reducido simultneamente al estado ferroso por la
presencia del cido ascrbico en la misma solucin amortiguadora. El Fe2+
liberado reacciona con la batofenantrolina sulfonatada (4:7-difenil-1:10-fenantrolina
sulfonatada), obtenindose la formacin de un complejo colorido cuya intensidad
de color es proporcional a la concentracin de Fe.
2. OBJETIVOS
Determinar la concentracin de Fe en suero aplicando el mtodo de Beale et
al modificado por Loria, A.
3. PROCEDIMIENTO (A)

3.1- MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Gradilla para tubos
Piseta
Celdas
Propipeta

38

El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocar toda la
noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Suero o plasma libre de hemlisis

3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos

3.4 REACTIVOS
Solucin de batofenantrolina al 0.64%
Solucin amortiguadora de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cido ascrbico al 0.5%
Solucin de trabajo: cido ascrbico al 0.5%
En amortiguador de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cloruro de sodio al 0.85%
Solucin estndar de hierro 150 ug/dl
Agua desionizada

3.5 MANEJO DE SUSTANCIAS


Para pipetear el material biolgico y los reactivos de esta tcnica es
necesario emplear propipeta.

39

3.6 TECNICA
Preparar 3 tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla (es
recomendable realizar el problema y el estndar por duplicado).
BLANCO

ESTANDAR

PROBLEMA

ml
Amortiguador

2.0

2.0

2.0

Suero o plasma

---

---

0.5

Solucin salina

0.5

---

---

Solucin estndar 150 ug/dl

---

0.5

---

Mezclar vigorosamente y dejar en reposo mnimo de 20 minutos. Leer la


absorbancia A1 contra el blanco a una longitud de onda de 530 nm.
Solucin de batofenantrolina sulfonatada

0.05

0.05

0.05

Mezclar inmediatamente, dejar reposar de 30 a 90 minutos. Leer la


absorbancia A2 contra el blanco a una longitud de onda de 530 nm.

4.- CALCULOS
Calcular la concentracin de hierro presente en el suero del paciente empleando la
siguiente frmula;
Fe (g)/dl) =

A2 A1 del problema
A2 A1 del problema

5.- VALORES DE REFERENCIA


65 175 g/dl

40

x concentracin del estndar


en g/dl

3.- PROCEDIMIENTO

(B)

3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 1.0 yh 5 ml
Gradilla para tubos
Piseta
Celdas
propipeta
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda
la noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Suero o plasma libre de hemlisis

3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Bao de incubacin

3.4 REACTIVOS
Buffer de fosfato de sodio 0.4 M pH 5.5
Reactivo de coloracin.- Acido
Batofenantrolindisulfnico, sal disfica 0.68 mM, fosfato de sodio 0.4 M
pH 5.5
Ascorbato de sodio
Solucin estndar de hierro 1 ug/ml = 17.91 mmol/L
Agua desionizada
HCl 1 N
Acido triclorocetico 20%
Acetato de sodio al 30%

3.4 MANEJO DE SUSTANCIAS


Para pipetear el material biolgico y los reactivos de esta tcnica es
necesario emplear propipeta.

41

3.6 TECNICA
SIN DESPROTEINIZAR

Ascorbato de sodio

BLANCO
Reactivos

ESTANDAR

BLANCO
Problema

PROBLEMA

5 mg

5 mg

5 mg

5 mg

1.0

---

ml
Buffer
Reactivo de color

---

---

1.0
1.0
--Disolver el ascorbato agitando lentamente.

1.0

Solucin estndar

---

1.0

---

---

Agua destilada

1.0

---

---

----

Suero

---

---

1.0

1.0

Mezclar, tapar los tubos y dejarlos a 37 C durante 10 minutos.


Enfriar a temperatura ambiente, medir las extinciones del problema y del estndar
contra el blanco de reactivos y la extincin del blanco del problema contra agua
destilada a 535 nm.
Nota: Si la extincin del blanco suero medida frente a agua excede 0.3, debe
realizarse la determinacin con suero desproteinizado.

42

CON DESPROTEINIZACION PREVIA

PROBLEMA

ESTANDAR

BLANCO

ml
Suero

2.0

---

---

Estndar

---

2.0

---

Agua destilada

---

---

2.0

HCl 1 N

1.0

1.0

1.0

Mezclar, dejar reposar durante 45 minutos a temperatura ambiente.


TCA al 20%

1.0

1.0

1.0

Mezclar, y centrifugar luego el problema. Pipetear de las soluciones claras en


tubos limpios y secos.
Sobrenadante
exento
de
protenas o mezcla patrn o
mezcla blanco

2.0

2.0

2.0

Acetato de sodio

1.0

1.0

1.0

5 mg

5 mg

5 mg

1.0

1.0

1.0

Ascorbato de sodio
Reactivo de color
4.- CALCULOS
SIN DESPROTEINIZACION

CONCENTRACION DE HIERRO = (EPROBLEMA EBLANCO) x F g/dl


F= 100
EESTANDAR

CON DESPROTEINIZACION PREVIA


CONCENTRACION DE HIERRO =

EPROBLEMA x 100 ug/dl


EESTANDAR

43

5.- VALORES DE REFERENCIA


Hombres

59 158 g/dl

Mujeres

37 145 g/dl

6.- BIBLIOGRAFIA
Beale, R.N., Bostrom, J.O. Improved rapid methods for the determiantion of
iron content and binding capacity of serum.
Jclin. Pathol
Loria, A., Monge, B. Tcnicas de dosificaciones sricas de hierro y capacidad
de fijacin de hierro. Rev. Inv. Clin. 20:429 (1969).

44

CAPACIDAD LIBRE DE FIJACION DE HIERRO


1.- INTRODUCCION
En el plasma, el hierro se encuentra unido a la trasnferrina (b-globulina) y la
capacidad total de fijacin de hierro (C.T.F.H.) depende de la concentracin de
esta globulina. La transferrina que no se encuentra unida a hierro se conoce como
la capacidad libre de fijacin de hierro. La concentracin de hierro en el suero ms
la capacidad libre de fijacin de hierro es igual a la capacidad total de fijacin de
hierro.
CAPACIDAD TOTAL
DE FIJACION DE HIERRO

HIERRO EN EL
= SUERO

CAPACIDAD LIBRE DE
+ FIJACION DE HIERRO

La capacidad libre es determinada al adicionar un exceso de hierro al suero y


midiendo el hierro retenido despus de la adicin de carbonato de magnesio (o
bien una resina de intercambio inico) a la muestra..

FUNDAMENTO

Un exceso de hierro es aadido a la muestra para saturar totalmente a la


transferrina y el hierro libre se precipita por la adicin de carbonato de magnesio.
Se centrifuga y en el sobrenadante se determina el hierro unido a la transferrina
despus de la saturacin.
2.- OBJETIVOS

Determinar la capacidad libre de fijacin de hierro.

Calcular la capacidad total y el % de saturacin de la transferrina.

3.- OBJETIVOS (B)

3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Gradilla para tubos
Piseta

45

Celdas
Propipeta
Esptula
Papel sanitario
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda
la noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.

1. MATERIAL BIOLOGICO
Suero o plasma libre de hemlisis

2. EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Centrfuga

3. REACTIVOS
Solucin de batofenantrolina al 0.64%
Solucin amortiguadora de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cido ascrbico al 0.5%
Solucin de trabajo: cido ascrbico al 0.5%
En amortiguador de glicina-HCl pH 1.9
Solucin de cloruro de sodio al 0.85%
Solucin estndar de hierro 150 ug/dl
Solucin de hierro de 600 ug/dl
Carbonato de magnesio
Agua desionizada

4. MANEJO DE SUSTANCIAS
Para pipetear el material biolgico y los reactivos de esta tcnica es
necesario emplear propipeta.

46

5. TECNICA
Preparar tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla (es
recomendable realizar el problema por duplicado).
PROBLEMA
TUBO 1

TUBO 2
ml

Suero o plasma
Solucin hierro de
600 ug/dl

1.0
1.0
Dejar en reposo 20 minutos

Carbonato de magnesio

200.0 mg

1.0
1.0

200.0 mg

Mezclar vigorosamente durante 2 minutos, centrifugar a 3000 rpm


durante 30 minutos. Tomar del sobrenadante 0.5 ml de cada uno de los
tubos y procesarlos de la misma forma que para hierro srico.

47

BLANCO

ESTANDAR

PROBLEMA

ml
Amortiguador

2.0

2.0

2.0

Suero o plasma

---

---

0.5

Solucin salina

0.5

---

---

---

0.5

---

Solucin estndar 150ug/dl


Mezclar inmediatamente, dejar reposar de 30 a 90 minutos. Leer la
absorbancia A2 contra el blanco a una longitud de onda de 530 nm.
Solucin de batofenantro-lina
sulfonatada

0.05

0.05

0.05

Mezclar inmediatamente, dejar reposar de 30 a 90 minutos. Leer la


absorbancia A2 contra el blanco a una longitud de onda de 530 nm.
4.- CALCULOS
Capacidad libre
de combinacin

% de saturacin

A2 - A1 del problema
A2 - A2 del estndar
Conc. De Fe en suro

X conc.
estndar

Del

X 100

Capacidad libre
Capacidad total
de fijacin
de hierro

= hierro en el suero +

5.- VALORES DE REFERENCIA


Capacidad libre de combinacin
Hombres
Mujeres

200 - 300 g/dl


150 - 250 g/dl

Capacidad total de combinacin

48

capacidad libre de fijacin


de hierro

Hombres
Mujeres

300 - 400 ug/dl


250 - 350 ug/dl

% de saturacin
20 - 50
3.- PROCEDIMIENTO

(B)

3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 y 0.2 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Gradilla para tubos
Piseta
Celdas
Propipeta
El material de vidrio debe estar libre de Fe por lo que es necesario colocarlo toda
la noche en cido ntrico o clorhdrico diluido con un volumen igual de agua; al da
siguiente se enjuaga con agua libre de hierro y se deja secar.

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


suero o plasma libre de hemlisis

3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Bao de incubacin

3.4 REACTIVOS
Buffer Tris (hidroximetil) aminometano 1.0 M pH 8.3
Solucin reductora.- Sulfato de metilaminofenol 30
MM, hidrogenosulfito de sodio 162 mM.
Reactivo de coloracin.- Acido
Batofenantrolindisulfnico, sal disdica 1.7
Solucin estndar de hierro 2.5 mg/dl
Agua desionizada

3.5 MANEJO DE SUSTANCIAS

49

Para pipetear el material biolgico y los reactivos de esta tcnica es necesario


emplear propipeta.
BLANCO
Reactivos

ESTANDAR

BLANCO
Problema

PROBLEMA

ml
Suero

---

---

1.0

1.0

Buffer

0.5

0.5

0.5

0.5

Solucin estndar
--0.2
0.2
0.2
Mezclar, tapar los tubos y dejar en bao de agua durante 10 minutos a 450 C
Solucin reductora

0.2

0.2

0.2

0.2

Agua destilada

1.2

1.0

0.2

----

Reactivo de color

0.2

0.2

---

0.2

Mezclar, tapar los tubos y dejarlos a 45 C durante 90 minutos. Enfriar a


temperatura ambiente, medir las extinciones del problema y del estndar contra el
blanco de reactivos y la extincin del blanco del problema contra agua destilada a
535 nm.
4.- CALCULOS
CAPACIDAD LIBRE DE
FIJACION DE HIERRO
F=

= (EESTANDAR EPROBLEMA + EBLANCO) X f

500
EESTANDAR

50

5.- VALORES DE REFERENCIA


Capacidad libre de fijacin de hierro
Hombres
Mujeres

200 - 300 g/dl


150 - 250 g/dl

Capacidad total de fijacin de hierro


Hombres
Mujeres

300 - 400 g/dl


250 - 350 g/dl

6.- BIBLIOGRAFIA
Beale, R.N., Bostrom, J.O. Improved rapid methods for the determination of
iron content and binding capacity of serum.
Jclin. Pathol. 15:156 (1962)
Loria, A., Monge, B. Tcnicas de dosificaciones sricas de hierro y capacidad
de fijacin de hierro. Rev. Inv. Clin. 20:429 (1969).

51

HEMOGLOBINA FETAL
(DESNATURALIZACION ALCALINA)

1.- INTRODUCCION
La hemoglobina normal en el adulto (Hb A) consta de dos molculas protecas,
cada una de las cuales contiene dos cadenas polipeptdicas, llamadas a y b.
La hemoglobina fetal (Hb F) es similar a la Hb A, posee dos cadenas a pero difiere
en la presencia de dos cadenas y en lugar de las cadenas b. Al nacer, la Hb F
constituye el 80% de la Hb total, sin embargo, esta desciende a menos del 2-38 a
los seis meses de edad y persiste hasta la vida adulta.
La informacin para producir Hb F esta latente pero se manifiesta en niveles
importantes en ciertas patologas como son: trastornos talasmicos, algunas
hemoglobinopatas, anemia aplasica y metstasis medular.

FUNDAMENTO

La Hb F a diferencia de las dems hemoglobinas presentes en la sangre, resiste


condiciones de hidrlisis alcalina y cida.

2.- OBJETIVOS

Cuantificar la Hb F en una muestra de sangre.

Demostrar que la Hb F es ms resistente que las dems hemoglobinas,


frente a la desnaturalizacin con hidrxido de sodio.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13 X 100 mm
Tubos de ensayo de 13 x 150 mm
Pipetas de 0.2, 5.0 y 10 ml
Pipetas de sahli (0.02 ml)
Boquilla
Gradilla
Celdas de 1 cm de dimetro

3.2 MATERIAL BIOLOGICO

52

Sangre capilar o venosa con anticoagulante.

3.3 EQUIPO
Centrfuga
Espectrofotmetro o fotmetro
Agitador de tubos (Vortex)

3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8%
Hidrxido de sodio 0.083 N
Solucin salina al 0.9%
Cloroformo R.A.
EDTA al 0.3%
Sulfato de amonio al 50%

3.5 TECNICA
SEPARACION DEL HEMOLIZADO

La muestra de sangre es colectada aadiendo 1 mg de EDTA por cada ml de


sangre (EDTA al 10%), centrifugar y separar el plasma. Los eritrocitos son lavados
dos veces con solucin salina al 0.9%, a un volumen de clulas lavadas se les
aade un volumen de agua y un volumen de cloroformo. Mezclar en Vortex de 5 a
7 minutos, dejar 12 h a 4C; centrifugar a alta velocidad durante 30 minutos. La
capa superior acuosa, la cual contiene la Hb se transfiere a un recipiente limpio
para la determinacin de Hb fetal.

DETERMINACION DE HEMOGLOBINA FETAL

a.-

Medir 3.2 ml de NaOH 0.0083 N en un tubo.

b.-

Aadir 0.2 ml de solucin de Hb (hemolizado), lavar la pipeta varias veces


con la misma solucin. En el momento de la adicin poner en marcha el
cronmetro.

c.-

Al minuto exanto, aadir 6.6 ml de sulfato de amonio al 50%, tapar e invertir


el tubo inmediatamente seis veces.

d.-

Filtrar a travs de papel filtro.

e.-

Hacer un control por dilucin del hemolizado con EDTA al 0.3% en una
relacin de 1:251.

f.-

Leer las absorbancias del control y del filtrado contra agua a 540 nm.

53

4.- CALCULOS
% de Hb fetal =
=

Absorbancia del problema


Absorbancia del control X 5
Absorbancia del problema
Absorbancia del control

X 100
X 20

5.- VALORES DE REFERENCIA


En sangre normal es menor de un 2% despus de los 2 aos de edad.
6.- BIBLIOGRAFIA
Williams, W.J. Hematologa. Ed. Salvat. 2. Edicin. 1983.

54

FRAGILIDAD OSMOTICA
1.- INTRODUCCION
La prueba de fragilidad osmtica es un mtodo simple para valorar la relacin que
existe entre el rea/volumen del glbulo rojo y detectar por lo tanto la presencia de
algn defecto en la membrana del eritrocito. En algunas anemias hemolticas se
presentan alteraciones en la fragilidad de los glbulos rojos como sera el caso de
la esferocitosis hereditaria y las talasemias.

FUNDAMENTO

Los eritrocitos estn rodeados por una membrana semipermeable al agua y a


electrolitos. Si un eritrocito es colocado en una solucin hipotnica, el equilibrio
osmtico puede ser estabilizado por la accin del agua que penetra al glbulo rojo
y provoca que este se hinche hasta alcanzar una forma esfrica. En este punto se
produce un desplazamiento de los electrolitos u un cambio en la molcula de la
hemoglobina; posteriormente la membrana del eritrocito se rompe liberando toda
la hemoglobina contenida en l.
La cantidad de hemoglobina liberada es metida en diferentes concentraciones de
NaC1 y comparada con la obtenida en una muestra totalmente hemolizada. Los
eritrocitos presentan resistencia globular cuando estn en contacto con soluciones
hipotnicas de concentracin decreciente de NaC1. El punto donde se inicia la
hemlisis se le denomina resistencia mnima y cuando la hemlisis es completa se
llama resistencia mxima.
2.- OBJETIVOS

Evaluar la resistencia de la membrana de los eritrocitos a los cambios a


que son sometidas in vitro.

Determinar la resistencia mnima y mxima de una muestra.

3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Gradilla para tubos
Piseta
55

Celdas
Propipeta
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre heparinizada o desfibrinada o bien sangre recientemente
extrada en EDTA al 10% y lavada varias veces con solucin salina
isotnica.

3.- EQUIPO
Espectrofotmetro
Agitador de tubos
Centrifuga

3.4 REACTIVOS
Heparina
Solucin de NaC1 al 10% en amortiguador de fosfatos de pH 7.4
Solucin de trabajo de NaC1 al 1% (diluir la solucin anterior 1:10).

3.5 CONDICIONES DE LA MUESTRA


Es necesario utilizar muestra heparinizada o desfibrinada ya que si se emplea
sangre oxalatada o citratada, u otros anticoagulantes variarn las condiciones de
la determinacin.

56

3.6 TECNICA
Preparar 13 tubos de ensaye de 13x100 mm de acuerdo a la siguiente tabla:
TUBO

NaC1 1%
Ml

Agua dest.
Ml

Conc. De
NaC1 (X)

Absorbancia

Hemolisis
%

4.50

0.50

0.90

4.25

0.75

0.85

3.75

1.25

0.75

3.25

1.75

0.65

3.00

2.00

0.60

2.75

2.25

0.55

2.50

2.50

0.50

2.25

2.75

0.45

2.00

3.00

0.40

10

1.75

3.25

0.35

11

1.50

3.50

0.30

12

1.00

4.00

0.20

13

0.50

4.5

0.10

100

Homogenizar perfectamente la sangre y adicionar 0.05 ml a cada uno de los tubos


mezclando por inversin varias veces.
Dejar reposar los tubos durante 60 minutos a temperatura ambiente.
Resuspender y centrifugar todos los tubos a 1500 rpm durante 5 minutos.
Separar el sobrenadante de cada tubo y utilizando el del tubo #1 como blanco, leer
la absorbancia de los dems a 540 nm.

57

4.- CALCULOS
Obtener el % de hemlisis de cada uno de los tubos, relacionando la
absorbancia de cada tubo con la obtenida en el tubo # 13, sta equivale al
100% de hemlisis.
Graficar % de hemlisis contra la concentracin final de NaC1.
Obtener el valor de la concentracin de NaC1 a la cual obtiene el 50% de
hemlisis.
5.- VALORES DE REFERENCIA
0.47 0.57% de NaC1

50% de hemlisis.

6.- BIBLIOGRAFIA
Decie, J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975.

58

INDUCCION DE DREPANOCITOS
1.- INTRODUCCION
Existe una serie de alteraciones posibles en el proceso de sntesis de la molcula
de hemoglobina, entre las ms estudiadas de estas hemoglobinopatas, se
encuentran la Hb S cuya presencia ocasiona la llamada drepanocitosis, la cual es
una alteracin en la secuencia de aminocidos de la cadena beta de las globinas
(sustitucin de cido glutmico por valina), esto se traduce en una variacin de las
propiedades fisicoqumicas de la molcula, entre otras la baja solubilidad en
condiciones de baja tensin de oxgeno, polimerizando la Hb y favoreciendo la
forma caracterstica de este tipo de anemia.

FUNDAMENTO

La presencia del metabisulfito de sodio en una muestra de anemia falciforme


provoca disminucin de la tensin de oxgeno y por lo tanto la deformacin de los
eritrocitos al polimerizarse las molculas de hemoglobina S.
2.- OBJETIVO
Diagnosticar la presencia de anemia drepanoctica o sus variantes.
3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL
Portaobjetos y cubreobjetos
Tubos de 10x75 mm
Gradilla

3.2- MATERIAL BIOLOGICO


Sangre venenosa o capilar

59

3.3 EQUIPO
Microscopio

3.4 REACTIVOS
Metabisulfito de sodio al 2% en agua destilada (recin preparado)

3.5 TECNICA
En un portaobjetos colocar una gota del metabisulfito de sodio al 2% y una gota de
sangre venosa o capilar, mezclar con un aplicador. En seguida colocar un
cubreobjetos sobre la mezcla, paralelamente se monta un control, sustituyendo el
agente reductor por solucin salina fisiolgica.
Se mantiene en cmara hmeda durante 15 a 30 minutos y se observa al
microscopio con objetivo de 40X
4.- CALCULOS Y RESULTADOS
La sola presencia de clulas falciformes (drepanocitos) se considera como prueba
positiva, el control con solucin salina resulta til cuando existen alteraciones en la
forma (poiqulocitosis) debidas a otras patologas.
5.- VALORES DE REFERENCIA
Prueba negativa
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico Hematolgico. Ed.
Cientfico-Mdica 1973.
William J. William Hematology 3 Ed. Mc Graw-Hill Book Company 1983.

60

HEMOGLOBINA LIBRE EN PLASMA


1.- INTRODUCCION
Entre las causas principales de anemia, se encuentran las hemolticas, cuya
naturaleza puede ser intracorpuscular (hereditarias) o extracorpuscular
(adquiridas); en las primeras la destruccin se realiza en el vaso (extravascular) y
en las segundas generalmente se hemolizan intravascularmente, en este ltimo
tipo de anemias los niveles de hemoglobina en plasma se incrementan
notablemente, as que este parmetro es indicativo del tipo de hemlisis que sufre
el paciente.

FUNDAMENTO

La hemoglobina es una protena que acta como pseudoperoxidasa, esta


propiedad es aprovechada para ponerla de manifiesto al catalizar la oxidacin de
la bencidina por accin del agua oxigenada para producir un complejo de color
azul.
2.- OBJETIVO
Determinar los niveles de hemoglobina libre en plasma de una muestra
problema.
3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Tubos de ensaye de 16 X 150 mm
Pipetas serolgicas de 0.1, 1.0, 5.0 y 10.0 ml
Propipeta
Piseta
Gradilla
Celdas

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Sangre venenosa o arterial

3.3 EQUIPO

61

Centrifuga
Espectrofotmetro

3.4 REACTIVOS
EDTA al 10%
Heparina
Bencidina al 1%
Agua oxigenada al 1%
Estndar de hemoglobina 200 mg/L
3.5 TECNICA
Obtener la muestra de sangre de preferencia con heparina como anticoagulante
(0.1 ml, 100 unidades) o en su defecto con EDTA al 10% mezclar y centrifugar,
separar el plasma cuidadosamente y centrifugar nuevamente, transferir el plasma
a otro tubo.
Marcar 3 tubos de 16 X 150 mm :
PROBLEMA

ESTANDAR

BLANCO

Bencidina 1%

1.00 ml

1.0 ml

2.0 ml

Plasma

0.02 ml

---

---

Estndar de Hb

---

0.02%

---

Agua destilada

1.0 ml

1.0 ml

1.0 ml

H2O2
1.0 ml
1.0 ml
1.0 ml
MANTENER LOS TUBOS A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 20
MINUTOS
Acido actico 10%

10.0 ml

10.0 ml

10.0 ml

Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente. Leer a 515 nm.

62

4.- CALCULOS Y RESULTADOS


Absorbancia del problema
Absorbancia del estndar

X 200 mg/L = mg de Hb/L

5.- VALORES DE REFERENCIA


Menor a 30 mg/L

TOXICIDAD DE LAS SUSTANCIAS

La bencidina es un reactivo considerado como carcingenico por lo que se deben


extremar precauciones en su manejo.
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975

63

RECOMENDACIONES GENERALES PARA REALIZAR


LAS PRUEBAS DE COAGULACION
2. Todo el material debe lavarse con agua bidestilada y slo se emplear para
pruebas de coagulacin.
3. La mezcla de anticoagulante y sangre debe ser exacta. La solucin de citrato
de sodio al 3.8% se debe emplear en una proporcin de una parte de
anticoagulante para nueve partes de sangre. La mezcla debe realizarse por
inversin suave del tubo y no por agitacin.
4. No usar reactivos con fecha de caducidad vencida. Debe tenerse mucho
cuidado de no contaminar con plasma o con reactivos los viales empleados
para cada determinacin.
5. Los reactivos empleados deben alcanzar la temperatura indicada evitndose al
mismo tiempo un sobrecalentamiento (Tomar en cuenta que se trabaja con un
sistema multienzimtico). Tambin debe tomarse el tiempo de incubacin
debidamente.
6. Usar siempre un control de plasma humano normal fresco o liofilizado para
todas las determinaciones realizadas.
7. Utilizar tubos de vidrio recubiertos de silicn.
8. Efectuar todas las pruebas por duplicado.
9. No utilizar material de vidrio que este daado o rayado.
10. La obtencin del espcimen debe ser realizado bajo las mejores condiciones y
evitando en todo momento cualquier fuente de variacin (e.g. tiempo
prolongado de la toma, personal inexperto, etc.)
11. La muestra deber procesarse mximo despus de dos horas de haberla
tomado, en caso de no ser as deber refrigerarse y trabajarla en el transcurso
de la maana.
12. No utilizar muestras hemolizadas.

64

FRAGILIDAD CAPILAR
(PRUEBA DEL TORNIQUETE)

1.- INTRODUCCION
La hemostasis es el conjunto de fenmenos que tienden a controlar el sangrado
cuando hay lesin en un vaso sanguneo. Dentro de los mecanismos que
participan en este proceso estn: Los Vasculares y los Celulares, representados
por el endotelio vascular y las plaquetas respectivamente.
Una de las pruebas que mide ambos mecanismos es la prueba del torniquete o
fragilidad capilar, puesto que las plaquetas y el cemento intercelular de los vasos
(vitamina C) son los factores de mayor importancia para conservar la integridad de
los vasos.

FUNDAMENTO

Esta prueba permite someter a prueba la resistencia capilar mediante la aplicacin


de una presin debida al esfingomanmetro colocado alrededor del antebrazo.
Esto provocar a aparicin de unas cuantas petequias en la zona seleccionada de
un paciente normal. Sin embargo, el nmero de stas se incrementar en
situaciones de trombocitopenia o en alteraciones vasculares. La prueba puede ser
positiva an en pacientes con tiempo de sangrado normal.
2.- OBJETIVO
Conocer y aplicar una prueba til en la deteccin de trastornos
vasculares y celulares de la coagulacin.
3.- PROCEDIMIENTO

3.1 MATERIAL
Esfingonanmetro
Estetoscopio

65

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Es una prueba in vivo

3.3 REACTIVOS
No requiere reactivos
3.3 TECNICA
1.2.-

3.4.-

Obtener la presin arterial y calcular el promedio de las lecturas.


En el brazo opuesto colocar el esfingomanmetro. Marcar una zona de 3
cm de dimetro en el antebrazo. Esta deber estar libre de marcas o
petequias.
Aplicar la presin promedio obtenida durante 5 minutos.
Retirar el esfingomanmetro y al cabo de 5 minutos observar la presencia
de petequias en el antebrazo en el rea seleccionada y a una distancia de 5
cm de la zona de aplicacin.

4.- CALCULOS Y RESULTADOS


El nmero de petequias comprendidas en el rea mencionada no debe
ser superior a 20. En casos normales las petequias aparecen con
frecuencia justo debajo del borde inferior del esfingomanmetro, estas no
se toman en cuenta.
5.- VALORES DE REFERENCIA
0 a 20 petequias/3 cm. de dimetro
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El Laboratorio en el Diagnstico Hematolgico. Ed.
Cientfico-Mdica 1973
Lynch-Raphael. Mtodos de Laboratorio en el Diagnstico 2. Ed.
Interamericana 1972.
Todd-Sanford. Diagnstico Clnico por el Laboratorio 6. Ed. Salvat 1979.
William J. Williams Hematology 3. Ed. Mc. Graw-Hill Bool Company
1983.
66

TIEMPO DE SANGRADO
1.- INTRODUCCION
Un tiempo de sangrado normal indica una retraccin normal de los capilares y la
existencia de un nmero suficiente de plaquetas con actividad normal. Se alarga
en la insuficiencia del factor VII, prpura trombocitopnica, tromboastenia de
Glanzmann, en la enfermedad de Von Willebrand, etc.
Esta prueba da informacin de la funcin hemosttica global de las plaquetas in
vivo, por la determinacin del tiempo del sangrado de una incisin estndar en la
piel mientras se mantiene aumentada la presin venosa, con ayuda de un
esfingomanmetro.
Adems de ser una prueba global de los mecanismos de coagulacin, es
importante en la evaluacin de trombocitopenia debido a su capacidad para
discriminar entre las plaquetas con funcin normal y las que tienen funcin
disminuida o aumentada.

FUNDAMENTO

La determinacin del tiempo de sangrado mide: la capacidad de los capilares para


controlar el sangrado, cantidad y calidad de las plaquetas y la actividad de los
factores en el control del sangrado.
2.- OBJETIVOS
Realizar dos determinaciones de tiempo de sangrado.
Evaluar la importancia de esta determinacin, as como sus ventajas y
limitaciones.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Lencetas estriles
Torundas de algodn con alcohol
Papel filtro
3.2 EQUIPO
Esfingomanmetro

67

3.3 TECNICA
METODO DE DUKE

a) Dar masaje suave al lbulo de la oreja y limpiarlo con una torunda de algdon
impregnada con alcohol (tambin puede hacerse en el pulpejo del dedo
anular).
b) Con una lanceta estril hacer una puncin de 2 x 4 mm de profundidad (con un
movimiento rpido) en el borde inferior del lbulo de la oreja o en el pulpejo del
dedo. En el momento en que aparece la gota de sangre se marca el tiempo en
el cronmetro.
c) Cada 15 segundos se aplica cuidadosamente sobre la gota de sangre el borde
de un papel filtro, sin tocar la herida.
d) Para el cronmetro en el momento en que el papel filtro ya no se manche de
sangre.
Nota: No abarcar venas visibles ni lesiones cutneas. Hay que recordar que
ciertos factores locales (presencia de hematomas) pueden variar el tiempo de
sangrado.

NOTIFICACION DE MARX

Despus del paso (b) del mtodo anterior, se introduce el lbulo de la oreja, en un
vaso de precipitado de 50 ml con agua a 37 C; el cronmetro se pone en marcha
cuando se observa la aparicin de un hilo continuo de sangre. En el instante en
que este se interrumpe se para el cronmetro.

METODO DE IVY

a) En el brazo del paciente se coloca el esfingomanmetro a una presin de 40


mm de Hg durante 2 a 4 minutos.
b) En el antebrazo del paciente se define un rea y utilizando una lanceta estril,
se hacen 3 punciones de 2 x 4 mm de profundidad, (evitando las venas visibles
o lesiones cutneas). En el momento en que aparece la gota de sangre se
marca el tiempo en el cronmetro.
c) Cada 30 segundos secar la gota con un papel filtro, procurando no tocar la piel,
hasta que desaparezca la sangre.
d) Parar el cronmetro en el momento en que el papel filtro ya no se manche de
sangre.
68

4.- VALORES DE REFERENCIA


Mtodo de Duke
Mtodo de Marx
Mtodo de Ivy

1 3 minutos
3 5 minutos
3 7 minutos

5.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfico-Mdica (1973) Espaa.
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983) USA.

69

RETRACCION DEL COAGULO


1.- INTRODUCCION
Cuando los mecanismos celulares de la coagulacin se activan como ocurre en
una lesin vascular, las plaquetas tienden a obturar el sitio lesionado formando as
un trombo dentro del cual quedan atrapados adems de plaquetas los otros
elementos formes de la sangre. Las plaquetas entonces liberan una protena
fibrilar contractil, llamada trombostenina que es la causante de la retraccin del
cogulo. Existen trastornos plaquetarios sobre todo cualitativos donde esta funcin
esta alterada.

FUNDAMENTO

Al tomar una muestra de sangre sin anticoagulante y colocarla en un tubo, ocurre


primero coagulacin y posteriormente la retraccin del cogulo; est en funcin de
la cantidad y capacidad funcional de las plaquetas.
2.- OBJETIVO
Evaluar mediante esta prueba la cantidad y calidad de las plaquetas en una
muestra problema.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de centrfuga graduados
Tapn de hule con tirabuzn
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre sin anticoagulante
3.3 EQUIPO
Bao de incubacin a 37 C

70

3.4 TECNICA
Se toma 5 ml de sangre por puncin venosa y se colocan en el tubo de centrifuga
graduado, se tapa con el tapn de hule con tirabuzn, se deja coagular y se
mantiene a 37 C durante una hora.
Despus de esta incubacin se saca y se observa el cogulo (compacto o
gelatinoso); el tubo con el suero y los glbulos rojos restantes se centrifugan a
3000 rpm durante 5 minutos despus de lo cual se lee el volumen total de suero
que corresponde al suero expulsado del cogulo.
4.- RESULTADOS
El volumen total de sangre es el 100%
El volumen de suero representa el x %
A este resultado se le resta el valor del hematocrito y esto es el porcentaje de
retraccin.
5.-VALORES DE REFERENCIA
25% de retraccin
6.- BIBLIOGRAFIA
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983)- USA.

71

TIEMPO DE COAGULACION
1.- INTRODUCCION
El diagnstico y estudio de un efecto de coagulacin cualquiera, representa
interacciones complejas entre sistemas enzimticos y varias protenas enzimticas
lbiles.
Se encuentran tiempos prolongados en la hemfilia clsica y en la deficiencia del
factor IX, la prueba carece de valore para insuficiencias ligeras de distintos
factores, porque basta una pequea cantidad de trombina para producir un
cogulo de fibrina.
Es menos til para anomalas de las ltimas etapas de la coagulacin.

FUNDAMENTO

Nos da un ndice de la eficacia global del sistema intrnseco, as como del sistema
celular.
2.- OBJETIVO
Medir el tiempo de coagulacin de la sangre in vitro
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 13x100 mm
Gradilla para tubos
Tubos capilares
Lancetas estriles
3.2 MATERIAL
Bao de incubacin a 37 C
Cronmetro
3.3 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre total sin anticoagulante.

72

3.4 METODO
1) Mtodo de Lee-White
a) Colocar sangre obtenida por puncin venosa en dos tubos de ensayo
(2 ml aproximadamente), poner en marcha el cronmetro.
b) Poner los tubos en bao de incubacin a 37C.
c) Al cabo de 3 minutos se inclina un tubo cada 15 segundos con
agitacin suave y otro cada 30 segundos con el fin de determinar el
tiempo de coagulacin.
d) Se nota como tiempo de coagulacin al intervalo de tiempo
transcurrido desde que la sangre entra en contacto con el cristal hasta
que al invertir completamente el segundo tubo la sangre ya no fluye.
Sacando el promedio de los dos tubos se obtiene el tiempo de
coagulacin.
2) Mtodo capilar
a) Aseptizar la yema del dedo y puncionar firmemente con una lanceta
estril.
b) Se desecha la primera gota y se llena un capilar, cuidando de que no
queden burbujas de aire, poner el cronmetro en marcha.
c) A partir del tercer minuto se procede a romper pedazo a pedazo el
capilar hasta observar la formacin del hilo de fibrina, en el momento
en que se presenta la coagulacin; parar el cronmetro.
5 VALORES DE REFERENCIA
Mtodo de lee-White
Mtodo capilar

5 10 minutos
3 5 minutos

Comentarios
1) El tiempo de coagulacin es relativo. Sobre el tiempo normal de coagulacin
influyen: La temperatura, el tamao y la superficie del tubo, el pH de sangre,
frecuencia e inclinacin y otros factores ms.
2) La puncin no debe ser traumtica, no debe ejercerse presin sobre el rea de
puncin.

73

3) Es importante encontrar la vena limpia y rpidamente obtener la sangre al


primer intento, pues de otra manera se provocara la entrada a la jeringa de
sustancias tisulares y por lo tanto acortar el tiempo de coagulacin.
4) De ser posible deben usarse tubos nuevos que no hayan tenido contacto con
detergentes.
5) El dimetro interior del tubo de ser constante, la sangre coagula ms
rpidamente en tubos pequeos.
6) La temperatura influye, temperatura inferior a 37C retarda la coagulacin.
7) El punto final es relativo, tambin, no indica que haya coagulacin completa en
toda la sangre; lo que sucede es que sea formado suficiente fibrina en la zona
de contacto con el aire para sostener toda columna de sangre con el tubo
completamente invertido.
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfico-Mdica (1973) Espaa
William J. William. Hematology 3- Ed. MgGraw-Hill Book Co. (1983) USA.

74

TIEMPO DE PROTROMBINA
1.- INTRODUCCION
La protrombina tiene un peso molecular aproximado de 75,000. La protrombina es
una a-1 globulina que se sintetiza en el
hgado y requiere para su sntesis la vitamina k.
Esta prueba mide la actividad coagulante del sistema extrnseco incluyendo
fibringeno, protrombina y factores V, VII y X. Adems permite registrar los efectos
de anticoagulantes y tambin se emplea en el diagnstico de trastornos de la
coagulacin congnitos y adquiridos.

FUNDAMENTO

Cuando el calcio y un extracto de tejido de cerebro (Factor III, fosfolpidos y


protenas y que constituyen una tromboplastina completa) son aadidos al plasma,
inmediatamente el factor VII reacciona con el factor V, calcio y los fosfolpidos
presentes en extracto del tejido para dar origen a la protrombinasa extrnseca, la
cual transforma a la protrombina en trombina; sta convierte al fibringeno en
fibrina.
La velocidad de formacin de la fibrina depende de la concentracin de los
factores V, VII y X, protrombina, fibringeno por lo tanto la prueba valora la
actividad de la totalidad de estos factores, es decir, los que participan en la va
intrnseca, excepto el factor XIII.
2.- OBJETIVOS
Realizar una curva de actividad de protrombina vs tiempo.
Evaluar el tiempo de protrombina en plasmas normales y patolgicas.

75

3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo por 13x100 mm
Tubos de ensayo de 10x75 mm
Pipetas serolgicas de 0.1 ml
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Pipetas serolgicas de 5.0 ml
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla para tubos
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Plasmas citratado pobre en plaquetas. (sangre venosa adicionada de
citrato de sodio al 3.8% en una proporcin de 9 partes de sangre y una
de anticoagulante, la cual es centrifugada a 3000 rpm durante 10
minutos).
3.3 EQUIPO
Centrifuga
Bao de incubacin a 37C
Cronmetro
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8 %
Tromboplastina lquida activada
Cloruro de calcio 0.02 M

3.5 CONDICIONES DE LA MUESTRA


Es necesario que la mezcla de anticoagulante y sangre se haga adecuadamente y
en la proporcin indicada; puesto que muestras donde se observa cogulos
pequeos se deben descartar. El plasma deber separarse inmediatamente del
paquete de eritrocitos y colocado en hielo.
3.6 TECNICA
a) Mantener el plasma en bao de hielo hasta el momento de la determinacin.
b) Homogenizar adecuadamente el reactivo de tromboplastina.
c) Transferir a un tubo de 10 x 75 mm la cantidad de CaCl2 suficiente para el
nmero de pruebas a efectuar y mantenerlo a una temperatura de 37C en el
bao de incubacin.
76

d) Adicionar 0.1 ml de plasma a un tubo e incubar durante 2 minutos.


e) Posteriormente agregar 0.1 ml de tromboplastina activada (previamente
incubada durante 10 minutos) y colocar la mezcla en el bao de incubacin a
371C.
f) Agregar 0.1 ml de CaC1212 0.02 M a la mezcla de plasma y tromboplastina, y
simultneamente poner en marcha el cronmetro.
g) Agitar inmediatamente la mezcla y mantenerla en el bao de incubacin a
37C. Es necesario revisar constantemente la apariencia de la mezcla y para
ello se debe contar con buena iluminacin para observar oportunamente la
aparicin de los primeros filamentos de fibrina; este es el momento final de la
prueba y se detiene la marcha del cronmetro.
PLASMA
NORMAL
ml

SOLUCION
NaC1 0.85%
ml

ACTIVIDAD
%

1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1

0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9

100
90
80
70
60
50
40
30
20
10

Con cada una de las diluciones continuar a partir del punto 4 de la tcnica.
Graficar los valore obtenidos del tiempo en segundos contra actividad en %.
Utilizar para ello papel milimtrico o semilogartmico.

77

4.- RESULTADOS
Los resultados se expresan en tiempo en segundos o bien en % de actividad.
Un tiempo prolongado (% de actividad bajo, es decir menor al 60%) indicar la
deficiencia de uno o ms de los siguientes factores
Factor I (Fibringeno)
Factor II (Protrombina)
Factor V (Proacelerina, Factor lbil)
Factor VII (proconvertina, factor estable)
Factor X (Factor de Stuart-Prower)
5.- VALORES DE REFERENCIA
Tiempo de protrombina 10 - 15 segundos
% de actividad mayor al 60&
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth
Edition. Churchill Livingstone, New York. 1975

78

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL


1.- INTRODUCCION
Es un estudio sobre el efecto del factor antihemoflico en las pruebas de
coagulacin de una fase, Longdell, Wagner y Brinkhous (1953) demostracin que
haba dos tipos de actividad troboplastnica y confirmaron la observacin de Mills
(1926) de que los preparados de cefalina cruda no coagulan el plasma hemoflico
tan pronto como al plasma normal.
Cuando las tromboplastinas hsticas activas fueron diluidas o fraccionadas, tenan
estos preparados una actividad semejante a la de la cefalina cruda. Basndose en
estos hallazgos, los preparados de tromboplastina pueden describirse como
completos o parciales. Las tromboplastinas completas son capaces de producir
una coagulacin tan rpida en el plasma hemoflico como en el normal, mientras
que con la parcial el plasma hemoflico coagula menos rpidamente que el plasma
normal.

FUNDAMENTO

El tiempo de tromboplastina parcial mide la actividad intrnseca de la coagulacin


del plasma. El tiempo requerido para que el plasma recalcificado coagule despus
de la incubacin con fosfolpidos plaquetarios (cefalina) y un activador (caoln) del
factor de contacto, es una medida de intensidad con la cual se forma la trombina a
travs de la va intrnseca de la coagulacin.
Esta prueba mide los factores VIII, IX, XII, II, V, X y la conversin de fibringeno a
fibrina.
2.- OBJETIVOS
Analizar el mecanismo de accin de la tromboplastina parcial dentro del
fenmeno de la coagulacin.
Familiarizarse con las precauciones que requiere esta tcnica y todas las
de coagulacin.

3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
tubos de ensayo de 13x100 mm
tubos de ensayo de 10x75 mm
pipetas serolgicas de 0.1 ml
79

pipetas serolgicas de 1.0 ml


pipetas Pasteur con bulbo
gradilla para tubos

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Plasma citratado pobre en plaquetas (sangre venosa adicionada de
citrato de sodio al 3.8% en una proporcin de 9 partes de sangre y una
de anticoagulante, la cual es centrifugada a 3000 rpm durante 10
minutos).
3.3 EQUIPO
centrifuga
bao de incubacin a 37C
cronmetro
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8%
Tromboplastina parcial lquida activada
Cloruro de calcio 0.02 M
3.5 CONDICIONES DE MUESTRA
Es necesario que la mezcla de anticoagulante y sangre se haga adecuadamente y
en la proporcin indicada; puesto que muestras donde se observa cogulos
pequeos se deben descartar. El plasma deber separarse inmediatamente del
paquete de eritrocitos y ser colocado en hielo.
3.6 TECNICA
1. Adicionar a un tubo de ensaye de 10 x 75 mm 0.1 ml de tromboplastina parcial
lquida activada e incubarlo a 37C durante 2 minutos.
2. Transcurrido los dos minutos, agregar 0.1
perfectamente e incubar a 37C por 2 minutos.

ml

de

plasma,

mezclar

3. Agregar 0.1 ml de cloruro de calcio 0.02 M (que se encuentra tambin a la


misma temperatura) y simultneamente poner en funcionamiento el
cronmetro. Incubar, a los 20 segundos observar cuidadosamente el tubo de la
prueba, haciendo resbalar el contenido por la pared, hasta la aparicin de los
primeros hilos de fibrina. En este momento detener el funcionamiento del
cronmetro. La observacin debe hacerse con mucha rapidez metiendo y
sacando el tubo del bao de agua.

80

4.- RESULTADOS
La prolongacin anormal indica deficiencias intrnsecas de un factor o presencia
de un inhibidor. Solo el factor VII no est incluido en el tiempo de tromboplastina
parcial. Detecta deficiencias importantes de los factores VIII, IX, XI, XII o presencia
de inhibidores (anticoagulantes circulantes) como la heparina, anticuerpos
dirigidos contra el factor VIII o IX.
5.- VALORES DE REFERENCIA
Tiempo de tromboplastina parcial 40 3 segundos.
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975

81

TIEMPO DE TROMBINA
1.- INTRODUCCION
La trombina es la enzima activa que transforma el fibringeno en fibrina. El calcio
acelera esta reaccin, pero no es aadido a la prueba. La velocidad de
coagulacin con la trombina es una funcin de la concentracin de fibringeno. La
trombina es una globulina que tiene un PM de 37,700 daltons.
Consta de 2 cadenas de longitud desigual unidas por un puente disulfuro. La
cadena A de la trombina contiene 49 residuos de aminocidos y no contiene
carbohidratos; la cadena B tiene 225 residuos y deriva de la terminal C de la
protrombina y contiene el centro activo de la enzima (residuo de la serina).

FUNDAMENTO

Mide el tiempo de coagulacin del plasma citratado en presencia de trombina,


explora la ltima fase de la coagulacin. Se encuentra alargado el tiempo de
trombina cuando el fibringeno se encuentra disminuido, o bien, est presente la
heparina o productos de degradacin de fribringeno y fibrina en cantidades
importantes.
2.- OBJETIVO
Emplear una prueba rpida para determinar la concentracin de fibringeno.
Detectar la presencia de productos de la degradacin del fibringeno o de la
fibrina.
3.- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensayo de 10 x 75 mm
Pipetas de 1.0 ml graduadas 1/100
Cronmetro
Gradilla
Bao de incubacin a 37C

82

3.2 MATERIAL BIOLOGICO


Plasma citratado pobre en plaquetas.
3.3 REACTIVOS
Citrato de sodio 3.8%
Solucin salina fisiolgica
Trombina humana de 50 unidades NIH
3.4 TOXICIDAD DE SUSTANCIAS
La trombina humana es preparada a partir de mezclas de plasmas y aunque el
reactivo tiene una reaccin negativa para hepatitis, sto no excluye el riesgo del
contagio; por lo que es necesario manejar el reactivo de trombina y el material
biolgico con sumo cuidado.

3.5

TECNICA

1. Reconstituir la trombina humana de 50 unidades NIH con 1 ml de solucin


salina fisiolgica, tomar 0.5 ml de sta y llevarla a 10 ml con solucin salina
(Reactivo de trombina). Asegurarse que con un plasma normal el tiempo de
trombina est entre 18-22 segundos.
2. Poner 0.2 ml del reactivo de trombina e incubarlo 2 minutos a 37C.
3. Agregar 0.2 ml de plasma citratado, poner el cronmetro en marcha y anotar el
tiempo de coagulacin.
4.- RESULTADOS
Anotar el tiempo de la formacin del cogulo.
5.- VALORES DE REFERENCIA
18 22 segundos
La prolongacin del tiempo de trombina se presenta cuando hay una deficiencia
de fibringeno o bien la presencia de un inhibidor de la reaccin de trombinafibringeno.

83

6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975

84

FIBRINOGENO
1.- INTRODUCCION
Los procedimientos para determinar fibringeno pueden ser: Cuantitativos
(Colorimtricos y fsicos) y semicuantitativos (observacin del cogulo): Dentro de
los ms usados se cuentan los mtodos nefelomtricos, enzimticos y
gravimtricos.

FUNDAMENTO

(Mtodo enzimtico de Claus).- La trombina transforma al fibringeno soluble en


un polmero insoluble (fibrina), la velocidad de la reaccin esta determinada por la
concentracin del fibringeno. Este mtodo mide el fibringeno funcional.
(Mtodo de Ratnoff).- El fibringeno del plasma es transformado en fibrina
utilizando tromboplastina y cloruro de calcio. La cuantificacin de fibringeno se
hace en base a su contenido de tirosina en la molcula utilizando el reactivo
fenlico de Folin-Ciocalteau. Este mtodo mide fibringeno total.
2.- OBJETIVO
Ejecutar e interpretar correctamente esta prueba.
3.- PROCEDIMIENTO METODO DE CLAUSS
3.1 MATERIAL
Tubos para pruebas de coagulacin fibrotips y fibrocups (BBL)
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre anticoagulado con citrato de sodio al 3.8% en proporcin
anticoagulante-sangre 1:10
3.3 EQUIPO
Fibrmetro
Cronmetro
Centrfuga

3.4 REACTIVOS
85

Citrato de sodio 3.8&


Trombina humana (aprox. 50 unidades NHI/ml
Fibrindex
Amortiguador de veronal 2.84 x 102 M en cloruro de sodio 1.25 X 10 pH
7.35
3.5 TOXICIDAD DE SUSTANCIAS
La trombina humana es preparada a partir de mezclas de plasmas y aunque el
reactivo tiene una reaccin negativa para hepatitis, sto no excluye la posibilidad;
por lo que es necesario manejar el reactivo de trombina y el material biolgico con
sumo cuidado.

3.6
-

TECNICA

PREPARACION DE LA CURVA DE CALIBRACION

1. Con el amortiguador se efectan una serie de diluciones de un estndar de


fibringeno (1:5, 1:10, 1:40).
Efectuar en el fibrmetro determinacin por duplicado a cada dilucin.
a) Incubar 0.2 ml. de la dilucin del fibringeno durante 2 minutos a 37 oC.
b) Adicionar 0.1 ml del reactivo de trombina (a temperatura ambiente) y accionar
el cronmetro del fibrmetro, el cual se para automticamente al formarse el
cogulo.
c) Anotar el tiempo de coagulacin para cada uno de los puntos y trazar una
grfica de concentracin en mg/dl contra tiempo en segundos.
DETERMINACION DEL FIBRINOGENO PROBLEMA

a) Hacer una dilucin de la muestra 1:10 en el amortiguador. Todas las


determinaciones se hacen por duplicado, se procesan de igual manera que los
puntos de la curva.
b) Anotar el tiempo de coagulacin y obtener en la curva de calibracin la
concentracin de fibringeno del problema.
c) El resultado se reporta en mg/dl.

4.- CALCULOS Y RESULTADOS

86

Si el tiempo obtenido es muy corto (ms de 800 mg/dl) se diluye el plasma 1:20 y
el resultado obtenido se multiplica por 2.
Si el tiempo es muy prolongado (menos de 50 mg/dl) se efecta una dilucin 1:5 y
el resultado se divide entre 2.
Si con una dilucin 1:2 el plasma no coagula, la concentracin de fibringeno es
menor de 15 mg/dl.
5.- VALORES DE REFERENCIA
200 400 mg/dl
3.- PROCEDIMIENTO METODO DE RATNOFF
3.1 MATERIAL
Tubos de centrfuga de 15 ml
Pipetas serolgicas de 0.1, 0.2, 1.0, 5.0 y 10 ml
Pipetas Pasteur
Tubos de cultivo de 13 x 100 mm
Tubos de cultivo de 16 x 150 mm
Gradilla
Mechero
Tripie
Tela de alambre
Vaso de precipitados de 200 ml
Piseta
Propipeta
Vidrio molido
Celdas
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Sangre anticoagulada con citrato de sodio al 3.8% en proporcin
anticoagulante-sangre 1:10.
Centrfugar a 1500 rpm durante 5 minutos para separar el plasma.

87

3.3 EQUIPO
Espectrofotmetro
Bao de incubacin
Centrfuga
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio 3.8%
Solucin de cloruro de sodio 0.85%
Hidrxido de sodio al 10%
Carbonato de sodio al 20%
Reactivo de Folin-Ciocalteau
Tromboplastina lquida activada
Cloruro de calcio 0.02 M
Solucin estndar de tirosina 20 mg/dl = 234 mg/dl de fibringeno

88

3.5 TECNICA
Colocar en un tubo de centrfuga de 15 ml:
ml
Vidrio molido

1.5

Cloruro de sodio 0.85%

10.0

Tromboplastina

0.2

Cloruro de calcio 0.02 M

1.5

Agitar suavemente por inversin


Incubar a 37C durante 10 minutos.
Agitar suavemente por inversin.
Centrifugar 10 minutos a 2500 rpm
Descartar el sobrenadante con ayuda de una pipeta
Pasteur.
Repetir 2 veces el lavado de la fibrina.
Descartar el sobrenadante
En este punto es necesario incluir un blanco que se prepara colocando en un tubo
de centrfuga de 15 ml, el mismo volumen de vidrio molido que el problema. (ver
cuadro anexo).

89

Problema

Blanco
ml

Hidrxido de sodio 10%

1.0

1.0

Colocar los tubos en bao de agua en ebullicin durante


10 minutos. Enfriar en hielo.
Carbonato de sodio 20%

3.0

3.0

Agua destilada

7.0

7.0

Folin-Ciocalteau

1.0

1.0

Mezclar despus de la adicin de cada reactivo. Reposar


a temperatura ambiente 10 minutos. Centrifugar 5 minutos
a 2000 rpm. Transferir a tubos de 13 x 100 mm los
siguientes volmenes:
Sobrenadante de c/tubo

1.0

1.0

Agua destilada

2.0

2.0

Leer la absorbancia del problema contra el blanco a 650


nm e interpolar el valor en la curva de calibracin

90

CURVA DE CALIBRACION

Concentracin
mg/dl

blanco

702

468

234

93.6

ml
Estndar de tirosina

1.5

1.0

0.5

0.2

--

Hidrxido de sodio 10%

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Agua destilada

5.5

6.0

6.5

6.8

7.0

Mezclar despus de la adicin de cada reactivo. Hervir 10 minutos y enfriar.


Carbonato de sodio 20%

3.0

3.0

3.0

3.0

3.0

Folin-Clocalteau

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Mezclar todos los tubos y reposar 10 minutos


Tomar de cada uno de los tubos 1.0 ml y mezclar con 2 ml de agua destilada
(Excepto el blanco). Leer la absorbancia a 650 nm.
4.- CALCULOS Y RESULTADOS
1

mg de tirosina = 11.7 mg de fibringeno

5.- VALORES DE REFERENCIA


200 400 mg/dl
6.- BIBLIOGRAFIA
Cartwright, G.E. El laboratorio en el Diagnstico
Hematolgico. 4. Edicin Cientfica-Mdica (1973)
Teliz Sandoval E. Estudio comparativo de 5 mtodos para determinar el
fibringeno en plasma Tesis de Licenciatura UNAM, 1982.
William J. Williams, Hematology, 3. Ed. Mc. Graw-Hill Book Company 1983.

91

TIEMPO DE LISIS DE EUGLOBULINAS


1. INTRODUCCION
En la fraccin euglobulinica del plasma, se encuentra el fibringeno, el
plasmingeno y las fibrinlisinas. Esta tcnica suprime los inhibidores del
plasmingeno. Las fibrinlisinas del glbulo rojo destruidas aceleran la lisis, pero
se encuentran en cantidades muy constantes, en cambio existe variacin en la
fibrinlisis plasmtica.
Si el paciente cursa con un cuadro de fibrinlisis aumentada, las actividades
presentes en dicha reaccin transformarn al plasmingeno en plasmina y esta
ltima actuar sobre la fibrina formada de manera acelerada.

FUNDAMENTO

La fraccin euglobulinica del plasma preparada por dilucin y acidificacin, est


relativamente libre del sistema enzimtico fibrinlitico La desaparicin del cogulo
va a significar la lisis de euglobulinas, y por lo tanto es un indicio de la presencia
de plasmina y/o de los activadores del plasmingeno.
2.- OBJETIVO
Valorar el componente fibrinoltico.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 13 x 100 mm
Pipetas serolgicas de 0.2, 1.0 y 5.0 ml
Aplicadores de madera
Gradilla
Matraz erlenmeyer de 50 ml
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Plasma citratado pobre en plaquetas
3.3 EQUIPO

92

Centrfuga
Bao de incubacin a 37 C
3.4 REACTIVOS
Acido clorhdrico 0.1 N
Amortiguador de imidazol pH 7.3
Trombina diluida (solucin de trabajo 1:10)
Acido actico 1%
Cloruro de calcio 0.025 M
3.5 TECNICA A
a. En un tubo de ensaye de 13 X 100 mm colocar:
4.2 ml de agua destilada
0.15 ml de cido clorhdrico
0.3 ml de plasma problema
b. Tapar el tubo con papel parfilm y agitarlo por inversin suavemente.
c. Centrifugar a 3000 rpm durante 5 minutos
d. Desechar el sobrenadante.
e. Agregar 0.3 ml de amortiguador de imidazol
f. El precipitado se resuspende con aplicador previamente mojado en
amortiguador de imidazol.
g. Agregar 0.1 ml de trombina diluida
h. Agitar el tubo suavemente, taparlo con papel parafilm y colocarlo en bao de
incubacin a 37 oC
i. Observar la formacin del cogulo cada 10 minutos.

93

TECNICA B

a. En un matraz erlenmeyer de 50 ml agregar 19 ml de agua destilada.


b. Adicionar 1.0 ml de plasma y 0.35 ml de cido actico al 1% (gota a gota y
agitando).
c. Reposar a 4 oC durante 10 minutos.
d. Agitar y repartir en 4 tubos volmenes iguales.
e. Centrifugar a 3500 rpm durante 5 minutos.
f. Decantar el sobrenadante y secar la pared interna de los tubos con papel filtro.
g. Redisolver con 1 ml de amortiguador de imidazol.
h. Colocar en bao de incubacin a 37 oC.
i. Coagular con 2 gotas de cloruro de calcio 0.025 M o 0.1 ml de trombina (debe
coagular entre 1 minuto 45 segundos a 2 minutos).
j. Observar la lisis del cogulo en las 2 primeras horas.
4.- VALORES DE REFERENCIA
El cogulo debe permanecer formado ms de 90 minutos.
5.- BIBLIOGRAFIA
Astrup, T. The biological significance of fibrinolysis Lancet 11:565. 1956.
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975

94

SULFATO DE PROTAMINA
1.- INTRODUCCION
El sulfato de protamina tiene la propiedad de inducir la polimerizacin no
enzimtica de complejos solubles de monmeros de fibrina, que se forman en el
plasma cuando se encuentran trazas de trombina circulante. Tal fenmeno se
denomina paracoagulacin y consiste en la formacin de filamentos de fibrina o de
un verdadero cogulo despus de aadir sulfato de protamina.

FUNDAMENTO

Los complejos solubles de monmeros de fibrina con fibringeno y productos de la


degradacin de fibrina y fibringeno o ambos, precipitan cuando se aade
protamina al plasma.
2.- OBJETIVO
Detectar los monmeros solubles de fibrina y/o los productos de degradacin
de fibringeno y fibrina.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 10 x 75 mm
Pipetas serolgicas de 0.2, 1.0 y 5.0 ml
Tubos de centrfuga de 5 ml
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Plasma citratado pobre en plaquetas

3.3 EQUIPO
Cronmetro
Bao de incubacin a 37 oC

95

3.4 REACTIVOS
Solucin de sulfato de protamina 1% en amortiguador TRIS pH 6.5
0.05 M.
Amortiguador TRIS pH 6.5 0.05 M
3.5 TECNICAS
a) Efectuar una dilucin 1:5 de la solucin de sulfato de protamina con el
amortiguador TRIS.
b) Colocar 0.2 ml de esta dilucin en un tubo de 10 x 75 mm.
c) El plasma pobre en plaquetas (ppp) del problema se obtiene al centrifugar el
plasma rico en plaquetas durante 10 minutos a 3500 rpm. El ppp se coloca en
un tubo limpio y se incuba a 37 oC durante 5 minutos.
d) Adicionar 0.2 ml del ppp al tubo que contiene 0.2 ml del sulfato de protamina
(dilucin 1:5).
e) Tapar el tubo y colocarlo a 37 oC durante 30 minutos. Agitar suavemente y
observar la apariencia de la mezcla de reaccin. Reportar considerando los
criterios indicados en la parte de resultados.
4.- RESULTADOS
g
rf

=
=
=

gelacin
red de fibrina
precipitado grueso

=
=

precipitado fino
solucin clara

Si el resultado es positivo es necesario realizar diluciones del sulfato de protamina


con el amortiguador TRIS en las siguientes proporciones: 1:10; 1:20 y 1:40. Para
cada una de estas diluciones continuar con la tcnica desde el inciso (b).

96

5.- VALORES DE REFERENCIA


Negativo = solucin clara
La presencia de un precipitado granular fino significa la existencia de bajos niveles
de monmeros de fibrina o productos de degradacin de fibringeno y de fibrina.
Se considera positiva si los tubos presentan cogulos de fibrina o precipitado fina.
3- BIBLIOGRAFIA
Seaman, A.J. The plasma protamine paracoagulation test.
1985. Arch Intern Medical.
Barrantes, A. Hemostasia y trombosis. 1980. Laboratorio de investigacin
clnica.

97

GELACION DE ETANOL
1.- INTRODUCCION
En algunas patologas de los sistemas de la coagulacin como en Coagulacin
Intravascular Diseminada (CID) o en procesos fibrinolticos, se producen productos
de degradacin de la fibrina o del fibringeno, as como monmeros de fibrina; los
cuales son capaces de paracoagular en presencia de etanol.

FUNDAMENTO

En esta prueba se aprovecha la propiedad de provocar la paracoagulacin que


tiene el etanol sobre los complejos solubles: monmeros de fibrina o fragmentos
Xo ligados a productos de degradacin del fibringeno o de la fibrina.
2.- OBJETIVO
Observar las reacciones de paracoagulacin en una muestra problema.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 10 x 75 mm
Pipetas serolgicas de 1.0 ml
Gradilla
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Plasma citratado pobre en plaquetas
3.3 EQUIPO
Bao de incubacin a 22 C
3.4 REACTIVOS
Citrato de sodio al 3.8%
Etanol al 50% en agua destilada

98

3.5 TECNICA
En un tubo de 10 x 75 mm colocar 0.5 ml de plasma pobre en plaquetas. Colocarlo
en el bao de incubacin durante 3 minutos; adicionar 0.15 ml de etanol al 50%,
agitar suavemente el tubo y mantener en reposo durante 10 minutos a 2 oC (TA),
despus de este tiempo observar con inclinacin cuidadosa del tubo, la
gelificacin de la muestra.
4.- RESULTADOS
Gelacin
No gelacin

= positiva
= negativo

Interpretacin.- Dado que esta prueba es positiva para monmeros de fibrina


como para productos de degradacin del fibringeno, es necesario que el
resultado se analice en forma integral con el resto de las pruebas de laboratorio.
5.- VALORES DE REFERENCIA
No se observa gelacin
6.- BIBLIOGRAFIA
Martnez C. Adela, et al. Tcnicas de Hemostasia y trombosis Grupo
CLATES. Buenos Aires, Argentina. 1975.

99

HEMOLISINAS Y AGLUTININAS
1.- INTRODUCCION
Los anticuerpos completos son capaces de producir aglutinacin o hemlisis en
presencia de solucin salina. Las hemolisinas son anticuerpos que producen la
hemolisis de los hemates en presencia de completo.
Las aglutininas son anticuerpos que producen aglutinacin de los hemates. El
antgeno del hemate se denomina aglutingeno para que tenga lugar la
aglutinacin, no es necesario que haya complemento.
En el campo de la Inmunohematologa se ha comprobado que existen distintos
tipos de anticuerpos en base a su tamao, peso molecular, temperatura ptima de
reaccin medio de reaccin, etc. en cuanto a estas propiedades han sido
clasificados en dos grupos: anticuerpos fros y anticuerpos calientes.
Los anticuerpos fros reaccionan mejor en rango de temperatura de 20 a 30 oC.
Puede interferir en la clasificacin sangunea del individuo y en las pruebas de
compatibilidad realizadas a temperatura ambiente. Estos anticuerpos se
denominan IgM con un peso molecular de 900,000 y reacciona en medio salino.

FUNDAMENTO

Las hemolisinas al estar en presencia del antgeno que estimul su formacin y


del complemento, desencadenan una reaccin que causa la lisis de los eritrocitos.
Este fenmeno es el resultado de la accin enzimtica del complemento, el cual
es activado por la unin del antgeno y del anticuerpo especfico; el complemento
activado va a producir cambios en la permeabilidad de la membrana del eritrocito y
al cambiar las propiedades osmticas de sta, penetran los lquidos y se produce
el estallamiento de los eritrocitos (hemlisis).
2.- OBJETIVO

Realizar la tcnica de titulacin de hemolisinas y aglutininas en un suero


problema.

Interpretar los resultados obtenidos y establecer su utilidad.

100

3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de cultivo de 13 x 100 mm
Tubos de cultivo de 10 x 75 mm
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla
Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Suero problema (A, B O)
Suspensin de glbulos rojos (A, B AB) al 4% en solucin salina
3.3 EQUIPO
Centrfuga
3.4 REACTIVOS
Solucin de cloruro de sodio al 0.9%

101

3.5 TECNICA
Preparar una serie de tubos con las siguientes diluciones del suero problema
empleado solucin salina para ello:
1:1, 1:2, 1:4, ..........., 1:1024
4 gotas del suero
problema

4 gotas de
sol. salina

4 gotas de sol.
Salina

4 gotas
del suero
problema
sin diluir

4 gotas de
dil. 1:2

1:1

1:2

....... Dil.
1:1024

1:4

Agregar a todos los tubos 2 gotas de la suspensin de glbulos rojos al 4%.


Centrifugar todos los tubos y centrifugar a 3000 rpm durante 30 segundos.
Observar la aglutinacin y reportar el ttulo.
Incubar una hora a temperatura ambiente todos los tubos y centrifugar 3 minutos a
3000 rpm.
Observar hemlisis y reportar el ttulo. En ambos casos se reporta el ttulo de la
dilucin en la cual todava se presenta hemlisis o aglutinacin.
4.- RESULTADOS
Dilucin :
Dilucin :

Hemolisinas
Aglutininas

5.- VALORES DE REFERENCIA


No debe presentarse hemlisis en diluciones mayores a 1:64
6.- BIBLIOGRAFIA
Dacie,J.V. and Lewis, S.M. Practical Hematology. Fifth Edition. Churchill
Livingstone, New York. 1975

102

ANTICUERPOS IRREGULARES
1.- INTRODUCCION
Dentro de los sistemas antgeno-anticuerpo a nivel eritrocitario se presentan
anticuerpos, tanto regulares como irregulares; dentro de stos se encuentran
generalmente inmunoglobulinas anti A y anti B, a los que se les ha denominado
hemolisinas, aglutininas, anticuerpos fros, anticuerpos completos, anticuerpos
salinos o anticuerpos regulares; generalmente de naturaleza IgM.
Tambin es posible detectar anticuerpos de otros sistemas diferentes al ABO y a
stos se les denomina anticuerpos calientes, anticuerpos albumina o anticuerpos
irregulares, de naturaleza IgG.
La reaccin antgeno-anticuerpo es especfica; tenemos que poner en contacto el
anticuerpo con el antgeno especfico, para lo cual necesitamos como reactivo a
eritrocitos con sus antgenos identificados plenamente. Estos eritrocitos pueden
conseguirse comercialmente, pero tambin son preparados por el Banco Central
de Sangre del IMSS. Se les conoce Panel de clulas de fenotipo conocido.

FUNDAMENTO

El rastreo de anticuerpos irregulares antieritrocitos, est indicado en pacientes


politransfundidos, mujeres multparas con antecedentes de productos con
enfermedad hemoltica del recin nacido, las mujeres embarazadas con Rh
negativo y en la seleccin de donadores de sangre.
Su determinacin ser til tanto en diagnstico como en la eliminacin de
donadores peligrosos.
2.- OBJETIVO
Determinar la presencia de anticuerpos irregulares y si stos estn presentes
identificar su especificidad.
3- PROCEDIMIENTO
3.1 MATERIAL
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Tubos de hemlisis 10 X 75 mm
Pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla
Piseta
103

Papel sanitario
Papel parafilm
3.2 MATERIAL BIOLOGICO
Suero problema
Eritrocitos problema al 2-3% en solucin salina
Panel de clulas de fenotipo conocido, lavadas y suspendidas al 2-3%
en solucin salina.
3.3 EQUIPO
Centrfuga
Reloj de intervalos
Bao de incubacin a 37 C
3.4 REACTIVOS
Solucin salina al 0.9%
Albumina bovina al 22% o 30%
Suero antiglobulina humana (suero de Coombs)
3.5 TECNICA
a. Rotular 10 tubos de 10 X 75 mm del a al 10 y otro ms como autotestigo.
b. Poner en cada tubo 2 gotas del suero del paciente.
c. Poner una gota de los eritrocitos del panel en su tubo correspondiente.
d. Colocar una gota de los eritrocitos del paciente (2%) al tubo marcado como
autotestigo.
e. Mezclar y centrifugar a 3400 rpm por 30 segundos.
f. Leer aglutinacin tubo por tubo. Reportar el resultado.
Aglutacin
No aglutinacin

= anticuerpos irregulares de naturaleza IgM.


= continuar la tcnica

g. Adicionar a todos los tubos tres gotas de albumina bovina al 30%.


h. Agitador y centrifugar a 3400 rpm 45 segundos.
i. Resuspender con suavidad el botn de eritrocitos y anotar resultados.
Aglutinacin
= anticuerpos irregulares de naturaleza IgG (alb-salina).
No aglutinacin
= continuar la tcnica.
104

j. Incubar los tubos a 37 oC durante 1 hora, despus de lo cual centrifugar a 3400


rpm durante 45 segundos.
k. Suspender con suavidad el botn de eritrocitos y anotar resultados.
Aglutinacin
=anticuerpos irregulares de naturaleza IgG (alb.-salina 37 oC.
No aglutinacin
=continuar la tcnica.
l. Lavar el botn de glbulos rojos 3 veces con solucin salina despus del ltimo
lavado eliminar el sobrenadante y resuspender el botn.
m. Adicionar una gota de suero de Coombs, agitar con suavidad, centrifugar a
3400 rpm durante 15 segundos.
n. Resuspender y anotar los resultados.
Aglutinacin
= anticuerpos irregulares de naturaleza IgG (alb-Coombs).
No aglutinacin
= Ausencia de anticuerpos irregulares.
Nota: Cuando se observa hemlisis y aglutinacin o nicamente aglutinacin
el resultado es positivo.
La aglutinacin se califica desde poca aglutinacin = graniento hasta
aglutinacin total = 4.
4.- RESULTADOS
Si no hubo hemlisis ni aglutinacin en ninguno de los tubos el resultado es
negativo, es decir no hay anticuerpos irregulares fuera del sistema ABO.
Si hubo resultados positivos, stos se comparan con la carta que acompaa a las
clulas del panel que se llama carta del panel para identificar la especificidad y se
reporta as:
Anticuerpos irregulares antieritrocito fuera del sistema ABO positivos de probable
especificidad ___________________ (la encontrada por ejemplo Anti S, anti P).

105

Hay que recordar que las 10 clulas del panel es un muestreo de los fenotipos de
la poblacin. Estn seleccionados los antgenos contra los cuales se producen
anticuerpos ms frecuentemente. La importancia de elegir el panel elaborado por
el Banco Central de Sangre, es que est elaborado, tomando en cuenta la
estructura antgenica de nuestra poblacin mexicana.
Una vez establecida la especificidad, efectuar titulacin de anticuerpos irregulares
mediante la prueba de alb-Coombs para ellos se efectan diluciones al doble del
suero en solucin salina y se adicionan los eritrocitos correspondientes, se
procesa igual que en la tcnica anterior, el ltimo tubo donde se observa
aglutinacin es el ttulo de anticuerpos irregulares.
5.- VALORES DE REFERENCIA
Negativo
6.- BIBLIOGRAFIA
Quintanar, E. Manual de tcnicas y procedimientos del Banco Central de
Sangre. Instituto Mexicano del Seguro Social.

106

REACTIVOS
1. SOLUCION DE EDTA AL 10%
EDTA sal disdica
Agua destilada c.b.p.

10.0 g
100.0 ml

2. SOLUCION DE DRABKIN
Bicarbonato de sodio
Ferricianuro de potasio
Cianuro de potasio
Saponina
Agua destilada c.b.p.

1.0 g
0.20 g
0.05 g
0.10 g
1000.00 ml

Solucin difana de color amarillo plido, estable en frasco mbar a


temperatura ambiente durante 6 meses
3. SOLUCION DE HAYEM
Cloruro de mercurio
Cloruro de sodio
Sulfato de sodio anhidro
Agua destilada c.b.p.

0.50 g
1.00 g
5.00 g
200.00 g

Disolver en el orden indicado. Estable por 2-3 semanas.


4. SOLUCION DE NUEVO AZUL DE METILENO
Nuevo azul de metileno
Oxalato de potasio
Cloruro de sodio
Saponina
Agua destilada c.b.p.

0.50 g
1.40 g
0.80 g
100.00 ml

Filtrar antes de usar.


5. SOLUCION DE AZUL DE CRISAL BRILLANTE AL 1%
Azul de cresil brillante
Solucin salina al 0.85% c.b.p.

1.00 g
100.00 ml

6. SOLUCION DE TURK
Acido actico glacial
Violeta de gensiana al 1%
Agua destilada c.b.p.

3.00 ml
1.00 ml
100.00 ml

107

Filtrar la solucin antes de usarla.


7. SOLUCION DE ALCOHOL ETILICO AL 70%
Alcohol etlico absoluto
Agua destilada c.b.p.

70.00 ml
100.00 mL

8. SOLUCION DILUYENTE DE PLAQUETAS


Citrato de sodio
Formaldehdo al 40%
Azul de cresil brillante
Agua destilada c.b.p.

3.80 g
0.20 ml
0.10 g
100.00 ml

Guardar la solucin en refrigeracin. Filtrar antes de usarla.


9. SOLUCION DE OXALATO DE AMONIO AL 1%
Oxalato de amonio
Agua destilada c.b.p.

1.00 g
100.00 ml

Guardar la solucin en refrigeracin. Filtrar antes de usarla.


10.METABISULFITO DE SODIO AL 2%
Metabisulfito de sodio
Agua destilada c.b.p.

2.00 g
100.00 ml

Debe prepararse diariamente.


11.CLORURO DE SODIO AL 0.85%
Cloruro de sodio
Agua destilada c.b.p.

0.85 g
100.00 ml

12.SOLUCION DE CLORURO DE SODIO AL 1% AMORTIGUADA


CON FOSFATOS A pH 7.4
Cloruro de sodio
Fosfato disdico
Fosfato monosdico
Agua destilada c.b.p.

180.00 g
27.31 g
4.86 g
2000.00 ml

Solucin de trabajo al 1%: diluir la solucin 1:10 con solucin salina


isotnica.

108

13.SOLUCION DE CITRATO DE SODIO AL 3.8%


Citrato de sodio
Agua destilada c.b.p.

3.80 g
100.00 ml

14.SOLUCION DE CLORURO DE SODIO AL 0.9%


Cloruro de sodio
Agua destilada c.b.p.

0.90 g
100.00 ml

15.SOLUCION DE HIDROXIDO DE SODIO 0.083 N


Hidrxido de sodio
Agua destilada c.b.p.

3.32 g
1000.00 ml

16.SOLUCION DE SULFATO DE AMONIO SATURADA. REACTIVO


PRECIPITANTE
Sulfato de amonio
Agua destilada

350.00 g
500.00 ml

Filtrar y diluir 400 ml del filtrado con 400 ml de agua


destilada.Adicionar:
Acido clorhdrico 10 N (ajustar el pH a 7.0)
Este reactivo es estable indefinidamente en frasco de polietileno a
temperatura ambiente.
17.SOLUCION DE EDTA AL 0.3%
EDTA sal disdica
Agua destilada c.b.p.

0.30 g
100.00 ml

18.REACTIVO DE BENDICINA
Bendicina
Acido actico glacial
Agua destilada c.b.p.

1.00 g
90.00 ml
100.00 ml

19.SOLUCION DE PEROXIDO DE HIDROGENO AL 1%


Perxido de hidrgeno al 30%
Agua destilada c.b.p.

3.30 g
100.00 ml

20.SOLUCION DE ACIDO ACETICO AL 10%


Acido actico glacial
Agua destilada c.b.p.

10.00 g
100.00 ml

109

21.SOLUCION DE BATOFENENTROLINA SULFONATADA AL 0.64%


Batofenantrolina sulfonatada
Agua destilada c.b.p.

0.64 g
100.00 ml

22.SOLUCION DE ACIDO ASCORBICO AL 0.5%


Acido ascrbico
Agua destilada (libre de Fe)

50.00 g
10.00 ml

23.SOLUCION AMORTIGUADORA DE GLICINA-HCl pH 1.9


Glicina
Agua destilada c.b.p. (libre de Fe)
Ajustar el pH a 1.9 0.02 con
HC1 1N
Agua destilada c.b.p.

0.75 g
30.00 ml
50.00 ml

24.SOLUCION DE TRABAJO: ACIDO ASCORBICO AL 0.5%AMORTIGUADOR DE GLICINA-HC1


1 volumen de amortiguador de glicina HC1
2 volmenes de solucin de cido ascrbico al 0.5%
25.SOLUCION DE HIERRO 150 g/dl
Hierro G.R.
Disolver en H2S04 IN
Agua destilada c.b.p.

150.00 mg
100.00 ml

26.SOLUCION DE HIERRO DE 300 g/dl


Igual que la anterior, pero usando 300 mg de hierro.
27.SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO 0.0125 M
Cloruro de calcio
Agua destilada c.b.p.

1.38 g
1000.00 ml

28.SOLUCION DE CLORURO DE CALCIO 0.02 M


Cloruro de calcio
Agua destilada c.b.p.

2.22 g
1000.00 ml

110

29.SOLUCION AMORTIGUADORA DE VERONAL DE OWREN pH


7.35
Dietil barbiturato de sodio
Cloruro de sodio
Agua destilada
Acido Clorhdrico 0.1 N
Ajustar el pH a 7.35
Agua destilada c.b.p.

11.75 g
14.67 g
500.00 ml
ml
2000.00 ml

30.SOLUCION AMORTIGUADORA DE VERONAL (OWREN-KOLLER)


pH 7.4
Igual que la solucin anterior, pero ajustar el pH a 7.4
31.SOLUCION DE ALCOHOL ETILICO AL 50%
Etanol absoluto
Agua destilada c.b.p.

50.00 ml
100.00 ml

32.AMORTIGUADOR DE FOSFATOS pH 7.2


Fosfato dibsico de sodio
Fosfato monobsico de potasio
Agua destilada
Ajustar el pH a 7.2
Agua destilada c.b.p.

1.14 g
0.49 g
900.00 ml
1000.00 ml

111

TABLA DE % DE TRANSMITANCIA ABSORBANCIA


%T

%T

%T

%T

1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
11.0
11.5
12.0
12.5
13.0
13.5
14.0
14.5
15.0
15.5
16.0
16.5
17.0
17.5
18.0
18.5
19.0
19.5
20.0
20.5
21.0
21.5
22.0
22.5
23.0
23.5
24.0
24.5
25.0
25.5

2.000
1.824
1.699
1.602
1.523
1.456
1.398
1.347
1.301
1.260
1.222
1.187
1.155
1.126
1.097
1.071
1.046
1.022
1.000
.979
.959
.939
.921
.903
.886
.870
.854
.838
.824
.810
.796
.782
.770
.757
.745
.733
.721
.710
.699
.688
.678
.668
.658
.648
.638
.629
.620
.611
.602
.594

26.0
26.5
27.0
27.5
28.0
28.5
29.0
29.5
30.0
30.5
31.0
31.5
32.0
32.5
33.0
33.5
34.0
34.5
35.0
35.5
36.0
36.5
37.0
37.5
38.0
38.5
39.0
39.5
40.0
40.5
41.0
41.5
42.0
42.5
43.0
43.5
44.0
44.5
45.0
45.5
46.0
46.5
47.0
47.5
48.0
48.5
49.0
49.5
50.0
50.5

.585
.577
.569
.561
.553
.545
.538
.530
.523
.516
.509
.502
.495
.488
.482
.475
.469
.462
.456
.450
.444
.438
.432
.426
.420
.414
.409
.403
.398
.392
.387
.382
.377
.372
.367
.362
.357
.352
.347
.342
.337
.332
.328
.323
.319
.314
.310
.305
.301
.297

51.0
51.5
52.0
52.5
53.0
53.5
54.0
54.5
55.0
55.5
56.0
56.5
57.0
57.5
58.0
58.5
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