Lipasas y Fosfolipasas en La Preparación de Nucleósidos Modificados y Sus Precursores

Universidad Nacional de Quilmes
Tesis Doctoral
Lic. Esteban Daro Gudio

Lipasas y fosfolipasas en la preparacin de nuclesidos
modificados y sus precursores
2011
El presente trabajo de Tesis Doctoral, para optar por el

grado de Doctor en Ciencias Bsicas y Aplicadas de la
Universidad Nacional de Quilmes, ha sido realizado
en el Laboratorio de Biotransformaciones, Departamento de Ciencia y Tecnologa
de la Universidad Nacional de Quilmes, bajo la direccin del
Dr. Luis Iglesias y la codireccin del Dr. Adolfo
Iribarren
NDICE
Captulo 1 Introduccin y objetivos ................................................................................................ 1
1.1.
Nuclesidos naturales y modificados ...................................................................................... 3
1.1.1.
Generalidades .................................................................................................................. 3
1.1.2.
Aplicaciones .................................................................................................................... 4
1.2.
1.1.2.1.
Antivirales ............................................................................................................... 4
1.1.2.2
Antitumorales .......................................................................................................... 9
Sntesis de nuclesidos .......................................................................................................... 10
1.2.1.
Sntesis de nuclesidos a travs de la formacin del enlace glicosdico ....................... 11
1.2.1.1.
Biocatlisis, biotransformaciones y biocatalizadores ............................................ 12
1.2.1.1.1.
Ventajas de las biotransformaciones ..................................................................... 12
1.2.1.1.2.
Desventajas de las biotransformaciones ................................................................ 14
1.2.1.1.3.
Enzimas aisladas vs clulas enteras....................................................................... 15
1.2.1.1.4.
Clasificacin de las enzimas.................................................................................. 16
1.2.1.1.5.
Lipasas................................................................................................................... 17
1.2.1.1.6.
Lipasa B de Candida antarctica (CAL B) ............................................................ 18
1.2.1.1.7.
Lipasa de Candida rugosa (CRL) ......................................................................... 20
1.2.2.
Sntesis biocataltica de nuclesidos ............................................................................. 21
1.2.2.1.
Generalidades ........................................................................................................ 21
1.2.3.
Sntesis de precursores en la sntesis de nuclesidos furanosas desacetiladas
regioselectivamente ....................................................................................................................... 23
1.2.4.
Antecedentes de la desproteccin regioselectiva de furanosas catalizadas por
enzimas. ............................................................................................................................... ..25
1.3.
Modificacin de nuclesidos naturales - prodrogas .............................................................. 26
1.3.1.
Derivados lipdicos de nuclesidos ............................................................................... 28
1.3.1.1.
1.3.2.
Fosfoslipasa D reaccin de transfosfatidilacin ................................................. 29
Derivados fosforilados de nuclesidos .......................................................................... 34
1.3.2.1.
Aplicaciones .......................................................................................................... 34
1.3.2.2.
Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato ................................................................ 36
1.3.2.2.1.
Hidrlisis de cidos nucleicos ............................................................................... 36
1.3.2.2.2.
Fermentacin directa ............................................................................................. 37
1.3.2.2.3.
Fosforilacin catalizada por nuclesido fosfotransferasa...................................... 38

I
1.4.
1.3.2.2.4.
Fosforilacin catalizada por quinasas.................................................................... 38
1.3.2.2.5.
Fosfatasas cidas no especficas bacterianas ......................................................... 38
1.3.2.2.6.
Fosforilacin indirecta utilizando fosfolipasas...................................................... 39
Inmovilizacin de enzimas .................................................................................................... 40
1.4.1.
Generalidades ................................................................................................................ 40
1.4.2.
Mtodos de inmovilizacin ........................................................................................... 42
1.4.2.1.
Mtodos por retencin qumica ............................................................................. 42
1.4.2.1.1.
Adsorcin .............................................................................................................. 43
1.4.2.1.2.
Unin covalente..................................................................................................... 44
1.4.2.2.
Mtodos por unin fsica ....................................................................................... 45
1.4.2.2.1.
Atrapamiento ......................................................................................................... 45
1.4.2.2.2.
Inclusin en membranas ........................................................................................ 46
1.4.3.
Efectos de la inmovilizacin ......................................................................................... 46
1.4.3.1.
Efectos en la estabilidad ........................................................................................ 47
1.4.3.2.
Efectos en la actividad enzimtica ........................................................................ 48
1.5.
Objetivos del presente trabajo ............................................................................................... 50
1.6.
Bibliografa ........................................................................................................................... 52
Captulo 2 Parte experimental ....................................................................................................... 59

2.1.
Materiales .............................................................................................................................. 61
2.1.1.
2.2.
Consideraciones generales ............................................................................................ 61
Metodologa .......................................................................................................................... 62
2.2.1.
Sntesis de pentofuransidos peracetilados ................................................................... 62
2.2.1.1.
Sntesis de metil D-pentofuransidos peracetilados .............................................. 62
2.2.1.2.
Sntesis de alquil-2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos .................................. 66
2.2.2.
Sntesis de pentofuranosas peracetiladas ....................................................................... 69
2.2.3.
Alcohlisis catalizadas por lipasas ................................................................................ 72
2.2.3.1.
Procedimiento analtico ......................................................................................... 72
2.2.3.2.
Procedimiento preparativo .................................................................................... 72
2.2.4.
Hidrlisis catalizada por lipasas .................................................................................... 75
2.2.4.1.
2.2.4.2.
Procedimiento preparativo .................................................................................... 75
2.2.5.
Alcohlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente ...................... 76
II
2.2.5.1.
2.2.6.
Hidrlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente......................... 76
2.2.6.1.
Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO] ................. 77
2.1.6.2.
Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][PF6] ................................................ 77
2.2.7.
Reacciones de transfosfatidilacin en medio bifsico catalizadas por la fosfolipasa D 78
2.2.7.1.
Cribado de microorganismos con capacidad de catalizar la reaccin de
transfosfatidilacin .................................................................................................................... 78
2.2.7.2.
netropsis
Obtencin del crudo enzimtico de fosfolipasa D proveniente de Streptomyces

79
2.2.7.3.
Reacciones de transfosfatidilacin ........................................................................ 79
2.2.8.
Inmovilizacin de la fosfolipasa D................................................................................ 86
2.2.8.1.
Inmovilizacin por adsorcin en Duolite ........................................................... 86
2.2.8.2.
Inmovilizacin en alginato .................................................................................... 87
2.2.8.3.
Inmovilizacin en glioxil-agarosa ......................................................................... 87
2.2.8.4.
Inmovilizacin en poliuretano ............................................................................... 88
2.2.8.5.
Inmovilizacin por tecnologa sol-gel ................................................................... 88
2.2.8.5.1.
Sntesis del precursor tetraquis-(2-hidroxietil)-ortosilicato (THEOS) .................. 88
2.2.8.5.2. Protocolo de inmovilizacin de PLD y PLD/colina oxidasa en sol-geles dopados

con quitosano ............................................................................................................................ 88
2.2.8.6.
2.2.9.
2.3.
Inmovilizacin en agarosa ..................................................................................... 89
Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos ................................................................................ 89
2.2.9.1.
Reacciones en fase heterognea ............................................................................ 89
2.2.9.1.1.
Hidrlisis con pulsos enzimticos ......................................................................... 90
2.2.9.2.
Reacciones en fase homognea ............................................................................. 90
2.2.9.3.
Cribado de nuevos biocatalizadores ...................................................................... 91
2.2.9.3.1.
Procedimiento experimental del screening............................................................ 91
2.2.9.3.2.
Medicin de la actividad de las soluciones de PLC .............................................. 91
Bibliografa ........................................................................................................................... 92
Captulo 3 Desproteccin regioselectiva de pentofuranosas y pentofuransidos peracetilados ... 95

3.1.
Objetivos y resumen .............................................................................................................. 97
3.2.
Resultados y discusin .......................................................................................................... 97
3.2.1.
Sntesis de los distintos sustratos................................................................................... 97
3.2.1.1.
Sntesis de los furansidos utilizados .................................................................... 97

III
3.2.1.2.
Sntesis de furanosas peracetiladas........................................................................ 99
3.2.2.
Efecto del sustituyente en el carbono anomrico sobre la regioselectividad de la
alcohlisis de ribofuransidos acetilados catalizada por CAL B ................................................ 100
3.2.3.
Efecto de la configuracin de la furanosa sobre la regioselectividad de la reaccin .. 107
3.2.4
Alcohlisis en lquidos inicos.................................................................................... 113
3.2.5
Hidrlisis enzimtica de pentofuranosas acetiladas .................................................... 117
3.2.5.1
Hidrlisis en ILs .................................................................................................. 119
3.2.5.1.1
Hidrlisis con [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO] ................................................ 119
3.2.5.1.2
Hidrlisis con [BMIM][PF6] ............................................................................... 120
3.2.5.1.3
Cuantificacin de las reacciones de hidrlisis por HPLC ................................... 122
3.3
Conclusiones ....................................................................................................................... 126
3.4
Bibliografa ......................................................................................................................... 127
Captulo 4 Estudio de la diastereoselectividad en las alcohlisis e hidrlisis de pentofuranosas y

pentofuransidos catalizadas por lipasas......................................................................................... 131
4.1
Objetivos y resumen ............................................................................................................ 133
4.2
Resultados y discusin ........................................................................................................ 133
4.2.1
Diastereoselectividad en reacciones con ribofuransidos con diversos sustituyentes
anomricos .................................................................................................................................. 133
4.2.2
Diastereoselectividad en reacciones con 2-desoxirribosas, arabinosas y xilosas ........ 137
4.3
Conclusiones ....................................................................................................................... 144
4.4
Bibliografa ......................................................................................................................... 145
Captulo 5 Preparacin de fosfoliponuclesidos ......................................................................... 147

5.1.
5.2.
5.2.1.
Cribado de biocatalizadores ........................................................................................ 149
5.2.2.
Sntesis de 5-(3-sn-fosfatidil)-nuclesidos................................................................. 153
5.2.3.
Evaluacin de diversas condiciones experimentales de la reaccin de
transfosfatidilacin ...................................................................................................................... 156
5.3.
5.2.3.1.
Temperatura ........................................................................................................ 156
5.2.3.2.
Utilizacin de detergentes en el medio de reaccin ............................................ 159
5.2.3.3.
Evaluacin del exceso estequiomtrico de los sustratos ..................................... 162
Conclusiones ....................................................................................................................... 164

IV
5.4.
Bibliografa ......................................................................................................................... 165
Captulo 6 Inmovilizacin de la fosfolipasa D Transfosfatidilacin en medio anhidro ........... 167

6.1.
6.2.
6.2.1.
Evaluacin de distintos tipos de inmovilizacin ......................................................... 169
6.2.2.
Tecnologa sol-gel ....................................................................................................... 173
6.2.2.1.
Obtencin del precursor THEOS ........................................................................ 175
6.2.2.2.
Optimizacin del proceso de inmovilizacin sol-gel .......................................... 176
6.2.2.3.
Coinmovilizacin de colina oxidasa y fosfolipasa D .......................................... 178
6.3.
Conclusiones ....................................................................................................................... 181
6.4.
Bibliografa ......................................................................................................................... 181
Captulo 7 Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato: Hidrlisis de los fosfatidilnuclesidos ...... 183

7.1.
7.2.
7.2.1.
Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos en medio heterogneo .......................................... 186
7.2.2.
Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos con pulsos de PLC ............................................... 190
7.2.3.
Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos en medio acuoso .................................................. 192
7.2.4.
Cribado de nuevos biocatalizadores ............................................................................ 194
7.3.
Conclusiones ....................................................................................................................... 195
7.4.
Bibliografa ......................................................................................................................... 197
Captulo 8 Resumen de resultados, conclusiones generales y perpectivas ................................. 199

8.1.
Resumen de resultados ........................................................................................................ 201
8.2.
Conclusiones generales y perpectivas ................................................................................. 202
Apndices ....................................................................................................................................... 205
VI
Captulo 1 Introduccin y objetivos
CAPTULO
1
INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
Captulo 1: Introduccin y objetivos

________________________________________________________________________________

________________________________________________________________________________
1.1. Nuclesidos naturales y modificados
1.1.1. Generalidades
Los nuclesidos son glicosilaminas, que consisten en la unin de una base

nitrogenada y un monosacrido de cinco carbonos (D-ribosa o D-2-desoxirribosa) a travs
de un enlace -glicosdico. Las bases son compuestos derivados de los ncleos
heterocclicos pirimidina y purina, razn por la cual se habla de bases pirimidnicas o
pirimdicas y de bases purnicas o pricas; entre las bases que se encuentran en nuclesidos
naturales se pueden distinguir tres pirimidnicas y dos purnicas (Figura 1.1). Las bases
pirimidnicas son la timina (5-metil-2,4-dioxo-pirimidina) en el nuclesido timidina, la
citosina (2-oxo-4-amino-pirimidina) en la citidina y el uracilo (2,4-dioxo-pirimidina) en la
uridina. Las bases pricas son la adenina (6-aminopurina) en el nuclesido adenosina y la
guanina (2-amino-6-oxo-purina) en la guanosina. Cuando alguna de estas bases estn
unidas a la D-ribosa se forman las subunidades del cido ribonucleico (ARN) y cuando lo
estn a la D-2-desoxirribosa forman parte del cido desoxirribonucleico (ADN).
Figura 1.1. Nuclesidos naturales

________________________________________________________________________________
Cuando los nuclesidos naturales poseen una modificacin qumica, ya sea en su

base nitrogenada o en la estructura del monosacrido, son denominados anlogos de
nuclesidos. Generalmente la modificacin en la base se realiza a travs de una sustitucin
de algunos de sus tomos, en cambio en el azcar se pueden efectuar sustituciones o
eliminaciones de los hidroxilos en el C-2 y C-3, aperturas de los ciclos (nuclesidos
acclicos), sustituciones isostricas, transposiciones de la base al C-2 o C-3, entre otras
tantas.
Estos anlogos de nuclesidos presentan actividades muy interesantes desde el
punto de vista farmacolgico. Una vez en el organismo estos derivados pueden ser
fosforilados por mecanismos internos, transformndolos en antimetabolitos, ya que debido
a su similitud estructural con los nuclesidos naturales pueden participar en la biosntesis
de las cadenas de ADN o ARN en la replicacin viral o celular, bloquendola; por ende,
una clula neoplsica o un virus no podrn duplicarse, disminuyendo los efectos adversos
que provocan estas entidades.
1.1.2. Aplicaciones
1.1.2.1. Antivirales
Los anlogos de nuclesidos como inhibidores de la actividad viral usualmente

actan por la interaccin de su derivado trifosfato con las polimerasas virales. Como
unidades estructurales de cidos nucleicos, los nuclesidos trifosfatos (NTPs) son los
sustratos para las polimerasas, que catalizan su polimerizacin. La biosntesis de estos
NTPs es controlada por quinasas. Los requerimientos estructurales de estos nuclesidos
para que interacten con las polimerasas y quinasas virales son los rasgos a tener en cuenta
en el diseo de nuclesidos con potencial actividad antiviral.
El desarrollo en el diseo de este tipo de drogas ha sido complicado debido a
diversas razones, la principal radica en la simplicidad del virus. Los virus son entidades
microscpicas infecciosas constituidas por material gentico (ADN o ARN) dentro de una
cubierta de naturaleza proteica denominada cpside; son parsitos intracelulares obligados
que necesitan de la maquinaria metablica de la clula husped para su propia replicacin.
4

________________________________________________________________________________
De esta forma, el ciclo reproductivo de los virus est ntimamente conectado a la clula que
ataca, por lo que un agente antiviral efectivo debe afectar las enzimas relacionadas con el
virus sin alterar las funciones celulares del husped.
Las primeras drogas capaces de inhibir al ADN viral in vitro fueron descubiertas en
la dcada de 1950, pero el progreso real no fue sino hasta la dcada de 1970. En los ltimos
tiempos se ha comenzado a conocer ms de la bioqumica de la replicacin viral y esto ha
conducido a una aproximacin ms real en el desarrollo de los agentes antivirales,
logrndose establecer nuevas dianas para la accin de estas drogas (Figura 1.2).
Figura 1.2. Ciclo de replicacin viral. Dianas utilizadas

para la accin de los frmacos
Extrado de Enferm Infecc Microbiol Clin. 2005; 23(Supl. 2):25-32

________________________________________________________________________________
Cuando se analizan las posibilidades quimioteraputicas antivirales, la mejor gua es

el ciclo de replicacin viral, el cual puede dividirse en varios pasos: primero el virus se une
a la superficie de la clula husped. El material gentico del virus utiliza los mecanismos
bioqumicos de la clula husped para replicar su material gentico; estos pasos de
replicacin son diferentes en los virus de ARN o ADN, pero el cido ribonucleico
mensajero (ARNm) es producido en ambos. Entonces el material gentico viral es
encapsulado y las nuevas partculas salen de la clula husped. Si bien todos los virus
siguen un ciclo de replicacin, ste puede variar considerablemente de una familia de virus
a otra. Por lo general los inhibidores son especficos para una familia de virus y en algunos
casos para algn miembro en particular de esa familia.
Cualquier droga que interfiera selectivamente con algunos de los eventos descriptos
anteriormente es un candidato para un posterior uso clnico. En efecto, la mayora de los
blancos donde actan los anlogos de nuclesidos son eventos biosintticos intracelulares y
su selectividad se debe generalmente a la inhibicin de enzimas virales asociadas al
metabolismo de nuclesidos y nucletidos. Existe una amplia cantidad de anlogos de
nuclesidos utilizados en terapias antivirales, algunos ejemplos de ellos se pueden
encontrar a continuacin:
La zidovudina (AZT) acta sobre la transcriptasa reversa del virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) y cumple la funcin de terminador de la reaccin de esta
enzima; luego de la fosforilacin intracelular para formar su derivado 5-trifosfato, sufre la
prdida de un grupo difosfato, para de esta manera incorporarse en su forma 5monofosfato al extremo 3-terminal de la cadena de ADN del virus. En la prctica se utiliza
en conjunto con otros agentes antivirales.
La didanosina (ddI) es un 2,3-didesoxinuclesido que acta de manera similar que
la zidovudina, y se utiliza generalmente cuando el sndrome provocado por el VIH est
muy avanzado. Al igual que la droga anterior se utiliza en conjunto con otros frmacos.
Otras drogas utilizadas contra el virus de VIH son la zalcitabina (ddC), utilizado
especialmente en pacientes adultos con sndromes de inmunodeficiencia avanzados y que
son resistentes a la accin de la AZT; es utilizado en combinacin con otras drogas pero en
ningn caso se puede utilizar junto con ddI.

________________________________________________________________________________
La stavudina (d4T) posee una insaturacin en su residuo furansico y tambin es

utilizada cuando la enfermedad provocada por el VIH se encuentra en estados avanzados.
Otra droga utilizada que presenta una modificacin en el azcar, pero en este caso la
presencia de un heterotomo, es la emtricitabina, en donde un tomo de carbono es
sustituido por uno de azufre; esta droga tiene aplicaciones contra el VIH y el virus de la
hepatitis B, est aprobada para el tratamiento del primero mientras que para el segundo se
encuentra en fase III.
La 5-trifluorometil-2-desoxiuridina, tambin conocida como TFT, ha sido utilizada
en usos tpicos para infecciones herpticas oculares, en particular para aquellas en las que
se ha presentado resistencia a otros frmacos. Las bases de su efecto antiviral son su
preferencial incorporacin en el ADN viral y subsecuente inhibicin de la transcripcin.
Otros mecanismos de accin incluyen la inhibicin de las enzimas desoxitimidn quinasa,
desoxitimidilato sintetasa y ADN polimerasa1.
Las
(E)-5-(2-bromovinil)-2-desoxiuridina
(BVDU)
(E)-5-(2-iodovinil)-2-
desoxiuridina (IVDU) son los inhibidores del virus del herpes tipo 1 (VHS-1) y del virus de
la varicela zoster (VVZ) ms potentes y selectivos. El mecanismo de accin de estos
compuestos involucra su fosforilacin preferencial por las quinasas virales y una vez
formados los correspondientes trifosfatos, inhiben la ADN polimerasa o sirven como
sustratos para ser incorporados al ADN viral.
El aciclovir es utilizado en el tratamiento de infecciones por el virus del herpes y
varicela zoster. La alta potencia antiviral y selectividad del aciclovir es resultado de su
mayor especificidad por las quinasas virales que por las de las clulas husped, por lo que
presenta una mayor inhibicin de la ADN polimerasa viral que la celular; se incorpora
diferencialmente en el ADN viral donde acta como terminador de cadena2.
La ribavirina es un agente antiviral de amplio espectro3, su mayor potencial clnico
es en el tratamiento de enfermedades respiratorias como la influenza A o B, para lo cual es
administrada como aerosol. Tambin es efectiva en la terapia de fiebre Lassa y otras
infecciones producidas por el virus de la fiebre hemorrgica. Este anlogo es rpidamente
monofosforilado por la enzima adenosn quinasa de la clula husped y posteriormente
fosforilado a ribavirina 5-trifosfato. La accin antiviral de la ribavirina est correlacionada
con la inhibicin de la enzima inosina monofosfato deshidrogenasa, lo que conlleva a una
7

________________________________________________________________________________
falta de guanosina 5-trifosfato (GTP) celular, lo que potencia la accin de 5-trifosfato de

ribavirina en la inhibicin de la RNA polimerasa viral.
Otro anlogo de nuclesidos que presenta una interesante actividad es la 6azauridina y se utiliza contra flavivirus, su prodroga (Azaribine) ha sido utilizada para el
tratamiento de casos agudos de psoriasis4. 6-Azauridina es convertida por la uridn quinasa
en el correspondiente monofosfato, el cual inhibe competitivamente la descarboxilacin del
cido orotidlico, un paso esencial en la biosntesis de pirimidinas.
Figura 1.3. Algunos anlogos de nuclesidos con actividad antiviral

________________________________________________________________________________
1.1.2.2 Antitumorales
Los anlogos de nuclesidos con actividad antineoplsica actan tambin como

antimetabolitos, interactuando con la maquinaria encargada en la replicacin de las clulas
tumorales e interfiriendo con la sntesis de ADN, evitando de esta manera la divisin
celular y por ende el crecimiento de los tumores. Debido a que la velocidad de replicacin
es mayor en clulas tumorales, la inhibicin celular se produce principalmente en stas.
Los mecanismos de accin para estos anlogos de nuclesidos son:
Activacin de la apoptosis por activacin de un grupo de protenas denominadas

caspasas y la activacin de ciertos receptores que estn involucrados en el inicio de
la muerte celular. Asimismo, la incorporacin de los anlogos de nuclesidos en el
ADN celular causa la ruptura de la hebra en fase S (sinttica) desencadenando la
apoptosis.
Inhibicin de las enzimas involucradas en la biosntesis de nuclesidos purnicos y

pirimidnicos.
Algunos ejemplos de estos nuclesidos son:
La fludarabina es un anlogo arabinsido fosforilado de la adenosina, sustituido en

la posicin 2 de la base por un flor. Inhibe la sntesis de ADN interfiriendo con enzimas
como la ribonucletido reductasa y la ADN polimerasa, entre otras.
La cladribina es un anlogo de la desoxiadenosina, en el cual la base se encuentra
sustituida en la posicin 2 por un cloro. Posee efectos inmunosupresores. Inhibe la
adenosindeaminasa, lo cual interfiere con la habilidad de la clula de procesar ADN.
La floxuridina es un anlogo pirimidnico, en el cual la base se encuentra sustituida
en la posicin 5 por un flor. La forma activa es la base fluorada que es liberada
enzimticamente en el cuerpo. Este compuesto acta de diversas maneras, pero
principalmente acta como inhibidor de la timidilato sintetasa. Esta inhibicin bloquea la
sntesis de timidina, requerida para la replicacin del ADN.
9

________________________________________________________________________________
La citarabina (AraC) es un anlogo modificado en el azcar, en el cual la ribosa ha

sido reemplazada por arabinosa. Este compuesto daa el ADN en su fase sinttica. A su
vez, inhibe tanto la ADN como la ARN polimerasas y la enzima nucletido reductasa,
necesarias para la sntesis de ADN.
Figura 1.4. Algunos anlogos de nuclesidos con actividad antitumoral
1.2. Sntesis de nuclesidos
La sntesis qumica de nuclesidos naturales o modificados puede realizarse por

diversos mtodos. Estas metodologas se pueden resumir en tres aproximaciones sintticas:
la glicosidacin directa de las bases purnicas o pirimidnicas naturales o

modificadas, a travs del desplazamiento de un grupo saliente ubicado en la
posicin 1 del monosacrido, por parte de un nitrgeno nucleoflico de la base;
10

________________________________________________________________________________
a partir de N-glicsidos utilizados como precursores, en donde la base purnica o

pirimidnica es formada qumicamente a partir de estos;
y la ltima es la modificacin qumica de un nuclesido natural.
1.2.1.
Sntesis de nuclesidos a travs de la formacin del enlace

glicosdico
Una de las formas qumicas para crear un enlace glicosdico en la sntesis de

nuclesidos consiste en la utilizacin de sales de metales pesados de purinas o pirimidinas
como Ag o Hg5, para catalizar el desplazamiento nucleoflico de un halgeno posicionado
en el carbono 1 del azcar protegido. En general, esta metodologa permite obtener al
nuclesido con la regioselectividad deseada (es decir, glicosidacin en el N-1 en el caso de
las pirimidinas y en el N-9 para las purinas) y con la estereoselectividad correcta
(formacin del enlace glicosdico con la configuracin ). Las principales dificultades
encontradas son la necesidad de proteger tanto la base como el azcar, la inestabilidad de
los derivados halogenados de los azcares y la baja solubilidad de las sales de mercurio.
Los bajos rendimientos obtenidos por la inestabilidad de los derivados halogenados
de los azcares pueden ser mejorados generando el tomo de halgeno reactivo in situ por
medio de la reaccin de 1-acetoxiazcares con cidos de Lewis tales como TiCl4 y SnCl4.
El problema de esta tcnica es que genera mezclas anomricas de productos y funciona
mejor con bases purnicas con grupos atractores de electrones unidos a ellas.
Otros investigadores desarrollaron otra metodologa, al constatar que las bases
pirimidnicas sustituidas son lo suficientemente nucleoflicas para desplazar al halgeno del
azcar sin la necesidad de catalizadores. El producto final es una sal cuaternaria que
elimina un haluro de alquilo a altas temperaturas para dar el producto deseado, aunque los
rendimientos no suelen ser altos debido a que se forma una mezcla de anmeros6, 7.
En general, a pesar de las numerosas optimizaciones que se llevaron a cabo para
mejorar estas metodologas, existen varias limitaciones que no han podido ser subsanadas,
entre ellas se puede mencionar:
bajos rendimientos;
11

________________________________________________________________________________
estereoselectividad parcial con respecto a la posicin anomrica, especialmente para

los 2-desoxirribonuclesidos;
regioselectividad parcial;
necesidad imperante de la proteccin de grupos lbiles;
generacin de gran cantidad de subproductos que dificultan la separacin.
Teniendo en cuenta estos problemas, se plantearon rutas alternativas para llevar a

cabo la sntesis de nuclesidos; stas incluyen la utilizacin de una serie de tcnicas que
aprovechan las ventajas que pueden llegar a tener las reacciones catalizadas por enzimas o
microorganismos.
A continuacin se hace una pequea introduccin al vasto campo de la biocatlisis y
biotransformaciones.
1.2.1.1. Biocatlisis, biotransformaciones y biocatalizadores
Una biotransformacin es definida como una reaccin o un conjunto de reacciones

simultneas en la cual un sustrato no natural es convertido en otra entidad qumica a travs
del uso de enzimas o microorganismos, o combinacin de ambos, en forma libre o
inmovilizada. Tanto las biotransformaciones como la catlisis enzimtica frecuentemente
son referidas como biocatlisis y las entidades que las llevan a cabo, biocatalizadores.
Los microorganismos y sus extractos han sido explotados desde hace miles de aos
en reacciones de fermentacin para producir alcoholes, vinagre u otros productos
alimenticios como el yogurt. En la actualidad, el inters por la biotecnologa fue estimulado
por el uso de microorganismos para producir productos qumicos a gran escala, como
azcares y aminocidos y para la qumica fina en la industria farmacutica.
El creciente uso de estas biotransformaciones en la industria se debe a un nmero de
ventajas no ofrecidas por la qumica clsica. A continuacin se har un resumen de las
ventajas y desventajas que poseen este tipo de metodologas.
1.2.1.1.1. Ventajas de las biotransformaciones
12

________________________________________________________________________________
Los procesos mediados por enzimas pueden ser acelerados en un factor de 108 a
1012 veces con respecto al mismo proceso sin catalizar, valores muy difciles de
alcanzar por los catalizadores qumicos tradicionales. Por otra parte, los
catalizadores qumicos son utilizados en una concentracin de 0.1% a 1% en
fraccin molar mientras que las enzimas pueden ser muy eficientes, en el orden de
10-3% a 10-4% en fraccin molar, lo cual demuestra su gran eficiencia.
Los biocatalizadores son completamente biodegradables, transformndose en una

opcin ambientalmente compatible en el campo de la sntesis orgnica.
Las enzimas actan bajo condiciones suaves de reaccin; en un pH de alrededor de

5-8 y en un rango de temperaturas de 20-60 C. Esto minimiza problemas laterales
tales como reacciones de descomposicin, isomerizacin, racemizacin, entre otras.
Tanto las enzimas como los microorganismos pueden aceptar una gran variedad de
sustratos no naturales y no requieren especficamente trabajar en agua por lo que se
las puede utilizar en solventes orgnicos.
Como todo catalizador, las enzimas slo pueden acelerar la velocidad de la reaccin
pero no pueden cambiar el equilibrio termodinmico, por lo que pueden catalizar
reacciones inversas.
Adems existen procesos catalizados por enzimas de una
enorme variedad de reacciones orgnicas, como por ejemplo, hidrlisis/sntesis de

steres, amidas y lactonas; oxidacin/reduccin de alquenos, compuestos
aromticos, alcoholes, aldehdos y cetonas; adicin/eliminacin de agua y
amonaco; halogenacin y deshalogenacin,
alquilacin
y desalquilacin,
isomerizacin, reacciones aldlicas y adicin de Michael, entre otras8.

-
Los
biocatalizadores,
especialmente
las
enzimas,
poseen
caractersticas
sobresalientes sobre la selectividad que pueden desplegar:
Quimioselectividad: las enzimas pueden reconocer uno de entre varios

grupos funcionales de reactividad similar presentes en la molcula.
Regioselectividad: debido a su compleja estructura tridimensional, las

enzimas pueden distinguir entre grupos funcionales iguales situados en
diferentes regiones de la molcula.
Enantioselectividad: todas las enzimas estn construdas a partir de Laminocidos por lo que son catalizadores quirales, como consecuencia,
13

________________________________________________________________________________
cualquier tipo de quiralidad presente en el sustrato es reconocido para la

formacin del complejo enzima-sustrato. Por esto, los sustratos proquirales
pueden ser transformados en uno de los productos pticamente activos y
ambos enantimeros de una mezcla racmica pueden reaccionar a diferentes
velocidades, obtenindose una resolucin cintica. Esto se debe a que cada
enantimero forma un complejo estado de transicin que presenta diferentes
energas.
1.2.1.1.2. Desventajas de las biotransformaciones
La utilizacin de biocatalizadores puede presentar algunas desventajas, pero muchas

han sido superadas con el transcurso del tiempo. Entre los problemas ms frecuentes
podemos destacar:
Las enzimas son provistas por la naturaleza en una nica forma enantiomrica por
lo que no hay disponibles enzimas que sean imgenes especulares formadas a partir
de D-aminocidos, por ende es imposible invertir la direccin de la quiralidad de
una reaccin enzimtica por eleccin de otro enantimero del biocatalizador, lo cual
es posible cuando estn involucrados catalizadores qumicos quirales. Una
alternativa puede ser la de realizar la bsqueda de otro proceso enzimtico,
modificar las condiciones de reaccin o disear enzimas a medida por medio del
empleo de tcnicas de biologa molecular.
Las ventajas de trabajar bajo condiciones suaves de reaccin pueden llegar a

convertirse en desventaja; si una reaccin enzimtica procede slo bajo ciertos
parmetros de pH y temperatura, hay poco margen para las modificaciones.
Elevadas temperaturas, as como pH extremos o altas concentraciones salinas
pueden desnaturalizar una enzima, pero existe la posibilidad de trabajar con enzimas
provenientes de organismos extremfilos, las cuales son estables a temperaturas
mayores o a altas concentraciones salinas. La naturaleza puede proveer de un gran
nmero de enzimas que an no han sido investigadas en su aplicacin a la
biocatlisis.
14

________________________________________________________________________________
Las enzimas presentan una alta actividad cataltica en agua, pero debido a su alto
punto de ebullicin, su alto calor de vaporizacin y su carcter nucleoflico, el agua
no es un medio de reaccin ideal para ciertas reacciones qumicas, adems muchos
de los sustratos utilizados son insolubles en medios acuosos. Por estos motivos el
cambio a la utilizacin de solventes orgnicos para la realizacin de las
biotransformaciones es una opcin muy utilizada aunque haya cierta prdida de
actividad enzimtica.
Muchas reacciones enzimticas son susceptibles de sufrir inhibicin por sustratos o

productos, lo cual causa que la enzima pierda su actividad cataltica a altas
concentraciones de sustrato o producto, un factor que limita la eficiencia del
proceso. Mientras que la inhibicin por sustrato puede ser sorteada favorablemente
agregando pequeas cantidades del sustrato a medida que avanza el tiempo de
reaccin, la inhibicin por producto es ms complicada de solucionar, ya que la
remocin del producto por mtodos fsicos es frecuentemente dificultosa. Una
alternativa sencilla que surge para estos problemas es realizar un diseo adecuado
del biorreactor.
1.2.1.1.3.
Enzimas aisladas vs clulas enteras
La decisin final de utilizar enzimas aisladas o clulas enteras depende de muchos

factores, entre los que se pueden destacar el tipo de reaccin, si se requiere la utilizacin de
cofactores y la necesidad de reciclarlos, as como tambin la escala a la cual la
biotransformacin se realizar.
Tanto el empleo de enzimas aisladas con distintos grados de purificacin y la de
clulas enteras presenta aspectos ventajosos y desventajosos entre los cuales podemos
destacar:
La utilizacin de enzimas aisladas presenta las ventajas de una metodologa simple,

muy buena productividad debido a las altas concentraciones de sustrato utilizadas,
pero en muchas reacciones puede ser necesario el reciclado del cofactor. Si se las
utiliza disueltas en agua se obtienen altas actividades enzimticas pero existe la
15

________________________________________________________________________________
posibilidad de reacciones secundarias y la insolubilidad de sustratos lipoflicos; si se

trabaja en medios orgnicos este problema desaparece pero por lo general se
observa una disminucin de la actividad enzimtica. Una estrategia muy utilizada es
el empleo de enzimas inmovilizadas, que facilita la recuperacin del biocatalizador
y su reutilizacin, pero muchas veces durante el proceso de inmovilizacin se pierde
actividad.
-
La utilizacin de clulas enteras evita la necesidad de reciclar cofactores aunque la

productividad puede ser baja debido a problemas difusionales o de concentracin de
sustrato. Adems, pueden ocurrir reacciones secundarias no deseadas provenientes
del metabolismo celular e inactivacin frente a solventes orgnicos. Cuando se
utiliza a los microorganismos inmovilizados el biocatalizador puede ser recuperado
y reutilizado con lo que se aumenta la productividad, pero nuevamente pueden
surgir problemas de prdida de actividad producto del proceso de inmovilizacin.
1.2.1.1.4.
Clasificacin de las enzimas
En la actualidad existen ms de 3500 enzimas que han sido reconocidas por la

Unin Internacional de Bioqumica, y se especula que en la naturaleza existen alrededor de
25000 enzimas, a pesar de esto slo un pequeo porcentaje ha sido investigado y aplicado
en el campo de la biocatlisis.
El nombre de cada enzima puede ser identificado por un cdigo numrico
encabezado por las letras EC (enzyme commission), seguido de cuatro nmeros separados
por puntos. El primer nmero indica el tipo de reaccin que cataliza (Tabla 1.1), el segundo
establece el subtipo, indicando el tipo de sustrato o molcula que es transferida, el tercero
denota la naturaleza del cosustrato y el cuarto es un nmero individual de cada enzima.
Dada la cantidad y tipos de enzimas que existen, slo se profundizar en aqullas
utilizadas en esta tesis.
16

________________________________________________________________________________
Tabla 1.1. Clasificacin de las enzimas9

Clase de enzima
Tipo de reaccin que cataliza
Utilizacin
Oxigenacin de uniones C-H, CC, C=C, C=O, remocin o

adicin de hidrgeno
25%
2. Transferasas
Transferencia de grupos:
aldehdo,cetona, acilos, azcar,
fosforilo o metilo
10%
3. Hidrolasas
Hidrlisis/sntesis de steres y
amidas; hidrlisis de epxidos y
nitrilos
55%
Adicin/eliminacin de
molculas pequeas sobre
uniones C=C, C=N, C=O
5%
5. Isomerasas
Isomerizacin, racemizacin,
epimerizacin
3%
6. Ligasas
Formacin/ruptura de uniones
C-O, C-S, C-N, C-C
2%
1. Oxidoreductasas
4. Liasas
1.2.1.1.5. Lipasas
Las lipasas (triacilglicerol hidrolasas, EC 3.1.1.3) son definidas inicialmente como

carboxilesterasas, que catalizan in vivo la hidrlisis y sntesis de cadenas largas de
acilgliceroles10, son clasificadas como serina hidrolasas debido a su inhibicin por dietil pnitrofenil fosfato. Poseen una trada cataltica compuesta de serina, histidina y aspartato o
glutamato, que tambin son encontradas en serina proteasas11. El mecanismo involucrado
en la catlisis de la lipasa consiste en una activacin de la serina por desprotonacin, para
lo cual histidina y aspartato son necesarios; la nucleofilicidad del grupo hidroxilo de la
serina se ve incrementada por este hecho y ataca al grupo carbonilo del sustrato formando
un intermediario acil-enzima. La presencia de un agujero oxianinico contribuye a
estabilizar la distribucin de carga y reducir la energa del estado basal del intermediario
tetradrico. El paso de desacilacin est gobernado por la electronegatividad de las
molculas presentes en la interfase. En este proceso el agua, u otros nuclefilos en medio
no acuoso, atacan la enzima acetilada provocando la liberacin del producto y la
regeneracin del sitio cataltico12.
17

________________________________________________________________________________
Una caracterstica particular que poseen las lipasas es su activacin interfacial, este
hecho fue observado cuando la lipasa pancretica exhiba poca actividad frente a
triglicridos de cadena corta, solubles en agua, como triacetina, y se encontraban en estado
monomrico. Una vez que la concentracin del sustrato excede su lmite de solubilidad, la
reaccin hidroltica se incrementa drsticamente, frente al mismo sustrato pero en forma de
micelas o emulsiones. Esta actividad es independiente de la concentracin molar pero
controlada por la concentracin del sustrato en la interfase13. La explicacin molecular de
este fenmeno se debe a la presencia de un loop peptdico anfiflico cubriendo el sitio
activo, que en contacto con una interfase agua-lpido, sufre un cambio conformacional que
descubre el sitio cataltico. Esta apertura lleva a la enzima a su estado activo14. La adicin
de solventes orgnicos inmiscibles con el agua en las reacciones catalizadas por lipasas
puede ser una tcnica til para mejorar la actividad.
Estas enzimas pueden ser encontradas en microorganismos, plantas y animales;
poseen diversas funciones en la degradacin de grasas siendo calificadas como drogas
valorables contra desordenes digestivos y enfermedades del pncreas. Adems son
ampliamente utilizadas como aditivos en detergentes y como catalizadores en la
elaboracin de productos qumicos y en sntesis orgnica en transformaciones quimio-,
regio- y/o estereoselectivas. Su gran potencial es debido a que son capaces de aceptar una
amplia variedad de sustratos, son estables en solventes no acuosos, y dependiendo del
medio de reaccin utilizado puede aprovecharse su actividad hidroltica o sinttica.
1.2.1.1.6.
Lipasa B de Candida antarctica (CAL B)
El hongo de la especie Candida antarctica produce dos lipasas, denominadas A

(CAL A) y B (CAL B). Esta cepa fue aislada en un principio en la Antrtida con el fin de
encontrar enzimas con propiedades extremas. Ambas enzimas son estables en un amplio
rango de pH, con CAL A mucho ms estable a pH cidos y CAL B a pH bsico. Aunque
CAL B no es tan estable en solucin como lo es CAL A, cuando estn inmovilizadas ambas
pueden ser utilizadas a temperaturas elevadas (60 C) por gran cantidad de tiempo sin una
prdida significativa de actividad.
18

________________________________________________________________________________
A pesar de que CAL A tiene una preferencia por la posicin sn-2 de los
triglicridos, esta selectividad no es lo suficientemente pronunciada como para permitir la
sntesis
selectiva
de
1,3-diglicridos
2-monoglicridos.
Salvo
su
extrema
termoestabilidad, demostr baja selectividad y actividad especfica en comparacin con

otras lipasas, y su principal uso es realizado en la industria papelera y textil para la
hidrlisis de glicridos de alto punto de fusin. Estudios realizados con anterioridad
demostraron que CAL A puede catalizar esterificaciones con sustratos altamente impedidos
estricamente15.
La enzima CAL B no presenta activacin interfacial y es muy poco activa frente a
triglicridos de cadena larga. sta se presenta en diferentes preparados comerciales que
difieren en el soporte sobre el que se incorpora la enzima. El preparado comercial empleado
en esta tesis es el comercializado por Novo Nordisk como Novozym 435 donde la enzima
est soportada en una resina de nombre comercial Lewatit E. Una de las ventajas de este
preparado es que es ms estable trmicamente que la enzima nativa. Adems, esta enzima
posee una alta selectividad, y una amplia especificidad por sustratos estructuralmente muy
diversos. El rea de aplicacin ms importantes por parte de esta enzima, es la resolucin
de alcoholes racmicos, aminas y cidos16.
A pesar de la baja homologa en su secuencia proteica con respecto a otras lipasas o
esterasas, CAL B asume estructuralmente la distribucin caracterstica hlice / lmina
de todas las hidrolasas y presenta la triada cataltica Ser-His-Asp en su sitio activo (Figura
1.5). La alta estereoselectividad de CAL B, en particular para alcoholes secundarios, est
fundamentada por la presencia de un bolsillo restringido compuesto de Thr42, Ser47 y
Trp10417.
19

________________________________________________________________________________
Figura 1.5. Mecanismo de transesterificacin catalizada por CAL B
1.2.1.1.7. Lipasa de Candida rugosa (CRL)
La Candida rugosa (anteriormente Candida cylindracea) es una levadura

pseudofilamentosa, unicelular, no patognica y no esporulante, que sintetiza y segrega una
mezcla de diferentes lipasas, compuesta de aproximadamente cinco isoenzimas18. Cada
isoenzima posee una cadena polipeptdica simple de 543 aminocidos y un peso molecular
aparente de 60 kDa con una bien definida triada cataltica (Ser209-Glu341-His449). Esta
mezcla enzimtica ha sido utilizada en un amplio rango de reacciones catalticas en medios
de reaccin acuosos y restringidos en agua, stas incluyen hidrlisis no-especficas y
estereoselectivas, esterificacin, transesterificacin e interesterificacin. Existe una
carencia general de discriminacin a travs de los steres secundarios y primarios de los
glicridos19.
Actualmente, todas las muestras comerciales de la lipasa de Candida rugosa (CRL)
estn compuestas de una mezcla de varias isoenzimas en diferentes proporciones,
denominadas Lip1, Lip2 y Lip3. La variabilidad bioqumica encontrada para las distintas
isoenzimas
se
debe
principalmente
modificaciones
post-transduccionales
(heteroglicosilacin) provocadas por las diferentes condiciones de fermentacin a que se

someten a los microorganismos en su produccin industrial20.
20

________________________________________________________________________________
1.2.2. Sntesis biocataltica de nuclesidos
1.2.2.1. Generalidades
Entre las metodologas biocatalticas diseadas para la sntesis de nuclesidos, se

destaca el uso de una enzima, la nuclesido fosforilasa (NP, E.C. 2.4.2), que cataliza la
fosforlisis reversible de ribo- y desoxirribonuclesidos, dando como producto una mezcla
de -D-ribosa 1-fosfato o -D-desoxirribosa 1-fosfato y la base correspondiente. La
adicin de otra base en el medio de reaccin resulta en la formacin del producto de
transglicosidacin (Figura 1.6), es decir la transferencia de un residuo ribosdico o
desoxirribosdico de un nuclesido hacia otra base natural o modificada, a travs del
intermediario
furansico
1-fosfato21.
Estas
biotransformaciones
son
regio-
estereoselectivas, produciendo la unin glicosdica en los tomos N-1 y N-9 de las bases
pirimidnicas y purnicas correspondientes, y dando como producto exclusivamente el
ismero .
La utilizacin de esta enzima se hace a travs de dos procedimientos:
Aislamiento de la furanosa 1-fosfato y su uso como el donor glicosdico en la

reaccin de acoplamiento con la base aceptora22.
A travs del intercambio de una base por otra, en presencia de cantidades catalticas
de fosfato inorgnico.
Comnmente esta ltima estrategia es la escogida por su sencillez, ya que la
reaccin se realiza en un sistema one-pot, pero posee algunas desventajas ya que puede
producirse una inhibicin competitiva de la enzima por parte de la base liberada. Adems,
la sntesis de nuclesidos modificados en el azcar ha sido llevada a cabo por el uso de
donores glicosdicos modificados. sta es la principal limitacin de la metodologa, donde
adems de encontrar las enzimas capaces de aceptar dicho donor glicosdico no natural, se
debe disponer del nuclesido donor del azcar, con la modificacin deseada.
21

________________________________________________________________________________
Figura 1.6. Sntesis de nuclesidos purnicos a partir de uno pirimidnico

por la accin de nuclesidos fosforilasas (NPs)
Se introdujo una mejora en esta metodologa para evitar el problema mencionado, es
utilizar furanosas 1-fosfato como material de partida; debido a su inestabilidad y la
dificultad que existe en su sntesis, se opta por generarlas a travs de las correspondientes
furanosas 5-fosfato por la accin de otra enzima, denominada fosfopentomutasa (PPM,
E.C. 5.4.2.7). sta cataliza la transferencia reversible del grupo fosfato entre los hidroxilos
de las posiciones 5 y 1 del residuo furansico (Figura 1.7). La sntesis del nuclesido es
posible acoplando la accin de la PPM y NP en presencia de la furanosa 5-fosfato23.
A pesar de las ventajas de esta biotransformacin, uno de los precursores necesarios
tanto para esta metodologa (la sntesis de la furanosa 5-fosfato), como para la sntesis
qumica de los nuclesidos mediante tcnicas tradicionales, son las furanosas protegidas.
Con este fin se emplean habitualmente furanosas acetiladas regioselectivamente (Figura
1.7). Este tipo de precursores puede ser obtenidos en forma qumica, con bajos
rendimientos debido a la formacin de subproductos y la poca selectividad, o pueden
aprovecharse las ventajas que aporta la biocatlisis para producirlos.
22

________________________________________________________________________________
Figura 1.7. Sntesis de nuclesidos catalizadas por fosfopentomutasa (PPM) y purn

nuclesido fosforilasa (PNP)
Un objetivo de esta tesis doctoral es la bsqueda de condiciones experimentales que

involucren biotransformaciones, para la sntesis eficiente de estos sintones, furanosas
peracetiladas desprotegidas regioselectivamente en la posicin 5, de manera de poder ser
fosforiladas qumicamente en un paso posterior y de esta manera mejorar los rendimientos
generales de la reaccin global de la sntesis de nuclesidos a travs del uso de las PPM y
NPs.
1.2.3.
Sntesis de precursores en la sntesis de nuclesidos furanosas

desacetiladas regioselectivamente
La introduccin y remocin de grupos protectores es una de las transformaciones

ms importantes y utilizadas en la qumica orgnica sinttica; en particular, en la
construccin selectiva de molculas complejas y polifuncionales como pueden ser los
oligonucletidos, oligosacridos, alcaloides, etc.
El principal problema que presentan estas transformaciones es cuando deben ser
realizadas bajo condiciones suaves de reaccin y en la presencia de funcionalidades de
reactividad similar, como as tambin cuando existen en la molcula grupos funcionales
23

________________________________________________________________________________
susceptibles a cidos, bases, agentes oxidantes y reductores. A pesar de que algunos de

estos problemas persisten en la actualidad en el campo de qumica orgnica clsica, el
arsenal de tcnicas de grupos protectores disponibles ha sido sustancialmente enriquecido
por la aplicacin de biocatalizadores.
La proteccin y desproteccin de monosacridos ha sido llevada a cabo a travs de
tcnicas clsicas, la introduccin de la biocatlisis ha mejorado los rendimientos de estas
reacciones en general.
La acilacin enzimtica de azcares ha demostrado una excelente utilidad cuando se
realiza en solventes orgnicos a travs de transesterificaciones catalizadas por lipasas y el
desplazamiento del equilibrio hacia productos puede ser favorecido con el uso de un exceso
del reactivo acilante o el uso de un derivado activado como pueden ser los donores de acilo
irreversibles, trihaloetil steres24, enol steres25 o steres de oxima26. En particular, los enol
steres poseen la ventaja de que el enol liberado tautomeriza a cetona o a un aldehdo,
provocando que el equilibrio se desplace a productos con altos rendimientos finales. Cabe
destacar tambin, que dada la alta polaridad de los azcares, son necesarios solventes
polares como dimetilsulfxido, piridina o dimetilformamida, que generalmente inactivan
las enzimas, sin embargo varias de ellas mantienen su actividad como las provenientes de
Candida antarctica o Candida rugosa; inclusive la acetilacin de glucosa suspendida en
tetrahidrofurano ha sido posible utilizando una lipasa de Candida antarctica27. Estas
estrategias de acetilacin han sido utilizadas en monosacridos piransicos principalmente,
y no son tiles para la sntesis del precursor furansico necesario para la sntesis de
nuclesidos, ya que la posicin favorecida para la acetilacin es la del hidroxilo primario,
es decir una regioselectividad inversa a la buscada, ya que justamente esta posicin debe
estar desprotegida con respecto a las dems para que pueda ser fosforilada y ser sustrato
para la enzima PPM.
Una estrategia ms adecuada para el cumplimiento de nuestro objetivo es
aprovechar la capacidad que poseen tambin las lipasas de desproteger regioselectivamente
(Figura 1.8).
24

________________________________________________________________________________
Figura 1.8. Estrategia quimioenzimtica para obtener furanosas 5-O-desacetiladas
La aplicacin de lipasas para la remocin enzimtica de grupos acilos ha sido

llevada a cabo en su gran mayora con piranosas, siendo la desproteccin regioselectiva de
furanosas, en particular pentofuranosas, dejada en un segundo plano28.
1.2.4.
Antecedentes de la desproteccin regioselectiva de furanosas

catalizadas por enzimas
Como ya se mencion, las furanosas no han recibido mucha atencin con respecto a
la construccin de sintones desacetilados en forma regioselectiva. Uno de los primeros
antecedentes que se puede encontrar en bibliografa corresponde a Hennen et al. 29, en
donde un grupo de furansidos fueron selectivamente acetilados y desacetilados; en
particular se obtuvieron las acetilaciones de los grupos hidroxilos primarios de un conjunto
de metil D-furansidos con buenos rendimientos (77-84%), catalizadas por la lipasa
pancretica porcina. Tambin se realiz la desacetilacin regioselectiva, a travs de una
reaccin hidroltica catalizada por la lipasa de Candida rugosa, que permiti obtener con
buenos rendimientos metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido y metil 2,3-di-O-acetil-D-arabinofuransido a partir de sus derivados triacetilados. Ms recientemente, condiciones
experimentales similares permitieron obtener con buenos rendimientos el producto
desacetilado en forma regioselectiva 1,2,3-tri-O-acetil--D-ribofuranosa a partir del
derivado peracetilado30 con un 80% de rendimiento; se analizaron diversas relaciones
enzima:sustrato (p/p) siendo la ptima 1,5:1. Utilizando el mismo sustrato que en el caso
anterior, Guisn y colaboradores observaron que los productos obtenidos a partir de la
hidrlisis catalizada por una lipasa de Pseudomonas fluorescens dependan del soporte en el
que estaban inmovilizados, pudiendo obtener el producto desprotegido en C-331 cuando la
25

________________________________________________________________________________
misma era inmovilizada covalentemente en agarosa activada con glutaraldehdo. Soo Kim y
colaboradores trabajaron sobre el metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-arabinofuransido, pudiendo
obtener cuantitativamente el producto desprotegido en C-2 a travs de una hidrlisis con
una esterasa de Rhizopus oryzae32. Por ltimo, Nicolosi y colaboradores observaron
estreo- y regioselectividades diferentes en las butanlisis catalizada por la lipasa B de
Candida antarctica y la lipasa de Candida rugosa frente al derivado peracetilado de la
hexosa D-fructofuranosa33; este trabajo es el nico referido a alcohlisis enzimtica de
pentofuranosas.
A su vez, nuestro grupo ha reportado que la desacetilacin enzimtica del metil
2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido utilizando CAL B, fue totalmente regioselectiva,
obtenindose el metil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido con elevados rendimientos. La
desacetilacin del correspondiente anmero no fue regioselectiva, pero condujo
cuantitativamente a la furanosa totalmente desacetilada metil -D-ribofuransido34.
Tambin fue llevado a cabo un estudio con hidrolasas de origen vegetal, pudindose
obtener cuantitativamente metil 2,3-tri-O-acetil--D-ribofuransido a partir de su derivado
triacetilado usando tejido celular de banana como biocatalizador35, observndose adems
que la regioselectividad depende fuertemente de la estructura del sustrato utilizado.
Teniendo en cuenta estos antecedentes, el primer objetivo particular de esta tesis es
el uso de lipasas para la obtencin de los precursores necesarios para efectuar la sntesis
biocataltica de nuclesidos, es decir la sntesis de furanosas acetiladas con el hidroxilo 5
libre.
1.3. Modificacin de nuclesidos naturales - prodrogas
La modificacin de los nuclesidos naturales puede tener otras razones adems de

simplemente cambiar su estructura para cambiar su actividad antiviral o antitumoral, y esta
modificacin puede cumplir una funcin especfica, como es la de transformar el
nuclesido en una prodroga.
El trmino prodroga fue propuesto por Albert36, y es definida como un derivado
farmacolgicamente inactivo de un compuesto parental activo, que en el organismo sufre
una transformacin espontnea o enzimtica que tiene como consecuencia la liberacin de
26

________________________________________________________________________________
la droga libre. Este tipo de derivados han sido diseados por varios propsitos,
principalmente para resolver problemas farmacolgicos como pueden ser la absorcin
incompleta, biodisponibilidad sistemtica pobre, absorcin muy rpida o excrecin
temprana del organismo, baja especificidad por la clula diana como tambin problemas de
formulacin. Las caractersticas que debe cumplir una prodroga son:
un enlace covalente entre la droga y un grupo modulador;
ruptura del enlace in-vivo;
carencia de actividad intrnseca;
carencia de toxicidad;
y parmetros cinticos ptimos de liberacin de la droga para asegurar niveles

efectivos de la misma en el sitio de accin y para minimizar la metabolizacin de la
prodroga y la inactivacin gradual de la misma37.
En el caso particular de los nuclesidos, las prodrogas de stos y sus derivados

fosforilados han recibido una atencin creciente estos ltimos aos; esto se debe a que un
paso vital en el modo de accin de la mayora de los anlogos de nuclesidos purnicos y
pirimidnicos contra enfermedades virales y neoplsicas es su activacin metablica por
quinasas celulares o virales38, que lleva a la formacin de su anlogo trifosfato, que es la
especia activa biolgicamente. Algunos nuclesidos no sufren el primer paso de
fosforilacin necesario para la formacin del derivado activo, debido a que son sustratos
pobres de las quinasas o no existe una enzima capaz de catalizar esta reaccin; los
nucletidos en cambio, no tienen este problema. Sin embargo los derivados fosforilados de
los nuclesidos poseen otras desventajas; debido a su carga neta presentan baja actividad in
vitro ya que tienen dificultades en traspasar la membrana plasmtica y generalmente tienen
baja estabilidad en medios biolgicos debido a la rpida desfosforilacin por parte de las
fosfatasas
39
. Las prodrogas de nucletidos pueden solucionar algunos de estos problemas,
atenuando la carga neta negativa del fosfato, incrementando la transferencia intracelular

liberando la droga fosforilada en el citoplasma, adems de alterar su farmacocintica,
distribucin en los tejidos y metabolismo, mejorando su eficiencia y especificidad.
27

________________________________________________________________________________
Con respecto a prodrogas de nuclesidos de carcter lipoflico, existen numerosos

artculos que resumen distintos ejemplos40. En nuestro grupo hemos aplicado la alcohlisis
catalizada por la lipasa B de Candida antarctica para la obtencin de diversos nuclesidos
2,3-di-O-acilados; en particular se destaca la preparacin enzimtica con altos
rendimientos de los derivados diacilados de 3-azauridina y 6-azauridina a travs de esta
metodologa, productos de carcter anfiflico y de potencial comportamiento como
prodrogas41.
1.3.1. Derivados lipdicos de nuclesidos
Otro tipo de prodrogas de nuclesidos que se pueden encontrar en literatura, son las
prodrogas lipdicas, las mismas llevan unido covalentemente al frmaco un cido graso, un
glicrido o un fosfolpido (Figura 1.9). En particular, existen dos clases de derivados
fosfolipdicos de nuclesidos, uno en el que la droga est unida al grupo fosfato del
fosfolpido (por lo que sera considerada una prodroga del nucletido) y otro desarrollado
recientemente en el que reemplaza a uno de los grupos acilos42,43.
La aproximacin utilizada para la sntesis de estas prodrogas de nucletidos se
apoya en la premisa de que existen liponuclotidos naturales que son precursores
biosintticos de fosfoglicridos como el fosfatidilinositol y fosfatidilglicerofosfato a partir
de citidina y 2-desoxicitidina difosfato diacilglicerol, cuyas reacciones proceden con la
liberacin de citidina 5-monofosfato y desoxicitidina 5-monofosfato respectivamente44.
Es por esto que liponucletidos que contienen nuclesidos con actividad antineoplsica y
antiviral han sido diseados con el objetivo de utilizar estos caminos metablicos para
provocar la liberacin intracelular del nuclesido 5-monofosfato, evitando la necesidad del
primer paso de fosforilacin a veces problemtico. De hecho, se comprob que derivados
difosfato-diacilglicerilados del arabinsido de citosina (1--D-arabinofuranosilcitosina,
AraC) y algunos 2,3-didesoxinuclesidos con actividad antiviral son sustratos de enzimas
que participan en el metabolismo lipdico con la consecuente liberacin del nucletido45.
Las prodrogas de AraC diseadas de esta manera demostraron una estabilidad metablica
mayor y alta actividad contra varias lneas celulares cancerosas y de leucemias, incluyendo
aquellas clulas que son quinasa-deficientes46.
28

________________________________________________________________________________
Figura 1.9. Esquema de las prodrogas lipdicas de nuclesidos/nucletidos
La
sntesis
qumica
de
estos
compuestos
generalmente
conlleva
bajos
rendimientos47, debido a la formacin de gran cantidad de subproductos que dificultan la

purificacin. Una alternativa biocataltica para su sntesis se desarroll estos ltimos aos y
consiste en la utilizacin de la fosfolipasa D para catalizar una reaccin denominada
transfosfatidilacin.
1.3.1.1. Fosfoslipasa D reaccin de transfosfatidilacin
29

________________________________________________________________________________
Los fosfolpidos son molculas anfiflicas que son ubicuas en la naturaleza. Forman
parte de las membranas y las paredes celulares, donde juegan un rol estructural y funcionan
como cofactores y activadores de varias enzimas asociadas a membranas. La hidrlisis de
estos compuestos in vivo produce la liberacin de molculas biolgicamente activas
(segundos mensajeros lipdicos: diacilglicerol, inositol 6-monofosfato, cido fosfatdico)
regulada por un grupo de enzimas denominada fosfolipasas48.
Las fosfolipasas comparten la propiedad de hidrolizar un mismo tipo de sustrato,
fosfolpidos; cada una de ellas es capaz de reconocer selectivamente uno de los cuatro
grupos ster de la molcula. Ms all de su rol en la homeostasis de las membranas, sus
funciones incluyen la digestin de nutrientes, la formacin de mensajeros involucrados en
la regulacin celular y en algunos casos excepcionales poseen propiedades txicas49.
La clasificacin de las fosfolipasas est basada de acuerdo al residuo del fosfolpido
que ataca, como se puede observar en la Figura 1.10. Las fosfolipasas A son acil-hidrolasas
clasificadas de acuerdo a la posicin del ster que hidrolizan; si catalizan la escisin del
acilo en la posicin 1 de la molcula de glicerol se denominan fosfolipasas A1, y si lo hacen
en la posicin 2 se llaman fosfolipasas A2. Algunas fosfolipasas catalizan la hidrlisis de
ambos acilos en forma indistinta, estas son llamadas fosfolipasas B. La lisis de los distintos
enlaces fosfoster son realizadas por la fosfolipasa C y la fosfolipasa D de manera similar a
una fosfatasa o a una fosfodiesterasa.
Figura 1.10. Accin de las fosfolipasas
En biocatlisis, las fosfolipasas han sido utilizadas para llevar a cabo un gran
nmero de biotransformaciones a nivel laboratorio como as tambin a escala industrial50.
30

________________________________________________________________________________
Fosfolipasas A1 y A2
La fosfolipasa A1 (PLA1, EC 3.1.1.32) hidroliza glicerofosfolpidos en la posicin

sn1 dando como productos finales una molcula de cido graso y un lisofosfolpido; poseen
una amplia especificidad por diversos sustratos. Enzimas con actividad PLA1 han sido
caracterizadas en lipasas pancreticas de cerdo de Guinea51, y tambin en Rhizomucor,
Mucor javanicus y Serratia. Algunas de estos preparados enzimticos estn disponibles
comercialmente y pueden ser utilizados para la hidrlisis de fosfolpidos en sistemas
emulsionados, como enzima libre o inmovilizada. Su tendencia para catalizar la
transesterificacin puede ser til sintticamente en sistemas donde la actividad del agua es
controlada, con una produccin por encima del 60%52.
La fosfolipasa A2 (PLA2, EC 3.1.1.4) hidroliza a la L--fosfatidilcolina para dar L-lisofosfatidilcolina y un cido graso como productos, tambin acepta como sustratos la
fosfatidiletanolamina, cido fosfatdico y otros fosfolpidos. La fuente ms accesible para
esta enzima son las PLA2 pancreticas, sin embargo para aplicaciones biocatalticas se
utilizan aquellas enzimas de invertebrados (Crotalus adamentus, Naja naja, Crotalus
atrox), de mamferos (pncreas bovino o porcino) y de microorganismos (Streptomyces
violaceoruber, S. cinnamomeus, S. griseus)53,54. Ya que la hidrlisis por parte de esta
enzima es ms eficiente que la transesterificacin, se suele utilizar la misma para hidrolizar
el residuo a ser reemplazado por otro acilo (en la posicin sn2) y la reesterificacin se suele
hacer qumicamente. La interesterificacin de fosfatidilcolina con cido mirstico en
presencia de PLA2 inmovilizada ha sido reportada, con una incorporacin del mismo de un
43% en la posicin sn2. La PLA2 es especfica para fosfolpidos con la configuracin
absoluta natural en la posicin sn2; esta propiedad puede ser til para resolucin de
fosfolpidos racmicos o para evaluar la configuracin absoluta de fosfolpidos de orgenes
diferentes55.
Fosfolipasa C
Dos importantes enzimas con la actividad de la fosfolipasa C (PLC, EC 3.1.4.3)

pueden ser reconocidas y utilizadas para la modificacin de fosfolpidos. La primera de
31

________________________________________________________________________________
ellas es la fosfolipasa C especfica de fosfatidilcolina, que a pesar de llamarse as acepta

como sustrato a una gran cantidad de fosfolpidos con distintas cabezas polares. Pueden ser
obtenidas de cepas de Bacillus cereus como tambin de Clostridium perfringens. La PLC
ms comnmente utilizada es la de B. cereus ya que esta es excretada fuera de la clula56.
La otra fosfolipasa es la que cataliza la hidrlisis de fosfatidilinositol que puede ser
obtenida de B. cereus y B. thuringiensis.
La funcin natural que tiene la fosfolipasa C es la de asegurar el correcto suministro
de fosfato a la clula, esta hiptesis es soportada por la existencia de mecanismos de
regulacin de genes de la PLC por fosfato exgeno. Tambin a ciertas fosfolipasas C se les
han adjudicado funciones en la patogenia de enfermedades debido a que poseen actividad
citoltica.
Fosfolipasa D
La fosfolipasa D (PLD, EC 3.1.4.4) posee una posicin destacada sobre las dems
debido a que en presencia de un alcohol aceptor adecuado cataliza eficientemente el
intercambio de la cabeza polar de los glicerofosfolpidos en una reaccin de
transesterificacin o comnmente llamada transfosfatidilacin. El espectro de alcoholes de
distinta estructura que puede ser introducido como cabeza polar es amplio, en general los
alcoholes primarios son mejores aceptores que los secundarios, mientras que los terciarios
no poseen reactividad57. Esta enzima est ampliamente distribuida en clulas de mamferos,
plantas, hongos y bacterias58; especialmente las provenientes de fuentes bacterianas,
especficamente del gnero Streptomyces, son superiores a todas las dems en su capacidad
de catalizar la transfosfatidilacin59 y al tratarse de una protena extracelular, facilita su
utilizacin.
La accin cataltica sugiere un mecanismo ping-pong con un intermediario
covalente fosfatidil-enzima (Figura 1.10). El primer paso requiere el ataque cataltico del
imidazol de la His170 sobre el tomo de fsforo del sustrato, se forma un intermediario
pentacoordinado de fsforo, luego un hidrgeno es donado desde la His488 a la cabeza
polar del fosfolpido y de esta manera es liberada la colina. En el siguiente paso la His488
32

________________________________________________________________________________
es capaz de tomar un protn para activar el agua o la molcula de alcohol y de esta manera
dar como producto final cido fosfatdico o el producto de transfosfatidilacin60.
Figura 1.10. Mecanismo de hidrlisis de PLD
R: 1,2-diacilglicerol; R: colina
En el campo de los nuclesidos, la capacidad de efectuar la transfosfatidilacin por

parte de la fosfolipasa D de origen bacteriano ha sido aplicada a la sntesis de diversas
prodrogas de nuclesidos, como el derivado 5-fosfatidil-2-desoxi-2-metilencitidina que
prolong la esperanza de vida de ratones inoculados con sarcoma M5076 y sus efectos
fueron claramente superiores a los del 2-desoxi-2-metilencitidina (DMDC)61. Otros
derivados de distintos nuclesidos con actividad farmacolgica fueron sintetizados por
Matsuda y colaboradores demostrando efectos superiores a los de sus drogas parentales62-64.
A su vez, el comportamiento en solucin de los fosfatidilnuclesidos formados a
travs de esta metodologa ha sido estudiado, mostrando que son capaces de autoagregarse
33

________________________________________________________________________________
para formar estructuras micelares. Texeira y colaboradores 65 observaron una particularidad

cuando
analizaban
las
concentraciones
micelares
crticas
(c.m.c.)
de
dioctanoilfosfatidiladenosina (diC8P-Ade) y dioctanoilfosfatidiluridina (diC8P-Uri), dado

que cuando preparaban una mezcla de ambos la c.m.c. medida era un 20% menor a la
obtenida por cada uno de los fosfolpidos por separado. Esto indicaba que un mecanismo
energticamente favorable operaba entre las cabezas polares; los datos obtenidos por SANS
(small-angle neutron scattering), RMN, UV y DC (dicrosmo circular) permitieron
establecer que existe un proceso de reconocimiento entre las bases complementarias de los
nuclesidos ubicados en la cabeza polar de los fosfolpidos. Actualmente este campo sigue
en constante estudio66-69.
1.3.2. Derivados fosforilados de nuclesidos
1.3.2.1. Aplicaciones
Otra forma de evitar que los nuclesidos con actividad farmacolgica sean
catabolizados rpidamente en sangre a derivados inactivos, provocando una pobre
biodisponibilidad del mismo, es aumentando su solubilidad y su polaridad. Un modo de
hacerlo es introduciendo funciones polares o inicas, como es el caso de los fosfatos, que
son posteriormente metabolizados y transformados en el principio activo correspondiente;
es decir que cuando penetra la clula este es fosforilado nuevamente a nuclesido 5trifosfato, el metabolito intracelular activo70.
El
caso
ms
representativo
es
el
de
la
fludarabina
(2-fluoro-9--D-
arabinofuranosiladenina). Este nuclesido presenta una baja solubilidad en agua por lo que
el suministro de su derivado fosforilado se convirti en una alternativa interesante.
Actualmente la fludarabina 5-monofosfato est indicada en el tratamiento de pacientes con
malignidades de clulas B como leucemia linfoltica crnica (LLC) o linfoma folicular71, 72.
De la misma manera, el arabinsido de guanina (9--D-arabinofuranosilguanina,
AraG) es un agente efectivo contra el crecimiento de la clulas T y clulas leucmicas
humanas pero su pobre solubilidad limita su uso clnico73. Nelarabina, una prodroga
hidrosoluble de AraG, es efectiva contra leucemia linfoblstica aguda y linfoma de clulas
34

________________________________________________________________________________
T74. Por otro lado, la administracin de arabinoadenosina 5-monofosfato en casos de

hepatitis B crnica asociada a hepatitis autoinmune, permiti la inhibicin de la replicacin
del ADN de virus de la hepatitis B (VHB) y la remisin de la enfermedad autoinmune75.
Adems de sus fines teraputicos, los nuclesidos 5-monofosfato son utilizados
como aditivos alimentarios. Las sales de inosina 5-monofosfato (IMP) y guanosina 5monofosfato (GMP), junto con la sal de mesa y el glutamato monosdico (GMS) son los
resaltadores de sabor ms empleados en la industria alimentaria. El
impacto
de
los
resaltadores de sabor depende de su concentracin, tanto aadida como natural, y del tipo
de comida en la que se los emplea. Son ms efectivos en carnes y vegetales a valores de pH
neutro. Estos compuestos intensifican los sabores naturales y contribuyen al gusto umami,
nombre que deriva de la palabra japonesa para delicioso. Umami es considerado como un
quinto gusto, independiente de los cuatro tradicionales, dulce, salado, cido y amargo76.
Naturalmente, el cido glutmico est presente en muchas comidas, como carne,
pollo, pescados y vegetales. Por otro lado, a IMP se lo encuentra mayormente en carnes
mientras que GMP es ms abundante en plantas. Adems, adenosina-5-monofosfato
(AMP) es abundante en pescados y mariscos77. El sabor de los alimentos puede ser
mejorado con la adicin de estos compuestos. El IMP y GMP tienen la habilidad de
incrementar la afinidad del sitio receptor del GMS, producindose un efecto sinrgico que
permite utilizar menor cantidad de ellos para obtener el mismo efecto potenciador del
sabor. Adems, vale la pena aclarar que su funcin biolgica est asociada a la posicin 5
del grupo fosfato. Mientras 5-IMP se utiliza como resaltador de sabor, 3-IMP y 2-IMP no
poseen sabor78.
Otra utilidad que poseen las sales disdicas de uridina 5-monofosfato (UMP),
citidina 5-monofosfato (CMP), AMP y GMP es que se usan para la preparacin de leche en
polvo para nios dado que aportan niveles de nucletidos similares a los que se encuentran
en la leche materna, para reforzar la inmunidad del beb79.
Finalmente, los nuclesidos 5-monofosfato naturales o modificados son
precursores sintticos de los correspondientes nuclesidos 5-trifosfato (NTP)80. Los 2desoxinuclesidos 5-trifosfato (dNTP) naturales se utilizan como sustratos en la tcnica de
PCR (reaccin en cadena de la polimerasa), ampliamente difundida por sus aplicaciones
35

________________________________________________________________________________
tanto en biologa molecular como en diagnstico. Los NTP tambin son de utilidad en el
descubrimiento de nuevos agentes antivirales y antitumorales mediante cribados in vitro.
1.3.2.2. Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato
La obtencin qumica de estos compuestos puede realizarse con rendimientos

moderados. La metodologa ms ampliamente utilizada ha sido el empleo de steres fosfito,
los cuales son generalmente introducidos a travs de la reaccin de una fosforamidita con
un alcohol, seguida de una oxidacin, este ltimo paso puede ser perjudicial para residuos
del sustrato susceptibles a ser oxidados81. Esta metodologa se emplea extensivamente en
la construccin de oligonucletidos.
Adems de los reactivos mencionados anteriormente, el uso de clorofosfatos como
agentes fosforilantes tambin tienen una amplia aplicacin82. Estos reactivos estn
disponibles comercialmente y poseen una estabilidad comparable a los cloruros de acilo, la
fosforilacin directa de un alcohol puede realizarse en presencia de este reactivo utilizando
un aceptor de protones como piridina o trietilamina.
Nuevamente las desventajas que presentan estos mtodos netamente qumicos, y
especialmente cuando se aplican sobre compuestos con gran cantidad de grupos con
reactividad similar como son los nuclesidos, es la necesidad de numerosos pasos de
proteccin y desproteccin, la utilizacin de solventes orgnicos de toxicidad moderada y
los pasos de oxidacin del fosfato para obtenerlo en su forma libre, que puede llevar a
formacin de gran cantidad de subproductos. Esto repercute en forma negativa elevando los
costos de estas transformaciones, convirtindolas en no aptas para la escala industrial.
El desarrollo de rutas alternativas mediante el uso de biocatalizadores surgi como
un opcin ambientalmente amigable y econmicamente rentable. Las reacciones de
fosforilacin enzimtica se llevan a cabo en condiciones suaves de reaccin y en forma
regioselectiva, por lo que no es necesario la proteccin de grupos funcionales, provocando
que la reaccin sea mucho ms eficiente.
1.3.2.2.1. Hidrlisis de cidos nucleicos
36

________________________________________________________________________________
Los nuclesidos 5-monofosfato (NMPs) naturales pueden obtenerse a partir de

hidrolizados de cidos nucleicos. La nucleasa P1 de Penicillium citrinum cataliza la
hidrlisis de cidos nucleicos de simple cadena produciendo nuclesidos 5-monofosfato;
requiere la presencia de Zn (II) y funciona en forma ptima a 70 C y pH 5,3 83. Otras
nucleasas, como la nucleasa de U. maydis producen nuclesidos 3-monofosfato.
Tambin, la nucleasa P1 puede ser utilizada en combinacin con la fosfodiesterasa I
de veneno de Crotalus adamentus para obtener 2-desoxirribonuclesidos 5-monofosfato a
partir de DNA desnaturalizado de hgado y timo de ternero84. Si bien ambas enzimas
pueden adquirirse comercialmente, la separacin de los distintos nucletidos es lo que
dificulta su uso como fuente de NMP.
1.3.2.2.2. Fermentacin directa

La inosina 5-monofosfato se obtiene por fermentacin directa empleando clulas
enteras de Corynebacterium (ex Brevibacterium) ammoniagenes ATCC 6872 e hipoxantina
y requiere concentraciones de Mn2+ inferiores a 1 M. La deplecin de Mn2+ es un requisito
para la produccin de nucletidos y lleva a un crecimiento desbalanceado del
microorganismo y su muerte. El desbalance es un resultado de la inhabilidad para producir
DNA, ya que el Mn2+ controla la sntesis de precursores de DNA. La ausencia de Mn2+
inhibe la enzima ribonucletido reductasa (RNR) que cataliza la reduccin de los
ribonuclotidos a 2-desoxirribonucletidos, causando la sobreproduccin y acumulacin de
nucletidos85. Estas fermentaciones son complicadas debido a la dificultad en el ajuste en la
concentracin de Mn2+ en los medios industriales y la baja excrecin de los nucletidos al
medio extracelular debido a la pobre permeabilidad en la clulas86. Adems, la purificacin
del compuesto a partir de un caldo de cultivo es generalmente laboriosa y costosa87.
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6872 tambin ha sido utilizada para la obtencin
de UMP, tanto en procesos fermentativos como biocatalizados. En el proceso fermentativo,
el medio de cultivo incluy cido ortico, precursor sinttico de UMP. En el proceso
biocatalizado, en cambio, la reaccin de formacin de UMP es posterior al crecimiento del
microorganismo; en 2007 Wang et al. reportaron la optimizacin de esta metodologa87, en
este caso el medio de reaccin contiene glucosa y cido ortico; la orotidina 5-monofosfato
37

________________________________________________________________________________
(OMP) se forma a partir del acoplamiento del cido ortico y 5-fosforribosil 1-pirofosfato,
formado en la ruta de las pentosas fosfato, catalizado por la enzima orotato
fosforribosiltransferasa (ORTPasa, EC 2.4.2.10). Posteriormente, el UMP es producido a
partir de la descarboxilacin de OMP, catalizada por la enzima orotidina 5-monofosfato
decarboxilasa (ODCasa, EC 4.1.1.23).
1.3.2.2.3. Fosforilacin catalizada por nuclesido fosfotransferasa
La enzima nuclesido fosfotransferasa (NPT, EC 2.7.1.77) cataliza la fosforilacin

de nuclesidos por steres fosfato orgnicos de baja energa para formar 5- o 3-NMP. La
NPT de Erwinia herbicola 47/3 ha sido utilizada para la fosforilacin de diversos
nuclesidos empleando clulas enteras o dicha enzima parcialmente purificada, y pnitrofenilfosfato (pNPP)88.
1.3.2.2.4. Fosforilacin catalizada por quinasas
Las nuclesido quinasas son un grupo de enzimas que catalizan la transferencia de

un grupo fosforilo desde un NTP a un nuclesido formando un NMP. Existen muchas
clases dependiendo del nuclesido que es fosforilado, entre ellas, adenosn quinasa (EC
2.7.1.20), timidn quinasa (EC 2.7.1.21), uridn-citidn quinasa (EC 2.7.1.48), inosnguanosn quinasa (EC 2.7.1.73), desoxicitidn quinasa (EC 2.7.1.74), desoxiadenosn
quinasa (EC 2.7.1.76) y desoxiguanosn quinasa (EC 2.7.1.113). Sin embargo, su uso en
biocatlisis es limitado debido a la alta especificidad de sustrato y al requerimiento de ATP
como dador de fosfato, que acta a su vez como inhibidor89.
1.3.2.2.5. Fosfatasas cidas no especficas bacterianas
Las fosfatasas cidas no especficas (NSAPs, por sus siglas en ingls) bacterianas
son un grupo de enzimas que son capaces de hidrolizar un amplio espectro de fosfosteres
orgnicos estructuralmente no relacionados y que exhiben actividad cataltica ptima a pH
cido a neutro. Se han identificado al menos tres clases moleculares de NSAPs bacterianas
38

________________________________________________________________________________
en base a la secuencia aminoacdica. Los miembros de estas familias se designan como

NSAPs de clase A, B o C, y para cada clase se ha definido un motivo de secuencia.
Algunas NSAPs bacterianas exhiben actividad fosfotransferasa adems de su actividad
fosfatasa intrnseca. En 1999, Asano y colaboradores78 reportaron un nuevo mtodo
enzimtico para la fosforilacin selectiva de nuclesidos. En esta publicacin se describe el
mtodo para la obtencin de 5-IMP partiendo de inosina y pirofosfato tetrasdico,
empleando microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. En particular,
se hace referencia a la marcada actividad fosfotransferasa de Morganella morganii, cuya
NSAP fue purificada y estudiada en detalle por el mismo grupo90.
El principal problema que presenta esta metodologa es la fuerte competencia que
ejerce su actividad natural, la reaccin hidroltica, provocando que sea necesaria la
presencia de un gran exceso de alcohol para obtener rendimientos moderados y una gran
cantidad del donor de fosfato (generalmente pirofosfato tetrasdico) que dificulta luego la
purificacin del producto.
1.3.2.2.6. Fosforilacin indirecta utilizando fosfolipasas
Como se mencion anteriormente las fosfolipasas son capaces de catalizar la

hidrlisis de los distintos residuos de los glicerofosfolpidos, y una de esta enzimas, la
fosfolipasa D, es capaz de efectuar la transferencia de un alcohol a la cabeza polar de la
fosfatidilcolina. Utilizando estas enzimas se propuso una estrategia para la fosforilacin
eficiente de diversas molculas orgnicas de inters, tales como dihidroxiacetona fosfato91
y glicerol 1-fosfato92. La misma consiste en preparar fosfolpidos que contengan los
alcoholes en la cabeza polar va transfosfatidilacin catalizada por la fosfolipasa D y el
producto obtenido es hidrolizado por la fosfolipasa C para liberar de esta manera el
correspondiente fosfato de los alcoholes inicialmente utilizados. Esta estrategia demostr
gran utilidad, con buenos rendimientos, en los dos casos mencionados anteriormente, y en
la sntesis de cido lisofosfatdico y 1-lauril-dihidroxiacetona fosfato93. Sin embargo esta
estrategia no ha sido aplicada a la obtencin de nuclesidos 5-monofosfato.
En base a estos antecedente, el segundo objetivo particular de esta tesis es evaluar
una nueva metodologa de fosforilacin enzimtica de nuclesidos que utilizar como
39

________________________________________________________________________________
sustrato el fosfatidilnuclesido obtenido a travs de la reaccin de transfosfatidilacin

catalizada por la fosfolipasa D, para someterlo a la accin de diversas fosfodiesterasas de
modo de que el producto final obtenido sea un nuclesido 5-monofosfato.
1.4. Inmovilizacin de enzimas
1.4.1.
Generalidades
A pesar de las claras ventajas catalticas de las enzimas mencionadas anteriormente,

existen una serie de problemas que deben ser solucionados para que los procesos
biocatalticos puedan ser transferidos a escala industrial. Los principales problemas a ser
solucionados son la baja estabilidad, inhibicin por altas concentraciones de sustratos y
productos y baja selectividad y actividad frente a sustratos no naturales bajo condiciones no
convencionales. La solucin a estos problemas puede estar en la inmovilizacin de la
enzima ms que en la utilizacin de sus contrapartes solubles. Ms all de las razones
tcnicas y econmicas que requieren que la enzima pueda volver a ser reusada o la
posibilidad de que pueda ser utilizada por gran cantidad de tiempo, existe una especial
atencin en la utilizacin de tcnicas de inmovilizacin para la estabilizacin de enzimas en
solventes no acuosos, ya que el confinamiento en una matriz del biocatalizador lo protege
de los efectos adversos de medios de reaccin poco compatibles con las enzimas como son
los solventes orgnicos.
Se puede definir entonces la inmovilizacin enzimtica como un proceso en el que
se confina o localiza al biocatalizador en una regin definida del espacio, para dar lugar a
formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas
repetidamente. Posteriormente esta definicin se ha ampliado a la de un proceso por el cual
se restringen, completa o parcialmente, los grados de libertad de movimiento de enzimas,
orgnulos, clulas, etc. por su unin a un soporte, de tal manera que se pueda reutilizar.
Sin importar como sea la preparacin de la enzima inmovilizada, su utilizacin
comprende dos grandes funciones que debe cumplir:
40

________________________________________________________________________________
Funciones no catalticas: que son diseadas para aadir separacin (aislamiento del
catalizador del ambiente en donde es aplicado, reuso del catalizador y control del
proceso).
Funciones catalticas: diseadas para convertir al sustrato en producto dentro del

tiempo y el espacio deseado.
Las funciones no catalticas estn conectadas con la naturaleza fsica y qumica de la
matriz en la que est confinada la enzima; especialmente propiedades geomtricas, forma,

tamao, grosor y longitud, mientras que las funciones catalticas estn ligadas a las
propiedades catalticas de la enzima, actividad, selectividad, estabilidad, pH y temperaturas
ptimas. Los criterios generales a tener en cuenta de estas dos propiedades para obtener
enzimas inmovilizadas robustas se encuentran en la Tabla 1.2.94
Tabla 1.2. Funciones catalticas y no catalticas a tener en cuenta en el proceso de

inmovilizacin
Parmetro
Funciones no catalticas
Funciones catalticas
Requerimiento
Beneficios
Tamao y forma de la partcula
Aporta separacin y fcil control de la
adecuada
reaccin
Propiedades mecnicas adecuadas Flexibilidad en el diseo del reactor
Baja capacidad de adsorber agua
Remocin del agua en forma sencilla
Alta estabilidad en una variedad

de solventes orgnicos
Sin cambio en el radio del poro y menores

barreras difusionales
Actividad alta
Alta productividad
Alta selectividad
Menor cantidad de reacciones secundarias,

fcil purificacin del producto, menor
polucin
Especificidad por el sustrato

Tolerancia en la variacin estructural del
amplia
sustrato
Estabilidad en solventes orgnicos Cambio en el equilibrio de la reaccin
Tiempos de reaccin corto al incrementar la
temperatura
Termoestabilidad
Estabilidad operacional
Capacidad de ser reciclada
Menor costo del producto

Modulacin de las propiedades de la
enzima
Bajo costo del catalizador
Amplia aplicabilidad
Tolerancia a variaciones del proceso
Reproducibilidad
Garanta de calidad del producto
Estabilidad conformacional
Enzima inmovilizada
41

________________________________________________________________________________
Las funciones catalticas son diseadas en paralelo con la actividad deseada,

selectividad, especificidad por el sustrato, productividad alta, disminucin de subproductos,
alta tolerancia con respecto a la variacin estructural del sustrato, y alta durabilidad del
catalizador. Por otra parte, la seleccin de las funciones no catalticas, especialmente las
propiedades geomtricas, son dependientes del diseo del reactor (en batch, tanque agitado,
columna o lecho fluidizado), del tipo de medio de reaccin (acuoso, solvente orgnico,
medio bifsico), del sistema de reaccin (lquido-lquido, lquido-slido o slido-slido) y
de las condiciones del proceso (pH, temperatura y presin); el objetivo del diseo de estas
propiedades no catalticas son las de producir una separacin sencilla de la enzima
inmovilizada de la mezcla de reaccin, flexibilizacin en el diseo del reactor, aplicabilidad
en diferentes medios de reaccin y facilitar el control del proceso.
1.4.2.
Mtodos de inmovilizacin
1.4.2.1. Mtodos por retencin qumica
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de una

mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en
el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe procurar que la inmovilizacin
incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ample el intervalo de pH
ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems, el soporte debe tener
resistencia mecnica adecuada a las condiciones de reaccin y ser fcilmente separable del
medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado una gran variedad de
materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos materiales
difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente se encuentran en
forma de cilindro, hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes
pueden clasificarse en dos grandes grupos:
Soportes inrganicos. Dentro de este grupo tenemos una gran variedad de soportes,
que pueden ser naturales (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.) o
42

________________________________________________________________________________
materiales manufacturados (xidos de metales y vidrio de tamao de poro

controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.)
-
Soportes orgnicos. Se pueden clasificar en:

-
Polmeros naturales: a su vez divididos en polisacridos (celulosa,

almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, quitosano,
etc) y protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc).
Polmeros
sintticos:
como
el
poliestireno,
poliacrilatos,
poliacrilamidas, polimetacrilatos, alcohol polivinlico, poliamidas,

etc.
Las enzimas se pueden unir a estos soportes mediante adsorcin o por unin
covalente.
1.4.2.1.1. Adsorcin
En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante

interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno. Los
principales factores que influyen en la adsorcin son:
el pH del medio: controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la

superficie de la protena y del slido;
la fuerza inica: al aumentar la fuerza inica se produce la desorcin de la enzima,

ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena;
el dimetro de poro: debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor
de la enzima;
la presencia de iones que acten como cofactores de la enzima, ya que pueden

incrementar la carga enzimtica del derivado.
Como principales ventajas de este mtodo destacan:
su preparacin sencilla;
43

________________________________________________________________________________
su bajo coste;
no hay cambios de especificidad enzimtica;
los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.
Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente:
la optimizacin de las variables que controlan la adsorcin;
los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico;
la unin al soporte es dbil.
Una variante dentro de la tcnica de adsorcin consiste en emplear resinas de

intercambio inico, las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos
contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin
que se produzcan cambios en la matriz insoluble.
1.4.2.1.2. Unin covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de

inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la
unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que
reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se
encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces
con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor
medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico. Los
aminocidos restantes, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el
exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la unin covalente. Este mtodo
presenta las siguientes ventajas:
La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla;
La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin;
44

________________________________________________________________________________
Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho

fluidizado o tanque agitado.
Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los

disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.
En cambio, la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de

inconvenientes:
Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que

condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser
distorsionante y conducir a derivados inactivos.
El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para

evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un
inhibidor que bloquee el centro activo.
La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a

cambios de pH, fuerza inica, etc.
1.4.2.2. Mtodos por unin fsica
1.4.2.2.1. Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz

slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrucruzables o polmeros
del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso
de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del
monmero. Seguidamente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o
mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras,
que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en
el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se encuentra ocluida dentro
de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, de gran sencillez desde el
punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados
45

________________________________________________________________________________
activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura. De

todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de
polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no
altera los grupos reactivos de la protena.
1.4.2.2.2. Inclusin en membranas
Microencapsulacin: En esta tcnica, las enzimas estn rodeadas de membranas

semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no
de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas
por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes,
tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma
esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 m de dimetro. Mediante este
mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas,
clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones
que suceden en mltiples pasos.
Reactores de membrana: El desarrollo de reactores o sistemas que contengan

enzimas atrapadas ha despertado gran inters en la industria. Estos reactores
emplean membranas permeables al producto final, permeables o no al sustrato
inicial y obviamente impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece
un flujo lquido de sustrato que atraviesa el reactor. En general, en esta metodologa,
se procede inicialmente a la adsorcin de la enzima sobre la membrana que formar
el reactor.
1.4.3. Efectos de la inmovilizacin
A menudo, la inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las

enzimas. En primer lugar se producen cambios en su estabilidad. En segundo lugar, la
enzima inmovilizada es un sistema heterogneo en el cual todos los componentes que
intervienen en el proceso cataltico (pH, sustratos, productos, inhibidores, cofactores,
activadores, etc.) se encuentran en la interfase: entre el medio de reaccin y la fase
46

________________________________________________________________________________
constituida por el soporte con la enzima. Como consecuencia, la actividad enzimtica se ve

afectada por efectos de tipo difusional, estrico y del microentorno.
1.4.3.1. Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de

su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones95:
Una estabilizacin conformacional de la enzima debido a la existencia de uniones

multipuntuales enzima-soporte. La estructura terciaria de la enzima adquiere una
mayor rigidez y se hace ms resistente a la desactivacin trmica o qumica. Este
tipo de estabilizacin se obtiene nicamente en aquellos mtodos en los que
intervienen enlaces de tipo covalente, como el reticulado o la unin a soportes
activados. La inmovilizacin covalente multipuntual se puede combinar con la
adicin de reactivos bifuncionales que den mayor rigidez a la estructura de la
enzima.
Una proteccin frente a las proteasas en el medio. Se ha visto que la unin de

proteasas a un soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autlisis.
Se
evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima
retenidas en una determinada regin del espacio.

-
Existe una alteracin del microentorno de la enzima debida a la interaccin de la

enzima con el soporte. Por ejemplo, si una enzima sensible al oxgeno (como las
nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la superficie de un soporte cargado, la
fuerza inica efectiva en el microentorno de la enzima ser muy alta y, como
consecuencia, la concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa zona
que en el medio de reaccin96. En otros casos el soporte tiene un efecto tamponador
de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su microentorno, aunque
en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en
aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de
disolventes orgnicos, la hidrofilia del soporte o su capacidad para retener agua
regula la actividad de la enzima97. Cuanto mayor es la hidrofilicidad del soporte,
47

________________________________________________________________________________
ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su

microentorno para mantener su conformacin activa.
1.4.3.2. Efectos en la actividad enzimtica
Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso

perderse por diversas razones. Si pierde totalmente la actividad enzimtica puede ser
debido a que la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro
activo est impedido, o a que los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn
aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica
de la enzima, o a que la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da
lugar a una forma inactiva, o a que las condiciones experimentales del proceso causan la
desnaturalizacin o desactivacin de la enzima.
Si la prdida de actividad no es total despus de la inmovilizacin, los cambios
(disminucin o aumento de la actividad enzimtica) se debern principalmente a efectos
difusionales, electrostticos, estricos y/o del microentorno.
Efectos difusionales: Como consecuencia de la inmovilizacin, la difusin de los

sustratos hacia el centro activo de la enzima puede estar impedida por resistencias
de tipo externo e interno.
-
Resistencias difusionales externas: si el soporte es insoluble en el medio de

reaccin, el sustrato deber atravesar la pelcula lquida estacionaria (capa de
Nernst o de disfusin) que rodea el soporte. En las proximidades de un
soporte no cargado, la concentracin de sustrato es menor que en el resto de
la disolucin, puesto que existe un gradiente de concentracin a travs de la
zona de difusin. Por tanto, los valores de Km para las enzimas
inmovilizadas son siempre aparentes (Km);
Resistencias difusionales internas: debida a que los sustratos tienen que

atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se
encuentra la enzima inmovilizada. Existen diversas maneras de minimizar
estos efectos difusionales como por ejemplo: disminuir el tamao del
48

________________________________________________________________________________
biocatalizador, aumentar la concentracin de sustrato, incrementar la

agitacin o el flujo en el reactor, etc. Con estas medidas se consigue reducir
el grosor de la capa de Nernst, y como consecuencia, el valor de K m
disminuye.
-
Efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, de tal manera que, si tienen la

misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay
atraccin. Cuando el sustrato y el soporte tienen cargas opuestas, el valor de Km
aparente puede verse reducido hasta varias veces por debajo del obtenido en
disolucin.
Impedimentos estricos o de tamao de sustrato. En un principio, cualquier enzima

puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su actividad. Este
hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero
si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima
inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo, muchas hidrolasas unidas
covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son muy activas frente a sustratos
pequeos, muestran una actividad muy baja hacia protenas, polisacridos y cidos
nucleicos98. Este efecto estrico se puede evitar mediante una inmovilizacin
covalente a travs de un brazo espaciador enzima-soporte ms largo.
Efectos en el microentorno: La enzima inmovilizada se encuentra en un entorno

diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados
elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH
ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el
intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar. Por ejemplo, una enzima unida a
un soporte cargado negativamente (Carboximetil Sephadex) tendr en su
microentorno una concentracin mayor de hidrogeniones que en el medio de
reaccin. Como resultado, la enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms
alcalino. La enzima sera ms activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte
cargado positivamente (Dietielaminoetil Sephadex)
49

________________________________________________________________________________
1.5. Objetivos del presente trabajo
El objetivo general de esta tesis doctoral es la aplicacin de tcnicas biocatalticas

para la sntesis de furanosas acetiladas desprotegidas regioselectivamente en el hidroxilo 5,
con el fin de poder utilizarlas como precursores sintticos de nuclesidos, as como tambin
encontrar una nueva metodologa enzimtica para la sntesis de nuclesidos 5monofosfato.
Los objetivos particulares consisten en:
La obtencin de furanosas acetiladas con el hidroxilo 5 libre a travs de reacciones

de alcohlisis e hidrlisis catalizadas por lipasas (Figura 1.11). Se evaluar el efecto
sobre la regio- y estereoselectividad de las biotransformaciones, de la configuracin
y sustitucin de la pentosas. Adems se analizarn distintas condiciones de
reaccin, entre ellas se incluyen: lipasa utilizada, alcohol vs buffer, temperatura,
tipo y exceso de alcohol reactivo, utilizacin de cosolventes y de lquidos inicos
como medio de reaccin.
Figura 1.11. Modo de obtencin de furanosas

desprotegidas regioselectivamente con el hidroxilo 5
libre
El planteo de una nueva metodologa enzimtica para la sntesis de nuclesidos 5monofosfato (Figura 1.12), que incluir:
como primer paso sinttico, la preparacin de fosfatidilnuclesidos a travs

de la reaccin de transfosfatidilacin catalizada por la fosfolipasa D. Los
objetivos comprendidos en este aspecto incluirn la bsqueda de fuentes
50

________________________________________________________________________________
enzimticas que permitan catalizar esta reaccin y el ensayo de diferentes

condiciones que permitan aumentar los rendimientos para la sntesis de los
distintos
derivados
lipdicos
de
nuclesidos.
Entre
las
posibles
optimizaciones para este primer paso, se incluye la posibilidad de realizar la

reaccin en ausencia de agua para mejorar la actividad sinttica de esta
enzima. Para ello se evaluarn distintos mtodos de inmovilizacin que
permitan obtener un biocatalizador activo en medio orgnico, adems se
plantear el uso de lquidos inicos que permitan la solubilizacin de los
nuclesidos en medios anhidros.
Como segundo paso de la estrategia enzimtica para la sntesis de

nucletidos, se ensayar la hidrlisis regioselectiva del fosfatidilnuclesido,
por accin de una fosfodiesterasa. Para ello se efectuar un cribado de
fosfodiesterasas comerciales con el fin de obtener la escisin del enlace
fosfodister de manera de obtener el nucletido respectivo. Adems, se
evaluarn distintos tipos de medios de reaccin y se efectuar un cribado de
los microorganismos de nuestro cepario para encontrar aqullos que posean
la actividad hidroltica deseada.
Figura 1.12. Estrategia sinttica planteada para obtener nuclesidos 5-monofosfato
AG: acilo graso
51

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58
Captulo 2 Parte experimental
CAPTULO
2
PARTE EXPERIMENTAL
Captulo 2: Parte experimental

________________________________________________________________________________
60

________________________________________________________________________________
2.1. Materiales
2.1.1. Consideraciones generales

La Lipasa de Candida antarctica (CAL B; Novozyme 435, 10000 PLU mg-1 de
slido; PLU: unidades de laurato de propilo) fue generosamente donada por Novozymes
(Brasil) y la lipasa de Candida rugosa (CRL, 875 U mg-1 de slido) fue obtenida a travs
de Sigma Chemical Co.
Las enzimas fosfolipasa D de repollo (tipo IV, liofilizada, >100 U mg-1 de slido),
fosfolipasa D de Arachis hypogaea (man, tipo II, liofilizada, 300-700 U mg-1 de slido),
fosfolipasa D de Streptomyces sp. (tipo VII, liofilizada, >150 U mg-1 de slido), fosfolipasa
C de Bacillus cereus (tipo V, >200 U mg-1 de slido), fosfolipasa C de Clostridium
perfringes (C. welchii, tipo I, liofilizada, 10-15 U mg-1 de protena), fosfodiesterasa I de
veneno de Crotalus adamentus (tipo VI, crudo seco de veneno, >0,01 U mg-1 de slido),
fosfodiesterasa I de veneno de Crotalus atrox (tipo IV, crudo seco de veneno, >0,01 U mg-1
de slido), fosfodiesterasa I de veneno de Bothrops atrox (tipo V, crudo seco de veneno,
>0,01 U mg-1 de slido), fosfodiesterasa 3,5-nucletido cclico especfica de cerebro
bovino (liofilizada, 15-30 U mg-1 de protena), Benzonase nucleasa (>250 U l-1 en
solucin acuosa de glicerol, recombinante expresada en Escherichia coli), Nucleasa S1 de
Aspergillus oryzae (50 KU mg-1 de slido) fueron obtenidas a travs de Sigma Chemical
Co. La fosfatidilcolina de soja (95% p/p) proviene de Avanti Polar Lipids.
Todos los reactivos y solventes empleados fueron de grado analtico y obtenidos
comercialmente. El diclorometano y el metanol utilizado para cromatografa en columna se
destilaron previamente a su utilizacin.
El tetrahidrofurano y la piridina fueron secados por mtodos convencionales y
destilados previos a su uso.
Las purificaciones de los compuestos de inters fueron realizadas utilizando
cromatografa en columna de silicagel 60 (Merck), grano 200-300 mesh. El anlisis y
seguimiento de las reacciones fue llevado a cabo por cromatografa en capa delgada (c.c.d.)
utilizando placas de aluminio recubiertas con silicagel comerciales (60F254). En las
reacciones que involucraron azcares, los distintos componentes fueron localizados en
61

________________________________________________________________________________
c.c.d. por medio de la carbonizacin con cido sulfrico/etanol (20% v/v) y calor y en el
caso de las reacciones en donde intervienen nuclesidos fueron revelados por irradiacin de
luz U.V. a 254 nm. Tambin se utiliz el reactivo de Dragendorff para revelar la presencia
de fosfatidilcolina1.
Las estructuras de inters fueron determinadas utilizando resonancia magntica
nuclear de 1H y 13C en un equipo Bruker de 500 MHz o de 125 MHz respectivamente. Los
espectros fueron realizados utilizando CDCl3, CD3OD o DMSO-d6 usando tetrametilsilano
(TMS) como estndar interno. Los desplazamientos qumicos estn expresados en ppm.
Los espectros de masa de los nuevos furansidos sintetizados fueron obtenidos en
un espectrmetro de masa Bruker micrOTOF-Q II de alta resolucin (HRMS) con una
fuente de ionizacin por electrospray (ESI) y un analizador cuadrupolo - tiempo de vuelo
(QTOF), disolviendo los distintos compuestos en una solucin metanlica de acetato de
amonio.
Los espectros de masa de los fosfatidilnuclesidos fueron obtenidos por inyeccin
directa de una solucin de los distintos compuestos disueltos en cloroformo:metanol (2:1),
en un espectrmetro de masa Finnigan LCQ Advantage Max Thermo con una fuente ESI
y un analizador de trampa de iones (IT).
Los poderes rotatorios de las furanosas obtenidas diastereopuras fueron medidos en
un polarmetro Perkin Elmer 343 (589 nm Lmpara de sodio).
Las reacciones enzimticas fueron llevadas a cabo en agitador orbital termostatizado
(Sontec OS 11, Argentina).
2.2. Metodologa
2.2.1. Sntesis de pentofuransidos peracetilados
2.2.1.1.
Sntesis de metil D-pentofuransidos peracetilados
A una solucin de 1 g (6,66 mmoles) de la furanosa correspondiente en 25 ml de

metanol seco se le agreg 0,05 ml de H2SO4 (98% p/p) y 1,1 g de CuSO4 anhidro (6,89
mmoles). La reaccin fue agitada magnticamente durante 2 horas a 50C y 24 horas a
62

________________________________________________________________________________
temperatura
ambiente.
Se
evalu
la
desaparicin
del
sustrato
por
c.c.d.
(isopropanol:NH3:H2O, 47:47:6). La reaccin fue detenida con el agregado de una solucin

saturada de NaHCO3 hasta constatar un pH levemente bsico con papel tornasol. Las sales
insolubles fueron removidas por filtracin y el sobrenadante fue concentrado bajo presin
reducida; de esta manera se obtuvo un aceite incoloro. A este ltimo se lo disolvi en 35 ml
de piridina anhidra y se le agreg una cantidad cataltica (50 mg) de 4-dimetilaminopiridina
(DMAP), luego se adicion lentamente 3,6 ml de anhdrido actico (3,6 mmoles). La
reaccin fue agitada durante 1 hora a 70 C y se control por c.c.d. la desaparicin del
material de partida (ter de petrleo:acetato de etilo, 60:40). Posteriormente la misma se
detuvo con el agregado de metanol, y se evapor el solvente bajo presin reducida hasta
sequedad. Se purific en una columna de slicagel, utilizando como fase mvil
CH2Cl2:metanol (98:2).
Las asignaciones espectroscpicas que se detallan a continuacin y en las Tablas
3.10 y 3.11 (Captulo 3) fueron efectuadas en base a los datos espectroscpicos de las
molculas ya publicadas2,3 y en base a la diferencia de intensidades entre anmeros.
Metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (1a,b)
Rendimiento: 60%
Relacin /: 1,0/3,0
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 2,05 (s, 3H, -CH3); 2,08 (s, 3H, -CH3); 2,09
(s, 3H, -CH3); 2,10 (s, 3H, -CH3); 2,11 (s, 3H, -CH3); 2,12 (s, 3H, -CH3); 3,37 (s, 3H,
-OCH3); 3,43 (s, 3H, -OCH3); 4,10 (dd, 1H, J1=11,7 Hz, J2=5,7 Hz, H5a); 4,21 (dd, 1H,
J1=11,8 Hz, J2=4,2 Hz, H5a); 4,25-4,29 (m, 1H, H4); 4,29-4,32 (m, 1H, H4); 4,34 (dd,
1H, J1=11,7 Hz, J2=3,7 Hz H5b); 4,32-4,36 (m, 1H, H5b); 4,89 (s, 1H, H1); 4,98 (dd,
63

________________________________________________________________________________
1H, J1=7,3 Hz, J2=3,7 Hz, H2); 5,12 (d, 1H, J=3,7 Hz, H1); 5,17 (dd, 1H, J1=7,3 Hz,
J2=4,6 Hz, H3); 5,19 (d, 1H, J=4,8 Hz, H2); 5,30 (dd, 1H, J1=6,8 Hz, J2=4,8 Hz, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,04 (-CH3); 20,07 (-CH3); 20,09 (CH3); 20,11 (-CH3); 20,12 (-CH3); 20,30 (-CH3); 54,76 (-OCH3); 55,13 (-OCH3);
63,22 (C-5); 64,00 (C-5); 69,60 (C-3); 70,52 (C-3); 71,28 (C-2); 74,35 (C-2);
78,30 (C-4); 79,17 (C-4); 101,33 (C-1); 105,92 (C-1); 169,41; 169,95; 170,06;
169,20; 169,27; 170,09 (COs).
Metil 3,5-di-O-acetil-2-desoxi-,-D-ribofuransido (7a,b)
Rendimiento: 55%
Relacin /: 1,0/1,1
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 2,01; 2,04; 2,06; 2,07; 2,08; 2,09 (s, 3H, CH3s); 2,18-2,26 (m, 2H, H2, H2); 2,44-2,46 (m, 1H, H2); 2,50-2,56 (m,1 H, H2);
3,31 (s, 3H, -OCH3); 3,36 (s, 3H, -OCH3); 4,25-4,28 (m, 1H, H5a); 4,15 (dd, 1H,
J1=11,8 Hz, J2=4,5 Hz, H5a); 4,17 (dd, 1H, J1=7,9 Hz, J2=5,4 Hz, H4); 4,27 (dd, 1H,
J1=17,5, J2=4,9 Hz, H5b); 4,36 (dd, 1H, J1=11,8, J2=4,0 Hz, H5b); 4,40 (dd, 1H, J1=7,4
Hz, J2=3,8 Hz, H4); 5,11-5,14 (m, 1H, H3); 5,24-5,27 (m, 1H, H3); 6,34 (d, 1H, J=5,3
Hz, H1); 6,36 (dd, 1H, J1=5,7 Hz, J2=2,3 Hz, H1).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,51; 20,56; 20,65; 20,74; 20,99; 21,02 (CH3s); 54,52; 54,63 (-OCH3s); 64,05; 63,60 (C-5,); 82,70; 83,16 (C-3,); 38,07; 38,13
(C-2,); 73,78; 74,00 (C-4,); 98,06; 98,28 (C-1,); 169,46; 169,72; 170,09; 169,93;
170,08; 170,31 (COs).
64

________________________________________________________________________________
Metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-arabinofuransido (9a,b)
Rendimiento: 77%
Relacin /: 1,0/1,1
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 2,09; 2,10; 2,11; 2,12; 2,14 (s, -CH3s); 3,37 (s,
3H, -OCH3); 3,40 (s, 3H, -OCH3); 4,09-4,12 (m, 1H, H5a); 4,17 (dd, 1H, J1=11,4 Hz,
J2=7,4 Hz, H5a); 4,21-4,23 (m, 1H, H4); 4,24-4,25 (m, 1H, H4); 4,36-4,40 (m, 1H,
H5b); 4,43 (dd, 1H, J1=13,7, J2=5,6 Hz, H5b); 4,93 (s, 1H, H1); 4,98 (dd, 1H, J1=4,6,
J2=1,2 Hz, H3); 5,03 (d, 1H, J=1,2 Hz, H2); 5,05 (dd, 1H, J1=6,8 Hz, J2=4,5 Hz, H2);
5,09 (d, 1H, J=4,5 Hz, H1); 5,33 (dd, 1H, J1=6,8 Hz, J2=4,6 Hz, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,05; 20,19; 20,23; 20,24; 20,40 (-CH3s);
54,40 (-OCH3); 54,86 (-OCH3); 63,00 (C-5); 65,06 (C-5); 75,45 (C-3); 76,54 (C3); 76,99 (C-2); 78,37 (C-2); 80,04 (C-4); 81,02 (C-4); 100,84 (C-1); 106,51 (C1); 169,20; 169,71; 169,86; 169,79; 170,11; 170,14 (COs).
Metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-xilofuransido (11a,b)
Rendimiento: 58%
Relacin /: 1,0/1,1
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 2,04; 2,06; 2,07; 2,08; 2,09; 2,10 (s, 3H, CH3s); 3,36 (s, 3H, -OCH3); 3,37 (s, 3H, -OCH3); 4,12 (dd, 1H, J1=12,0 Hz, J2=4,5 Hz,
65

________________________________________________________________________________
H5a); 4,20-4,23 (m, 1H, H4); 4,26 (dd, 1H, J1=12,5, J2=5,3, H5a); 4,22 (dd, 1H, J1=12,0
Hz, J2=5,7 Hz, H5b); 4,47-4,49 (m, 1H, H4); 4,59 (dd, 1H, J1=12,5, J2=5,9 Hz, H5b);
4,88 (s, 1H, H1); 5,00 (dd, 1H, , J1=6,5, J2=4,5 Hz, H2); 5,08 (d, 1H, J=1,8 Hz, H2);
5,14 (d, 1H, J=4,5, H1); 5,35 (dd, 1H, , J1=6,3, J2=1,8 Hz, H3); 5,52 (m, 1H, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 19,75; 19,82; 19,91; 19,92; 19,96; 21,01 (CH3s); 54,73; 54,96 (-OCH3s); 61,88; 63,12 (C-5,); 73,39; 74,67 (C-3,); 74,95; 76,93
(C-2,); 78,14; 80,82 (C-4,); 99,93; 107,78 (C-1,); 168,80; 169,12; 169,46; 169,53;
169,67; 169,74 (COs).
2.2.1.2.
Sntesis de alquil-2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos
La sntesis de los derivados alquil-2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos es

anloga a la reaccin utilizada para producir metil-2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransido,
pero en cada caso se utiliz el alcohol respectivo para sustituir el hidroxilo anomrico con
el residuo alquil correspondiente, en la preparacin del acetal.
Etil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (3a,b)
Rendimiento: 43%
Relacin /: 1,0/3,2
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 1,10 (t, 3H, J = 6,9 Hz, OCH2CH3); 1,21 (t,
3H, J = 7,1 Hz, OCH2CH3); 1,96 (s, 3H, -CH3); 1,99 (s, 3H, -CH3); 2,02 (s, 3H, CH3); 2,06 (s, 3H, -CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3); 2,11 (s, 3H, -CH3); 3,35 (dd, 1H,
J1=16,4, J2=7,1, OCH2CH3); 3,47 (dd, 1H, J1=14,0, J2=6,9, OCH2CH3); 3,74 (dd, 1H,
J1=14,0, J2=6,9, OCH2CH3); 3,76 (dd, 1H, J1=16,4, J2=7,1, OCH2CH3); 4,13 (dd, 1H,
J1=11,0, J2=6,0 Hz, H5a); 4,21 (dd, 1H, J1=12,0 Hz, J2=4,0 Hz, H5a); 4,27-4,30 (m, 2H,
66

________________________________________________________________________________
H4,); 4,30 (dd, 1H, J1=11,0, J2=4,0 Hz, H5b); 4,97 (dd, 1H, J1=7,2, J2=4,6 Hz, H2);
5,01 (s, 1H, H1); 5,15 (dd, 1H, J1=7,2 Hz, J2=4,2 Hz, H3); 5,21 (d, 1H, J=5,0 Hz, H2);
5,26 (d, 1H, J=4,6 Hz, H1); 5,34 (dd, 1H, J1=6,4 J2=5,0 Hz, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 14,82 (OCH2CH3); 14,96 (OCH2CH3);
20,40; 20,43; 20,49; 20,45; 20,60; 20,62 (-CH3s); 63,90 (OCH2CH3); 64,50 (OCH2CH3);
63,40 (C-5); 63,50 (C-5); 69,79 (C-3); 70,60 (C-3); 71,53 (C-2); 74,72 (C-2);
78,30 (C-4); 78,25 (C-4); 100,15 (C-1); 104,84 (C-1); 169,74; 170,37; 170,40;
169,49; 169,53; 170,23 (COs).
Propil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (4a,b)
Rendimiento: 50%
Relacin /: 1,0/3,7
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 0,91 (m, 6H, OCH2CH2CH3,); 1,59 (m, 4H,
OCH2CH2CH3,); 2,03 (s, 3H, -CH3); 2,06 (s, 3H, -CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3); 2,07 (s,
3H, -CH3); 2,08 (s, 3H, -CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3); 3,35 (td, 1H, J1=9,4, J2=7,0,
OCH2CH2CH3); 3,66 (td, 1H, J1=9,4, J2= 7,0, OCH2CH2CH3); 4,10 (dd, 1H, J1=11,2,
J2=5,4 Hz, H5a); 4,18 (dd, 1H, J1=11,8 Hz, J2=4,3 Hz, H5a); 4,23-4,25 (m, 2H, H4,);
4,29 (dd, 1H, J1=11,2, J2=3,8 Hz, H5b);
4,95 (dd, 1H, J1=7,2, J2=4,6 Hz, H2); 4,98 (s,
1H, H1); 5,13 (dd, 1H, J1=7,2 Hz, J2=4,1 Hz, H3); 5,18 (d, 1H, J=5,0 Hz, H2); 5,26 (d,
1H, J=4,6 Hz, H1); 5,29 (dd, 1H, J1=6,2 J2=5,0 Hz, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 10,07 (OCH2CH2CH3); 10,08
(OCH2CH2CH3);
19,83;
(OCH2CH2CH3); 22,45
19,85;
19,93;
19,95;
(OCH2CH2CH3); 63,13
20,03;
(C-5);
20,10
64,18
(-CH3s);
22,33
(C-5);
69,67
(OCH2CH2CH3); 69,46 (OCH2CH2CH3); 69,67 (C-3); 70,46 (C-3); 71,37 (C-2);

67

________________________________________________________________________________
74,41 (C-2); 78,03 (C-4); 78,50 (C-4); 100,16 (C-1); 104,82 (C-1); 169,11; 169,23;
169,69; 169,11; 169,50; 169,84 (COs).
Isopropil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (5b)
Rendimiento: 38%
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 1,14 (d, 3H, J=6,0 Hz, -CH3); 1,19 (d, 3H,
J=6,0 Hz, -CH3); 1,96; 1,99; 2,02 (s, 3H, -COCH3s); 3,91 (h, 1H, J=6,0 Hz, -OCH); 4,13
(dd, 1H, J1=11,0 Hz, J2=6,0 Hz, H5a); 4,25-4,27 (m, 1H, H4); 4,30-4,40 (dd, 1H, J1=11,0
Hz, J2=4,0 Hz, H5b); 5,10 (s, 1H, H1); 5,16 (d, 1H, J=4,8 Hz, H2); 5,33 (dd, 1H, J1=6,6 Hz,
J2=4,8 Hz, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,30; 20,39; 20,56 (-COCH3s); 21,17 (CHCH3); 23,15 (-CHCH3); 69,90 (-OCH); 64,66 (C-5); 71,61 (C-3); 75,07 (C-2); 77,97 (C4); 103,22 (C-1); 169,56, 170,45, 174,46 (COs)
Butil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (6a,b)
Rendimiento: 43%
Relacin /: 1,0/4,9
Espectro de RMN-1H (CDCl3, 500 MHz): 0,91 (t, 3H, J= 7,2 Hz, O(CH2)3CH3); 0,92 (t,
3H, J= 7,2 Hz, O(CH2)3CH3); 1,37 (m, 4H, OCH2CH2CH2CH3,); 1,51-1,57 (m, 4H,
OCH2CH2CH2CH3,); 2,03; 2,06; 2,07; 2,08; 2,09 (s, 3H, -CH3s); 3,39 (td, 1H, J1=9,5 Hz,
68

________________________________________________________________________________
J2= 6,6 Hz, -OCH2(CH2)2CH3); 3,47 (td, 1H, J1=9,8, J2= 6,5 Hz, -OCH2(CH2)2CH3); 3,71
(m, 2H, -OCH2(CH2)2CH3,); 4,10 (dd, 1H, J1=11,2, J2=5,2 Hz, H5a); 4,19 (dd, 1H,
J1=12,0, J2=4,0 Hz, H5a); 4,24-4,26 (m, 2H, H4,); 4,29 (dd, 1H, J1=11,2 Hz, J2=5,5 Hz,
H5b); 4,94 (dd, 1H, J1=7,2, J2=4,4 Hz, H2); 4,97 (s, 1H, H1); 5,14 (dd, 1H, J1=7,2,
J2=4,1 Hz, H3); 5,18 (d, 1H, J=5,0 Hz, H2); 5,21 (d, 1H, J=4,4 Hz, H1); 5,30 (dd, 1H,
J1=6,3 J2=5,0 Hz, H3).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 13,44 (O(CH2)3CH3); 13,41 (O(CH2)3CH3);
19,72 (-CH3); 19,97 (-CH3); 20,05 (-CH3); 20,15 (-CH3); 20,22 (-CH3); 20,39 (CH3);
18,77
(O(CH2)2CH2CH3);
18,91
(O(CH2)2CH2CH3);
31,22
(OCH2CH2CH2CH3); 31,26 (OCH2CH2CH2CH3); 67,51 (C-5); 67,69 (C-5); 63,19

(OCH2(CH2)2CH3); 64,31 (OCH2(CH2)2CH3); 69,72 (C-3); 70,53 (C-3); 71,44 (C2); 74,53 (C-2); 78,07 (C-4); 78,57 (C-4); 100,50 (C-1); 105,20 (C-1); 169,32;
169,47; 169,78; 169,13; 169,18; 169,94 (COs).
2.2.2. Sntesis de pentofuranosas peracetiladas
A 8,0 mmoles de la furanosa correspondiente en 60 ml de tetrahidrofurano anhidro,

se le agregaron 24 mmoles de anhdrido actico (2,26 ml), y se inici la reaccin con el
agregado de 1,6 g de Novozyme 435, se agit la misma a 50C durante 90 minutos hasta
conversin completa del sustrato, constatado por c.c.d. (isopropanol:NH3:H2O, 47:47:6).
Luego de esto, la mezcla fue filtrada y concentrada a presin reducida hasta
aproximadamente 10 ml. A la mezcla anterior se le adicionaron 212 mmoles de anhdrido
actico (20 ml) y 4 ml de piridina, y se la mantuvo agitando durante 12 horas a temperatura
ambiente. Pasado este tiempo, la reaccin se detuvo al adicionarle 70 ml de hielo/H2O, se
efectu una extraccin con CH2Cl2 (2x100 ml) y la fase orgnica fue lavada con H2O
(2x100 ml), secada con CaCl2 y luego el solvente fue removido a presin reducida
obtenindose de esta manera un aceite incoloro.
Usando esta metodologa se obtuvieron los siguientes compuestos:
1,2,3,5-Tetra-O-acetil-,-D-ribofuranosa (2a,b)
69

________________________________________________________________________________
Rendimiento: 40%
Relacin /: 1,0/2,6
-CH3); 2,14 (s, 3H, -CH3); 4,10-4,14 (m, 1H, H5a); 4,21 (dd, 1H, J1=12,1 Hz, J2=3,9
Hz, H5a); 4,32 (dd, 1H, J1=7,0, J2=3,6 Hz, H4); 4,35-4,39 (m, 2H, H5b, H5b); 4,44
(dd, 1H, J1=6,6, J2=3,1 Hz, H4); 5,22 (dd, 1H, J1=6,7, J2=4,6 Hz, H2); 5,23 (dd, 1H,
J1=6,7, J2=3,1 Hz, H3); 5,35 (d, 1H, J=5,0 Hz, H2); 5,41 (dd, 1H, J1=7,0 Hz, J2=5,0 Hz,
H3); 6,17 (s, 1H, H1); 6,44 (d, 1H, J=4,6 Hz, H1).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,76 (-CH3); 20,91 (-CH3); 20,95 (CH3); 21,09 (-CH3); 21,17 (-CH3); 21,19 (-CH3); 21,22 (-CH3); 21,49 (-CH3);
63,32 (C-5); 63,68 (C-5); 69,80 (C-3); 70,03 (C-3); 70,60 (C-2); 74,20 (C-2);
78,75 (C-4); 81,70 (C-4); 94,09 (C-1); 98,20 (C-1); 169,04; 169,45; 170,47; 170,64;
169,79; 170,50; 170,95; 171,20 (COs).
1,3,5-tri-O-acetil-2-desoxi-,-D-ribofuranosa (8a,b)
Rendimiento: 45%
Relacin /: 1,0/1,2
70

________________________________________________________________________________
(s, 3H, -CH3); 2,07 (s, 3H, -CH3); 2,08 (s, 3H, -CH3); 2,09 (s, 3H, -CH3); 2,18-2,26
(m, 2H, H2, H2); 2,44-2,46 (m, 1H, H2); 2,50-2,56 (m,1 H, H2); 4,25-4,28 (m, 1H,
H5a); 4,15 (dd, 1H, J1=11,8 Hz, J2=4,5 Hz, H5a); 4,17 (dd, 1H, J1=7,9 Hz, J2=5,4 Hz,
H4); 4,27 (dd, 1H, J1=17,5, J2=4,9 Hz, H5b); 4,36 (dd, 1H, J1=11,8, J2=4,0 Hz, H5b);
4,40 (dd, 1H, J1=7,4 Hz, J2=3,8 Hz, H4); 5,11-5,14 (m, 1H, H3); 5,24-5,27 (m, 1H,
H3); 6,34 (d, 1H, J=5,3 Hz, H1); 6,36 (dd, 1H, J1=5,7 Hz, J2=2,3 Hz, H1).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,51; 20,56; 20,65; 20,74; 20,99; 21,02 (CH3s); 64,05; 63,60 (C-5s); 82,70; 83,16 (C-3s); 38,07; 38,13 (C-2s); 73,78; 74,00 (C-4s);
98,06; 98,28 (C-1s); 169,46; 169,72; 170,09; 169,93; 170,08; 170,31 (COs).
1,2,3,5-Tetra-O-acetil-,-D-arabinofuranosa (10a,b)
Rendimiento: 42%
Relacin /: 1,0/1,3
-CH3); 2,14 (s, 3H, -CH3); 4,19-4,22 (m, 1H, H4); 4,22-4,24 (m, 1H, H4); 4,26 (dd,
1H, J1=11,5 Hz, J2=7,0 Hz, H5a); 4,35 (dd, 1H, J1=11,9, J2=4,0 Hz, H5a); 4,36-4,38 (m,
1H, H5b); 4,39 (dd, 1H, J1=11,9, J2=3,5 Hz, H5b); 5,05 (dd, 1H, J1=4,1, J2=1,5 Hz, H3);
5,20 (d, 1H, J=1,5 Hz, H2); 5,35 (dd, 1H, J1=4,1 Hz, J2=2,7 Hz, H2); 6,18 (s, 1H, H1);
6,37 (d, 1H, J=4,1 Hz, H1).
Espectro de RMN-13C (CDCl3, 125 MHz): 20,36; 20,57; 20,60; 20,64; 20,66; 20,68;
20,94; 20,98 (-CH3s); 63,04; 64,47 (C-5s); 74,70; 75,33 (C-3s); 76,83; 79,53 (C-2s); 80,53;
82,64 (C-4s); 93,63; 99,30 (C-1s); 169,72; 169,42; 169,70; 169,69; 170,07; 170,23; 170,41;
171,47 (COs).
71

________________________________________________________________________________
2.2.3. Alcohlisis catalizadas por lipasas
2.2.3.1.
Procedimiento analtico
En una reaccin tpica, 10 mg de sustrato fueron disuelto en el alcohol reactivo en

diversas relaciones molares alcohol/sustrato (A/S) = 120, 660 1200 y se agreg la enzima
en una relacin 300 mg mmol-1 sustrato, ya sea CAL B o CRL; la reaccin se mantuvo en
un agitador orbital a 200 rpm a la temperatura ensayada.
Cuando fue utilizado un cosolvente, el sustrato fue disuelto en el alcohol y se agreg
el cosolvente hasta alcanzar un 10% v/v en el volumen final de la reaccin, manteniendo la
relacin A/S informada anteriormente. Una A/S=3 tambin fue ensayada, pero en este caso
fue necesario utilizar un solvente de reaccin, por lo que el alcohol reactivo utilizado qued
en una relacin 0,7% (v/v) con respecto al solvente utilizado.
El seguimiento de la reaccin se realiz por c.c.d. de silicagel y se tomaron alcuotas
de las mezclas de reaccin a tiempos determinados, despus de la remocin de la enzima,
se sembraron alcuotas y se utiliz una fase mvil CH2Cl2:MeOH (95:5). La placa fue
visualizada con un reactivo universal de revelado, H2SO4/etanol (20% v/v).
Adems se efectuaron los controles correspondientes sin la presencia del
biocatalizador, que no mostraron conversin de los sustratos.
2.2.3.2.
Procedimiento preparativo
Luego de encontradas las condiciones ms satisfactorias de los procesos analticos,

se procedi a la obtencin en forma preparativa de los correspondientes productos para el
anlisis espectroscpico de los mismos. Para ello se escalaron las cantidades 10 veces (100
mg de sustrato) utilizando las mismas relaciones de alcohol/sustrato y enzima que en el
inciso anterior.
Despus de transcurrido el tiempo de reaccin estipulado, se detuvo la misma por
separacin de la enzima del medio de reaccin y se efectuaron lavados con CHCl3 para
evitar prdida de producto. Luego de evaporar el solvente a presin reducida con la ayuda
72

________________________________________________________________________________
de un rotavapor, el producto fue purificado por cromatografa en columna, utilizando como

fase mvil CH2Cl2:MeOH (98:2). A partir de la masa de producto obtenida, fue calculado el
rendimiento de la reaccin.
El producto de la reaccin fue analizado por RMN-1H y -13C para evaluar la
regioselectividad y estereoselectividad de la reaccin.
Para aquellos compuestos que no presentan antecedentes bibliogrficos de su
sntesis (14a,b; 15b), fue obtenido el espectro de masa de alta resolucin del mismo y para
aquellos compuestos diastereopuros su rotacin especfica.
Con este procedimiento general se obtuvieron los productos, cuyos datos
espectroscpicos se presentan en las Tablas 3.10 y 3.11, Captulo 3:
Metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido (12a,b)
Obtenido por etanlisis (A/S=120), rendimiento: 33%.
1,2,3-Tri-O-acetil-,-D-ribofuranosa (13a,b)
Etil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido (14a,b)

HRMS: calculado para C11H18O7.Na (M+Na): 285,0945;
encontrado: 285,0940.
Isopropil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido (15b)
73

________________________________________________________________________________

HRMS: calculado para C12H20O7.Na (M+Na): 299,1101;
encontrado: 299,1099.
[ ]20D -22,5 (c 0,014; CH3CH2OH).
Metil 3-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuransido (16a)
[ ]20D +129,4 (c 0,06; CH3CH2OH).

1,3-Di-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuranosa (17a)
Obtenido por etanlisis (A/S=3; CH2Cl2 99,3% v/v), rendimiento:

24%.
[ ]20D +89,4 (c 0,04; CH3CH2OH).
Metil 2,3-di-O-acetil-,-D-arabinofuransido (18a,b)
Obtenido por butanlisis (A/S=3; TBME 99,3% v/v),

rendimiento: 41%. Tambin obtenido por etanlisis (A/S=3;
TBME 99,3% v/v), rendimiento: 49% y con A/S=120 (acetona
10% v/v), rendimiento: 35%.
1,2,3-tri-O-acetil--D-arabinofuranosa (19a)
Obtenido por etanlisis (A/S=3; DMF 99,3%v/v), rendimiento:

30%.
[ ]20D -13,3 (c 0,12; CH3CH2OH).
Metil 2,3-di-O-acetil-,-D-xilofuransido (20a,b)
74

________________________________________________________________________________
Obtenido
por
etanlisis
(A/S=3;
TBME
99,3%v/v),
rendimiento: 72%.
2.2.4. Hidrlisis catalizada por lipasas
2.2.4.1.
Se prepar una suspensin de 10 mg de sustrato en 1 ml de buffer fosfato 30 mM,

pH=7,0 y se agreg la enzima en una relacin 300 mg mmol-1 de sustrato; se mantuvo a
200 rpm en un agitador orbital a la temperatura ensayada, 30 45C.
En los casos en que se utiliz cosolvente, el medio de reaccin consisti en 90%
(v/v) de buffer y 10% (v/v) de solvente orgnico. Los mismos fueron todos miscibles con
agua, por lo que el medio de reaccin fue homogneo.
Se tomaron alcuotas a distintos tiempos y se analizaron cualitativamente por
cromatografa en capa delgada, la fase mvil fue CH2Cl2:MeOH (95:5) y fueron
visualizadas rociando H2SO4/etanol (20% v/v) sobre la placa. Previo a su anlisis la enzima
fue separada por filtracin o centrifugacin.
Se efectuaron reacciones control en ausencia de enzima, no observndose en ningn
caso reactividad apreciable.
2.2.4.2.
Procedimiento preparativo
El procedimiento preparativo fue conducido de la misma manera que en el inciso

2.2.3.2. Se obtuvo de esta manera:
Metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido (12a,b)
Obtenido por hidrlisis en buffer fosfato pH=7 (acetona, 10%

v/v) catalizada por CRL, rendimiento: 82%.
75

________________________________________________________________________________
2.2.5. Alcohlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente
2.2.5.1.
Las reacciones de alcohlisis se llevaron a cabo con etanol como alcohol reactivo;
las mismas consistieron en 10 mg de sustrato y la adicin de CAL-B manteniendo una
relacin 300 mg mmol-1 sustrato, los excesos utilizados de alcohol con respecto al sustrato
A/S=3, 60, 120 y 1200.
Los lquidos inicos utilizados comparten el catin 1-butil-3-metil imidazolio y los
aniones
correpondientes
cada
uno
son:
metanosulfonato
([BMIM][MeSO]),
hexafluorofosfato ([BMIM][PF6]) y tetrafluoroborato ([BMIM][BF4]); cuando se utiliz

una relacin A/S=60, 120 y 1200, el volumen de lquido inico agregado correspondi al
10% del volumen total de la reaccin; cuando se trat de la relacin A/S=3, el lquido
inico represent un 99,3% v/v.
Las reacciones se mantuvieron en un agitador orbital a 30 o 45C y 200 rpm. Se
tomaron alcuotas a distintos tiempos que luego fueron analizadas por cromatografa en
capa delgada, utilizando como fase mvil CH2Cl2:MeOH, (95:5), las mismas fueron
reveladas rocindolas con H2SO4/etanol (20% v/v) y calentando.
Se efectuaron adems los controles correspondientes en ausencia de enzima, sin
observarse reactividad alguna.
2.2.6. Hidrlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente
De acuerdo a datos obtenidos por bibliografa y ensayos preliminares efectuados, se

realizaron nicamente reacciones de hidrlisis con [BMIM][BF4], [BMIM][MeSO]
[BMIM][PF6]; en el primer caso la reaccin fue homognea y en el segundo caso se trabaj
con reacciones en fase heterognea ya que el lquido inico es inmiscible en el buffer de
reaccin.
76

________________________________________________________________________________
2.2.6.1.
Reacciones
de
hidrlisis
utilizando
[BMIM][BF4]
[BMIM][MeSO]
Con fines analticos, se realizaron reacciones de hidrlisis con [BMIM][BF4] y

[BMIM][MeSO] en buffer fosfato 30 mM, pH=7,0; se utilizaron 10 mg de sustrato y
enzima (CAL B o CRL) en una relacin 300 mg mmol-1 sustrato; se evalu el lquido
inico como cosolvente, con un porcentaje en el medio de reaccin de 10 y 20% v/v; las
reacciones fueron llevadas a cabo a 30 o 45 C y 200 rpm en un agitador orbital. Se analiz
el perfil de la reaccin por c.c.d. a lo largo del tiempo y se establecieron las condiciones
ptimas de las mismas para ser escaladas y analizadas por RMN.
Para el anlisis espectroscpico de los productos y el clculo del rendimiento de la
reaccin, se utiliz un procedimiento similar al informado en el inciso 2.2.3.2.
2.1.6.2.
Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][PF6]
En el caso del [BMIM][PF6], por ser inmiscible en el buffer de reaccin, las

reacciones fueron llevadas a cabo en fase heterognea. En una reaccin tpica, se utilizaron
10 mg de sustrato y lipasa CAL B o CRL (300 mg mmol-1 de sustrato), se agreg buffer
fosfato 30mM, pH=7,0 y el lquido inico en distintos porcentajes (25, 50 y 75% v/v),
manteniendo el volumen final de la reaccin constante en 0,5 ml. La reaccin fue
mantenida a 30C y a 200 rpm con la ayuda de un agitador orbital, se analiz la misma a lo
largo del tiempo por c.c.d., sembrando principalmente la fase del lquido inico y
comprobando que en la fase acuosa no existieran productos de inters; para ello, se
efectuaron extracciones con etanol de las alcuotas de lquido inico, para disminuir la
interferencia del mismo en el desarrollo de las placas. La fase mvil utilizada y el mtodo
de revelado de la c.c.d. son similares a los mencionados anteriormente.
Se evaluaron dos maneras de determinar el rendimiento de la reaccin: por
purificacin del producto por cromatografa en columna y por cromatografa lquida de alta
performance (HPLC).
En el primer caso fueron necesarios varios pasos cromatogrficos, ya que el lquido
inico co-elua con el producto; las fases mviles ensayadas fueron CH2Cl2:MeOH (98:2) y
77

________________________________________________________________________________
ter de petrleo:acetato de etilo (80:20), pero en ambos casos se requiri de varias

cromatografas en columna.
Para el segundo procedimiento, fue necesaria la separacin del lquido inico del
medio de la reaccin para el anlisis del perfil de la reaccin. En funcin de los resultados
obtenidos anteriormente se evalu el uso de una resina de intercambio catinico, Dowex
50WX8-Na, 100-200 mesh, resistente a solventes orgnicos, para eliminar el cromforo del
lquido inico (catin [BMIM]). Como primera medida se utiliz la resina en su forma Na+
para evitar la reactividad de los grupos acetales en el medio cido presente, se efectu un
lavado de la misma con metanol y luego con cloroformo, y se procedi a sembrar el crudo
de la reaccin que contena el lquido inico; se sigui lavando con cloroformo hasta no
observar elucin de ningn producto. Se evaporaron las alcuotas hasta sequedad y se
redisolvieron, para luego ser inyectadas y analizadas por HPLC; para ello se utiliz una
columna GRACE-C18, y el mtodo usado consisti de un gradiente de agua:acetonitrilo (de
95:5 a 80:20 en 20 minutos) a una longitud de onda de 215 nm. Los rendimientos fueron
calculados por la confeccin previa de una curva de calibracin correspondiente al
producto.
2.2.7. Reacciones de transfosfatidilacin en medio bifsico catalizadas por la

fosfolipasa D
2.2.7.1.
Cribado de microorganismos con capacidad de catalizar la
reaccin de transfosfatidilacin
Para efectuar el cribado de los microorganismos, se hicieron crecer las cepas en sus
respectivos medios nutritivos y a las temperaturas informadas como ptimas para su
crecimiento, las mismas crecieron hasta saturacin y fueron centrifugadas a 10000 rpm por
10 min para separar los microorganismos; estos sobrenadantes fueron concentrados a
presin reducida en una centrifuga (SpeedVac) aproximadamente a un 20% de su volumen
inicial. Estas suspensiones fueron utilizadas como fuente enzimtica. Para ello 0,15 ml de
las mismas se mezclaron con 0,15 ml de una solucin 20mM de uridina en buffer acetato
78

________________________________________________________________________________
50mM, pH=6,0 y con una solucin de 12 mg de fosfatidilcolina en 0,67 ml de cloroformo.

Las reacciones se mantuvieron agitando a 200 rpm a 37 C en un agitador orbital.
Se tomaron alcuotas a distintos tiempos para el anlisis del perfil de la reaccin que
catalizaban estos crudos enzimticos por HPLC, para ello se utiliz una columna GRACEC8. Para la determinacin de las actividades de las distintas fuentes enzimticas, se utiliz
la velocidad inicial de formacin del producto (fosfatidiluridina), y para determinar la
actividad especfica se cuantific la concentracin de protenas que posea la solucin a
travs del mtodo de Bradford.
2.2.7.2.
Obtencin del crudo enzimtico de fosfolipasa D proveniente de
Streptomyces netropsis
Para la obtencin del crudo enzimtico, se hizo crecer el microorganismo en medio

nutritivo compuesto por: extracto de levadura (2% p/v), glucosa (0,5% p/v) y sulfato de
magnesio heptahidratado (0,1% p/v), pH=7,2. El cultivo se mantuvo a 200 rpm y 30C
durante 72 horas. Luego de transcurrido este tiempo, se centrifug el cultivo a 7000 rpm
por 20 minutos a 4C para separar el microorganismo y se procedi a filtrar el sobrenadante
por un filtro de 0,22 m. A esta solucin enzimtica se le agreg acetona, previamente
enfriada a -20C, hasta alcanzar un 60% v/v del volumen final, esta mezcla fue mantenida
a 4C durante una hora y luego se centrifug a 3500 rpm durante 5 minutos a 4C para
obtener el crudo enzimtico final. El mismo fue secado a temperatura ambiente bajo
presin reducida.
2.2.7.3.
Reacciones de transfosfatidilacin
Para la determinacin analtica de la sntesis de distintos fosfatidilnuclesidos, se

utiliz el crudo obtenido por la metodologa descripta en el inciso 2.2.7.2. Se disolvieron 12
mg de fosfatidilcolina en 0,67 ml de cloroformo y a esta solucin se le agregaron 0,33 ml
de buffer acetato 50mM, pH=6,0 que contena el nuclesido a ser transferido, en una
concentracin 10 mM; para el seguimiento de la reaccin se tomaron alcuotas de la fase
orgnica a distintos intervalos de tiempo para luego ser analizados por HPLC, para ello se
79

________________________________________________________________________________
utiliz columna GRACE-C8, la fase mvil consisti en una solucin de acetato de amonio
(200 mM) y metanol y se trabaj con un gradiente a una longitud de onda de 260 nm. La
reaccin fue mantenida a 37C y a 200 rpm.
Para fines preparativos, la reaccin se redimension 10 veces en sus cantidades, y
luego de transcurrido el tiempo ptimo de reaccin se la detuvo por el agregado de HCl 1N,
se extrajo dos veces la fase acuosa con 100 ml de cloroformo y se evapor la fase orgnica
a presin reducida hasta sequedad; se purific el producto por cromatografa en columna,
por medio de un gradiente de CH2Cl2:MeOH de 95:5 a 70:30. El producto obtenido fue
analizado por RMN.
A continuacin se describe la elucidacin estructural de los productos obtenidos. Es
importante tener en cuenta que debido a que se parti de una fuente natural de
fosfatidilcolina, sta es una mezcla de compuestos que difieren en los grupos acilos que
esterifican al glicerol. Pero debido a que el material de partida est muy enriquecido en 1palmitoil-2-linoleil-sn-glicero-3-fosfocolina se pudieron hacer las asignaciones de los
productos mayoritarios que se detallan a continuacin. En particular, las adjudicaciones de
las seales de los espectros de RMN-13C fueron posibles debido a las distintas intensidades
de las mismas y teniendo como referencia las reportadas previamente en literatura4.
Los pesos moleculares informados fueron determinados por espectrometra de masa.
Para este fin se llev a cabo la inyeccin directa de una solucin (cloroformo:metanol; 2:1)
de los diferentes fosfatidilnuclesidos en un espectrmetro de masa Finnigan LCQ
Advantage Max Thermo (ESI-IT). El rango de iones explorados fue de m/z=260-1300, y
se utiliz el modo negativo por lo que el peso informado corresponde al M- de la especie
mayoritaria ionizada. Los parmetros utilizados fueron: 300C para la temperatura del
capilar, 5 kV para el voltaje del spray y 43 V para el potencial del capilar.
5-(3-sn-Fosfatidil)-adenosina (21)
80

________________________________________________________________________________
ESI-MS: m/z=920,38
Espectro de RMN-1H (DMSO-d6, 500 MHz): 0,83-0,92 (m, CH3s); 1,27-1,34 (m, CH2s
'
'
alifticos); 3,88-3,91 (m, 2H, sn-3-CH2); 3,80-3,82 (m, 2H, H5a , H5b ); 4,06-4,09 (m, 1H,
H4); 4,19 (dd, 1H, J1=11,9 J2=7,1 Hz, sn-1-CH2); 4,26 (t, 1H, J=5,7 Hz, H3); 4,35 (dd,
1H, J1=11,9, J2=2,7 Hz, sn-1-CH2); 4,65 (t, 1H, J=5,7 Hz, H2); 5,09-5,12 (m, 1H, sn-2CH); 5,98 (d, 1H, J=5,7 Hz, H1); 7,31 (s, 2H, -NH2); 8,20 (s, 1H, H2); 8,50 (s, 1H, H8).
Espectro de RMN-13C (DMSO-d6, 125 MHz): CH3); 24,38; 24,45 (CH2-CH2COO); 26,62; 26,65 (CH2-C=C); 28,42-31,32 (CH2 alifticos); 33,37; 33,58 (CH2-COO);
62,20 (sn-1-CH2); 62,37 (C-5); 64,45 (sn-3-CH2); 70,45 (sn-2-CH); 70,92 (C-3); 73,99
(C-2); 83,94 (C-4); 86,84 (C-1); 118,83 (C5a); 127,72 (C=C); 139,30 (C-8); 149,66 (C4); 152,59 (C-2); 155,97 (C-6);172,51; 172,26 (COs).
5-(3-sn-Fosfatidil)-uridina (22)
ESI-MS: m/z=897,52
Espectro de RMN-1H (DMSO-d6, 500 MHz): 0,96-0,98 (m, -CH3s); 1,29-1,34 (m, CH2s
alifticos); 1,59-1,62 (m, 4H, CH2-CH2-COO); 2,34-2,36 (m, 4H, CH2-CH2-COO); 3,8881

________________________________________________________________________________
'
'
3,91 (m, 4H, sn-3-CH2, H5a , H5b ); 3,99 (t, 1H, J=4,6 Hz, H2); 4,12 (t, 1H, J=4,6 Hz,
H3); 4,15-4,17 (m, 2H, H4, sn-1-CH2); 4,22 (dd, 1H, J1=11,7, J2=5,7 Hz, sn-1-CH2); 5,225,24 (m, 1H, sn-2-CH); 5,78 (d, 1H, J=8,0, H5); 5,92 (d, 1H, J=5,3 Hz, H1); 8,05 (d, 1H,
J=8,0 Hz, H6); 11,30 (s, 1H, -NH).
Espectro de RMN-13C (DMSO-d6, 125 MHz): CH3); 24,40; 24,49 (CH2-CH2COO); 26,62; 26,68 (CH2-C=C); 28,48-31,39 (CH2s alifticos); 33,39; 33,57 (CH2-COO);
62,43 (sn-1-CH2); 62,47 (sn-3-CH2); 64,30 (C-5); 69,84 (sn-2-CH); 70,28 (C-3); 73,39
(C-2); 83,61 (C-4); 87,74 (C-1); 101,89 (C-5); 129,48; 129,56 (C=C); 140,75 (C-6);
150,78 (C-2); 163,14 (C-4);172,12; 172,17 (COs).
5-(3-sn-fosfatidil)-citidina (23)
ESI-MS: m/z=897,85
Espectro de RMN-1H (DMSO-d6, 500 MHz): 0,95-0,97 (m, 6H, -CH3s); 1,28-1,32 (m,
CH2s alifticos); 1,58-1,62 (m, 4H, CH2-CH2-COO); 2,39-2,44 (m, 4H, CH2-CH2-COO);
'
'
3,82-3,87 (m, 4H, sn-3-CH2, H5a , H5b ); 3,99 (t, 1H, J=4,6 Hz, H2); 3,92-3,96 (m, 1H,
H2, H3); 4,49 (dd, 1H, J1=4,1, J2=1,1 Hz, sn-1-CH2); 4,22 (dd, 1H, J1=11,7, J2=5,7 Hz,
sn-1-CH2); 5,22-5,25 (m, 1H, sn-2-CH); 5,88 (d, 1H, J=5,5, H1); 5,74 (d, 1H, J=8,2 Hz,
H5); 8,00 (d, 1H, J=8,2 Hz, H6).
Espectro de RMN-13C (DMSO-d6, 125 MHz): CH3); 25,32 (CH2-CH2-COO);
27,56 (CH2-C=C); 29,58-32,36 (CH2s alifticos); 34,48; 34,62 (CH2-COO); 63,02 (sn-1CH2); 64,06 (sn-3-CH2); 64,14 (C-5); 69,30 (C-3); 70,91 (sn-2-CH); 75,67 (C-2); 83,49
82

________________________________________________________________________________
(C-4); 91,03 (C-1); 95,58 (C-5); 130,12 (C=C); 143,69 (C-6); 155,86 (C-2); 165,24 (C4);172,02; 174,44 (COs).
5-(3-sn-Fosfatidil)-guanosina (24)
ESI-MS: m/z=936, 55
alifticos); 1,60-1,63 (m, 4H, CH2-CH2-COO); 2,00-2,14 (m, 4H, CH2-CH2-COO); 4,08'
4,12 (m, 3H, sn-3-CH2, H4, sn-1-CH2); 4,01 (dd, 1H, J1=11,0, J2=4,8 Hz, H5a ); 3,94 (dd,
'
1H, J1=11,0, J2=6,3 Hz, H5b ); 4,13 (t, 1H, J=5,4 Hz, H3); 4,12-4,15 (m, 1H, sn-1-CH2);
4,40 (t, 1H, J=5,4 Hz, H2); 5,10-5,12 (m, 1H, sn-2-CH); 5,70 (d, 1H, J=5,4 Hz, H1); 8,31
(s, 1H, H8).
Espectro de RMN-13C (DMSO-d6, 125 MHz): CH3); 24,48; 24,69 (CH2-CH2COO); 26,65; 26,69 (CH2-C=C); 28,42-33,48 (CH2 alifticos); 33,24; 33,48 (CH2-COO);
61,41 (C-5); 65,20 (sn-3-CH2); 70,37 (sn-2-CH); 70,92 (C-3); 73,81 (C-2); 79,23 (C-4);
85,22 (C-1); 116,70 (C5); 127,77 (C=C); 135,56 (C-8); 151,32 (C-4); 153,84 (C-2); 156,83
(C-6);167,01; 172,92 (COs).
5-(3-sn-Fosfatidil)-arabinofuranosiluridina (25)
83

________________________________________________________________________________
ESI-MS: m/z=897,52
'
3,99 (m, 4H, sn-3-CH2, H5a , H5b ); 4,04-4,07 (m, 1H, H2); 4,10-4,12 (m, 1H, H3); 4,244,26 (m, 2H, H4, sn-1-CH2); 4,21 (dd, 1H, J1=11,8, J2=7,2 Hz, sn-1-CH2); 5,21 (m, 1H, sn2-CH); 5,66 (d, 1H, J=8,0, H5); 6,12 (d, 1H, J=4,6 Hz, H1); 8,05 (d, 1H, J=8,0 Hz, H6);
11,37 (s, 1H, -NH).
62,41 (sn-1-CH2); 62,56 (sn-3-CH2); 64,22 (C-5); 67,41 (sn-2-CH); 70,46 (C-3); 74,24
(C-2); 83,28 (C-4); 85,18 (C-1); 99,93 (C-5); 129,62; 129,69 (C=C); 142,34 (C-6);
150,43 (C-2); 163,30 (C-4);172,20; 172,26 (COs).
5-(3-sn-Fosfatidil)-2,3-didesoxiuridina (26)
ESI-MS: m/z=866,09
84

________________________________________________________________________________
Espectro de RMN-1H (DMSO-d6, 500 MHz): 0,93-0,95 (m, -CH3s); 1,30-1,36 (m, 38H,
CH2s alifticos); 1,58-1,62 (m, 4H, -CH2-CH2-COO); 2,15-2,20 (m, 4H, -CH2-CH2-COO);
'
'
3,75-3,82 (m, 4H, sn-3-CH2, H5a , H5b ); 4,20-4,24 (m, 2H, H4, sn-1-CH2); 5,16-5,18 (m,
1H, sn-2-CH); 5,66 (d, 1H, J=8,1, H5); 5,92-5,94 (m, 1H, H1); 7,94 (d, 1H, J=8,1 Hz,
H6); 11,25 (s, 1H, -NH).
Espectro de RMN-13C (DMSO-d6, 125 MHz): CH3); 24,21; 24,50 (CH2CH2COO);
28,37-31,31 (CH2s alifticos); 33,24; 33,86 (CH2COO); 61,98 (sn-1-CH2); 60,61 (sn-3CH2); 64,14 (C-5); 67,41 (sn-2-CH); 80,70 (C-4); 94,12 (C-1); 102,49 (C-5); 141,23 (C6); 150,80 (C-2); 163,51 (C-4); 169,75; 170,02 (COs).
5-(3-sn-Fosfatidil)-inosina (27)
ESI-MS: m/z=921, 53
Espectro de RMN-1H (DMSO-d6, 500 MHz): 0,82-085 (m, -CH3s); 1,23-1,30 (m, CH2s
'
3,82 (m, 2H, sn-3-CH2); 3,75-3,77 (m, 2H, H5a , H5b ); 4,00-4,04 (m, 2H, H4 sn-1-CH2);
4,17 (q, 1H, J=5,6 Hz, H3); 4,28 (dd, 1H, J1=12,0, J2=3,1 Hz, sn-1-CH2); 4,53 (q, 1H,
J=5,6 Hz, H2); 5,03-5,06 (m, 1H, sn-2-CH); 5,89 (d, 1H, J=5,6 Hz, H1); 8,05 (s, 1H,
H2); 8,37 (s, 1H, H8).
Espectro de RMN-13C (DMSO-d6, 125 MHz): CH3);
27,31-31,58 (CH2s
alifticos); 32,31; 33,21 (CH2COO); 65,37 (C-5); 63,98 (sn-3-CH2); 69,35 (sn-2-CH);
70,30 (C-3); 73,42 (C-2); 86,74 (C-4); 96,84 (C-1); 115,83 (C5); 140,30 (C-8); 151,66
(C-4); 152,40 (C2); 158.78 (C-6);171,21; 172,50 (COs).
85

________________________________________________________________________________
5-(3-sn-fosfatidil)-fludarabina (28)
ESI-MS: m/z=938,54
Espectro de RMN-1H (DMSO-d6, 500 MHz): 0,86-0,89 (m, -CH3s); 1,29-1,35 (m, CH2
'
3,70 (m, 2H, H5a , H5b ); 3,77 (m, 2H, H4 sn-3-CH2); 4,15 (t, 1H, J=5,2 Hz, H3); 4,10
(dd, 1H, J1=11,9, J2=3,5 Hz, sn-1-CH2); 4,36 (t, 1H, J=5,2 Hz, H2); 5,10-5,13 (m, 1H, sn2-CH); 6,08 (d, 1H, J=5,2 Hz, H1); 7,96 (s, 2H, NH2); 8,31 (s, 1H, H8).
62,71 (C-5); 64,45 (sn-3-CH2); 70,65 (sn-2-CH); 71,39 (C-3); 73,49 (C-2); 84,06 (C-4);
86,48 (C-1); 119,96 (C-5); 128,66 (C=C); 139,32 (C-8); 149,58 (C-4); 153,69 (C-2);
155,80 (C-6);170,82; 171,39 (COs).
2.2.8. Inmovilizacin de la fosfolipasa D
2.2.8.1.
Inmovilizacin por adsorcin en Duolite
Para la inmovilizacin de la PLD por adsorcin en Duolite se pes 1 g de la matriz,

se le adicionaron 6 ml de etanol y 15 ml de buffer de acetato de sodio 200 mM, pH=6,0,
conteniendo 80mM de CaCl2 y se agit la suspensin durante 30 minutos a temperatura
ambiente. Se separ el sobrenadante y se agregaron nuevamente 17 ml del buffer
86

________________________________________________________________________________
mencionado anteriormente, se agit durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se

separ el sobrenadante; este proceso fue repetido nuevamente.
Se disolvieron 10 mg del crudo enzimtico de PLD obtenido segn el inciso 2.2.7.2
en 10 ml de buffer acetato 50 mM, pH=6,0 y se agit a temperatura ambiente durante 1
hora.
Se mezcl el slido con la solucin enzimtica y se agit toda la noche a una
temperatura de 4 C.
2.2.8.2.
Inmovilizacin en alginato
Se prepar una solucin de cido algnico 2% p/v, se autoclav y luego de enfriarla

se mezcl 1,5 ml con 1 ml de una solucin enzimtica conteniendo 1,5 mg de PLD. Con la
ayuda de una micropipeta, la mezcla se gote en una solucin de CaCl2 0,1 M agitada
magnticamente en forma suave. Se separaron las perlas de alginato por filtracin y se
lavaron con 50ml de solucin fisiolgica y luego con 50 ml del medio de reaccin a ser
utilizado.
2.2.8.3.
Inmovilizacin en glioxil-agarosa
Se suspendieron 25 ml de perlas de agarosa en 30 ml de agua destilada. Se

adicionaron 8,5 ml de una solucin NaOH 1,7 N que contenan 237 mg de NaBH4; luego se
agregaron 1,68 ml de glicidol gota a gota, manteniendo la suspensin bajo agitacin en un
bao de hielo para evitar que la temperatura supere los 25 C. Se prosigui con la agitacin
de la suspensin a temperatura ambiente toda la noche. Se filtraron las perlas y se lavaron
exhaustivamente con agua destilada.
Luego se procedi a oxidar el diol formado para formar glioxil-agarosa, para ello se
suspendieron las perlas en 200 ml de agua destilada, se le adiconaron 42 ml de una solucin
0,1 M de NaIO4 manteniendo la suspensin con agitacin magntica. Luego de 90 minutos
se lav el gel con 100 ml de agua destilada y se las sec a temperatura ambiente y presin
reducida.
87

________________________________________________________________________________
Para la inmovilizacin de la enzima, se disolvieron 10 mg del crudo enzimtico de

PLD obtenido segn el inciso 2.2.7.2 en 10 ml de buffer acetato 50 mM, pH=6,0 y se
mezclaron con 1 gramo de las perlas activadas, luego se las mantuvo bajo agitacin toda la
noche a 4 C.
2.2.8.4.
Inmovilizacin en poliuretano
Se utiliz un prepolmero hidrofbico, poli(propilenglicol) toluen 2,4-diisocianato,

para sintetizar el poliuretano.
Se disolvi 1,5 mg de PLD, previamente precipitada con acetona del caldo de
cultivo de Streptomyces netropsis, en 10 ml buffer acetato 50 mM, pH=6,0; se adicionaron
adems 182 l de Tween 20 (1% p/p), se agregaron 10 ml del prepolmero y se agit a 2500
rpm por 11 minutos. Se dej reposar el gel formado. Se cort en pequeos cubos y de esta
manera fue utilizado como biocatalizador.
2.2.8.5.
Inmovilizacin por tecnologa sol-gel
2.2.8.5.1.
Sntesis del precursor tetraquis-(2-hidroxietil)-ortosilicato
(THEOS)
En un baln se mezclaron 10 ml de tetraetilortosilicato (TEOS) y 10 ml de

etilenglicol en una relacin molar 1:4; ambos reactivos fueron destilados a presin reducida
previo a su utilizacin. Se arm un equipo de destilacin fraccionada, y se calent la
mezcla a 150C durante 48 horas bajo atmsfera de nitrgeno; de esta manera se recupera
en el baln de destilado etanol proveniente de la reaccin y se desplaza el equilibrio hacia
la formacin del precursor deseado. Luego de transcurrido el tiempo mencionado
anteriormente, se destilaron a presin reducida los materiales de partida remanentes, y se
obtuvo as el THEOS con una pureza aproximada de 85% determinada por su espectro de
RMN-1H.
2.2.8.5.2.
Protocolo de inmovilizacin de PLD y PLD/colina oxidasa
en sol-geles dopados con quitosano

88

________________________________________________________________________________
Para la inmovilizacin o coinmovilizacin de las enzimas, en primer lugar se

prepar una mezcla homognea de 0,2 ml de solucin enzimtica (1,5 mg de PLD en buffer
acetato 50 mM, pH=6,0 y en el caso que correspondiera se le adicionaron adems 0,1 mg
de colina oxidasa) y 80 l de la solucin cida de quitosano (2,5% p/v); luego de haber
homogeneizado la misma se aadieron 41 l del precursor THEOS sintetizado
anteriormente; para iniciar el proceso sol-gel se adicionaron 179 l de buffer tris 100 mM,
pH=8,0. Se dej envejecer el sol-gel formado en un vial de plstico de 1,5 ml a 4C durante
24 horas y luego fue liofilizado durante un periodo de 8 horas. Los monolitos formados
fueron utilizados como biocatalizadores en las reacciones.
2.2.8.6.
Inmovilizacin en agarosa
Para la inmovilizacin por este mtodo, se prepar en primer lugar una solucin de
agarosa 2,5% p/v, que posteriormente fue autoclavada. En el momento de ser utilizada fue
fundida y mantenida a 60C; se mezcl 1,5 ml con 1 ml de solucin enzimtica (1,5 mg de
PLD en buffer acetato 50 mM, pH=6,0) y se gote en 100 ml de aceite puro de girasol a
temperatura ambiente agitado magnticamente, luego de formadas las perlas, se sumergi
el aceite en un bao de hielo manteniendo una agitacin suave en todo momento. El
biocatalizador fue separado por filtracin del aceite, y se lavaron las perlas con 50 ml de
ter de petrleo y despus con 50 ml de solucin fisiolgica.
Las perlas fueron almacenadas hasta su utilizacin a 4C en buffer acetato 50 mM,
pH=6,0.
2.2.9. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos
2.2.9.1.
Reacciones en fase heterognea
Se disolvieron 6 mg de 5'-(3-sn-fosfatidil)-nuclesido en 300 l de cloroformo, y a

esta solucin se le adicionaron 600 l de solucin enzimtica; cuando se utiliz la
fosfolipasa C de Bacillus cereus el buffer utilizado fue HEPES 100 mM, CaCl2 5 mM,
89

________________________________________________________________________________
pH=7,5. Cuando la enzima utilizada fue Nucleasa 1 se us buffer acetato 50mM, NaCl 0,3
M, ZnSO4 5mM, pH=4,5; y para la Benzonasa y las distintas fosfodiesterasas ensayadas
se us buffer tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, pH=8,9. Para efectuar los ensayos en forma
comparativa, se agregaron 3,14 unidades de enzima en todas las reacciones. Se las mantuvo
en un agitador orbital a 37C y 200 rpm, se tomaron alcuotas a distintos tiempos y se
analizaron por HPLC en una columna GRACE-C18 usando como fase mvil acetato de
trietilamonio:acetonitrilo a flujo de 1 ml min-1, midiendo la absorbancia a una longitud de
onda de 260 nm. Con fines cualitativos, las c.c.d. se desarrollaron con una fase mvil apta
para molculas cargadas, n-propanol:NH3:H2O (15:11:2,25) y se revelaron bajo radiacin
UV.
2.2.9.1.1.
Hidrlisis con pulsos enzimticos
Esta experiencia fue realizada nicamente con la fosfolipasa C de Bacillus cereus

(PLCBC). Las reacciones fueron llevadas a cabo en las mismas condiciones que el inciso
anterior, con la modificacin de tomar slo una alcuota en el tiempo de mxima
produccin del nuclesido 5-monofosfato para luego ser analizada por HPLC.
Posteriormente a la toma de muestra, a la mezcla de reaccin se le agreg 1 unidad de
PLCBC adicional disuelta en 10 l de buffer HEPES 100 mM, CaCl2 5 mM, pH=7,5; se la
mantuvo bajo agitacin a 200 rpm y 37 C durante un tiempo igual al anterior y se repiti el
procedimiento de toma de muestra para su anlisis por HPLC y agregado de 1 unidad
adicional de PLCBC, as sucesivamente hasta completar el nmero de pulsos informado.
2.2.9.2.
Reacciones en fase homognea
Se disolvieron 2 mg de cada uno de los fosfatidilnuclesidos en la minma cantidad

de cloroformo y se evapor el solvente con la ayuda de un evaporador rotatorio hasta la
formacin de un film de lpidos, se utiliz una corriente de nitrgeno para eliminar el
solvente restante y se resuspendi en 1 ml de buffer HEPES 100 mM, CaCl2 5 mM,
pH=7,5. Se agit en Vrtex durante 15 minutos y se sonic durante 30 minutos a
temperatura ambiente. De esta manera se forma una solucin con los derivados lipdicos
90

________________________________________________________________________________
agregados en estructuras supramoleculares; a esta solucin se le agreg 1 unidad de

fosfolipasa C de Bacillus cereus para iniciar la reaccin, se lo mantuvo en agitacin a 200
rpm a 37 C, se tomaron alcuotas de las mismas a diversos intervalos de tiempo y se
analizaron por HPLC.
2.2.9.3.
Cribado de nuevos biocatalizadores
2.2.9.3.1.
Procedimiento experimental del screening
Se efectu un cribado de todos los microorganismos de nuestro cepario. Se hicieron

crecer cada una de las cepas en su medio nutritivo respectivo aproximadamente 24 horas o
hasta saturacin; se tom 1 ml del mismo y se centrifug a 10000 rpm por 5 minutos; se
tomaron 0,5 ml del sobrenadante y se diluyeron con 0,5 ml de buffer de reaccin (HEPES
100 mM, CaCl2 5 mM, pH=7,5). Se agreg 10 mol de fosfatidilcolina disueltos en 0,5 ml
de cloroformo; la reaccin se mantuvo durante 48 h a 37C, y bajo agitacin a 200 rpm en
un agitador orbital y se tomaron alcuotas de la fase orgnica para ser analizadas por c.c.d.,
utilizando como fase mvil CH2Cl2:MeOH (65:35). Se seleccionaron aquellas cepas
capaces de hidrolizar el sustrato y que presentaron formacin de diacilglicerol,
comparndolo con un patrn proveniente de la hidrlisis de fosfatidilcolina catalizada por
una enzima comercial, fosfolipasa C de Bacillus cereus.
2.2.9.3.2.
Medicin de la actividad de las soluciones de PLC
Para determinar la actividad PLC presente en el sobrenadante de las nuevas cepas

seleccionadas en el screening previo, se utiliz un mtodo indirecto a travs de la medicin
del fosfato inorgnico, generado por la accin de una fosfatasa alcalina a partir de la colina
fosfato que se produce como producto de la reaccin deseada.
Se hicieron crecer los microorganismos seleccionados en sus medios nutritivos y
temperaturas respectivos. Los sobrenadantes fueron separados por centrifugacin a 10000
rpm por 5 minutos, y concentrados aproximadamente 5 veces a presin reducida y
91

________________________________________________________________________________
temperatura ambiente. Estas soluciones enzimticas fueron dializadas durante 24 horas

frente a una solucin HEPES 100 mM, CaCl2 5 mM, pH=7,5.
Para efectuar las reacciones de hidrlisis se mezclaron 7 mg de fosfatidilcolina
disueltos en 2 ml de cloroformo con 1 ml de cada una de las soluciones enzimticas
obtenidas anteriormente. Se las mantuvo bajo agitacin a 200 rpm a 37C y se tomaron
alcuotas a distintos intervalos de tiempo para analizar el contenido de fosfato inorgnico.
Para la medicin de fosfato inorgnico presente en cada una de las alcuotas, se
hidroliz la colina fosfato formada en la reaccin con la ayuda de una fosfatasa alcalina de
camarn (Sigma-Aldrich). Se tomaron 10 l de la solucin que contiene la colina fosfato,
se le adicionaron 10 l de una solucin 2 M de Tris, 0,4% SDS, pH=8,0; para detener la
reaccin inactivando la PLC. Se le agreg 1 unidad de fosfatasa alcalina de camarn y 2,3
l de buffer de reaccin 10X (provisto comercialmente junto con la solucin de fosfatasa;
250 mM tris, 10 mM MgCl2, 10 mM ZnCl2, pH=7,6), y se incubaron las distintas
fracciones durante 1 hora a 37C.
El reactivo que form el complejo coloreado con el fosfato inorgnico presente en la
solucin acuosa, se obtuvo mezclando un volumen de una solucin 4,2% p/v de molibdato
de amonio en HCl 5 N y 3 volmenes de una solucin 0,2% p/v de verde de malaquita,
luego de 30 minutos se filtra la solucin, la misma puede ser guardada hasta 3 semanas.
A 10 l de la solucin que contiene el fosfato inorgnico libre se le agreg 116 l
del reactivo colorante, y 4,6 l de Tween 20 (1,5% v/v) para evitar la aglutinacin del
colorante, y se midi la absorbancia a 660 nm.
La actividad de las distintas soluciones enzimticas fue determinada empleando la
velocidad inicial de formacin de colina fosfato y la actividad enzimtica especfica fue
calculada cuantificando la cantidad de enzima por el mtodo de Bradford5.
2.3. Bibliografa
(1)
Bregoff, H. M.; Roberts, E.; Delwiche, C. C. Journal of Biological Chemistry. 1953,

205, 565-574.
92

________________________________________________________________________________
(2)

Chemistry. 1988, 53, 4939-4945.
(3)
Stevens, J. D.; Fletcher, H. G. Journal of Organic Chemistry, 1968, 33, 1799-1805.
(4)
Berti, D.; Baglioni, P.; Bonaccio, S.; Barsacchi-Bo, G.; Luisi, P. L. Journal of
Phisical Chemistry B. 1998, 102, 303-308
(5)
Bradford, M. M. Analytical Biochemistry. 1976, 72, 248-254.
93

________________________________________________________________________________
94
Captulo 3 Desproteccin regioselectiva de pentofuranosas y

pentofuransidos peracetilados
CAPTULO
3
DESPROTECCIN REGIOSELECTIVA DE
PENTOFURANOSAS Y PENTOFURANSIDOS
PERACETILADOS
Parte de este captulo ha sido publicada como:

Esteban Gudio, Adolfo Iribarren, Luis Iglesias. Candida antarctica B lipase-catalysed
alcoholysis
of
peracetylated
Biotransformation. 2010, 28, 267-271
alkyl
D-pentofuranosides.
Biocatalysis
and
Captulo 3: Desproteccin regioselectiva de pentofuranosas y pentofuransidos peracetilados

________________________________________________________________________________
96

________________________________________________________________________________
3.1. Objetivos y resumen
El objetivo de este captulo es la evaluacin de la regioselectividad de reacciones de

alcohlisis e hidrlisis catalizadas por lipasas, aplicadas a pentofuranosas peracetiladas. Se
analiz el efecto de diversos sustituyentes en el carbono anomrico, de las condiciones de
reaccin y de la estereoqumica de la furanosa, sobre la regioselectividad de la reaccin.
En las alcohlisis realizadas, se ensayaron numerosas condiciones de reaccin para
obtener el producto deseado (furanosas acetiladas con el hidroxilo 5 libre) con un mayor
rendimiento. stas incluyeron tipo y cantidad de alcohol reactivo, temperatura, adicin de
cosolventes en el medio de reaccin, uso de lquidos inicos como medio de reaccin y
lipasa. Tambin se llevaron a cabo reacciones de hidrlisis con el mismo fin, analizando
condiciones de reaccin similares.
La lipasa B de Candida antarctica (CAL B) demostr ser la ms adecuada en las
reacciones de alcohlisis, mientras que la lipasa de Candida rugosa (CRL) lo fue en las de
hidrlisis.
3.2. Resultados y discusin
3.2.1. Sntesis de los distintos sustratos
3.2.1.1.
Sntesis de los furansidos utilizados
Para sintetizar los diferentes pentofuransidos se utiliz la misma metodologa

(Figura 3.1), que consisti en alquilar el hidroxilo anomrico mediante una glicosilacin de
Fischer, utilizando los alcoholes correspondientes al residuo alqulico deseado, como
disolvente de la reaccin, en presencia catalticas de cido sulfrico y cantidades
equimolares de sulfato de cobre anhidro, con el fin de capturar las molculas de agua
liberadas en la reaccin y de esta manera desplazar el equilibrio hacia el producto.
97

________________________________________________________________________________
Figura 3.1. Obtencin de los pentofuransidos utilizados
Luego de este primer paso, se realiz una acetilacin qumica en las dems
posiciones
con
anhdrido
actico
en
piridina
cantidades
catalticas
de
dimetilaminopiridina (DMAP), obtenindose de esta manera los azcares mostrados en la

Tabla 3.1 (1, 3, 4, 6, 7, 9 y 11a,b; 5b); en ella se indican adems los rendimientos obtenidos
y el porcentaje de cada anmero (a,b) en la mezcla. Para determinar este parmetro se
calcul la relacin existente entre la integracin de las seales del H-1 de los dos anmeros
por RMN. Salvo para el caso de 11, la separacin de los diasteremeros es dificultosa por
cromatografa en columna de silicagel, por lo que las reacciones enzimticas se ensayaron
utilizando la mezcla de ambos.
En la glicosilacin de Fischer, la formacin de los furansidos es cinticamente ms
favorable que la formacin de su contraparte, los piransidos, ya que la ciclacin formando
un anillo de 5 miembros es ms rpida que para uno de 6 miembros, por lo que a tiempos
cortos de reaccin predominan los primeros. Es por esto que el tiempo de reaccin debe ser
estrictamente controlado para evitar la formacin de los productos favorables
termodinmicamente, los piransidos, ya que presentan menores interacciones del tipo
estrico y mayor estabilizacin por el efecto anomrico2.
En el caso de la preparacin de isopropil 2,3,5-tri-O-acetil-D-ribofuransido (5b) se
observa slo la formacin del anmero , esto es debido al alto impedimento estrico que
produce este sustituyente alqulico ramificado cuando se encuentra en su configuracin ,
provocando que la formacin del anmero con menor energa se produzca exclusivamente.
Asimismo se denota que comparando sustituyentes lineales en el carbono anomrico, al
aumentar la cadena hidrocarbonada, se va enriqueciendo la mezcla de productos en el
anmero , efecto que puede apreciarse en la sntesis del butil 2,3,5-tri-O-acetil--Dribofuransido (6a,b), donde el diasteremero en cuestin se encuentra en un exceso 5
veces mayor que el anmero .
98

________________________________________________________________________________
Tabla 3.1. Sntesis de los diferentes sustratos utilizados (Figuras 3.1 y 3.2)
Compuesto
1a
OMe
1b
OMe
2a
OAc
2b
OAc
3a
OEt
3b
OEt
4a
OPr
4b
OPr
5b
6a
OBut
6b
OBut
7a
OMe
7b
OMe
8a
OAc
8b
OAc
9a
OMe
9b
OMe
10a
OAc
10b
OAc
11a
OMe
11b
OMe
b
a Rend. (%)
R1
R2
R3
R4
OAc
OAc
1,0:3,0
60
OAc
OAc
1,0:2,6
40
OAc
OAc
1,0:3,2
43
OAc
OAc
1,0:3,7
50
OiPr OAc
OAc
0:1,0
38
OAc
OAc
1,0:4,9
43
OAc
1,0:1,1
55
OAc
1,0:1,2
45
OAc OAc
1,0:1,1
77
OAc OAc
1,0:1,3
42
OAc 1,0:1,1
58
OAc
Relacin entre anmeros determinada por RMN-1H. bRendimiento obtenido por

purificacin en cromatografa en columna de silicagel.
3.2.1.2.
Sntesis de furanosas peracetiladas
Para la sntesis de los derivados peracetilados no se utiliz directamente una

acetilacin qumica clsica en piridina con anhdrido actico, ya que este procedimiento
gener una mezcla de los derivados furansicos y piransicos de los distintos azcares.
Para estos casos se utiliz un procedimiento quimioenzimtico para prepararlos (Figura
99

________________________________________________________________________________
3.2), que consiste en acetilar regioselectivamente, con CAL B y anhdrido actico en

tetrahidrofurano anhidro3, el hidroxilo 5 del azcar para fijar la forma furansica, y luego
peracetilar qumicamente con anhdrido actico mediante un procedimiento estndar. De
esta manera se obtuvieron las furanosas 2, 8 y 10a,b (Tabla 3.1).
Figura 3.2. Estrategia sinttica para la obtencin de las furanosas peracetiladas
La obtencin de 1,2,3,5-tetra-O-acetil--D-xilofuranosa no fue posible llevarla a

cabo, ya que el paso de proteccin del hidroxilo 5 por medio de la acetilacin con anhdrido
actico y CAL B no fue regioselectiva como en los casos anteriores, produciendo una
mezcla de derivados furansicos y piransicos en la acetilacin qumica final.
3.2.2. Efecto
del
sustituyente
en
el
carbono
anomrico
sobre
la
regioselectividad de la alcohlisis de ribofuransidos acetilados catalizada

por CAL B
Con el fin de obtener ribofuransidos acetilados desprotegidos regioselectivamente

en la posicin 5, se evalu primero la reaccin de alcohlisis con CAL B y CRL como
biocatalizadores. La eleccin de una desacetilacin enzimtica mediante alcohlisis se basa
en la regioselectividad observada en nuestros trabajos de alcohlisis de nuclesidos
peracilados4-6, que condujeron a la obtencin de los productos con el hidroxilo 5 libre. La
reaccin general se muestra en la Figura 3.3.
Con anterioridad a esta tesis, en nuestro laboratorio se efectu un anlisis de la
alcohlisis catalizada por CAL B de metil ribofuransidos peracetilados; la reaccin de
alcohlisis tuvo un desarrollo diferente cuando se utiliz metil 2,3,5-tri-O-acetil--Dribofuransido (1a) a cuando se utiliz metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (1b).
Mientras
que
con
el
primer
sustrato
se
obtuvo
el
producto
desprotegido
regioselectivamente, metil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido, con altos rendimientos, la

100

________________________________________________________________________________
alcohlisis del diasteremero fue menos selectiva, produciendo el metil -Dribofuransido totalmente desacetilado1.
En el presente trabajo se extendi el estudio, evaluando en primer lugar el efecto
que puede llegar a tener el sustituyente en el hidroxilo anomrico sobre la regioselectividad
de la reaccin; para ello se utilizaron como sustratos ribofuranosas, con diversos
sustituyentes alqulicos (1,2,4 y 6a,b; 5b) y acetilo (2a,b). Como ya se mencion, se ensay
la mezcla de anmeros como sustrato de la reaccin debido a la dificultad presente en la
separacin de los mismos por cromatografa en columna.
Se seleccionaron CAL B y CRL para catalizar las distintas reacciones, debido a que
existen antecedentes que confirman la regioselectividad por la desacetilacin del hidroxilo
primario en hidrlisis de hidratos de carbono o derivados de estos, como se coment
anteriormente6-8 (ver tambin 1.2.4).
Figura 3.3. Alcohlisis enzimtica de ribofuranosas y alquil ribofuransidos peracetilados
Se efectuaron ensayos con diferentes alcoholes reactivos como nuclefilos de las

alcohlisis, utilizando alcoholes lineales de cadenas alqulicas de longitud crecientes y uno
ramificado; tambin se evalu el efecto que puede ejercer el exceso molar del mismo con
respecto al sustrato (A/S); un resumen general de las condiciones utilizadas para cada una
de las ribofuranosas se encuentra en la Tabla 3.2.
101

________________________________________________________________________________
En principio, estos excesos fueron utilizados ya que existen antecedentes que

muestran que altos excesos de etanol, A/S = 1200, en este tipo de reacciones catalizadas por
CAL B permiten la remocin selectiva del acetato 5 en nuclesidos peracetilados4,6; y que
adems una A/S=120 permiti una regioselectividad similar con metil 2,3,5-tri-O-acetil-D-ribofuransido1; tambin se plante el uso de un exceso A/S=660, intermedio entre
ambos.
Tabla 3.2. Resumen de las condiciones
experimentales ensayadas en las alcohlisis
Alcohol
A/Sa
Enzima
T (C)
Etanol
120
CAL B
30/45
CAL B
30/45
CAL B
30/45
CAL B
30/45
CRL
30/45
CRL
30/45
CRL
30/45
CRL
30/45
660
1200
Propanol
120
660
1200
Isopropanol
120
660
1200
Butanol
120
660
1200
Etanol
120
660
1200
Propanol
120
660
1200
Isopropanol
120
660
1200
Butanol
120
660
1200
Relacin molar alcohol:sustrato
Debido al antecedente existente del etanol como alcohol reactivo, en primer lugar se
evalu a ste en diferentes excesos. Para los distintos sustratos ensayados 1-6, a una
A/S=120, la reaccin procedi a mayor velocidad que a excesos ms grandes, ya que a 24
102

________________________________________________________________________________
horas de iniciada se observ por c.c.d. gran proporcin de productos monoacetilados y

totalmente desacetilados, por lo que el estado regioselectivo, es decir, cuando la formacin
del producto con el hidroxilo 5 libre es mximo, se encuentra a tiempos menores.
La tendencia observada por c.c.d. para A/S=660 y 1200 es una menor velocidad de
reaccin lo que puede explicarse en base a una mayor dilucin de los sustratos, pero en el
caso en que se us como sustrato 1,2,3,5-tetra-O-acetil--D-ribofuranosa (2a,b) esta
disminucin de la velocidad permiti encontrar un estado regioselectivo, ya que relaciones
menores de etanol/sustrato generaron una gran cantidad de subproductos, en cantidades
cualitativamente equimolares.
Como se discutir posteriormente, fue posible obtener los productos acetilados
desprotegidos regioselectivamente con el hidroxilo 5 libre (12-15); todas sus estructuras
fueron confirmadas por datos espectroscpicos despus de su purificacin por
cromatografa en columna. El anlisis de los espectros RMN-1H de los productos obtenidos
(Tabla 3.10) mostr corrimientos significativos del H-5 con respecto al sustrato, coherentes
con su desacetilacin selectiva; seales en un rango 3,65-3,85 ppm contrastan con las
presentes en los H-5 de los sustratos, denotando una diferencia de 0,5-0,6 ppm hacia
campos ms altos. Tambin cabe aclarar que los desplazamientos qumicos de los H-5 de
los productos analizados son consistentes con hidrgenos metilnicos de alcoholes
primarios, indicando junto con los datos mencionados anteriormente que la desacetilacin
ocurri en el acetato 5. Cuando se analiz el espectro de RMN-13C, no se observ un
cambio importante en el desplazamiento qumico del C-5 comparado con el observado en el
correspondiente sustrato, mientras que el C-4 sufri un corrimiento a campos ms bajos
(2,5-3,5 ppm) en los productos 5-monodesacetilados.
En cuanto a las alcohlisis en cuestin, se observ un denominador comn en todas
las reacciones catalizadas por la enzima CRL, y es la baja reactividad en todos los excesos
y tipos de alcohol ensayados; esto es debido principalmente a los efectos negativos sobre la
actividad enzimtica que pueden provocar los solventes orgnicos polares, como son los
alcoholes, cuando la enzima no est protegida (por ejemplo a travs de la inmovilizacin de
la misma), por lo que su uso en reacciones hidrolticas est ms ampliamente estudiada,
como se evaluar en secciones posteriores9. A diferencia de lo mencionado para CRL, CAL
B puede soportar condiciones de reaccin consideradas ms perjudiciales para una enzima,
103

________________________________________________________________________________
debido al proceso de inmovilizacin a la que est sometida. Es por ello que los datos ms
satisfactorios se obtuvieron principalmente debido a la accin de esta ltima.
En las alcohlisis catalizadas por CAL B, en las que se utiliz 1,2,3,5-tetra-O-acetil-D-ribofuranosa (2a,b) como sustrato,
en donde los alcoholes fueron 1-propanol,
isopropanol y 1-butanol, se observ una rpida formacin de diversos productos

diacetilados, monoacetilados y el totalmente desacetilado en proporciones cualitativamente
equimolares; cuando se utiliz 1-butanol se observ una conversin total del sustrato a las
48 horas de iniciada la reaccin y una desacetilacin total a los 13 das dando como
producto -D-ribosa. Para los dems alcoholes se observ sustrato sin reaccionar
inclusive a 15 das de reaccin. La utilizacin de etanol a A/S=1200 permiti obtener 1,2,3tri-O-acetil--D-ribofuranosa (13a,b) con un rendimiento de 40% (Entrada 2, Tabla 3.3),
sin llegar a la conversin total del sustrato; excesos menores, aunque ms reactivos, no
demostraron regioselectividad ya que a 1 hora de iniciada la reaccin ya se observaron
diversos productos desacetilados; a pesar de ello a 7 das sigui observndose gran cantidad
de sustrato sin reaccionar. Cabe destacar que a A/S=1200 (Entrada 2, Tabla 3.3) no se
produjo la remocin del acetilo qumicamente ms reactivo, el que se encuentra en el
hidroxilo anomrico, resultado que afirma nuevamente la preferencia de CAL B por la
desacetilacin del hidroxilo primario.
Tabla 3.3. Resultados de las alcohlisis catalizadas por CAL

B para los sustratos 1-6
Entrada Sustrato
1
2
3
4
5
6
1a,b
2a,b
3a,b
5b
4a,b
6a,b
T (C)
t (h)
Alcohol
A/S
Producto
(Rend %)a
45
30
30
30
45
30
4
20
6
48
24
48
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
Etanol
1-Butanol
120
1200
120
1200
1200
1200
12a,b (33)
13a,b (40)
14a,b (43)
15b (24)
51b
27b
Determinado por purificacin del producto por cromatografa en columna de

silicagel. bMezcla de ismeros de posicin.
Al ensayar etil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (3a,b), el perfil de reaccin

fue muy similar cuando se utilizaron grandes excesos de alcohol reactivo (A/S=1200); tanto
etanol, 1-propanol e isopropanol presentaron muy poca conversin y escasa
104

________________________________________________________________________________
regioselectividad en los productos formados, observndose mucho sustrato sin reaccionar,

inclusive a 45C, por lo que se descart el escalado de estas reacciones para su anlisis
posterior; cuando se utiliz 1-butanol prcticamente no se observ formacin de ningn
producto. En cambio, cuando se utilizaron relaciones menores, A/S=120, se observ una
mayor reactividad, con prdida de regioselectividad. Especialmente en el caso del
isopropanol se observ conversin total del sustrato a las 24 horas con una proporcin
importante de etil -D-ribofuransido; la reaccin con 1-butanol, como su predecesora,
no demostr reactividad; cuando se utiliz etanol, a las 6 horas de iniciada la reaccin se
observ una mayor proporcin del producto diacetilado de inters, por lo que esta
biotransformacin fue escalada y el producto aislado, fue dilucidado por RMN-1H y -13C
como etil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido (14a,b), con un 43% de rendimiento
(Figura 3.4; Entrada 3, Tabla 3.3). A las 24 horas esta reaccin mostr una gran cantidad de
etil ,-D-ribofuransido.
2.14
2.13
Figura 3.4. RMN-1H del etil 2,3-di-O-acetil-,-ribofuransido (14a,b)

EG22 (PROD).101.esp
1.0
2.12
2.07
0.8
1.23
0.9
0.6
1.24
1.21
0.5
0.3
1.25
0.4
5.41
5.40
5.28
5.39
5.27
5.24
5.02
4.97
4.96
4.95
4.95
4.24 4.16
4.22 4.15
3.84 3.80
3.81 3.80
3.79
3.76 3.78
3.62
3.61
3.60
3.59
Normalized Intensity
0.7
0.2
0.1
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
105
3.5
3.0
Chemical Shift (ppm)
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5

________________________________________________________________________________
Con el isopropil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (5b), cuando se utiliz una

relacin A/S=120, no se encontr un estadio regioselectivo para ninguno de los alcoholes,
observndose conversin total del sustrato a las 24 horas y exclusivamente producto
totalmente desacetilado a las 48 horas; al aumentar la relacin A/S a 1200 la velocidad de
reaccin disminuy, permitiendo la acumulacin del producto diacetilado, siendo el etanol
el mejor alcohol reactivo utilizado. El anlisis del producto purificado permiti determinar
que se obtuvo exclusivamente el regioismero isopropil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido
(15b) con un rendimiento del 24% (Figura 3.5; Entrada 4, Tabla 3.3).
2.12
2.07
Figura 3.5. RMN-1H del isopropil 2,3-di-O-acetil--ribofuransido (15b)

di.O.ac.iso.rib.101.esp
1.0
0.9
0.8
1.23
1.22
1.19
1.17
0.6
0.5
0.4
4.22
4.21
4.21
3.95
3.94
3.92
5.42
5.41
5.19
0.2
0.1
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
0.00
3.82
3.80
3.79
3.67
0.3
1.25
5.11
0.7
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
Para el propil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransido (4a,b) y el butil 2,3,5-tri-Oacetil-,-D-ribofuransido (6a,b) se observaron resultados similares en sus alcohlisis, y
una baja regioselectividad denotada por la gran cantidad de subproductos (monoacetilados
y totalmente desacetilados) a tiempos cortos de reaccin. Por esto fue necesario la
utilizacin de relaciones A/S altas para disminuir la velocidad de reaccin, de esta manera
fue posible encontrar condiciones en donde se producen los derivados diacetilados
106
-0.5

________________________________________________________________________________
exclusivamente, pero con gran cantidad de sustrato sin reaccionar. A pesar de ello, estas
reacciones (Entradas 5 y 6, Tabla 3.3) fueron escaladas y los productos purificados por
cromatografa en columna y analizados espectroscpicamente por RMN-1H y -13C,
pudindose determinar que se trataba de una mezcla de ismeros de posicin diacetilados.
Una influencia de la aglicona en la regioselectividad de la reaccin de alcohlisis
catalizada por CAL B puede observarse dado que propil y butil 2,3,5-tri-O-acetil-,-Dribofuransidos (4a,b y 6a,b) reaccionaron sin selectividad, mientras que los grupos 5-Oacetilos de metil y etil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos (1a,b y 3a,b) y 1,2,3,5tetra-O-acetil-,-D-ribofuranosa (2a,b) fueron removidos regioselectivamente; el mismo
resultado fue posible cuando el sustrato fue isopropil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido
(5b). Desde el punto de vista de la regioselectividad, la longitud creciente del sustituyente
en el hidroxilo anomrico repercuti negativamente en las interacciones del sustrato con el
sitio activo de la enzima ya que en las alcohlisis de los sustratos, a excepcin de los
derivados propilado y butilado, se efectu primeramente la desacetilacin del hidroxilo 5
(para ambos anmeros) y luego en las dems posiciones.
3.2.3. Efecto de la configuracin de la furanosa sobre la regioselectividad de la

reaccin
Una vez analizada la influencia del sustituyente en el carbono anomrico, se intent

estudiar el efecto que podran llegar a tener las distintas configuraciones de los carbonos
que conforman el anillo furansico en la regioselectividad de la reaccin de alcohlisis
catalizada por CAL B. Para ello se sintetizaron una serie de pentofuranosas con dos tipos de
sustituyentes en el carbono anomrico, O-metil y O-acetil. Con este objetivo se prepararon
los sustratos mostrados en la Figura 3.6: metil 3,5-di-O-acetil-2-desoxi--Dribofuransido (7a,b), 1,3,5-tri-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuranosa (8a,b), metil 2,3,5tri-O-acetil--D-arabinofuransido (9a,b), 1,2,3,5-tetra-O-acetil--D-arabinofuranosa
(10a,b) y metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-xilofuransido (11a,b), con los rendimientos
mencionados en la Tabla 3.1. La metodologa para la preparacin de estos compuestos, que
se detall en la seccin 3.2.1., incluye la glicosilacin de Fischer con metanol para la
formacin de los distintos furansidos y la posterior acetilacin qumica; para las furanosas
107

________________________________________________________________________________
peracetiladas se utiliz un mtodo quimioenzimtico que incluy la acetilacin del

hidrxilo 5 con anhdrido actico en tetrahidrofurano, catalizada por CAL B, y la posterior
acetilacin qumica de las dems posiciones en piridina, con el mismo reactivo acilante
usado en el primer paso sinttico.
Figura 3.6. Alcohlisis enzimtica de furanosas de configuraciones diferentes a ribo
Las condiciones experimentales de alcohlisis ensayadas corresponden en parte a

las mencionadas en la Tabla 3.2, utilizando una A/S=120, 660 y 1200, slo que en este caso
CRL fue descartada debido a los resultados poco satisfactorios en las alcohlisis probadas
anteriormente. Pero como se observar ms adelante en esta seccin, fue necesario realizar
un cribado de condiciones experimentales para obtener resultados regioselectivos con
algunos sustratos. Ya que existen gran cantidad de antecedentes bibliogrficos que
demuestran que la naturaleza de un solvente orgnico tiene efectos profundos en la
especificidad del sustrato, y en la estereo- y regioselectividad de las reacciones catalizadas
por enzimas hidrolticas10-12, la eleccin de un solvente orgnico adecuado como medio (o
aditivo) de reaccin puede mejorar el perfil regioselectivo de las alcohlisis aplicadas a
nuestros sustratos. DAntona et al. observaron que la alcohlisis enzimtica catalizada por
lipasas aplicada a la sntesis de derivados de D-fructofuranosa regioselectivamente acilados
mostr un reconocimiento regio- y estereoselectivo diferencial frente a 1,2,3,4,6-penta-O108

________________________________________________________________________________
acetil-,-D-fructofuranosa8. El efecto del terbutilmetilter (TBME) sobre la butanlisis

catalizada por CRL di como resultado la desproteccin regioselectiva de uno de los
hidroxilos primarios presentes en la molcula generando 2,3,4,6-tetra-O-acetil--Dfructofuranosa mientras el anmero se mantuvo como sustrato sin reaccionar; la reaccin
catalizada con CAL B prob ser altamente regio- y estereoselectiva, dando como productos
1,2,3,4-tetra-O-acetil--D-fructofuranosa
2,3,4,6-tetra-O-acetil--D-fructofuranosa.
Teniendo en cuenta estos resultados, se ensayaron condiciones similares ampliando el

nmero de solventes orgnicos utilizados, una A/S=3 y las lipasas CAL B y CRL; adems
de 1-butanol tambin se ensay etanol como nuclefilo. Dado que el uso de proporciones
menores de solventes orgnicos (10% v/v) puede ejercer un efecto sobre la selectividad de
las lipasas, observado especialmente en reacciones hidrolticas13, se evalu el efecto de
estas cantidades sobre la regioselectividad de la reaccin, para ello se utilizaron A/S=120 y
1200 y CAL B como biocatalizador de modo de poder comparar con las reacciones
anteriores. Un resumen de las condiciones experimentales probadas se encuentra en la
Tabla 3.4.
Cuando se utiliz metil 3,5-di-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuransido (7a,b) como
sustrato, las mejores condiciones fueron con etanol como alcohol reactivo, ya que al usar
los dems la regioselectividad fue deficiente y la conversin, pobre. A una A/S=120 la
reaccin tuvo lugar a una velocidad muy rpida, se obtuvieron mezclas de productos y se
observ metil 2-desoxi--D-ribsido a las 24 horas, que a 5 das se form
cuantitativamente; en cambio, el exceso A/S=1200 mejor el perfil de la reaccin,
encontrndose que el tiempo ptimo para la desacetilacin regioselectiva fue de 24 horas y
la temperatura de 30C (Entrada 1, Tabla 3.5). El anlisis de los espectros de RMN-1H y 13
C del producto purificado por cromatografa en columna de silicagel permiti determinar
que se obtuvo metil 3-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuransido (16a).
109

________________________________________________________________________________
Tabla 3.4. Resumen de las condiciones de reaccin de las

alcohlisis de los sustratos 7-11 utilizando cosolventes
Alcohol
Enzima
A/S
Cosolvente
% Cosolvente
(v/v)
Etanol
CAL B/CRL
TBME
99.3
Diclorometano
99.3
ter de petrleo
99.3
1-Butanol
CAL B/CRL
Etanol
CAL B
Etanol
CAL B
120
1200
Dioxano
99.3
Acetonitrilo
99.3
TBME
99.3
Diclorometano
99.3
ter de petrleo
99.3
Dioxano
99.3
Acetonitrilo
99.3
Acetonitrilo
10
Diclorometano
10
ter de petrleo
10
Dioxano
10
Acetona
10
Acetonitrilo
10
Diclorometano
10
ter de petrleo
10
Dioxano
10
Acetona
10
Las etanlisis catalizadas por CAL B utilizando 1,3,5-tri-O-acetil-2-desoxi--Dribofuranosa
(8a,b)
como
sustrato
no
permitieron
obtener
el
producto
5-O-
monodesacetilado buscado, observndose un perfil de reaccin poco regioselectivo con

formacin de 2-desoxi-,-D-ribosa a las 24 horas de iniciada la reaccin, en todos los
casos probados. Por esto se decidi, como se discuti anteriormente, ampliar las
condiciones experimentales ensayadas, incluyendo solventes orgnicos en el medio de
reaccin. Las nuevas condiciones de reaccin probadas (Tabla 3.4) mostraron en general
una baja regioselectividad, y a las 2 horas de iniciadas las mismas se observ ya formacin
de productos monoacetilados. Sin embargo, a una A/S=3, usando diclorometano como
solvente y etanol como nuclefilo, se gener una regioselectividad superior comparada con
las dems condiciones experimentales ensayadas, por lo que la biotransformacin fue
escalada, se purific su producto por cromatografa y se analizaron sus espectros de RMN,
110

________________________________________________________________________________
determinando de esta manera que slo se obtuvo el 1,3-di-O-acetil-2-desoxi--Dribofuranosa (17a) con un exceso diastereomrico del 100% y un rendimiento del 24%
(Entrada 2, Tabla 3.5).
Tabla 3.5. Resultados de las reacciones llevadas a cabo con los sustratos
7-11
Entrada Sustrato
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
7a,b
8a,b
9a,b
9a,b
9a,b
9a,b
9a,b
10a,b
11a,b
11a,b
T (C)
t (h)
Alcohol
A/S
Cosolvente
(% v/v)
Producto
(Rend %)a
30
30
30
45
45
30
30
30
45
45
24
1.5
24
24
24
48
24
24
24
24
Etanol
Etanolb
Etanol
Butanolc
Etanolc
Isopropanol
Etanold
Etanole
Etanolc
Etanol
1200
3
1200
3
3
120
120
120
3
120
99,3
99,3
99,3
10
10
99,3
-
16a (32)
17a (24)
40g
18a,b (41)
18a,b (49)
33g
18a,b (35)
19a (30)
20a,b (72)
28g
Determinado por purificacin del producto por cromatografa en columna de

silicagel.bDiclorometano como cosolvente, cTBME como cosolvente. dAcetona como
cosolvente. eDMF como cosolvente. fAcetonitrilo como cosolvente. gMezcla de productos.
En general, los dos derivados pentofuransicos estudiados que poseen un ncleo 2desoxi presentaron una regioselectividad pobre en todas las condiciones ensayadas; los
rendimientos obtenidos fueron bajos y se observ una incapacidad por parte de las enzimas
utilizadas en detener la reaccin en el estado regioselectivo buscado.
Para los sustratos metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-arabinofuransido (9a,b) y 1,2,3,5tetra-O-acetil--D-arabinofuranosa (10a,b), en cuanto a las alcohlisis realizadas sin el
agregado de un solvente orgnico, se destacaron dos que fueron escaladas para su anlisis,
con etanol (A/S=1200, Entrada 3, Tabla 3.5) e isopropanol (A/S=120, Entrada 6, Tabla
3.5), las dems condiciones mostraron poca conversin del sustrato inclusive a 45C y el
anlisis espectroscpico de los productos por RMN permiti determinar que la reaccin no
procedi con regioselectividad alguna, observndose una mezcla de productos. Se procedi
entonces a analizar el posible efecto que podra llegar a tener la introduccin de un solvente
orgnico; se utiliz un 10% (v/v) del mismo; a una A/S=1200 no se observ mucha
conversin, adems a partir de los 4 das las reacciones no siguieron avanzando. A una
A/S=120, las reacciones posean mayor cantidad de producto deseado pero en ningn caso
se observ conversin total del sustrato. Sin embargo, el escalado de la reaccin con etanol
111

________________________________________________________________________________
(A/S=120) y acetona como cosolvente (Entrada 7, Tabla 3.5), que cualitativamente mostr
un mejor perfil de reaccin, y el posterior anlisis del correspondiente producto purificado
permiti obtener metil 2,3-di-O-acetil--D-arabinofuransido (18a,b) con un 35% de
rendimiento, mientras que el uso de un exceso menor (A/S = 3) y TBME como solvente
condujo al mismo producto con un rendimiento mayor, 49% (Entrada 5, Tabla 3.5). El
cambio del alcohol a butanol mostr un perfil de reactividad similar obtenindose un 41%
de rendimiento (Entrada 4, Tabla 3.5). La utilizacin de etanol (A/S=120) posibilit la
produccin de 1,2,3-tri-O-acetil--D-arabinofuranosa (19a) con un 30% de rendimiento,
pero en este caso fue necesario el uso de dimetilformamida como cosolvente de reaccin
(Entrada 8, Tabla 3.5).
Las alcohlisis llevadas a cabo con metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-xilofuransido
(11a,b) no mostraron un perfil de reaccin conveniente para nuestros propsitos; con los
alcoholes utilizados como reactivos (Tabla 3.2) no se observ regioselectividad debido a la
presencia de gran cantidad de subproductos a tiempos cercanos al inicio de la reaccin;
inclusive se pudo determinar cualitativamente por c.c.d. la presencia de diversos
regioismeros diacetilados. El escalado de la reaccin correspondiente al uso de etanol a
A/S=120 (Entrada 10, Tabla 3.5), la purificacin del producto y su posterior anlisis
espectroscpico permitieron determinar que la reaccin careci de regioselectividad, al
observarse por RMN una mezcla de productos. Se procedi entonces a evaluar el efecto de
un cosolvente sobre la regioselectividad de la reaccin, para ello se ensayaron las
condiciones descriptas en la Tabla 3.4; se escal cuando se utiliz etanol a A/S=3 en
terbutilmetil ter (Entrada 9, Tabla 3.5), obtenindose metil 2,3-di-O-acetil--Dxilofuransido (20a,b) con un rendimiento del 72%. Esta metodologa permiti obtener
regioselectivamente el producto 20a,b, a diferencia de la hidrlisis de 11a,b catalizada por
CRL e informada por Hennen et. al7, que condujo a una mezcla de ismeros de posicin.
Resumiento,
con
los
sustratos
2-desoxirribofuransicos,
arabinsicos
xilofuransicos, fue necesario un cribado de condiciones experimentales para obtener

regioselectividad en las reacciones, ya que el uso exclusivo de alcohol no permiti obtener
el producto 5-O-desacetilado buscado, a diferencia de lo observado con los derivados
ribosdicos.
112

________________________________________________________________________________
3.2.4
Alcohlisis en lquidos inicos
Los lquidos inicos (LIs) son sustancias orgnicas compuestas completamente de

iones y que son lquidas a temperatura ambiente. El inters por estos compuestos se debe a
su versatilidad en el control de propiedades tales como polaridad, hidrofobicidad y
miscibilidad con otros solventes orgnicos, a travs de la adecuada eleccin del catin y el
anin que lo forman; el nmero de aplicaciones de estos lquidos como medio de reaccin
para sntesis orgnica y catlisis est creciendo rpidamente. El primer reporte de
biocatlisis en estos lquidos fue realizado en el ao 200014. El inters de fondo en su
utilizacin en biocatlisis est dado por el reemplazo de los solventes orgnicos voltiles
por los lquidos inicos no voltiles, adems de las propiedades no convencionales de los
LIs que ya han dado lugar a metodologas de reaccin nuevas y eficientes15.
Las lipasas, en particular, mantienen su actividad en lquidos inicos anhidros, y la
selectividad y estabilidad operacional son a menudo mejores que en medios tradicionales.
Biotransformaciones regioselectivas mediadas por lipasas ya han sido realizadas en lquidos
inicos; Nara et al.16, utilizando como sustrato 3,4,6-tri-O-acetil-D-glucal, efectuaron una
comparacin entre el tetrahidrofurano y dos lquidos inicos, hexafluorofosfato de 1-butil3-metilimidazolio
([BMIM][PF6],
Figura
3.7)
tetrafluoroborato
de
1-butil-3-
metilimidazolio ([BMIM][BF4]) en alcohlisis e hidrlisis para evaluar la influencia del

medio de reaccin en la velocidad y selectividad desplegada por la enzima. Una marcada
regioselectividad hacia la formacin de 4,6-di-O-acetil-D-glucal fue observada en
[BMIM][PF6] con 84% de rendimiento despus de 6 horas con un 98 % de
regioselectividad en la hidrlisis y 48% de rendimiento con la misma selectividad en
alcohlisis utilizando la lipasa de Pseudomona cepacia.
La utilizacin de lquidos inicos como medio de reaccin en acilaciones
regioselectivas catalizadas por lipasas tambin ha sido llevada a cabo. CRL fue utilizada
como biocatalizador en reacciones de acilacin, utilizando como sustrato metil-6-O-tritilglucsidos y galactsidos, y evaluando como medio de reaccin THF, cloroformo,
[BMIM][PF6] y hexafluorofosfato de 1-metoxietil-3-metilimidazolio ([MOEMIM][PF6]),
observndose que las reacciones que tuvieron lugar en lquidos inicos procedieron con
113

________________________________________________________________________________
mayor rapidez y selectividad17. Tambin la acetilacin de glucosa en [BMIM][BF4]

catalizada por CAL B, con acetato de vinilo como reactivo acilante, permiti obtener 6-Oacetil glucosa con un 89% de regioselectividad en el producto formado, mientras que
cuando
se
us
tetrafluoroborato
de
1-etil-3-metilimidazolio
([EMIM][BF4])
la
regioselectividad alcanzada lleg a 99%18.

Se decidi evaluar el efecto del agregado de lquidos inicos en el medio de
reaccin de las alcohlisis de pentofuranosas acetiladas. Como primer paso se utilizaron
condiciones de alcohlisis con distintos excesos de alcohol, ensayndose nicamente etanol
debido a que demostr ser ms eficaz en este tipo de reacciones; el lquido inico fue usado
como solvente de la reaccin para A/S=3 y con A/S superiores se mantuvo la cantidad de
lquido inico aadido (10% v/v) y lo que se modific fue la cantidad de etanol (Tabla 3.6).
De esta manera es posible la comparacin con las alcohlisis correspondientes para cada
relacin A/S en la seccin 3.2.2. (Tabla 3.2) y analizar el efecto producido por la presencia
del lquido inico en lugar de un solvente orgnico tradicional.
Se utilizaron dos lquidos inicos que de acuerdo a los datos en bibliografa
descriptos anteriormente, demuestran una buena compatibilidad con la enzima utilizada
(CAL B), y un tercero disponible en nuestro laboratorio, que comparte el catin pero vara
en su parte aninica (Figura 3.7) ellos son; [BMIM][PF6], [BMIM][BF4], y
metanosulfonato de 1-butil-3-metilimidazolio ([BMIM][MeSO]); cuando se utiliz
[BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO] las reacciones fueron homogneas, en cambio al utilizar
[BMIM][PF6] se formaron dos fases ya que el lquido inico es insoluble en etanol.
Figura 3.7. Estructuras de los lquidos inicos utilizados
114

________________________________________________________________________________
Tabla 3.6. Resumen de condiciones experimentales

de las etanlisis catalizadas con CAL B y llevadas a
cabo en presencia de lquidos inicos (LIs)
LI
[BMIM][PF6]
[BMIM][BF4]
[BMIM][MeSO]
A/S
% LI (v/v)
Temp (C)
99.3
30
60
10
30
120
10
30
1200
10
30
99.3
30
60
10
30
120
10
30
1200
10
30
99.3
30
60
10
30
120
10
30
1200
10
30
Se evaluaron tres sustratos: metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (1a,b),

metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-arabinofuransido (9a,b) y metil 2,3,5-tri-O-acetil--Dxilofuransido (11a,b), con la finalidad de mantener constante la variable correspondiente a
la sustitucin del carbono anomrico.
El exceso muy grande de etanol (A/S=1200) demostr una pobre reactividad,
observndose una gran proporcin de sustrato sin reaccionar, a diferencia de las etanlisis
sin la presencia de lquido inico, en las que, a pesar de ser muchos menos reactivas que a
menores A/S, a tiempos mayores hay una conversin mayor. En el caso de los LIs la
reaccin no avanz ms a partir de una hora de iniciada la misma, sin importar el lquido
inico utilizado.
En comparacin con las alcohlisis analizadas en la seccin 3.2.3 con cosolventes,
la conversin del sustrato sufri una disminucin en general cuando se utilizaron lquidos
inicos en su lugar.
Al utilizar como sustrato metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-ribofuransido (1a,b), la
produccin mxima de producto diacetilado vari dependiendo del lquido inico utilizado.
Cuando se utiliz [BMIM][BF4], a la hora se observ slo formacin de productos
diacetilados pero poca conversin y a tiempos mayores no se observ un avance de la
115

________________________________________________________________________________
misma, mostrando que este medio de reaccin es poco conveniente para obtener el producto
deseado. Un denominador comn observado en estas reacciones es que al parecer, el exceso
de alcohol comprendido entre 3-120 no parece tener un efecto determinante, ya que no se
observan diferencias apreciables en la velocidad y el perfil de reaccin de los distintos
excesos.
Cuando el medio de reaccin estaba compuesto por alguno de los otros dos lquidos
inicos, se observaron resultados diferentes a los encontrados con el lquido inico
utilizado anteriormente. La presencia de [BMIM][PF6] tuvo un efecto negativo sobre la
regioselectividad de la reaccin ya que se observ la formacin de gran cantidad de
subproductos, diacetilados y monoacetilados. El exceso de alcohol agregado a la reaccin
no pareci tener influencia en ella, ya que se observ el mismo perfil de reaccin con los
tres excesos; a las 24 horas apareci metil ,-ribofuransido sin posterior conversin del
sustrato.
A diferencia de los lquidos inicos probados anteriormente, la utilizacin de
[BMIM][MeSO] fue influida por el exceso de alcohol utilizado; en este caso, al aumentar la
relacin etanol/sustrato se observ una mayor reactividad, llegando a conversin total del
sustrato en presencia de un exceso A/S=120 a las 24 horas de reaccin. A pesar del efecto
provocado por este lquido inico, las distintas relaciones etanlicas no condujeron a una
reaccin regioselectiva, debido a la gran cantidad de subproductos presentes.
En el caso del metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-arabinofuransido (9a,b), las etanlisis
catalizadas en [BMIM][BF4] mostraron un perfil de reaccin similar al sustrato anterior;
poca conversin e independencia de la relacin etanol/sustrato utilizada; lo mismo sucedi
con la alcohlisis de metil 2,3,5-tri-O-acetil--D-xilofuransido (11a,b), descartando a
este lquido inico como candidato para ser utilizado como solvente en etanlisis
catalizadas por CALB.
Las reacciones llevadas a cabo en presencia de [BMIM][PF6] y [BMIM][MeSO] de
9 y 11a,b demostraron muy poca reactividad, observndose mucha cantidad de sustrato sin
reaccionar.
Ninguna de las etanlisis catalizadas en presencia de lquido inico ensayadas
demostr un perfil regioselectivo til para nuestros propsitos, por lo que ninguna
biotransformacin fue escalada para su posterior anlisis espectroscpico.
116

________________________________________________________________________________
3.2.5
Hidrlisis enzimtica de pentofuranosas acetiladas
Adems de las alcohlisis previamente discutidas, se ensayaron hidrlisis con los

sustratos 1, 9 y 11a,b (Tabla 3.1), tanto con CAL B como con CRL, en buffer fosfato
30mM, pH=7,0; cabe destacar que dada la polaridad de los sustratos stos no eran solubles
y se encontraban en suspensin.
En general el comportamiento de los distintos sustratos fue similar, ya que todas las
reacciones mostraron una pobre regioselectividad, dada la cantidad de subproductos
presentes en cada una de las reacciones probadas.
Una modificacin de las condiciones de reaccin fue el agregado de cosolventes
para obtener una reaccin homognea; Wong7 ya haba utilizado esta metodologa con el
agregado de 10% (v/v) de dimetilformamida, obteniendo rendimientos variables de los
productos 12a,b (Figura 3.3) y 18a (Figura 3.6), cuando utilizaba la lipasa de Candida
cylindracea (actualmente, CRL). Ampliando esta metodologa, adems de CAL B y CRL
se probaron otras dos hidrolasas: la lipasa de pncreas porcino (PPL) y la esterasa de
hgado porcino (PLE), en distintos medios de reaccin, compuestos de buffer fosfato 30mM
(pH=7,0), con 10% (v/v) de un solvente miscible en agua (Tabla 3.7).
Las hidrlisis de 1a,b catalizada por estas enzimas en estos sistemas mostraron por
c.c.d. resultados diferentes entre s; las reacciones catalizadas por CAL B fueron muy
reactivas observndose aparicin de productos monoacetilados a las 3 horas de iniciadas las
mismas y producto totalmente desacetilado a las 24 horas, observndose siempre sustrato
sin reaccionar; los resultados fueron similares con todos los cosolventes utilizados. En
cambio, cuando se utilizaron PPL y PLE, slo se observ poca conversin del sustrato, por
lo que estas enzimas no fueron capaces de aceptar estos compuestos como sustratos. En
concordancia con Wong, CRL fue el biocatalizador ms conveniente ya que se observ una
conversin total del sustrato a las 24 horas con una gran proporcin de productos
diacetilados; a pesar de que los resultados fueron parecidos para todos los solventes, el uso
de acetona disminuy la cantidad de productos monoacetilados, siendo esta ltima la
condicin elegida para el escalado y posterior anlisis espectroscpico del producto
117

________________________________________________________________________________
purificado; los espectros de RMN confirmaron la presencia del producto 5-Omonodesacetilado (12a,b) deseado, con un rendimiento del 82%.
Tabla 3.7. Resumen de las condiciones de reaccin de las

hidrlisis de los sustratos 1,9 y 11ab
Enzima
Cosolvente
% (v/v)
Temperatura
(C)
10
30
10
30
10
30
10
30
Acetona
Acetonitrilo
CAL B
Dimetilformamida
1,4-Dioxano
Tetrahidrofurano
Acetona
Acetonitrilo
CRL
Dimetilformamida
1,4-Dioxano
Tetrahidrofurano
Acetona
Acetonitrilo
PPL
Dimetilformamida
1,4-Dioxano
Tetrahidrofurano
Acetona
Acetonitrilo
PLE
Dimetilformamida
1,4-Dioxano
Tetrahidrofurano
Teniendo en cuenta estos resultados, se repiti esta ltima experiencia pero

utilizando como sustratos 9 y 11a,b; aunque los resultados fueron similares, ya que la
conversin del sustrato fue alta, se observ una mayor cantidad de productos
monodesacetilados y totalmente desacetilados, determinados cualitativamente por c.c.d.
118

________________________________________________________________________________
3.2.5.1 Hidrlisis en ILs

3.2.5.1.1
Hidrlisis con [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO]
Se efectuaron hidrlisis de los mismos sustratos ensayados en el inciso anterior,

pero en este conjunto de reacciones se evalu la influencia de la introduccin de un lquido
inico miscible en el medio de reaccin, [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO], ensayados en
un 10 y 20% (v/v) en buffer fosfato 30 mM (pH=7,0). Lou et al.19 reportaron que un 20%
(v/v) de [BMIM][BF4] permiti efectuar la hidrlisis enantioselectiva de L-fenilglicinato de
metilo a partir del racemato con CAL B; la enzima exhibi una actividad y
enantioselectividad excelente en sistemas conteniendo este LI, comparado con otros
solventes orgnicos ensayados.
La hidrlisis de metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransido (1a,b) demostr
cualitativamente una regioselectividad moderada cuando se utiliz una proporcin de 10%
(v/v) de [BMIM][BF4], observndose un mximo de productos desacetilados en 5 a las 3
horas de reaccin; el aumento de la cantidad de lquido inico (20% v/v) parece tener un
efecto inhibitorio en la enzima, ya que se observ una mayor cantidad de sustrato sin
reaccionar. Se decidi escalar la condicin de reaccin ms favorable, y tras purificar el
producto formado por cromatografa en columna, los espectros de RMN permitieron
determinar que se obtuvo exclusivamente metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido
(12a,b) con un rendimiento del 62%, resultado sensiblemente menor que el obtenido con
una reaccin anloga pero con acetona en lugar de lquido inico presente en el medio de
reaccin (seccin 3.2.5).
Las condiciones ensayadas anteriormente se aplicaron a metil 2,3,5-tri-O-acetil-,D-xilofuransido (11a,b), pero los resultados fueron marcadamente diferentes, ya que no se
obtuvo un estado regioselectivo, observndose gran cantidad de subproductos; nuevamente
se manifest el posible carcter inhibitorio sobre la actividad enzimtica cuando se aument
la cantidad de lquido inico. Se realiz un escalado de la biotransformacin con menor
cantidad de [BMIM][BF4] (20% v/v), aislndose un producto diacetilado por cromatografa
en columna, con un rendimiento de 25%; el anlisis de sus espectros de RMN permiti
119

________________________________________________________________________________
determinar que la reaccin careci de regioselectividad ya que se observ una mezcla de

productos.
La hidrlisis del derivado arabinofuransico (9a,b), utilizando las mismas
condiciones aplicadas a los sustratos anteriores no present una gran conversin del mismo
a productos, observndose por c.c.d. la presencia mayoritaria del sustrato, inclusive a
mayores tiempos de reaccin.
Las reacciones llevadas a cabo en presencia de [BMIM][MeSO] no mostraron
reactividad con ninguno de los sustratos, demostrando un fuerte efecto negativo sobre la
actividad de las enzimas.
3.2.5.1.2
Hidrlisis con [BMIM][PF6]
Las reacciones de hidrlisis llevadas a cabo con [BMIM][PF6] fueron heterogneas,

debido a que este lquido inico es totalmente inmiscible con agua. Existen reportes en los
que este tipo de sistemas fueron utilizados exitosamente para la desproteccin
regioselectiva de etil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio--D-glucopiransido20, observndose una
modulacin de la regioselectividad de la lipasa que cataliza la reaccin, de acuerdo a la
proporcin de lquido inico presente en el medio de reaccin.
Por lo mencionado anteriormente se procedi a analizar el efecto que tiene este
lquido inico con CAL B y CRL como catalizadores en reacciones de hidrlisis. Se
utilizaron diversas proporciones: 25, 50 y 75% (v/v) de [BMIM][PF6] en buffer fosfato
30mM (pH=7,0), observndose que las mejores condiciones fueron un 75% y 50% del
lquido inico en cuestin, en analoga a lo descripto en bibliografa donde un 50% v/v
mostr ser la mejor condicin para la desproteccin regioselectiva del tioglucopiransido,
empleando la lipasa de Candida cylindracea20.
Las reacciones con el metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransido (1a,b) no fueron
regioselectivas, ya que a tiempos muy cortos se constat una proporcin muy grande de
productos monoacetilados con las dos enzimas ensayadas y en todas las proporciones de
lquido inico.
Para los sustratos metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-arabinofuransido (9a,b) y metil
2,3,5-tri-O-acetil-,-D-xilofuransido (11a,b), el perfil de las reacciones fue diferente, y
120

________________________________________________________________________________
se pudo hacer una analoga con lo informado por Gervaise et al.20, donde la produccin de
derivados diacetilados fue mxima cuando se usaron concentraciones elevadas del lquido
inico en cuestin. En la Tabla 3.8 se presentan las condiciones de reaccin que fueron
escaladas y los resultados obtenidos.
Tabla 3.8. Resultados de las hidrlisis en presencia de

[BMIM][PF6]
Sustrato
9a,b
11a,b
Enzima
% LI (v/v)a
Productob (Rend %)c
CAL B
CAL B
CRL
CRL
CAL B
CAL B
CRL
CRL
75
50
75
50
75
50
75
50
18a,b (17)
18a,b (42)
18a,b (38)
18a,b (54)
19d
27d
35d
40d
Porcentaje de [BMIM][PF6]. bProducto segn Figura 3.6. cDeterminado por

purificacin del producto por cromatografa en columna de silicagel. dMezcla de
productos
Debido a la dificultad de separar el lquido inico remanente de la reaccin

mediante cromatografa en columna de silicagel, se debi someter la muestra a varias
purificaciones cromatogrficas sucesivas para obtener el producto, de all que los
rendimientos obtenidos no sean representativos de los observados cualitativamente por
c.c.d. A pesar de esto se pudo determinar, a travs del anlisis espectroscpico de los
productos, que en las reacciones de hidrlisis del metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-Dxilofuransido (11a,b) no hubo regioselectividad en ninguna de las condiciones ensayadas,
ya que se determin que se trataba de una mezcla de productos.
La hidrlisis de metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-arabinofuransido (9a,b) provoc la
formacin del producto diacetilado con el hidroxilo 5 libre (18a,b) con rendimientos
moderados, observndose un mejor desempeo por parte de CRL en comparacin con CAL
B.
121

________________________________________________________________________________
3.2.5.1.3
Cuantificacin de las reacciones de hidrlisis por HPLC
Teniendo en cuenta los resultados anteriores, y debido a la necesidad de mejorar el

anlisis de las reacciones ensayadas, en cuanto a la determinacin de un rendimiento
representativo para las distintas reacciones evitando las prdidas de producto por las
purificaciones cromatogrficas, se decidi modificar el tratamiento que se hizo sobre las
biotransformaciones para poder cuantificar las mismas por cromatografa lquida de alta
resolucin (HPLC).
Debido a que el detector del HPLC utilizado es UV-visible, se debi determinar la
longitud de onda correspondiente a la mxima absorcin de este tipo de compuestos, que
debido a su estructura, tienen al acetilo como nico cromforo presente en la molcula
capaz de absorber en la ventana determinada por la interferencia que generan los solventes
de la fase mvil. De los barridos espectrales efectuados sobre los productos diacetilados y
monoacetilados aislados, se determin que la longitud de onda ptima es 215 nm. Teniendo
en cuenta que el coeficiente de extincin de los compuestos es muy pequeo, se decidi
inyectar las distintas muestras sin dilucin alguna.
De los datos extrados de los cromatogramas, no se pudieron sacar conclusiones
certeras debido a la gran interferencia que imparta la presencia del lquido inico, y no
pudiendo encontrar condiciones cromatogrficas pertinentes para la cuantificacin, se
decidi agregar un paso de separacin a las muestras tomadas de la mezcla de reaccin para
eliminar el lquido inico presente con la menor prdida posible de compuestos de inters.
Descartada la cromatografa de adsorcin, se decidi utilizar la cromatografa de
intercambio inico, haciendo uso de una resina de intercambio catinico para eliminar el
componente cromforo del lquido inico (catin imidazolio). Dado que el intercambio no
poda hacerse en medio acuoso, debido a la baja solubilidad tanto de los compuestos de
inters como del lquido inico, se ensay la insolubilidad de diversas resinas en
cloroformo, siendo la ms adecuada para dicho proceso la Dowex 50WX2 en su forma
sdica. El procesamiento de cada muestra con la resina elegida en cloroformo permiti
separar las distintas mezclas de sustrato y productos del catin del lquido inico,
permitiendo la cuantificacin de las reacciones por HPLC. Los resultados obtenidos para la
hidrlisis de la mezcla 9a,b se resumen en la Tabla 3.9.
122

________________________________________________________________________________
Tabla 3.9. Resultados de la hidrlisis de 9 en

presencia de [BMIM][PF6]
Sustrato
Enzima
% LI (v/v)a
9a,b
CRL
CRL
CAL B
CAL B
50
75
50
75
Rend %
18a,b (24h)b
77
51
50
17
Porcentaje de [BMIM][PF6]. bDeterminado por HPLC
Debido a la gran cantidad de muestra que debe inyectarse para obtener

concentraciones que se encuentren en la zona lineal de la curva de calibracin, se tomaron
alcuotas cuando la produccin del compuesto de inters fue mxima, determinndose esto
por c.c.d.
Se observ un aumento de los rendimientos, consecuencia del mtodo utilizado para
su determinacin. Como puede desprenderse del anlisis de los datos obtenidos, la lipasa
CRL demostr ser la ms indicada para este tipo de reacciones con rendimientos que van de
moderados a altos, a las 24 horas de reaccin. El efecto de la proporcin de lquido inico
es anlogo al informado en bibliografa20, siendo la proporcin de 50% v/v la que produce
mayor cantidad del producto regioselectivamente diacetilado.
123

________________________________________________________________________________
Tabla 3.10. RMN-1H de los productos 12-201 (Figuras 3.3 y 3.6)

Compuesto
H1
H2
H3
H4
5.20 (dd, 1H, J1=7.5

Hz, J2=3.7 Hz)
4.14-4.19
(m, 1H)
5.39 (dd, 1H, J1=6.1

Hz, J2=5.1 Hz)
4.22-4.25
(m, 1H)
12a
5.14 (d, 1H, 4.96 (dd, 1H, J1=7.5

J=4.3 Hz)
Hz, J2=4.3 Hz)
12b
4.92 (s, 1H)
13a
6.43 (d, 1 H, 5.22 (dd, 1H, J1=6.7

J=4.5 Hz)
Hz, J2=4.5 Hz)
5.31 (dd, 1H, J1=6.7

Hz, J2=3.0 Hz)
4.30-4.34
(m, 1H)
5.35 (d, 1H, J=4.9

Hz)
5.27 (d, 1H, 4.95 (dd, 1H, J1=7.2
J=4.3 Hz)
Hz, J2=4.3 Hz)
5.41 (dd, 1H, J1=7.0

Hz, J2=4.9 Hz)
5.18 (dd, 1H, J1=7.2
Hz, J2=4.1 Hz)
4.25-4.28
(m, 1H)
4.14-4.16
(m, 1H)
13b
14a
5.24 (d, 1H, J=5.1

Hz)
6.16 (s, 1H)
Residuos acetilos2
Residuos alqulicos anomricos
2.13; 2.14
3.45 (s, 3H, OCH3)
2.06; 2.12
3.44 (s, 3H, OCH3)
2.08; 2.12; 2.13
-----
3.66-3.68 (m, 2H)
2.07; 2.09; 2.10
-----
3.54-3.63 (m, 2H)
2.06; 2.12
-----
H5
3.86 (dd, 1H,
J1=12.1 Hz,
J2=3.2 Hz)
H5
3.80 (dd, 1H,
J1=12.1 Hz,
J2=3.3 Hz)
3.66-3.68 (m, 2H)

3.84 (dd, 1H,
J1=12.3 Hz,
J2=3.1 Hz)
3.78 (dd, 1H,

J1=12.3 Hz,
J2=3.1 Hz)
14b
5.02 (s, 1H)
5.23 (d, 1H, J=5.0

Hz)
5.39 (dd, 1H, J1=6.6

Hz, J2=5.0 Hz)
4.21-4.24
(m, 1H)
3.83-3.87 (m,
1H)
3.65-3.68 (m,
1H)
2.13; 2.14
1.23 (dd, 3H, J1=14.0 Hz; J2=6.9 Hz,

CH3); 3.64-3.67 (m, 1H, OCH2); 3.763.81 (m, 1H, OCH2)
15b
5.11 (s, 1H)
5.18 (d, 1H, J=5.0

Hz)
5.41 (dd, 1H, J1=6.4

Hz, J2=5.0 Hz)
4.20-4.23
(m, 1H)
3.81 (dd, 1H,

J1=12.1 Hz,
J2=3.0 Hz)
3.65 (dd, 1H,

J1=12.1 Hz,
J2=2.6 Hz)
2.06; 2.12
1.18 (d, J=6.1 Hz, CH3); 1.22 (d; J=6.1

Hz; CH3); 3.93 (h, 1H, J =6.1 Hz, OCH)
16a
5.09 (d, J=5.0)
2.03-2.06 (m, 1H);

2.34-2.40 (m,1 H)
5.08 (m, 1H)6
3.68-3.88 (m, 2H)
2.09
3,40 (s, 3H, OCH3)
17a
6.39 (d, 1H,

J=5.3 Hz)
2.12-2.16 (m, 1H);

2.47-2.52 (m, 1H)
5.16-5.19 (m, 1H)
3.74-3.83 (m, 2H)
2.08; 2.11
-----
3.90-3,92 (m, 2H)
2.11; 2.12
3.41 (s, 3H, OCH3)
3.77-3.81 (m, 2H)
2.115; 2.13
3.42 (s, 3H, OCH3)
3.78-3.93 (m, 2H)
2.12; 2.13; 2.14
-----
3.66-3.68 (m, 2H)
2.11; 2.12
3.45 (s, 3H, OCH3)
3.70-3.72 (m, 2H)
2.128; 2.13
3.40 (s, 3H, OCH3)
4,98 (dd, 1H, J1=4,6

Hz, J2=1,2 Hz)
5.33 (dd, 1H, J1=6.8
18b
Hz, J2=5.3 Hz)
5.12 (dd, 1H, J1=5.1
6.18 (s, 1H) 5.25 (d, 1H, J=1.8)
19a
Hz, J2=1.8 Hz)
5.15 (d, 1H, 5.05 (dd, 1H, J1=6.0 5.52 (dd, 1H, J1=7.1
20a
J=4.7 Hz)
Hz, J2=4.7 Hz)
Hz, J2=6.0 Hz)
4.88 (d, 1H, 5.19 (dd, 1H, J1=2.7 5.30 (dd, 1H, J1=6.6
20b
J=1.1 Hz)
Hz, J2=1.1 Hz)
Hz, J2=2.7 Hz)
1
500 MHz, CDCl3; desplazamientos qumicos () expresados en ppm.
2
Cada seal corresponde a un singulete que integra para 3H.
18a
5.03 (d, 1H,

J=1,2Hz)
5.09 (d, 1H, 5.07 (dd, 1H, J1=6.8
J=4.6 Hz)
Hz, J2=4.6 Hz)
4.93 (s, 1H)
4.11 (dd, 1H,

J1=7.7 Hz,
J2=3.8 Hz)
4.29 (dd, 1H,
J1=6.7,
J2=3.6 Hz)
4.10-4.13
(m, 1H)
4.03-4.06
(m, 1H)
4.21-4.25
(m, 1H)
4.35-4.38
(m, 1H)
4.47-4.51
(m, 1H)
124

________________________________________________________________________________
Tabla 3.11. RMN-13C de los productos 12-201 (Figuras 3.3 y 3.6)

Compuesto
C1
C2
C3
C4
C5
Residuos acetilos
Residuos alqulicos
anomricos
12a
101.61
71.24
69.99
82.46
62.31
20.61, 20.62 (CH3s); 170.81, 170.06 (COs)
55.55 (OCH3)
12b
106.52
75.27
71.19
82.39
62.88
20.91, 20.59 (CH3s); 169.68, 170.10 (COs)
55.79 (OCH3)
13a
94.09
70.55
70.03
81.60
61.90
20.64, 20.74, 20.77 (CH3s); 169.05, 170.48, 171.20 (COs)
-----
13b
98.22
74.16
69.79
79.32
62.00
20,47, 20,50, 21,04 (CH3s); 169.46, 169.74, 170.51 (COs)
-----
14a
100.27
71.28
69.99
81.78
62.21
20.60, 20.62 (CH3s); 169.70, 170.04 (COs)
15.11 (CH3); 63.04 (OCH2)
14b
105.22
75.54
71.13
82.38
62.87
20.40, 20.88 (CH3s); 170.08, 170.80 (COs)
15.06 (CH3); 64.32 (OCH2)
15b
103.84
75.55
70.78
81.75
62.23
20.12, 20.16 (CH3s); 170.20, 169.90 (COs)
70.75 (OCH); 21.27, 22.76

(CH3s)
16a
104.96
39.26
74.27
83.54
62.59
21.15 (CH3); 171.40 (CO)
55.08 (OCH3)
17a
98.34
38.57
74.00
86.09
62.42
21.04, 21.29 (CH3s); 170.48, 171.08 (COs)
----
18a
106.51
77.16
77.12
77.42
61.92
20.70, 20.78 (CH3s); 169.72, 170.31 (COs)
54.81 (OCH3)
18b
100.73
77.19
77.00
77.24
64.02
19.99, 20.53 (CH3s); 170.62, 170.94 (COs)
55.81 (OCH3)
19a
93.78
76.83
74.10
82.50
61.23
20.61, 20.59, 20.62 (CH3s); 169.82; 171.10, 170.14 (COs)
----
20a
99.93
75.63
73.39
81.09
61.44
20.64; 20.70 (CH3s); 170.65; 170.64 (COs)
55.56 (OCH3)
20b
107.08
75.93
74.67
81.06
60.85
20.74; 20.78 (CH3s); 170.55; 170.36 (COs)
55.93 (OCH3)
125 MHz, CDCl3; desplazamientos qumicos () expresados en ppm.
125

________________________________________________________________________________
3.3
Conclusiones
La alcohlisis de una serie de alquil ,-D-ribofuransidos peracetilados catalizadas

por la lipasa B de Candida antarctica (CAL B) ha sido realizada para estudiar el
reconocimiento del sustrato por parte de esta lipasa. Se observ que existe una influencia de
la aglicona en la regioselectividad de la reaccin, ya que los propil y butil 2,3,5-tri-O-acetil,-D-ribofuransidos reaccionaron sin selectividad, mientras que los grupos 5-O-acetilos
del
metil
etil
2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos
fueron
removidos
regioselectivamente, produciendo el respectivo 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido, con

un 33% y un 43% de rendimiento. Adems del nuevo compuesto sintetizado, etil 2,3-di-Oacetil-,-D-ribofuransido,
la
desacetilacin
de
isopropil
2,3,5-tri-O-acetil--D-
ribofuransido dio como resultado el nuevo producto isopropil 2,3-di-O-acetil--Dribofuransido con un 24% de rendimiento, que a nuestro leal saber y entender, no posee
antecedentes bibliogrficos que informen de su sntesis qumica o enzimtica.
En cuanto a las alcohlisis llevadas a cabo con la lipasa de Candida rugosa (CRL),
en general no mostraron reactividad, debido principalmente al efecto desnaturalizante que
ejerce el alcohol cuando esta enzima no est inmovilizada. CRL result de utilidad cuando
fue empleada como biocatalizador en reacciones de hidrlisis, obtenindose mejores
resultados cuando se utilizaba acetona como cosolvente (10% v/v), dando como resultado
metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido con rendimientos altos (> 80%). Tanto CAL B,
PPL como PLE no fueron capaces de producir perfiles de reaccin regioselectivos en
condiciones de hidrlisis.
La alcohlisis catalizada por CAL B de otras pentofuranosas ensayadas: 2-desoxi-,
arabino- y xilofuranosas mostraron regioselectividad hacia la remocin del acetato en 5,
obtenindose los correspondientes productos con el hidroxilo 5 libre. As se obtuvieron:
metil 3-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuransido, 1,3-di-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuranosa y
1,2,3-tri-O-acetil--D-arabinofuransido diastereoselectivamente puros. Para el metil 2,3,5tri-O-acetil-,-D-xilofuransido (11a,b), se encontraron condiciones regioselectivas que
permitieron obtener el producto diacetilado con el hidroxilo 5 libre con un 72%.
126

________________________________________________________________________________
En general, se observa que la configuracin de la furanosa tiene una influencia en la

regioselectividad de las alcohlisis catalizadas por CAL B, ya que existen diferencias en las
condiciones
experimentales
utilizadas
para
la
obtencin
de
los
productos
regioselectivamente desacetilados en 5, para los distintos derivados ribofuransicos,

arabinofuransicos y xilofuransicos entre s. Mientras que con los primeros, el etanol sin
cosolvente produca la desacetilacin en la posicin deseada, y la relacin A/S slo tena
efecto en los tiempos de reaccin, en los otros derivados era necesaria la presencia de
cosolventes para obtener perfiles de reaccin regioselectivos, ya que las alcohlisis
realizadas sin aditivos siempre produjeron mezclas de productos (Tabla 3.5). A pesar de
esto la configuracin de la furanosa tuvo menos influencia en la regioselectividad de las
reacciones de alcohlisis que la sustitucin en el hidroxilo anomrico.
Se estudi el efecto de la presencia de lquidos inicos en estas reacciones; de esta
manera se encontr que la hidrlisis catalizada por CRL en presencia de hexafluorofosfato
de 1-butil-3-metilimidazolio (50% v/v) permiti obtener metil 2,3-di-O-acetil-,-Darabinofuransido con un rendimiento del 77%. La extensin de esta metodologa a otros
pentofuransidos gener una mezcla de ismeros de posicin cuando se utiliz metil 2,3,5tri-O-acetil-,-D-xilofuransido, y subproductos a partir de metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-Dribofuransido, concluyndose que esta metodologa era dependiente del sustrato de partida
en cuanto a la regioselectividad de la reaccin.
En resumen, fue posible encontrar condiciones de reaccin que permitieron obtener
diversas pentofuranosas regioselectivamente desacetiladas en su hidrxilo primario; CAL B
fue mucho ms eficiente en condiciones de alcohlisis y capaz de ser activa en una variada
cantidad de cosolventes orgnicos, mientras que CRL tuvo su mximo rendimiento en
condiciones de hidrlisis, en la presencia de solventes orgnicos miscibles con agua y de un
lquido inico inmiscible en el medio de reaccin.
3.4
Bibliografa
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(2)
Boons, G.-J.; Hale, K. Organic Synthesis with Carbohydrates, 1ra Ed.; Blackwell
Publishing; 2000.
127

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2009, 50, 2083-2085.
129

________________________________________________________________________________
130
Captulo 4 Estudio de la diastereoselectividad en las alcohlisis e

hidrlisis de pentofuranosas y pentofuransidos catalizadas por lipasas
CAPTULO
4
ESTUDIO DE LA DIASTEREOSELECTIVIDAD
EN LAS ALCOHLISIS E HIDRLISIS DE
PENTOFURANOSAS Y PENTOFURANSIDOS
CATALIZADAS POR LIPASAS
Parte de este captulo ha sido publicada como:

Esteban Gudio, Adolfo Iribarren, Luis Iglesias. Diastereoselective enzymatic preparation
of acetylated pentofuranosides carrying free 5-hydroxyls groups. Tetrahedron: Asymmetry.
2009, 20, 1813-1816
Captulo 4: Estudio de la diastereoselectividad en las alcohlisis e hidrlisis de pentofuranosas y

pentofuransidos catalizadas por lipasas
________________________________________________________________________________
132

________________________________________________________________________________
4.1 Objetivos y resumen
El objetivo de este captulo es analizar la diastereoselectividad desarrollada por la

lipasa B de Candida antarctica (CAL B) y la lipasa de Candida rugosa (CRL) en las
reacciones de alcohlisis e hidrlisis regioselectivas del captulo anterior. Para esto, el
anlisis de la selectividad de las enzimas por cada uno de los anmeros, fue realizado a
travs de la observacin y anlisis de los datos espectroscpicos de los productos (RMN1
H).
Se pudieron determinar relaciones entre la estructura del sustrato y la selectividad
de la enzima; adems, en ciertos casos, fue posible encontrar condiciones experimentales

que permitieron obtener diastereoselectivamente puros a los productos regioselectivamente
desacetilados en 5. Adems del valor sinttico de estas biotransformaciones, esto significa
un procedimiento simple para la separacin de mezclas anomricas de pentofuranosas
peracetiladas, difciles de separar por mtodos cromatogrficos preparativos habituales.
4.2 Resultados y discusin
4.2.1
Diastereoselectividad en reacciones con ribofuransidos con diversos

sustituyentes anomricos
Un anlisis de la regioselectividad de las reacciones de alcohlisis de los ribsidos

acetilados con distintas agliconas fue realizado en el captulo anterior, pero no se ahond en
el anlisis de la diastereoselectividad mostrada por la enzima; este captulo pretende
completar el estudio de las reacciones en este aspecto.
Como se determin anteriormente (Captulo 3, seccin 3.2.2), existe una prdida de
la regioselectividad cuando la cadena alqulica que sustituye el hidroxilo anomrico de los
ribofuransidos estudiados es un propilo o un butilo, a diferencia de lo observado cuando la
aglicona es un metilo, etilo o isopropilo. A pesar de que los rendimientos obtenidos son en
general bajos, surgen datos interesantes a partir del anlisis de los espectros RMN-1H de los
productos, si los comparamos con los espectros de los sustratos respectivos.
133

________________________________________________________________________________
Figura 4.1. Alcohlisis regio- y diastereoselectiva de los sustratos 1-6
Como se puede observar en la Tabla 4.1, salvo para 5 la sntesis de estos sustratos
genera una mezcla anomrica de dos diasteremeros y ; el anlisis de las seales
correspondientes a los protones anomricos (H-1) de los dos estereoismeros permite
establecer la relacin de cada uno en la mezcla, a partir de la integracin de cada seal.
Como se puede observar, existe un exceso del anmero , en general tres veces mayor que
su contraparte.
Tabla 4.1. Alcohlisis catalizadas por CAL B de D-ribofuransidos

(1-6, Figura 4.1)
Entrada
Sustrato
Relacin
sustratob
Alcohol
Producto
(Rend %)a
Relacin
productob
1a,b
1.0/3.0
Etanol
12a,b (33)
2.0/1.0
2a,b
1.0/2.6
Etanol
13a,b (39)
3.0/1.0
3a,b
1.0/3.2
Etanol
14a,b (43)
1.3/1.0
5b
0/1.0
Etanol
15b (24)
0/1.0
4a,b
1.0/3.7
Etanol
51c
0.5/1.0
6a,b
1.0/4.9
1-Butanol
27c
2.1/1.0
Determinado por purificacin del producto por cromatografa en columna de silicagel.

Obtenido a travs de datos de RMN-1H, por integracin de la seal de los H-1. cMezcla de
ismeros de posicin.
b
134

________________________________________________________________________________
Las alcohlisis realizadas a partir de estos sustratos generaron nuevamente una

mezcla de dos anmeros desacetilados regioselectivamente en la posicin 5 por la accin de
lipasa B de Candida antarctica; en este caso, la relacin de los dos diasteremeros fue
inversa a la observada en el sustrato, denotado por el enriquecimiento del anmero (Tabla
4.1). Sin embargo, los excesos diastereomricos de las reacciones son bajos o moderados
(Figura 4.2), por lo que en ningn caso puede ser considerado como una alternativa para
una separacin enzimtica de una mezcla anomrica, pero existe una particularidad que
cabe destacar. A partir de los datos obtenidos de las reacciones, se pueden calcular
parmetros que pueden ser denominados recuperacin del anmero y recuperacin del
anmero , cuyos valores representan la cantidad de cada anmero encontrado en la
mezcla de productos diacetilados (triacetilados en el caso de 13) en relacin con el
encontrado inicialmente en el sustrato; como se puede observar en los productos existe una
mayor recuperacin del anmero en comparacin con su epmero (Figura 4.2).
Figura 4.2. Datos de la diastereoselectividad desplegada por CAL B en las

alcohlisis de D-ribofuransidos (1-6, Figura 4.1)
100
90
80
70
60
%
50
Exceso diastereomrico del

producto
40
Recuperacin del anmero a
30
Recuperacin del anmero b
20
10
0
1
Entrada, Tabla 4.1
Estos datos concuerdan con lo observado anteriormente por nuestro laboratorio1, en

donde se determin que la lipasa B de Candida antarctica posee una reactividad distinta
para cada uno de los anmeros de metil 2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransido; mientras
que para el anmero se observ una desacetilacin total a los 7 das, para el se observ
135

________________________________________________________________________________
la formacin exclusiva de metil 2,3-di-O-acetil--D-ribofuransido a 45C a las 3 horas de

iniciada la reaccin. Lo que podran sugerir estas experiencias es que en condiciones de
alcohlisis con CAL B, el acomodamiento del anmero en el sitio activo de la enzima es
mucho ms restringido que el de su contraparte, siendo posible nicamente la
desacetilacin del ster primario; en cambio, las interacciones que entabla el anmero con
la enzima permiten la desacetilacin de las posiciones 2 y 3 de la furanosa. Las progresivas
desacetilaciones de este ltimo diasteremero provocan que no se acumule en el producto,
mientras que el anmero s lo hace. Dado que la posicin atacada por la enzima no posee
estereoqumica, y los carbonos 2 y 3 poseen la misma configuracin para todos los
sustratos, la diferencia en la reactividad est dada nicamente por la configuracin y los
sustituyentes del C-1.
A pesar que existe una prdida de regioselectividad cuando la aglicona es un propilo
o butilo, la recuperacin del anmero sigue siendo alta, confirmando nuevamente nuestra
hiptesis, ya que es el anmero el que mostr distintos ismeros de posicin diacetilados
mientras que el anmero slo di el producto desprotegido regioselectivamente en la
posicin 5, indicando que el tamao de la cadena alqulica en estos compuestos en
particular influye ms en la regioselectividad que en la diastereoselectividad de la
alcohlisis catalizada por CAL B.
Con respecto a la estereoselectividad de CAL B en la catlisis de los anmeros de
hidratos de carbono, algunos trabajos han reportado diferencias en el comportamiento de
los distintos anmeros de piranosas2. En acilaciones catalizadas por CAL B, los anmeros
de los alquil piransidos manifiestan regioselectividades diferentes3; en alcohlisis, ha sido
descripto que existe un reconocimiento diferencial por parte de CAL B frente a epmeros de
glucosamina peracetilada; se observ que la butanlisis de los distintos anmeros lleva a
mejores resultados regioselectivos para el epmero sin posterior reaccin, en cambio la
reaccin para el anmero sufre la solvlisis sucesivas de sus acetatos en varias
posiciones4. Sin embargo, con respecto a furanosas, aparte del trabajo en donde se reporta
la alcohlisis regioselectiva de la hexosa 1,2,3,4,6-penta-O-acetil-,-D-fructofuranosa5, en
la cual se observa una regioselectividad diferencial en la monodesacetilacin de cada
136

________________________________________________________________________________
anmero, a nuestro leal saber y entender no existe otro trabajo que analice la
estereoselectividad de las reacciones de furanosas catalizadas por CAL B.
En cuanto a la utilizacin de la lipasa de Candida rugosa (CRL), se probaron
condiciones hidrolticas de reaccin ya que tal como se coment, las alcohlisis no fueron
productivas debido a la pobre estabilidad que presenta esta enzima en este medio de
reaccin. Como se mencion en el captulo anterior, la condicin de reaccin ms
satisfactoria para la regioselectividad correspondi al buffer fosfato con 10% v/v de
acetona; del anlisis espectroscpico del producto purificado se comprob que a diferencia
de lo sucedido con las alcohlisis catalizadas por CAL B, se observa un exceso
diasteroselectivo del 36% pero esta vez del anmero demostrando un comportamiento
inverso; la recuperacin del anmero es del 99% mientras que para su epmero es del
73%.
4.2.2
Diastereoselectividad en reacciones con 2-desoxirribosas, arabinosas y

xilosas
Las reacciones llevadas a cabo con 2-desoxirribofuranosas, arabinofuranosas y

xilofuranosas poseen una diastereoselectividad distintiva en las alcohlisis e hidrlisis
ensayadas, con respecto a los ribsidos analizados anteriormente.
Un esquema de los sustratos ensayados se encuentra en la Figura 4.3.
En la Tabla 4.2 se muestra que a diferencia de los ribsidos, la sntesis qumica de
los distintos sustratos generalmente llev a mezclas anomricas con cantidades similares de
ambos epmeros.
Se puede observar que las reacciones llevadas a cabo con los derivados de 2desoxirribofuranosas producen nicamente el derivado diacetilado desprotegido en 5 del
anmero en las condiciones indicadas en las Entradas 1 y 2 de la Tabla 4.2, con una
diastereoselectividad del 100%.
137

________________________________________________________________________________
Figura 4.3. Regio- y diastereoselectividad en la alcohlisis enzimtica de

diversas furanosas
Tabla 4.2. Alcohlisis catalizadas por CAL B de diversas D-furanosas (7-11,

Figura 4.3)
Entrada Sustrato
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
a
7a,b
8a,b
9a,b
Relacin
sustratoa
Alcohol
A/S
1.0/1.1
Etanol
1200
16a (32)
1.0/0
1.0/1.2
99,3
17a (24)
1.0/0
Etanol
1.0/1.1
Etanol
1.0/1.1
Butanol
9a,b
1.0/1.1
Etanolc
9a,b
9a,b
1.0/1.1
40
99,3
18a,b (49)
1.7/1.0
99,3
18a,b (41)
2.6/1.0
Etanol
120
33
120
10
18a,b (35)
2.5/1.0
120
10
19a (30)
1.0/0.0
10
20a,b (58)
1.4/1.0
1.0/1.3
Etanol
11a,b
1.0/1.1
Etanolc
1.0/1.1
ND
10a,b
11a,b
Isopropanol
1.0/1.1
1200
c
9a,b
Cosolvente Producto Relacin

(% v/v)
(Rend %)e
productoa
Etanol
120
28
ND
ND
Obtenido a travs de datos de RMN- H, por integracin de la seal de los H-1. Diclorometano como
cosolvente. cTBME como cosolvente. dAcetona como cosolvente. eDeterminado por purificacin del
producto por cromatografa en columna de silicagel. fMezcla de productos. ND: no determinado.
En las Figuras 4.4 y 4.5, se muestran los espectros de RMN-1H para las seales de
los hidrgenos 1 y 3 de los sustratos 7 y 8a,b y sus productos 16 y 17a respectivamente;
estas seales concuerdan con los desplazamientos qumicos informados por Wong6. En la
mezcla de sustratos se puede distinguir la presencia de los dos anmeros, en particular, un
doblete caracterstico para el H-1 del anmero y un doble doblete para el , mientras que
138

________________________________________________________________________________
el H-3 se manifiesta como un multiplete para ambos anmeros; en el espectro de los

productos se denota la ausencia de las seales correspondientes a los anmeros , mientras
que las seales correspondientes a los anmeros permanecen.
Figura 4.4. Vista parcial de los espectros de RMN-1H de los compuestos 8a,b y 17a.
EG25(SUSTR).101.esp
0.14
0.13
0.12
0.11
H1 - ,
6.35
6.34
0.09
6.37
6.37
6.36
0.08
0.07
H3 - ,
0.06
5.27
5.26
5.26
5.25
5.25
5.24
5.13
5.13
5.12
5.12
5.12
0.10
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
6.5
6.0
5.5
5.0
0.12 EG26.101.ESP
0.11
H1 -
6.40
6.39
0.10
0.09
0.07
0.06
H3 -
0.05
5.21
5.20
5.20
5.20
5.19
5.19
5.18
5.18
0.08
0.04
0.03
0.02
0.01
6.5
6.0
139
5.5
5.0

________________________________________________________________________________
0.11
EG10(SUSTR).101.esp
H1, H3 -
5.08
5.08
0.10
0.09
0.08
5.04 5.03
5.03
5.03
5.02
5.02
5.01 5.01
5.13
5.12
5.12
5.11
5.20
0.06
0.05
5.21
5.21
5.20
5.19
5.19
5.18
H1, H3 -
0.07
0.04
0.03
0.02
0.01
5.4
0.16
5.3
5.2
5.1
5.0
4.9
4.8
4.7
4.6
4.5
4.8
4.7
4.6
4.5
EG21.101.esp
0.15
5.09
H1, H3 -
0.14
0.13
0.12
5.10
0.10
0.09
0.08
0.07
0.06
5.09
5.08
5.08
5.07
5.07
0.11
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
5.4
5.3
5.2
5.1
5.0
4.9
En cambio, las alcohlisis ensayadas con el arabinsido con un sustituyente metilo

en el hidroxilo anomrico (9a,b) presentan una diastereoselectividad similar a la encontrada
para los ribsidos; tambin se puede observar que cuando el alcohol reactivo fue etanol,
140

________________________________________________________________________________
esta tendencia aument si se compara con la butanlisis (Entradas 4 y 5, Tabla 4.2), y fue
similar a pesar de utilizar diversos cosolventes en el medio de reaccin, mostrando un
exceso diastereomrico similar en terbutilmetilter y en acetona (Entradas 5 y 7, Tabla 4.2).
Cuando el arabinsido estaba acetilado en todas sus posiciones (10a,b) present un
comportamiento distintivo, ya que se observ nuevamente la formacin exclusiva del
anmero (19a) en las condiciones ensayadas (Entrada 8, Tabla 4.2), con una
diastereoselectividad del 100%. En el espectro RMN-1H se observan las seales
caractersticas de los hidrgenos anomricos, un singulete para el anmero y un doblete
para el , a campos ms bajos debido al efecto desprotector causado por el grupo acetilo,
consistente con la multiplicidades reportadas por Stevens et al.7; claramente se observa la
ausencia de las seales del anmero en el espectro del producto (Figura 4.6).
Las reacciones llevadas a cabo con xilofuransidos (11a,b) demostraron una leve
diastereoselectividad (Entrada 9, Tabla 4.2), pero no fue posible encontrar condiciones
experimentales que permitan obtener un epmero en particular.
Como se puede observar en la Figura 4.7, en general, la recuperacin del anmero
es moderada, y en algunos casos alta (70%); mientras que la observada para el anmero
suele ser inferior al 40%. Nuevamente esta tendencia en las alcohlisis ensayadas se vuelve
a repetir, denotando que la epimerizacin de la posicin 3 de la pentosa no parece tener un
efecto significativo en la diastereoselectividad de las alcohlisis catalizadas por CAL B; en
cambio, la ausencia de un grupo hidroxilo en la posicin adyacente al carbono anomrico
genera un aumento de la selectividad por el anmero ; el mismo efecto es provocado por
la proteccin del grupo hidroxilo anomrico por un acetilo en la ,-D-arabinofuranosa
peracetilada (10a,b), ya que como se mencion anteriormente la presencia de un metilo en
la posicin anomrica mostr una baja diastereoselectividad.
141

________________________________________________________________________________
EG32(SUSTR).101.esp
H1 - ,
6.18
H2, H3 - ,
5.36
6.37
6.36
0.10
5.06
5.06
5.06
5.05
5.05
5.35
5.35
5.35
0.15
5.20
5.20
5.20
5.35
0.20
0.05
6.5
6.4
6.3
6.2
6.1
6.0
5.9
5.8
5.7
5.6
5.5
5.4
5.3
5.2
5.1
5.0
EG29.101.esp
0.14
0.13
H1 -
0.12
0.11
H2, H3 -
6.20
0.09
0.08
5.28
5.27
5.27
5.27
0.07
0.06
0.05
5.15
5.15
5.15
5.15
5.14
5.14
5.14
0.10
0.04
0.03
0.02
0.01
6.5
6.4
6.3
6.2
6.1
6.0
5.9
5.8
5.7
142
5.6
5.5
5.4
5.3
5.2
5.1
5.0

________________________________________________________________________________
Figura 4.7. Datos de la diastereoselectividad desplegada por CAL B en las

alcohlisis de D-furansidos (7-11)
100
90
80
70
60
%
50
Exceso diastereomrico del

producto
40
Recuperacin del anmero

a
30
Recuperacin del anmero

b
20
10
0
1
Entrada, Tabla 4.2
En algunos casos en que se obtuvo un 100% de diastereoselectividad (Entradas 1 y

8, Tabla 4.2) la recuperacin del anmero fue superior al 60%, establecindose esta
metodologa como una alternativa para la separacin de una mezcla anomrica de difcil
separacin cromatogrfica.
Con respecto a las hidrlisis, como se mencion en el captulo anterior, los sustratos
arabino y xilo (9, 10 y 11a,b) llevaban generalmente a bajos rendimientos debido a la gran
cantidad de subproductos monoacetilados y desacetilados que se formaban. Slo la
utilizacin de lquidos inicos en las reacciones de hidrlisis ([BMIM][PF6]) permiti
obtener con buenos rendimientos metil 2,3-di-O-acetil-,-D-arabinofuransido (18a,b),
como se determin en el captulo anterior (seccin 3.2.5.1.2). Para estudiar la
diastereoselectividad, se ensayaron dos lipasas: CRL y CAL B, y el anlisis estructural de
los productos por RMN-1H permiti determinar que a diferencia de lo que se observaba con
el derivado ribofuransico, el exceso diastereomrico es igual a cero, con una proporcin
aproximada 1:1 de cada uno de los anmeros; teniendo en cuenta que se parti de una
mezcla tambin con cantidades similares de cada epmero; no se produjo un
enriquecimiento de ninguno de los anmeros en particular, inclusive con CAL B que, como
143

________________________________________________________________________________
se discuti, en las alcohlisis, demostr tener una preferencia por el anmero , en algunos
casos de forma exclusiva.
4.3 Conclusiones
La alcohlisis aplicada a la desproteccin regioselectiva, catalizada por la lipasa B
de Candida antarctica, demostr una preferencia general por el anmero a partir de
distintas mezclas anomricas de pentofuranosas ensayadas. Esto se debi a una reactividad
mayor del anmero que generalmente es convertido en diferentes subproductos, mientras
que su epmero no sufre esto, acumulndose el producto monodesacetilado en el medio de
reaccin.
En reacciones de alcohlisis, cuando la mezcla anomrica se trat de ribofuranosas
peracetiladas con distintos sustituyentes en el oxhidrilo anomrico, la relacin / del
producto con el hidroxilo 5 libre obtenido siempre fue mayor a uno, denotando que la
sustitucin en el carbono anomrico tiene poca influencia en la diastereoselectividad de la
reaccin. Adems se pudo recuperar, en su gran mayora, todo el anmero en forma de su
producto diacetilado.
Cuando la modificacin consisti en la epimerizacin del carbono 2 3, o en la
ausencia de un grupo hidroxilo en el C-2, los resultados demostraron nuevamente
preferencia de la enzima por el anmero . En particular, cuando los sustratos de partida
fueron dos 2-desoxirribosas con sustituyentes anomricos metilo o acetilo, la
diastereoselectividad fue exclusiva para este anmero; lo mismo sucedi con mezclas
anomricas de D-arabinofuranosa peracetilada, pero en este caso el sustituyente del C-1
demostr ser determinante ya que no se observ esta diastereoselectividad cuando un
metilo se encontraba en el carbono anomrico.
En general se obtuvieron mejores resultados al emplear como alcohol reactivo
etanol, ya que las solvlisis catalizadas en presencia de otros alcoholes tuvieron
comparativamente un rendimiento regio- y diastereoselectivo menor; adems la presencia
de diclorometano como cosolvente en el medio de reaccin favoreci esta tendencia para la
formacin de 1,3-di-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuranosa y la de TBME, para 1,3,5-tri-Oacetil--D-arabinofuranosa.
144

________________________________________________________________________________
En cambio, las hidrlisis en general se desarrollaron sin estereoselectividad;

especialmente la lipasa de Candida rugosa no manifest preferencia por ninguno de los
anmeros. Por ltimo, el uso de lquidos inicos tampoco permiti obtener mejores
resultados en este campo, ya que generalmente se obtenan mezclas con excesos
diastereomricos cercanos a cero.
De esta manera, por lo anteriormente dicho, las etanlisis catalizadas por la lipasa B
de Candida antarctica se establecen como un procedimientos sinttico para la obtencin de
furanosas acetiladas con el hidroxilo 5 libre, anomricamente puras o enriquecidas en el
anmero , as como tambin una alternativa enzimtica para la separacin de este tipo de
compuestos debido al perfil reactivo diferencial que posee cada anmero en particular.
Mientras que el anmero es desprotegido regioselectivamente, el anmero suele ser
desacetilado consecutivamente, provocando la acumulacin en el medio de reaccin de
especies fcilmente separables por mtodos cromatogrficos.
4.4 Bibliografa
(1)
(2)
Kadereit, D.; Waldmann, H. Chemical Reviews. 2001, 101, 3367-96.
(3)
Danieli, B.; Luisetti, M.; Sampognaro, G.; Carrea, G.; Riva, S. Journal of Molecular
Catalysis B: Enzymatic. 1997, 3, 193201.
(4)
Nicolosi, G.; Spatafora, C.; Tringali, C. Tetrahedron: Asymmetry. 1999, 10, 2891
2897.
(5)

2005, 340, 319-23.
(6)

Chemistry. 1988, 53, 4939-4945.
(7)
Stevens, J. D.; Fletcher, H. G. Journal of Organic Chemistry. 1968, 33, 1799-1805.
145

________________________________________________________________________________
146
Captulo 5 Preparacin de fosfoliponuclesidos
CAPTULO
5
PREPARACIN
DE
FOSFOLIPONUCLESIDOS
Captulo 5: Preparacin de fosfoliponuclesidos

________________________________________________________________________________
148

________________________________________________________________________________
El objetivo de este captulo es sintetizar derivados fosfoliponuclesidicos

intercambiando la cabeza polar de la fosfatidilcolina (PC) por nuclesidos, formando los
denominados fosfatidilnuclesidos (PNuc). La reaccin fue catalizada por una enzima
perteneciente a la familia de las fosfolipasas, que producen la hidrlisis de diferentes
residuos de los fosfolpidos naturales. En particular se hizo uso de la fosfolipasa D (PLD),
para catalizar la transesterificacin (o transfosfatidilacin) de la colina ubicada en la parte
hidroflica de la fosfatidilcolina por un alcohol, en este caso, un nuclesido.
Para la concrecin de este objetivo, se efectu un cribado de diversas fuentes
naturales, plantas y bacterias para encontrar la actividad deseada. Con el mejor
biocatalizador, se optimizaron las condiciones de reaccin para obtener los mejores
rendimientos y se aplicaron a la sntesis de diversos 5-(3-sn-fosfatidil)-nuclesidos de
inters.
5.2.1. Cribado de biocatalizadores
La fosfolipasa D (PLD) es una enzima ubicua que est presente en una amplia
variedad de especies: plantas, mamferos y microorganismos; algunas de estas enzimas se
encuentran disponibles comercialmente, especialmente las provenientes de fuentes
bacterianas y vegetal.
Las fosfolipasas derivadas de plantas corresponden a las provenientes de col, arroz y
man. Las reacciones de transfosfatidilacin fueron realizadas en un medio heterogneo,
donde el sustrato, la fosfatidilcolina, se encuentra disuelta en cloroformo y la enzima, en
buffer acetato junto con el nuclefilo de la reaccin, que en una primera aproximacin y
como reaccin modelo fue la uridina. Las reacciones fueron analizadas analticamente por
c.c.d. Un esquema de la reaccin natural y una de las sintticas que puede catalizar la PLD
se encuentra en la Figura 5.1.
149

________________________________________________________________________________
Figura 5.1. Esquema de las reacciones que cataliza la fosfolipasa D
AG: acilo graso. PA: cido fosfatdico. PC: fosfatidilcolina. Nuc: nuclesido. PNuc:
fosfatidilnuclesido.
De los resultados obtenidos se concluy que las PLDs provenientes de col, arroz y
man no fueron convenientes para nuestro propsito ya que se observ la formacin de
cido fosfatdico (PA), producto proveniente de la reaccin hidroltica natural que tiene esta
enzima, pero no se observ ningn producto adicional, resultado respaldado por diversos
antecedentes bibliogrficos que concluyen que este tipo de fuentes enzimticas no son aptas
para catalizar reacciones de transfosfatidilacin con alcoholes complejos, pero s lo son
para algunos alcoholes pequeos1.
Siguiendo con la bsqueda de enzimas que puedan llegar a catalizar la
transfosfatidilacin, se ensayaron otras dos enzimas comerciales provenientes de fuentes
bacterianas: fosfolipasa D de Streptomyces chromofuscus y fosfolipasa D de Streptomyces
sp.; ambas reacciones produjeron cido fosfatdico, producto proveniente de la reaccin de
150

________________________________________________________________________________
hidrlisis, pero en el caso de la reaccin catalizada por la PLD de Streptomyces sp. tambin
se observ otro producto de mayor Rf, que absorbe radiacin U.V. El anlisis por ESI-MS
de la mezcla de reaccin revel la presencia de un compuesto de peso molecular 897,52
asignable al producto mayoritario de transfosfatidilacin. En concordancia con este
resultado, los espectros de RMN-1H y -13C del producto aislado por cromatografa en
columna de silicagel, mostraron las seales esperadas para la 5-(3-sn-fosfatidil)-uridina.
En particular, el RMN-13C demostr que el C-5 sufre un corrimiento a campos ms bajos,
64,30 ppm, comparado con la uridina sin modificar (61,12 ppm), cercano a 64,37 ppm,
observado para la 5-UMP2, consistente con el producto de transesterificacin esperado.
Teniendo en cuenta estos resultados preliminares, se decidi realizar un cribado en
nuestro cepario de todas la cepas pertenecientes a este gnero (Streptomyces) capaces de
catalizar la transfosfatidilacin de uridina. Gracias a que la enzima es extracelular y es
secretada por el microorganismo durante su crecimiento, se evalu la presencia de la
actividad enzimtica de inters en el medio nutritivo de crecimiento a las 48 horas de
haberse inoculado el mismo. Para ello se diluy 2 veces el medio de cultivo, luego de
haberse separado el microorganismo por centrifugacin, con buffer acetato 100 mM,
pH=6,0, conteniendo uridina y se lo hizo tomar contacto con una fase orgnica de
cloroformo con fosfatidilcolina disuelta. Las reacciones fueron mantenidas a 37C y 200
rpm durante 24 horas y se cuantific la formacin del producto proveniente de la
transfosfatidilacin a lo largo del tiempo (Tabla 5.1).
En todos los medios extracelulares se hall evidencia de actividad de PLD, debido a
que se observ presencia de cido fosfatdico. A pesar de esto, slo algunas de las cepas
ensayadas secretaron enzimas capaces de catalizar la reaccin de inters, denotndose por
la aparicin de fosfatidiluridina por c.c.d.
De las 15 cepas evaluadas slo 6 catalizaron la reaccin de transfosfatidilacin;
Streptomyces badius, phaechromogenes y sp. tuvieron una actividad menor al 10% de la
actividad desarrollada por la mejor fuente seleccionada, por lo que fueron descartadas para
su uso posterior. Streptomyces griseus y halstedii demostraron tambin una actividad baja;
la PLD proveniente de Streptomyces netropsis fue la seleccionada debido a la alta
produccin de fosfatidiluridina, constatada por HPLC y a la alta actividad especfica que
posee en comparacin con las dems. Este resultado concuerda con un trabajo publicado
151

________________________________________________________________________________
durante la realizacin de esta tesis que informa la PLD de Streptomyces netropsis como
catalizador de la transfosfatidilacin de diversos nuclesidos, y en el que uridina no fue
estudiada3.
Tabla 5.1. Datos de actividad PLD de los sobrenadantes de las

distintas cepas de Streptomyces
Nombre
S. halstedii
S. grisostramineus
S. griseus
S. phaeochromogenes
S. badius
S. sp
S. Fladiae
S. baldacii
S. cattleya
S. cetonii
S. netropsis
S. sp
S. blastmyceticus
S. baldacii
S. flavogrisus
Concentracin
de protenasa
(mg ml-1)
0,15
ND
0,30
0,19
0,06
0,32
ND
ND
ND
ND
0,03
ND
ND
ND
ND
Actividad
especfica
(U.10-3.mg-1)b
0,5
0,2
1,6
0,9
0,1
20
-
Actividad
relativa
2,5
11
8
4,5
0,5
100
-
Determinada por Bradford. bDeterminada por HPLC a partir de la aparicin de

fosfatidiluridina. ND: no determinado
Luego de haberse encontrado la mejor fuente enzimtica para nuestro propsito, se

realiz un estudio cintico del microorganismo para determinar en qu etapa del
crecimiento bacteriano se encuentra la mayor produccin de enzimas extracelulares. Los
resultados obtenidos se encuentran en la Figura 5.2; all se puede observar que el patrn de
produccin de protenas extracelulares es similar al determinado para el crecimiento
celular, por lo que se puede concluir que ambos procesos estn asociados. A pesar de esto,
se puede observar que al llegar a las 72 horas de inoculado el cultivo, la cantidad de enzima
presente en el sobrenadante comienza a disminuir, al mismo tiempo se puede observar que
el microorganismo empieza a entrar en su fase estacionaria de crecimiento. Este resultado
parece demostrar que las protenas presentes en el sobrenadante pueden ser degradadas por
proteasas excretadas al medio de cultivo; un estudio anterior permiti establecer que la
secrecin de este tipo de protenas tiene su mximo de produccin a partir de las 72 horas
en el caso de Streptomyces clavuligerus4.
152

________________________________________________________________________________
0,45
9,E+08
0,4
8,E+08
0,35
7,E+08
0,3
6,E+08
0,25
5,E+08
0,2
4,E+08
0,15
3,E+08
0,1
2,E+08
0,05
1,E+08
0,E+00
0
20
40
60
80
100
Nmero de clulas
mg/ml
Figura 5.2. Cintica de crecimiento de la S. netropsis y perfil de la

concentracin de enzimas extracelulares
120
t (h)
Conc. Protena
N Clulas
La precipitacin con acetona permiti obtener un crudo enzimtico a partir del

medio extracelular de un cultivo de S. netropsis. El procedimiento usado consisti en
precipitar del sobrenadante del medio de cultivo la enzima PLD con el agregado de acetona
hasta un 60% del volumen final, centrifugando para separar el sobrenadante y secando el
slido obtenido a presin reducida. Este mtodo permite obtener una fuente slida
enzimtica que puede ser almacenada por varios meses a -20C. Esta enzima extracelular
fue utilizada para catalizar las reacciones discutidas de aqu en adelante.
5.2.2. Sntesis de 5-(3-sn-fosfatidil)-nuclesidos
Se procedi a utilizar el biocatalizador seleccionado para la sntesis de diversos 5'(3-sn-fosfatidil)-nuclesidos (Figura 5.3), se estableci su uso en un medio bifsico para
permitir la solubilidad de ambos sustratos en la reaccin; la reaccin se inici por el
agregado de 2 mg del crudo enzimtico, se mantuvo en un agitador orbital a 37C y a 200
rpm y se tomaron alcuotas para su anlisis posterior por HPLC.
153

________________________________________________________________________________
Figura 5.3. Esquema de la reaccin catalizada por PLD y productos obtenidos.
AG: acilo graso
Los resultados se resumen en la Tabla 5.2 y en la Figura 5.4 se pueden observar los
perfiles de reaccin para cada nuclesido. Se utilizaron nuclesidos de estructuras variadas
para evaluar la tolerancia que tiene la enzima de aceptar sustratos diferentes. Generalmente
para todas las reacciones el mximo de concentracin del producto se encuentra a las 24
horas de iniciadas las mismas y a partir de este tiempo, la concentracin de los 5'-(3-snfosfatidil)-nuclesidos disminuye por la accin hidroltica de la enzima.
Tabla 5.2. Rendimientos mximos obtenidos para las
reacciones de transfosfatidilacin catalizadas por PLD de
S. netropsisa (Figura 5.3)
Aceptor del residuo
fosfatidlico
Rendimiento
(%)b
t (h)
Producto
Adenosina
Uridina
Citidina
Guanosina
Uracil arabinsido
2,3-Didesoxiuridina
Inosina
Fludarabina
84
56
39
9
97
94
25
17
6
20
26
23
53
3
24
24
21
22
23
24
25
26
27
28
La reaccin fue realizada a 37 C y 200 rpm, usando una relacin

nuclesido:fosfolpido (5:1). bDeterminado por HPLC
Los mejores resultados corresponden a las reacciones en presencia de adenosina,

uracil arabinsido y 2,3-didesoxiuridina, donde los rendimientos obtenidos son altos.
154

________________________________________________________________________________
En particular, el derivado lipdico proveniente de la reaccin con uracil arabinsido

(25) parece ser un sustrato pobre para ser aceptado por la fosfolipasa D para una reaccin
hidroltica posterior, ya que su acumulacin en el medio sigue aumentando, y nunca
disminuye como sucede con los dems compuestos.
Para la 5'-(3-sn-fosfatidil)-2,3-didesoxiuridina (26) el rendimiento obtenido puede
ser explicado teniendo en cuenta un estudio realizado por Bossi et al.5 sobre los
requerimientos que debe poseer un sustrato de la PLD para ser hidrolizado. En el mismo
determinaron que la sustitucin de la colina por residuos que no poseen grupos hidroxilos
en la proximidad al enlace fosfodister afect drsticamente la velocidad de hidrlisis
catalizada por PLD, favoreciendo la acumulacin de estos compuestos en el medio de
reaccin, por la imposibilidad de la enzima de hidrolizarlos, caracterstica que presenta este
nuclesido. Asimismo la sustitucin de la colina de la cabeza polar por cualquier residuo,
disminuye su capacidad de ser hidrolizada por PLD en menor o mayor medida5.
Figura 5.4. Perfil de reaccin de transfosfatidilacin catalizada por PLD de S.

netropsis utilizando nuclesidos
100,0
90,0
Rendimiento (%)
80,0
70,0
21
60,0
22
50,0
23
24
40,0
25
30,0
26
20,0
27
10,0
28
0,0
0
10
20
30
40
50
60
t (h)
En la transfosfatidilacin realizada en presencia de adenosina (21), el mximo de

formacin del producto fosfoliponucleosdico se encontr a las 6 horas de iniciada la
155

________________________________________________________________________________
reaccin, y luego disminuy su concentracin, producto de la accin natural de la enzima,

la hidrlisis; en comparacin con los dems nuclesidos esta disminucin pareci ser ms
pronunciada, demostrando que la adenosina interacciona en forma conveniente con el sitio
activo de la enzima, favoreciendo su participacin tanto en su papel de nuclefilo como
cuando acta como grupo saliente.
En cuanto a los derivados producidos con uridina (22) y citidina (23), los resultados
fueron moderados y sus mximos de reaccin se encuentraron a las 24 horas de iniciada la
reaccin, adems los productos formados son levemente hidrolizados a lo largo del tiempo.
El pobre rendimiento obtenido con la guanosina (24) y fludarabina (28) se debi
principalmente a la baja solubilidad que tienen estos nuclesidos, que luego de ser
solubilizados a 60C, precipitan a la temperatura de 37C en la cual se realiza la reaccin, lo
que provoca que gran parte de los mismos haya estado en suspensin.
5.2.3. Evaluacin de diversas condiciones experimentales de la reaccin de

transfosfatidilacin
5.2.3.1.
Temperatura
Para optimizar las condiciones experimentales con esta enzima, se evalu la

influencia de distintos parmetros del medio de reaccin. El primero en ser analizado fue la
temperatura y se observ el efecto que ejerca el aumento de la misma en el perfil de la
reaccin. Teniendo en cuenta que siempre est presente la reaccin hidroltica natural de la
PLD compitiendo con la sinttica, un aumento de la temperatura puede impactar
negativamente, ya que puede producirse a mayor velocidad la hidrlisis del 5-(3-snfosfatidil)-nuclesido formado evitando su acumulacin en el medio de reaccin.
Se ensayaron a modo de prueba 5 nuclesidos naturales con las mismas condiciones
experimentales, aumentando la temperatura a 45C. Los resultados se resumen en la Tabla
5.3 y los perfiles de reaccin se encuentran en la Figura 5.5.
156

________________________________________________________________________________
Tabla 5.3. Rendimientos mximos obtenidos para las

reacciones de transfosfatidilacin catalizadas por PLD de
S. netropsis a 45C
Aceptor del residuo
fosfatidlico
Adenosina
Rendimiento
(%)a
64
Uridina
t (h)
Producto
21
56
22
Citidina
61
23
Guanosina
52
0,5
24
Inosina
67
27
Determinado por HPLC
En primer lugar se observ que la velocidad de la reaccin se aceler notablemente,

ya que dentro de las 2 horas de iniciada la misma se obtuvo el mximo rendimiento para
todos los nuclesidos ensayados. En el perfil de la reaccin (Figura 5.5) se puede observar
que los 5-(3-sn-fosfatidil)-nuclesidos no se acumularon en el medio de reaccin,
disminuyendo rpidamente por la accin hidroltica de la enzima.
Figura 5.5. Perfil de reaccin de transfosfatidilacin catalizada por PLD de

S. netropsis utilizando nuclesidos a 45 C
80
Rendimiento (%)
70
60
50
21
40
22
30
23
20
24
10
27
0
0
10
20
30
40
50
60
t (h)
En general se obtuvieron rendimientos mayores al 50% a tiempos cortos e

inmediatamente se observ una fuerte cada llegando hasta un 20-30%; luego la velocidad
de hidrlisis fue menor y se observ una meseta en los perfiles de reaccin (Figura 5.5)
denotando que la actividad de la enzima disminuy hasta desaparecer, ya que no se advirti
157

________________________________________________________________________________
formacin de cido fosfatdico (determinado cualitativamente por c.c.d.) ni tampoco una

disminucin significativa de la cantidad del producto de transfosfatidilacin luego de 10
horas de iniciada la reaccin.
Un estudio realizado por Hagishita y colaboradores6 compar la termoestabilidad de
PLDs de cuatro cepas de Streptomyces, las mismas demostraron que mantienen 100% de su
actividad a 45 C, menos para la PLD de S. halstedii que disminuy con el tiempo hasta
llegar a cero, resultado similar a lo observado para nuestra PLD de S. netropsis. Pero
cuando la temperatura de reaccin fue de 60 C las actividades de todas las PLDs
disminuyeron significativamente con el transcurso del tiempo inactivndose totalmente
despus de incubarlas durante 5 minutos a esa temperatura. Adems de estos estudios, el
anlisis de las secuencias primarias de los genes de las distintas PLDs demostr una alta
homologa, concluyendo que la termoestabilidad de cada una de ellas est determinada por
la presencia de un solo aminocido en particular.
Los resultados anteriores sugieren que a 45C el control del tiempo de reaccin se
transforma en un factor importante a tener en cuenta para la sntesis de estos derivados. A
pesar de la disminucin significativa en el tiempo de reaccin observado en la mayora de
las reacciones probadas, la hidrlisis compite con el paso sinttico (constatado por la
presencia creciente de cido fosfatdico por c.c.d.), disminuyendo el rendimiento de la
reaccin en algunos casos.
Una mayor temperatura permiti una mejor solubilizacin de algunos nuclesidos
ms hidrofbicos, como la guanosina, lo que permitira explicar por qu la sntesis de 5-(3sn-fosfatidil)-guanosina (24) a 45C produce un rendimiento mximo del 52% comparado
con el 9% obtenido a 37C; para el caso de la adenosina (21) el efecto fue opuesto.
A 45 C se observan rendimientos similares a los obtenidos a 37 C con la uridina,
pero se obtiene un rendimiento mayor en un 22% en el caso de la citidina. El efecto de la
temperatura sobre la transfosfatidilacin de estos nuclesidos es variable y difcil de
racionalizar, ya que diversos factores tales como reconocimiento enzimtico del nuclefilo,
equilibrio de las reacciones involucradas y solubilidad pueden influir en el resultado final
observado.
158

________________________________________________________________________________
5.2.3.2.
Utilizacin de detergentes en el medio de reaccin
En esta reaccin heterognea, el fosfolpido se encuentra disuelto en la fase

orgnica, mientras que el nuclesido y la enzima lo estn en la fase acuosa, las reacciones
sinttica e hidroltica se llevan a cabo en la interfase formada entre ambos lquidos
inmiscibles.
La adicin de surfactantes favorece la formacin de emulsiones que aumentan la
interfase cataltica efectiva, lo que puede provocar un efecto positivo o negativo en la
reaccin sinttica general; a continuacin se pone a prueba esta modificacin en la
metodologa de transfosfatidilacin de nuclesidos.
Los detergentes inicos (aninicos y catinicos) pueden afectar negativamente la
actividad enzimtica de diversas maneras. A pesar de que el mecanismo no est muy claro
existen varias hiptesis al respecto:
-
desestabilizacin de su estructura secundaria debido a interacciones
especficas enzima-surfactante produciendo la desnaturalizacin de la misma;

-
competencia con el sustrato por el sitio activo y;
acumulacin en la interfase de reaccin que provoca un cambio en el
ambiente cataltico de la enzima.

En cambio, el uso de detergentes no inicos minimiza estos efectos debido a la
ausencia de las fuertes interacciones electrostticas, por lo que resultan ms convenientes
para nuestro propsito7. Con el fin de evaluar este efecto, se analiz la utilizacin de dos
detergentes no inicos, Triton X-100 y Tween-20 a 37 C y en dos proporciones menores al
1% del volumen de la reaccin ya que debido a su naturaleza anfiflica pueden provocar
una inhibicin competitiva a altas concentraciones8.
La presencia de cada uno de los detergentes tuvo un efecto particular en el perfil de
la reaccin. Sin embargo, comparten una caracterstica, a partir de las 24 horas ninguna de
la reacciones, independientemente del nuclesido que acte como nuclefilo, pareci
proseguir, ya que no se observ produccin de 5-(3-sn-fosfatidil)-nuclesido ni tampoco
una disminucin del mismo, denotando la ausencia de la reaccin hidroltica que cataliza
esta enzima. Probablemente esto se debi a un efecto negativo ejercido por el surfactante en
la estructura de la protena, provocando su desnaturalizacin a lo largo del tiempo, o a una
159

________________________________________________________________________________
aceleracin de la desnaturalizacin enzimtica provocada por la presencia de una superficie

interfacial mayor9.
En la Figura 5.6 puede verse el efecto del Triton X-100 sobre los rendimientos
mximos de las reacciones de transfosfatidilacin de cinco nuclesidos naturales. Lo que
parece observarse principalmente, es que la menor produccin de fosfatidilnuclesido es
debido a un aumento en la reaccin hidroltica en presencia de este surfactante. Este efecto
es notorio cuando se aumenta la concentracin del mismo provocando la disminucin
general de todos los rendimientos y la aparicin de una gran cantidad de cido fosfatdico
constatado por c.c.d.
Figura 5.6. Efecto

transfosfatidilacin
del
Triton
X-100
sobre
la
reaccin
de
80
70
% Rendimiento
60
65
55
52
50
40
30
35
37
40
39
36
Triton 0,1 %
24
Triton 0,5 %
18
20
10
0
Uri
Cit
Ade
Gua
Ino
Sustrato
A pesar de esto, el rendimiento de la reaccin de transfosfatidilacin para algunos

de los nuclesidos, cuando la concentracin del detergente fue del 0,1%, fue mayor o
similar a las reacciones sin aditivos. Para la guanosina, en particular, se observa un
rendimiento de 40% de produccin del derivado fosfoliponucleosdico, que disminuye a
18% al aumentar 5 veces la cantidad de detergente. Un efecto similar fue constatado para la
citidina y la inosina, cuyos rendimientos con 0,1 y 0,5% fueron mayores a los obtenidos sin
agregado de detergentes.
160

________________________________________________________________________________
Esto confirm que el aumento de la superficie interfacial provocado por la

emulsificacin del medio de reaccin tiene un efecto negativo sobre la reaccin sinttica de
la PLD debido a un aumento de la hidrlisis, provocada quizs por el gran exceso molar del
agua en comparacin con el nuclesido.
En la Figura 5.7 se observa la accin del Tween 20 en la reaccin de
transfosfatidilacin de cinco nuclesidos naturales, se indican en el grfico de barras los
rendimientos mximos obtenidos para cada uno. Los tiempos mximos para cada reaccin
tambin se encuentran antes de cumplidas las primeras 24 horas de reaccin.
Sorprendentemente, la adicin de cantidades crecientes de Tween 20 provoc un
aumento significativo de los rendimientos mximos en tres de los nuclesidos
mencionados; con uridina, elevando su rendimiento un 10% en comparacin con las
condiciones sin agregado de ningn aditivo a la reaccin; con citidina, donde el aumento es
an mayor ya que se pas de un 39% de produccin de fosfatidilnuclesido a un 68%, y
para el caso de la inosina, donde se lleg a un 71% de rendimiento.
Figura 5.7. Efecto del Tween 20 sobre la reaccin de transfosfatidilacin

80
71
68
66
70
% Rendimiento
60
50
42
40
30
34
35 33
24
Tween 0,1 %
29
Tween 0,5 %
20
9
10
0
Uri
Cit
Ade
Gua
Ino
Sustrato
Tanto para la adenosina como para la guanosina, el aumento de la proporcin de

detergente fue contraproducente, observndose una disminucin en los rendimientos
obtenidos; para el caso particular de la adenosina, en ninguna de las condiciones
161

________________________________________________________________________________
experimentales probadas fue mejorado el rendimiento obtenido con la reaccin sin

surfactante y a 37 C.
5.2.3.3.
Evaluacin del exceso estequiomtrico de los sustratos
El mecanismo de catlisis de esta enzima involucra la formacin de un

intermediario fosfatildil-enzima, que es comn a los dos posibles caminos que puede llegar
a tomar esta reaccin: puede ser atacado por un alcohol para dar el producto de
transfosfatidilacin, o por agua para formar cido fosfatdico. Como ha sido constatado por
Servi10, a tiempos cortos de reaccin la relacin de concentraciones de los dos productos
posibles es constante, sin que tenga alguna influencia el fosfolpido que acte como dador
del residuo fosfatdico, por lo que la mayor formacin de alguno de ellos est relacionada
con la concentracin de los diferentes nuclefilos (alcohol o agua).
Cuando la relacin molar nuclesido/fosfatidilcolina (N/P) es menor que 1 se
favorece la acumulacin del fosfatidilnuclesido ya que el exceso de fosfatidilcolina
presente en el medio disminuye la probabilidad de que el producto de inters sea
hidrolizado; cuando N/P es mayor que 1 existe una mayor concentracin del nuclefilo, por
lo que se favorece la sntesis ya que aumentan las posibilidades de que se produzca el
ataque del intermediario fosfatidil-enzima por parte del alcohol en lugar del agua.
Es por esto que se evalu el efecto que tiene la relacin molar entre el fosfolpido y
el nuclesido, en la reaccin de transfosfatidilacin de la citidina, tomada como reaccin
modelo. Para ello se realizaron reacciones a 37 C, respetando siempre la misma cantidad
de biocatalizador, siendo la nica variable modificada la relacin molar entre la
fosfatidilcolina y el nuclesido.
En la Figura 5.8 se muestran los rendimientos mximos de 5-(3-sn-fosfatidil)citidina obtenidos para cada relacin molar.
Cuando N/P=1 se pudo observar el resultado previsible, un mnimo en la produccin
del fosfatidilnuclesido, debido a que la carencia de un exceso del nuclefilo permiti que
se acumulara principalmente cido fosfatdico, determinado cualitativamente por c.c.d.,
proveniente de la hidrlisis de fosfatidilcolina y de la fosfatidilcitidina.
162

________________________________________________________________________________
Con N/P=5, se observ un mximo del 66%, consistente con la hiptesis planteada,
donde se favoreci la transfosfatidilacin; en este caso la fosfatidilcolina actu como
reactivo limitante por lo que al finalizar la reaccin qued mucho nuclesido que no
particip en la reaccin. Lo mismo sucedi con N/P=10, pero en este caso se observ que el
rendimiento mximo fue menor al obtenido para la relacin anterior, observndose quizs
algn tipo de inhibicin.
Las relaciones en donde la fosfatidilcolina se encontr en exceso en comparacin
con la citidina mostraron una tendencia similar; cuando N/P=0,1 se determin un
rendimiento menor en comparacin con N/P=0,5, sugiriendo la presencia de una inhibicin
por sustrato, siendo ms conveniente excesos intermedios.
Figura 5.8. Rendimientos mximos de transfosfatidilacin,

calculados respecto del reactivo limitante, obtenidos con
distintas relaciones de citidina-fosfatidilcolina (N/P)
66
70
Rendimiento (%)
60
49
50
38
40
30
27
20
10
0
N/P
0,1
0,5
10
En funcin de lo anteriormente discutido, la utilizacin de N/P=0,5 5, depender

principalmente del valor econmico del nuclesido, ya que los que tienen una importancia
mayor son no naturales y pueden llegar a ser ms onerosos, haciendo que su uso en exceso
no sea practicable a grandes escalas.
163

________________________________________________________________________________
5.3. Conclusiones
La utilizacin de la fosfolipasa D (PLD) de fuentes bacterianas, especialmente del

gnero de las Streptomyces, demostr ser capaz de catalizar la reaccin de
transfosfatidilacin deseada; se pudo obtener un crudo enzimtico activo a partir de
Streptomyces netropsis, derivado de un cribado en nuestro cepario.
Este crudo enzimtico fue capaz de efectuar la transferencia de diversos nuclesidos
a la cabeza polar de un residuo fosfatidlico aceptor, produciendo una variedad de
fosfatidilnuclesidos, con rendimientos moderados y en algunos casos altos. Fue necesario
utilizar un exceso de fosfatidilcolina, ya que el medio de reaccin era bifsico, compitiendo
de esta manera la reaccin hidrlitica.
Se ensayaron diversas modificaciones de las variables experimentales para intentar
mejorar los rendimientos de las reacciones. El aumento de la temperatura de 37 a 45 C
produjo un perfil de reaccin en donde los rendimientos mximos de la transfosfatidilacin
se obtuvieron a tiempos ms cortos, pero la hidrlisis prevaleca a tiempos ms largos; sin
embargo fue posible mejorar la sntesis del fosfatidilnuclesido a partir de guanosina,
nuclesido conocido por su pobre solubilidad, desde un rendimiento del 9% a un 52%.
La utilizacin de agregados que favorecieran la formacin de emulsiones en el
medio de reaccin heterogneo y de esta manera facilitaran la transferencia de masa de los
distintos sustratos, posibilitaron la sntesis de 5-(3-sn-fosfatidil)-uridina, 5-(3-snfosfatidil)-citidina y 5-(3-sn-fosfatidil)-inosina con rendimientos mayores al 60%. La
reaccin fue dependiente de la cantidad y el detergente utilizado, siendo el Tween 20 con
una concentracin del 0.5% v/v la mejor condicin de reaccin.
El exceso del nuclefilo, en este caso el nuclesido, tena influencia en los
rendimientos obtenidos, tomndose como reaccin modelo la transfosfatidilacin de la
citidina; se alcanz un mximo en la produccin del fosfatidilnuclesido cuando N/P=0,5 y
5. La utilizacin de alguna de las dos proporciones depender del costo relativo del sustrato
y el nuclesido para obtener la mxima productividad.
Se estableci una metodologa sencilla y verstil que permite obtener estos
derivados hidrofbicos de nuclesidos con buenos rendimientos, que pueden ser utilizados
164

________________________________________________________________________________
como prodrogas, o ser sustratos para modificaciones sucesivas con otras enzimas para
obtener productos de mayor valor agregado, como se discutir en un captulo posterior.
5.4. Bibliografa
(1)
Leiros, I.; Secundo, F.; Zambonelli, C.; Servi, S.; Hough, E. Structure. 2000, 8, 65567.
(2)
Mantsch, H.; Smith, I. Biochemical and Biophysical Research Communications.

1972, 46, 808-815.
(3)
Birichevskaya, L. L.; Kvach, S. V.; Sivets, G. G.; Kalinichenko, E. N.; Zinchenko,

A. I.; Mikhailopulo, I. A. Biotechnology Letters. 2007, 29, 585-91.
(4)
Bascaran, V.; Hardisson, C.; Braa, A. F. Applied Microbiology and Biotechnology.

1990, 34, 208-213.
(5)
Bossi, L.; D'Arrigo, P.; Pedrocchi-Fantoni, G.; Mele, A.; Servi, S.; Leiros, I. Journal
of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2001, 11, 433-438.
(6)
Hatanaka, T.; Negishi, T.; Kubota-Akizawa, M.; Hagishita, T. Biochimica et

Biophysica Acta. 2002, 1598, 156-64.
(7)
Rubingh, D. N. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 1996, 1, 598-603.
(8)
Helist, P.; Korpela, T. Enzyme and Microbial Technology. 1998, 23, 113117.
(9)
Ball, A.; Jones, R. a L. Langmuir. 1995, 11, 3542-3548.
(10)
Carrea, G.; D'Arrigo, P.; Mazzotti, M.; Secundo, F.; Servi, S. Biocatalysis and
Biotransformation. 1997, 15, 251-264.
165

________________________________________________________________________________
166
Captulo 6 Inmovilizacin de la fosfolipasa D Transfosfatidilacin en

medio anhidro
CAPTULO
6
INMOVILIZACIN DE LA FOSFOLIPASA D
TRANSFOSFATIDILACIN EN MEDIO
ANHIDRO
Captulo 6: Inmovilizacin de la fosfolipasa D Transfosfatidilacin en medio anhidro

________________________________________________________________________________
168

________________________________________________________________________________
El objetivo de este captulo es obtener un biocatalizador capaz de efectuar la

reaccin de transfosfatidilacin de nuclesidos en medio anhidro. El propsito es eliminar
la reaccin hidroltica que compite con la reaccin de sntesis y de esta manera aumentar
los rendimientos sin necesidad de usar ningn exceso, ya sea del sustrato o del nuclefilo.
Para aumentar la estabilidad de la enzima en los solventes anhidros se estudi su
inmovilizacin.
Para cumplir este objetivo, se ensayaron diversas metodologas de inmovilizacin
del crudo enzimtico obtenido en el captulo anterior, que incluyeron mtodos de adsorcin,
atrapamiento y covalentes. Entre ellos se destacaron la inmovilizacin en sol-gel y agarosa.
Adems fue necesario el uso de lquidos inicos como cosolventes del medio de reaccin,
ya que el nico solvente orgnico, en el que demostr actividad el biocatalizador
inmovilizado, fue en cloroformo y los nuclesidos no son solubles en el mismo. Se
encontr que el uso de metanosulfonato de 1-butil-3-metilimidazolio permite mejorar la
solubilidad de los nuclesidos en cloroformo.

6.2.1. Evaluacin de distintos tipos de inmovilizacin
En principio se eligi una reaccin modelo de transfosfatidilacin con fosfolipasa

D, y ya que los nuclesidos no son solubles en solventes orgnicos se debi utilizar otro
sustrato con el fin de determinar la actividad de los distintos inmovilizados. De acuerdo a
antecedentes encontrados en bibliografa en donde se utilizaba esta enzima para la sntesis
de fosfatidilglicerol se eligi como medio de esta reaccin modelo al biocatalizador
suspendido en cloroformo, donde estaban disueltos tanto el glicerol como la
fosfatidilcolina, en presencia de una resina de intercambio catinico (Dowex 50WX8-Na,
100-200 mesh). La tarea que cumple esta resina es la de atrapar la colina que se produce en
la reaccin ya que de lo contrario, al ser poco soluble en medio orgnico, queda unida al
sitio activo de la enzima, inhibindola1. El biocatalizador usado fue la fosfolipasa D
comercial de Streptomyces sp., previa liofilizacin en presencia de 98% p/p de KCl. Este
169

________________________________________________________________________________
slido result ser eficiente como biocatalizador, ya que la matriz polar que se forma en altas
concentraciones de sal protege la enzima de una desnaturalizacin provocada por el
solvente orgnico2. La reaccin modelo en este caso slo sirve para fines cualitativos ya
que la cuantificacin del fosfatidilglicerol no fue posible, debido a que no se encontraron
condiciones de HPLC que permitan separar el producto del sustrato.
A continuacin se evalu la utilidad sinttica de este sistema para nuestro caso en
particular, es decir utilizando nuclesidos en lugar de glicerol y se utiliz adems este
mtodo de proteccin enzimtica con KCl con el crudo enzimtico obtenido en el captulo
anterior. El principal problema es la pobre solubilidad del nuclesido en cloroformo, por lo
que se ensay el comportamiento del biocatalizador en solventes ms polares:
dimetilformamida, dioxano, t-butanol y piridina. En estos solventes los nuclesidos fueron
mucho ms solubles que en cloroformo, pero la reaccin no fue positiva en ninguno de los
casos, usando como nuclefilo modelo uridina. Muy probablemente la consecuencia
negativa de utilizar solventes orgnicos polares se debe a la fuerte desorcin del agua de la
superficie de la enzima, lo que conlleva a la inactivacin de la protena perdiendo de esta
manera su actividad3, este proceso pudo ser acelerado por la solubilizacin parcial de la
matriz inica; este tipo de tratamiento con sales no demostr ser propicio para evitar o
atenuar esta tendencia en el biocatalizador.
Una vez descartadas estas estrategias, se probaron otras metodologas, en particular
de inmovilizacin, para mejorar la eficiencia de la fosfolipasa D en medio no acuoso.
La primera tcnica de inmovilizacin evaluada involucr la utilizacin de una
matriz, Duolite, una resina de intercambio inico insoluble utilizada generalmente en
forma directa en aplicaciones farmacuticas o como vehculo para drogas; en este caso la
inmovilizacin se realiz por medio de la adsorcin de la enzima en su superficie. Para ello
se utiliz un mtodo estndar que consisti en la incubacin overnight de la resina con la
solucin enzimtica, lo que permiti obtener una carga del 68% de las protenas presentes
sobre el carrier determinado por Bradford. La prueba de actividad enzimtica fue realizada
con la reaccin modelo explicada anteriormente con glicerol como nuclefilo y cloroformo
como medio de reaccin; no detectndose la presencia de fosfatidilglicerol. La causa de
este resultado puede deberse a que al tratarse de una resina de intercambio inico al igual
que la encargada de atrapar la colina, esta ltima no haya sido efectiva y el subproducto (la
170

________________________________________________________________________________
colina) haya quedado adsorbida en la matriz del carrier, particionndose con el sitio activo
e inhibiendo a la enzima o que la misma se haya adsorbido de una manera que no favorezca
la estabilizacin en solventes orgnicos4. Esta metodologa fue descartada para posibles
optimizaciones.
La segunda tcnica de inmovilizacin probada consisti en el atrapamiento de la
enzima en una matriz de alginato, este compuesto es un polisacrido que se obtiene de
algunas algas marinas pardas y su componente principal es la sal sdica de cido algnico.
Este es soluble en soluciones acuosas a pH por encima de 3,5, como as tambin en mezclas
de agua y solventes orgnicos miscibles como alcoholes. Pero en presencia de cationes
como el calcio forma una estructura conocida como caja de huevos producindose una
gelificacin del mismo, en donde los cationes calcio se sitan como puentes entre los
grupos con carga negativa del cido gulurnico5. El protocolo consisti en el goteo de una
solucin enzimtica con cido algnico al 2% p/v, en una solucin 0,1 M de CaCl2, las
perlas formadas fueron lavadas con buffer y con cloroformo, y a continuacin se ensay la
actividad de las mismas. El resultado obtenido fue negativo, no observndose formacin de
producto. Cabe comentar que se observ la adherencia de la resina de intercambio Dowex,
encargada del atrapamiento de la colina, sobre la superficie de las perlas de alginato,
posiblemente debido a una atraccin electrosttica con los cationes calcio presentes. Dadas
la presencia de estas cargas netas y la naturaleza inica de la colina es factible proponer
tambin la adsorcin de la colina sobre la matriz provocando un efecto similar al observado
en el caso anterior. Se realiz una reaccin control para poner a prueba esta hiptesis
utilizando un medio de reaccin heterogneo: buffer-cloroformo, sin el agregado de resina.
La formacin de fosfatidilglicerol observada sugiere que la enzima mantiene su actividad
cuando es inmovilizada en alginato. Por consiguiente, estos resultados indicaran que esta
matriz no es adecuada para el medio de reaccin anhidro que requiere la presencia de la
resina.
Se analiz el uso de otro polmero natural: agarosa. En su estado natural, este
compuesto se encuentra como un carbohidrato estructural de la pared celular de las algas
agarfitas. Es una mezcla compleja de polisacridos compuesta por dos fracciones
principales; la fraccin gelificante es una molcula lineal neutra, esencialmente libre de
sulfatos, que consiste en cadenas repetidas de unidades alternadas -1,3-D-galactosa y 171

________________________________________________________________________________
1,4-3,6-anhidro-L-galactosa6. El procedimiento de inmovilizacin consisti en el goteo de

una solucin enzimtica con 2,5% p/v de agarosa fundida, previamente autoclavada, sobre
un bao de aceite de girasol comercial, seguido de un bao exhaustivo de las perlas
formadas con ter de petrleo, buffer y cloroformo. En paralelo, tambin se utiliz agarosa
para inmovilizar por medio de enlaces covalentes a travs de la activacin de los grupos
hidroxilos con glicidol y posterior oxidacin para formar la denominada glioxil-agarosa7.
Se efectu la prueba de actividad de ambos biocatalizadores en medio orgnico anhidro y
se observ un comportamiento similar al observado con las perlas de alginato: ausencia de
reactividad y adherencia de la resina de intercambio. Adems, el ensayo posterior de
actividad en medio buffer:cloroformo tambin dio positivo. Las causas de esta inactividad
pueden ser similares a las mencionadas anteriormente.
Tambin se utiliz otro tipo de inmovilizacin covalente, usando un pre-polmero
de poliuretano, poli-propilenglicol-toluen-2,4-diisocianato; el mismo permite formar un
polmero de poliuretano simplemente con la agitacin en agua8. Una dada cantidad del prepolmero fue agregado a una solucin enzimtica y agitada a 2500 rpm, la reaccin de
entrecruzamiento se lleva a cabo en unos minutos. Este proceso produce el atrapamiento de
la enzima y adems posibilita la reaccin de grupos presentes en las cadenas laterales con
isocianato, dando origen tambin a una inmovilizacin covalente. La prueba de actividad
del biocatalizador obtenido no fue positiva, sugiriendo que las condiciones poco suaves
utilizadas en esta metodologa conllevan a la desnaturalizacin de la enzima.
Para profundizar la explicacin de la ausencia de actividad de estos biocatalizadores
en medios no acuosos, se realiz una medicin de actividad de todos los inmovilizados en
un medio de reaccin bifsico (buffer-cloroformo), con uridina como nuclefilo. La
carencia de actividad en este medio de reaccin denotara una inactivacin de la enzima,
provocada por el mtodo de inmovilizacin. Los datos obtenidos se encuentran en la Tabla
6.1.
Los datos obtenidos demuestran que la inmovilizacin covalente, con glioxilagarosa y poliuretano, son nocivas para la fosfolipasa D, no observndose ninguna
actividad por parte de estos biocatalizadores. Lo mismo sucede con la inmovilizacin por
Duolite, a pesar de tratarse de un mtodo suave de inmovilizacin.
172

________________________________________________________________________________
Tabla 6.1. Datos obtenidos de la medicin de actividad de cada

uno de los inmovilizados en medio bifsico (cloroformo:buffer)
Mtodo de
inmovilizacin
Temperatura
(C)
t (h)
Actividad
Relativaa
Rendimiento
(%)b
Libre
37
20
56
Duolite
37
---
---
---
Alginato
37
24
0,75
37
Agarosa
37
24
0,81
48
Glioxil-agarosa
37
---
---
---
Poliuretano
37
---
---
---
En comparacin con la enzima libre. Determinado por HPLC.
Tanto la inmovilizacin con alginato y agarosa demuestran una buena capacidad

cataltica, con prdidas de actividad mnimas en comparacin con la enzima libre, y
rendimientos mximos similares, concluyndose que la ausencia de actividad en medios no
acuosos no es debido al mtodo de inmovilizacin sino al medio de reaccin necesario para
llevar a cabo la reaccin en forma anhidra.
6.2.2. Tecnologa sol-gel
Se decidi probar una tecnologa de inmovilizacin vtrea biocompatible, de

condiciones experimentales suaves, a travs de la denominada tecnologa sol-gel.
Un sol-gel puede ser formado por el crecimiento de un arreglo de partculas
coloidales o por formacin de una red interconectada, por hidrlisis y condensacin
simultnea de un precursor organometlico9.
En el primer paso de este proceso debe producirse la hidrlisis de un precursor
Si(OR)4, luego el cido silcico interacta con otros monmeros y se condensa formando
enlaces -Si-O-Si-. Eventualmente queda formada una red de SiO2 (Figura 6.1).
173

________________________________________________________________________________
Figura 6.1. Proceso de formacin del sol-gel
Cuando en una regin se forman suficientes enlaces -Si-O-Si-, ellos responden

cooperativamente como partculas coloidales o sol. El tamao de las partculas de sol y el
entrecruzamiento entre ellas (o sea la densidad) depende del pH y de la relacin
H2O/Si(OR)4. Con el tiempo estas partculas coloidales se unen entre s para formar una red
tridimensional (proceso denominado gelacin). Luego se deja reposar el gel (proceso
llamado comnmente envejecimiento) para que las reacciones de policondensacin sigan
producindose, de esta manera la fuerza del gel se incrementa
Las principales desventajas del proceso es que se utiliza normalmente como
precursor tetraetilortosilicato (TEOS), esto produce etanol durante la hidrlisis y adems
son necesarios cambios abruptos en el pH para el inicio de la etapa de polimerizacin,
provocando efectos que son perjudiciales para la actividad de la enzima atrapada. Para
evitar estas condiciones adversas para la protena, se utiliz otro precursor bio-compatible,
el tetraquis-(2-hidroxietil)-ortosilicato o THEOS. La liberacin de un alcohol amigable
para la enzima a ser inmovilizada en la etapa de hidrlisis del precursor (etilenglicol),
disminuye la posible desnaturalizacin proteica. Otra ventaja de estos precursores es que
pueden ser disueltos directamente en agua (a diferencia del TEOS) y condensan a pH casi
neutro eliminando la necesidad de alteraciones abruptas en el pH durante el procesamiento
del gel10. Tambin estos precursores generan materiales con menor grado de encogimiento,
menor dimetro de poro y mejores propiedades mecnicas que los materiales basados en
TEOS11.
174

________________________________________________________________________________
En particular el precursor modificado THEOS puede ser preparado fcilmente a

partir de TEOS y etilenglicol. Con el objeto de obtener materiales mecnicamente ms
resistentes y de menor tamao de poro, se adicion un auxiliar polimrico, quitosano, a los
sol-geles de slica. Es sabido que la presencia de quitosano, una molcula policatinica,
puede actuar como agente nucleante para la slica, debido a la formacin de enlaces puente
de hidrgeno entre los grupos aminos del quitosano y los hidroxilos de los silanoles12.
6.2.2.1.
Obtencin del precursor THEOS
Se obtuvo el precursor THEOS mediante la reaccin del TEOS con etilenglicol

(Figura 6.2). Fue posible reemplazar directamente los grupos etoxilos del TEOS, sin el uso
de catalizadores, a la vez, el diol actu como nuclefilo y solvente de la reaccin. La
reaccin se llev a cabo bajo una atmsfera inerte a 150C utilizando directamente TEOS
y etilenglicol, recin destilados, con remocin del subproducto formado, etanol
(por
destilacin), para as favorecer el avance de la reaccin. Asimismo, se demostr

espectroscpicamente el intercambio casi completo del alcohol, debido a que, en general,
no se evidenciaron grupos etoxilos en los espectros de RMN-1H y -13C. Una vez alcanzado
el rendimiento mximo, se removi el remanente de etilenglicol por destilacin a presin
reducida, para as obtener al THEOS como un aceite transparente, con un 85% de pureza.
El THEOS fue totalmente soluble en agua, con un tiempo de gelificacin en
solucin acuosa neutra de varias horas, dependiendo de la concentracin del precursor en la
solucin (a temperatura ambiente). Tal como se cit anteriormente las molculas de
quitosano actan como centro de nucleacin, acelerando los tiempos de gelificacin
enormemente, efecto combinado con el aumento de pH. A concentraciones de quitosano
constante (1%), el tiempo de gelificacin dependi de la concentracin del precursor,
siendo de 8 minutos para una concentracin de slice del 12%, 6 minutos para 20% de
slice y de 3 minutos para 40%. Estos ensayos se realizaron con soluciones de buffer Tris
100 mM, pH=8,0.
175

________________________________________________________________________________
Figura 6.2. Sntesis del precursor THEOS
Por ltimo cabe destacar que al mezclar el precursor THEOS con la solucin acuosa
cida de quitosano, no se observ precipitacin ni separacin de fases, demostrando una
buena compatibilidad.
6.2.2.2.
Optimizacin del proceso de inmovilizacin sol-gel
Teniendo en cuenta que la polimerizacin del precursor THEOS es menos

desnaturalizante que la anloga basada en TEOS, se evaluaron concentraciones ms
elevadas del precursor de partida. En primer lugar, se prepararon diversos sol-geles a
concentracin constante de quitosano, variando el porcentaje de THEOS entre un 10% y un
40%, fijando el pH de la inmovilizacin en un valor igual a 8. Para evaluar el efecto de la
cantidad de precursor THEOS sobre la actividad enzimtica, se decidi utilizar la menor
cantidad de quitosano posible, fijndose en un valor de 0,2%.
Para cuantificar el efecto de la concentracin del precursor y el aditivo en la
reaccin se utiliz en este caso uridina como nuclefilo de la reaccin modelo, en un medio
heterogneo buffer-cloroformo y se cuantific por HPLC. Los resultados se encuentran
resumidos en la Tabla 6.2.
Los sol-geles obtenidos con slica pura mostraron una menor resistencia mecnica,
siendo quebradizos, lo que provocara una ausencia de estabilidad operacional (Entrada 5,
Tabla 6.2). El aumento de la proporcin de THEOS, manteniendo constante la cantidad de
quitosano, produce una disminucin en la actividad relativa, adems de volverse ms
quebradizos siendo poco convenientes para posibles reusos. En cuanto al incremento de la
cantidad de quitosano, fue contraproducente para la actividad de la enzima a pesar de que la
inmovilizacin sin el agregado de quitosano present la mayor actividad, el sol-gel que se
forma se va deshaciendo en el transcurso de la reaccin, como antes mencionado.
176

________________________________________________________________________________
Tabla 6.2. Datos de

inmovilizada en sol-gel
Entrada
THEOS (%)
actividad
Quitosano (%)
de
PLD
Actividad
Relativaa
1
0
0
1
2
10
0,2
0,20
3
20
0,2
0,09
4
40
0,2
0,03
5
10
0
0,61
6
10
0,4
0,46
7
10
1,3
0,04
a
En comparacin con la enzima sin inmovilizar; determinada por
la aparicin de fosfatidiluridina por HPLC.
Por lo tanto la mejor condicin para la inmovilizacin de la enzima corresponde a la

utilizacin de un 10% de THEOS y 0,4% de quitosano, ya que rene las condiciones de
estabilidad operacional y mayor actividad relativa (Entrada 6, Tabla 6.2).
En la Figura 6.3 se pueden observar los datos obtenidos de la evaluacin de la
estabilidad operacional de estos monolitos; la actividad se mantiene casi en su totalidad
para el primer reuso, pero en el segundo pierde la actividad hasta casi un 50% de la
demostrada inicialmente, esto es debido probablemente a la prdida de fosfolipasa D por la
desintegracin parcial del monolito por la agitacin de la reaccin y la manipulacin para la
medicin de actividad de los distintos reusos.
Se procedi a utilizar este biocatalizador en condiciones anhidras, para ello fue
necesario modificar el medio orgnico anhidro que se vena usando hasta ahora, ya que los
nuclesidos, y en particular la uridina no son solubles en cloroformo; para ello se ensayaron
diversos lquidos inicos miscibles con cloroformo que pueden llegar a aumentar la
solubilidad del nuclesido. Se ensayaron tres lquidos inicos: tetrafluoroborato de 1-butil3-metilimidazolio
([BMIM][BF4]),
hexafluorofosfato
de
1-butil-3-metilimidazolio
([BMIM][PF6]) y metanosulfonato de 1-butil-3-metilimidazolio ([BMIM][MeSO]). Se

analiz la solubilidad de uridina en cloroformo con 10% v/v de cada uno de los lquidos
inicos, a travs del mtodo de saturacin y por HPLC. De los tres lquidos inicos, el que
permiti disolver mayor cantidad de uridina fue [BMIM][MeSO], por lo que fue escogido
como medio de reaccin para las reacciones subsiguientes.
177

________________________________________________________________________________
Figura 6.3. Medicin de actividad de la PLD inmovilizada

en sol-gel en los distintos reusos
1200
U x 10-2
1000
800
600
400
200
0
1
N usos
La reaccin llevada a cabo en este nuevo medio de reaccin permiti obtener un

36% de rendimiento de fosfatidiluridina, a partir de una mezcla equimolar de uridina y
fosfatidilcolina en la presencia de la fosfolipasa D inmovilizada en sol-gel, pero la reaccin
se detuvo al llegar al mximo de produccin; cualitativamente se pudo observar que el
lquido inico haba disminuido su concentracin en el medio de reaccin, ya que la
siembra en una c.c.d. no dejaba residuos no voltiles, particularidad caracterstica que suele
observarse en estos medios de reaccin. Se concluy, teniendo como antecedente lo
explicado en el captulo 3, que el catin imidazolio fue intercambiado por la resina,
disminuyendo de esta manera la capacidad de esta ltima de atrapar la colina. Al mismo
tiempo se observaba la aparicin de un precipitado blanco en el medio de reaccin, uridina
sin disolver, debido a la disminucin de la cantidad de lquido inico.
Tratando de resolver este problema se efectu un cambio en la forma en que se
elimina la colina del medio de reaccin, y es la utilizacin de una segunda enzima que
catalice la transformacin de este subproducto en otro compuesto que no sea inhibidor de la
enzima.
6.2.2.3.
Coinmovilizacin de colina oxidasa y fosfolipasa D
La colina oxidasa (ChOx) es una enzima que cataliza la conversin de colina en

betana (Figura 6.4); esta enzima ha sido utilizada anteriormente para mejorar la produccin
178

________________________________________________________________________________
de diversos derivados fosfatidcos en medios heterogneos13, pero nunca ha sido utilizada

con el mismo fin en medios orgnicos anhidros.
Para evitar tener que utilizar una resina de intercambio inico para atrapar la colina,
se coinmovilizaron ambas enzimas (PLD y ChOx), ya que la transformacin del inhibidor
aumentara la capacidad cataltica de la fosfolipasa D.
Figura 6.4. Esquema de reaccin de la nueva metodologa enzimtica

propuesta
AG: acilo graso
Se estudi la coinmovilizacin en monolitos de sol-gel, y tambin en la matriz de

agarosa, ya que este material tiene una estabilidad operacional interesante, una amplia
aplicabilidad y la resina de intercambio inico que se consideraba que produca la
inactivacin del biocatalizador se encuentra ausente en este caso.
Se efectuaron en un principio ensayos para medir la potencial prdida de actividad
de la colina oxidasa en el proceso de inmovilizacin, para ello se utiliz un mtodo
colorimtrico indirecto descripto en la Parte Experimental14.
Los resultados arrojados se encuentran en la Tabla 6.3, y lo que se puede observar
es que para los dos mtodos de inmovilizacin la prdida de actividad con respecto a la
enzima libre es cercana al 20%; a pesar de ello, ambos biocatalizadores demostraron poder
catalizar la transformacin de toda la colina presente en betana.
179

________________________________________________________________________________
Tabla 6.3. Medicin de la actividad residual luego

de la inmovilizacin de la colina oxidasaa
Mtodo de
inmovilizacin
Actividad relativab
Rendimiento
(%)c
Libre
100
> 99
Agarosa
80,52
> 99
Sol-gel
83,2
> 99
Reaccin de oxidacin de cloruro de colina. bEn comparacin con

la enzima sin inmovilizar. cDeterminado a travs de un mtodo
colorimtrico (seccin 2.2.9.3.2)
Teniendo en cuenta esto, ambos preparados fueron utilizados para co-inmovilizar la

fosfolipasa D y la colina oxidasa con el fin de catalizar la reaccin de transfosfatidilacin,
en un principio con glicerol, sin el agregado del lquido inico, para descartar efectos
producidos por la presencia de ste.
De los datos cualitativos obtenidos por c.c.d., se observ que para la reaccin
llevada a cabo con el inmovilizado de agarosa, se obtuvo una conversin cuantitativa a
productos, en cambio para la reaccin llevada a cabo con la inmovilizacin de la enzima
con tecnologa sol-gel no se obtuvo reactividad, esto puede ser debido a que la proteccin
que puede ejercer la matriz es insuficiente para la colina oxidasa, produciendo su
desnaturalizacin en el solvente orgnico.
Habiendo establecido que el mejor mtodo de inmovilizacin para las dos enzimas
es la agarosa, se decidi probar nuevamente esta enzima pero en cloroformo, en presencia
del lquido inico utilizado anteriormente [BMIM][MeSO] (10% v/v). En este caso se pudo
utilizar uridina como nuclefilo y cuantificar la reaccin por HPLC. El resultado obtenido
fue negativo, nuevamente se observ que la concentracin del lquido inico disminuy
provocando la precipitacin de la uridina, en este caso el lquido inico pareci
concentrarse en las perlas de agarosa, constatado por un aumento en su volumen. El uso de
solventes orgnicos polares como piridina, dimetilsulfxido y dimetilformamida en donde
los nuclesidos son ms solubles, para tratar de solucionar el problema ocasionado por el
lquido inico, tampoco produjo buenos resultados ya que tampoco se observ reactividad,
y en algunos casos la matriz no soport estas condiciones disgregndose.
180

________________________________________________________________________________
6.3. Conclusiones
Se ensayaron diversas estrategias de inmovilizacin de la enzima PLD con el objeto

de determinar la ms adecuada para dicha protena.
De las estrategias analizadas, se encontr que la ms eficiente (mayores valores de
rendimiento y actividad) fue el atrapamiento de la misma en materiales hbridos de slicabiopolmero, preparados mediante la tecnologa sol-gel. Los mejores resultados se
obtuvieron utilizando como precursor del sol-gel el THEOS, y como polmero auxiliar, el
quitosano.
Se logr encontrar un sistema que puede ser usado para la transfosfatidilacin en
solvente orgnico, este consta de la coinmovilizacin de fosfolipasa D y colina oxidasa en
agarosa que fue exitosamente probado en la reaccin con glicerol, obtenindose resultados
cuantitativos; este sistema no posee antecedentes bibliogrficos de utilizacin para la
sntesis de derivados fosfatdicos. A pesar de su utilidad no pudo ser usado para catalizar la
reaccin con nuclesidos debido a que el medio de reaccin necesario (cloroformo
[BMIM][MeSO]) no es compatible con esta matriz.
Adems fue posible encontrar un medio orgnico anhidro que puede llegar a
solubilizar una gran variedad de nuclesidos, compuesto de cloroformo y el lquido inico
[BMIM][MeSO], teniendo este sistema una gran aplicabilidad en una variedad de
reacciones con este tipo de compuestos hidroflicos.
6.4. Bibliografa
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and Design, 1ra Ed.; Wiley-VCH; 2006.
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Ruzicka, J.; Carroll, A. D.; Lhdesmki, I. The Analyst. 2006, 131, 799-808.
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Pessela, B. C. C.; Hidalgo, A.; Fernndez-Lorente, G.; Fernndez-Lafuente, R.;
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182
Captulo 7 Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato: Hidrlisis de los

fosfatidilnuclesidos
CAPTULO
7
SNTESIS DE NUCLESIDOS 5MONOFOSFATO:
HIDRLISIS DE LOS
FOSFATIDILNUCLESIDOS
Captulo 7: Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato: Hidrlisis de los fosfatidilnuclesidos

________________________________________________________________________________
184

________________________________________________________________________________
El objetivo de este captulo es completar la nueva metodologa enzimtica planteada

para producir nuclesidos 5-monofosfato. El mismo consiste en escindir selectivamente el
enlace fosfodister presente en los fosfatidilnuclesidos sintetizados en el captulo 5 de
manera que los productos de esta reaccin sean un nucletido y 1,2-diacilglicerol (DAG).
Para llevar a cabo tal tarea, se ensayaron distintas enzimas de fuentes bacterianas, de
mamferos e invertebrados, capaces de catalizar la reaccin hidrlitica de este tipo de
enlaces y se plantearon diferentes sistemas de reaccin: orgnico/acuoso y acuoso. Por
ltimo se realiz un cribado de los 100 microorganismos de nuestro cepario para encontrar
fuentes accesibles y novedosas de enzimas para efectuar esta reaccin.

La sntesis enzimtica de molculas orgnicas fosforiladas, en especial nuclesidos,
ya ha sido reportada; las estrategias incluyen la utilizacin de enzimas tales como fosfatasas
cidas no especficas, quinasas, o a travs de la digestin enzimtica de cidos nucleicos.
Todas estas metodologas sufren de diversas desventajas que limitan su utilizacin: alta
especificidad de sustrato, requerimientos de cofactores (ATP), obtencin de mezclas
complejas de nucletidos o bajos rendimientos debido a la presencia de reacciones
secundarias.
Aqu se plantea el uso de una nueva metodologa para la sntesis de nuclesidos 5monofosfato, como se esquematiza en la Figura 7.1; existen antecedentes de esta tcnica
pero para la sntesis de diversos fosfatos orgnicos no nucletidos, entre ellos la formacin
de dihidroxiacetona fosfato1, y glicerol 1-fosfato2. El primer paso incluye la reaccin
practicada en el captulo 5, la transferencia del nuclesido a la cabeza polar de la
fosfatidilcolina catalizada por la fosfolipasa D y luego la utilizacin de una fosfodiesterasa
que produzca la hidrlisis de manera que el resultado final sea el nuclesido fosforilado;
dado que slo se observ la transfosfatidilacin a travs del hidroxilo primario del
nuclesido, el resultado final fue un nuclesido 5-monofosfato.
185

________________________________________________________________________________
Figura 7.1. Esquema de la estrategia sinttica enzimtica planteada para la obtencin de

nuclesidos 5`-monofosfato (29-36)
AG: acilo graso
Teniendo en cuenta los antecedentes mencionados, se decidi efectuar un pequeo

cribado para encontrar biocatalizadores capaces de efectuar la hidrlisis de estos derivados
para dar como resultado los nucletidos; en un principio se ensayaron enzimas que son
obtenidas comercialmente, que incluyeron fosfodiesterasas utilizadas en biologa molecular
para la digestin de ADN y ARN, de origen bacteriano y animal, y fosfolipasas C
bacterianas: fosfolipasa C de Bacillus cereus (PLCBC) y Clostridium perfringens (PLCCP),
cuyo sustrato natural es la fosfatidilcolina y son capaces de escindir el enlace fosfodister
convenientemente, dando como producto colina fosfato.
7.2.1. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos en medio heterogneo
El medio de reaccin consisti en una fase orgnica compuesta de cloroformo,

donde se encuentra disuelto el fosfatidilnuclesido sintetizado a travs de la
transfosfatidilacin con la fosfolipasa D, y un medio acuoso compuesto de un buffer de
reaccin caracterstico para cada enzima, en donde se encuentra disuelta la misma. Todas
las enzimas tienen una misma temperatura ptima de reaccin 37 C, por lo que se utiliz la
186

________________________________________________________________________________
misma para realizar las hidrlisis en un agitador orbital a 200 rpm. Diferentes alcuotas
fueron tomadas de la fase acuosa a lo largo de la reaccin y analizadas por HPLC, ya que
de formarse un nucletido ste no es soluble en el medio orgnico.
Los rendimientos mximos para las distintas reacciones de hidrlisis se encuentran
detallados en la siguiente Tabla 7.1.
Tabla 7.1. Rendimientos obtenidos en las reacciones de hidrlisis de

fosfatidilnuclesidos con distintas fosfodiesterasas (Figura 7.1)
Producto
Rendimientos (%)a
PLCBC (t, h)
PECAd (t, h)
PECAt (t, h)
Nucleasa S1 (t, h)
29
Adenosina
41 (48)
30
Uridina
35 (51)
19 (24)
8 (24)
32 (10)
3 (10)
31
Citidina
23 (26)
3 (10)
3 (24)
32
Guanosina
21 (24)
33
AraU
32 (51)
34
ddU
36
2-F-AraA
Determinado por HPLC utilizando patrones de los productos 29-33 y de los correspodientes
nuclesidos. PLCBC: fosfolipasa C de Bacillus cereus. PECAd: fosfodiesterasa de veneno de
Crotalus adamentus. PECAt: fosfodiesterasa de veneno de Crotalus atrox.
De las enzimas ensayadas, la Benzonasa, enzima comercializada por SigmaAldrich Co., la fosfodiesterasa 3,5-nucletido cclico especfica de cerebro bovino, la
fosfolipasa C de Clostridium perfringens y la fosfodiesterasa I de Bothrops atrox no
mostraron actividad por ninguno de los sustratos ensayados. Cabe destacar que existe una
gran diferencia estructural y de polaridad entre los sustratos naturales de estas enzimas,
cadenas de ADN,
ARN o nucletidos cclicos (cAMP y cGMP) y los ensayados,
repercutiendo negativamente en la interaccin con el sitio activo de la enzima,

imposibilitando que se produzca la reaccin hidroltica3. La fosfolipasa C proveniente de C.
perfringens es capaz de hidrolizar eficientemente una amplia variedad de fosfolpidos:
fosfatidilcolina, lisofosfatidilcolina, esfingomielina y fosfatidilserina, todos ellos con una
187

________________________________________________________________________________
parte hidrofbica diferente, pero con cabezas hidroflicas iguales o anlogas con carga neta
en ellas4, por lo que la presencia de un nuclesido podra afectar la interaccin del sustrato
lipdico con el sitio activo de la enzima, pudiendo esto justificar su carencia de actividad.
Las fosfodiesterasas I de veneno de Crotalus atrox y adamentus, a pesar de lo
explicado anteriormente, fueron capaces de hidrolizar el enlace fosfodister de la 5-(3-snfosfatidil)-uridina y 5-(3-sn-fosfatidil)-citidina, nicamente. La escisin no fue selectiva,
ya que el enlace fosfodister hidrolizado no produjo el nucletido correspondiente en forma
exclusiva; en el caso del derivado lipdico de la uridina se observ la formacin de uridina
5-monofosfato (30) en mayor proporcin y uridina libre cuando la reaccin era catalizada
por la fosfodiesterasa de C. adamentus, mientras que con el derivado de citidina slo se
observ nuclesido libre. En ambos casos, la formacin de nuclesido libre fue menor al
10%, mientras que la del nucletido no super el 20%; tampoco se observ un avance de la
reaccin despus de los tiempos informados, denotando quizs una inactivacin de la
enzima por la presencia del solvente orgnico.
Cuando la hidrlisis fue catalizada por la fosfodiesterasa de Crotalus atrox, se
obtuvo exclusivamente como producto nuclesido libre con los sustratos que mostraron
actividad con la enzima anterior, en el caso de la citidina el rendimiento fue muy bajo, pero
con uridina se obtuvo un 32%.
En el caso de la Nucleasa S1, adems de bajos rendimientos solo se produjo uridina
libre.
A pesar de que los resultados con las enzimas mencionadas anteriormente no fueron
convenientes para el cumplimiento de nuestros objetivos, los fosfatidilnuclesidos con
bases pirimidnicas demostraron mayor aceptacin por parte de las enzimas ensayadas,
mientras que sus contrapartes purnicas slo mostraron reaccin con una sola enzima
(PLCBC).
No existen antecedentes bibliogrficos que mencionen la utilizacin de las enzimas
mencionadas anteriormente para la hidrlisis de este tipo de sustratos.
nicamente la fosfolipasa C de Bacillus cereus fue capaz de hidrolizar el enlace
fosfodister de manera selectiva y formar exclusivamente el nuclesido 5-monofosfato
(29-33) a partir de la mayora de los derivados ensayados. Las excepciones fueron la 5-(3sn-fosfatidil)-2,3-didesoxiuridina, cuya ausencia de grupos hidroxilos en el azcar puede
188

________________________________________________________________________________
disminuir su polaridad y por ende su interaccin con el sitio activo de la enzima, encargado
de estabilizar la carga positiva de la colina; una situacin similar se pudo observar con la
reaccin de transfosfatidilacin con la fosfolipasa D (Captulo 5), donde la carencia de
grupos hidroxilos disminuye la tendencia del producto a ser hidrolizado y permite que se
acumule en el medio de reaccin, de all la obtencin de rendimientos elevados (95%). Con
la PLCBC tambin se observ una carencia de actividad por parte de la 5-(3-sn-fosfatidil)fludarabina, no pudindose obtener el monofosfato correspondiente.
Los dems rendimientos obtenidos fueron similares, con una preferencia por parte
de la enzima por el derivado de adenosina, y dos derivados de uracilo (salvo la 2,3didesoxiuridina). Las reacciones transcurren en forma lenta observndose los rendimientos
mximos a partir de las 24 horas y llegan a un estado estacionario a partir de los tiempos
indicados, por lo que la reaccin nunca llega a completarse.
Se evaluaron otros solventes orgnicos como reservorio para el fosfatidilnuclesido,
las opciones son limitadas debido a la baja solubilidad que presentan estos derivados;
adems de cloroformo suelen usarse teres para disolver fosfolpidos, dietilter o
terbutilmetilter, pero debido a la temperatura de trabajo (37 C), se opt por la utilizacin
de este ltimo. Ya que las nicas reacciones que demostraron un resultado satisfactorio
fueron catalizadas por la fosfolipasa C de Bacillus cereus, se us esta enzima como el
biocatalizador de estas nuevas reacciones, las condiciones fueron las mismas a excepcin
del solvente orgnico utilizado.
Los resultados con este nuevo solvente difieren de los obtenidos con cloroformo, en
principio, se observa una disminucin marcada de los rendimientos en general; tanto para la
obtencin de adenosina 5-monofosfato como para uridina 5-monofosfato los rendimientos
mximos fueron de 4% a las 50 horas, mientras que las reacciones con 5-(3-sn-fosfatidil)citidina y guanosina no mostraron reactividad, al no observarse los nucletidos respectivos.
En cuanto a la produccin de uracilarabinsido 5-monofosfato, su rendimiento fue
levemente mayor, 16% a los 2 das de iniciada la reaccin, concluyndose que el uso de
cloroformo como reservorio de los fosfolpidos sigue siendo ms conveniente. Nuevamente
la capacidad cataltica de la protena no parece superar las 48 horas de reaccin.
189

________________________________________________________________________________
La explicacin de por qu la reaccin hidroltica catalizada por PLCBC no haya sido

completa puede estar dada por la desnaturalizacin de la protena provocada por la
presencia del solvente orgnico.
Una solucin que se propone a continuacin es la introduccin de pulsos
enzimticos, es decir pequeos agregados de enzima activa, para posibilitar la hidrlisis del
sustrato remanente.
7.2.2. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos con pulsos de PLC
Para efectuar el agregado de pulsos enzimticos, se realiz nuevamente la reaccin

con la misma cantidad de enzima (1 unidad) y a los tiempos en que se lleg al
estancamiento de la reaccin, se agreg una cantidad equivalente en actividad enzimtica
de PLCBC disuelta en una mnima cantidad de buffer de reaccin; al mismo tiempo se tom
una alcuota para ser analizada por HPLC. Se prosigui la reaccin un tiempo similar para
el agregado del segundo pulso y se tom una segunda alcuota para ser analizada, as
sucesivamente hasta completar el nmero de cuatro pulsos. Los resultados se muestran en
la Figura 7.2.
De los resultados obtenidos se observa que no hay una mejora de los rendimientos
obtenidos despus del segundo agregado de enzima (el pulso N 1 corresponde al agregado
inicial de enzima), por lo que una inactivacin de la enzima por la presencia del solvente
orgnico es poco probable.
Tambin se puede observar en la Figura 7.2 que las concentraciones de algunos de
los productos van disminuyendo con el tiempo de reaccin, en el caso del
uracilarabinofuransido 5-monofosfato se observa una cada del 7% mientras que con
citidina 5-monofosfato la cada es del 5%. Esto puede deberse principalmente a la
hidrlisis qumica de los nucletidos formados teniendo en cuenta que los tiempos de
reaccin entre cada pulso van de las 24 a las 48 horas, y en el cuarto ya transcurrieron 6
das de iniciada la reaccin. Esto fue comprobado por HPLC, ya que se constat la
presencia de nuclesido libre en el medio de reaccin.
190

________________________________________________________________________________
Figura 7.2. Rendimientos obtenidos en los distintos pulsos de las

hidrlisis de los fosfatidilnuclesidos con la fosfolipasa C de
Bacillus cereus
60
% Rendimiento
50
40
29
30
30
20
31
33
10
0
1
N de pulsos
A pesar de esto, se observa que el perfil de la reaccin hidroltica de la

fosfatidiluridina fue afectado por el agregado del segundo pulso enzimtico; se puede
observar en la Figura 7.2 que la adicin de PLC aumenta el rendimiento, pero luego de este
pulso la reaccin vuelve a detenerse y no avanza ms, inclusive con el agregado de un
nuevo pulso.
Hough y colaboradores5 determinaron que los productos fosforilados producidos a
partir de la hidrlisis de fosfolpidos, especficamente colina fosfato y glicerol 1-fosfato, no
inhiban la PLCBC, pero aqu parece apreciarse un efecto de este tipo, ya que la reaccin no
avanza luego de alcanzada una determinada concentracin de nuclesido 5-monofosfato,
con la salvedad de que para la uridina 5-monofosfato esa concentracin inhibitoria parece
ser mayor que para los dems nuclesidos. Otra explicacin puede estar dada por la
presencia de la interfase lquido-lquido y los efectos que puede ejercer la misma sobre la
actividad enzimtica6; para descartar dicha posibilidad se plante realizar la hidrlisis de
estos compuestos en ausencia de solventes orgnicos.
191

________________________________________________________________________________
7.2.3. Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos en medio acuoso
Las estructuras moleculares y la naturaleza anfiflica de estos compuestos, al igual

que la fosfatidilcolina de la que derivan, los hacen capaces de formar estructuras
supramoleculares del tipo de micelas y liposomas en medios netamente acuosos7-13. Ya que
este tipo de estructuras son dianas naturales para la PLCBC se decidi evaluar la accin de
esta enzima cuando el sustrato se encuentra formando liposomas, en lugar de estar disuelto
en un solvente orgnico, y de esta manera evitar los conocidos efectos negativos que puede
ejercer la presencia de una interfase lquido-lquido sobre la conformacin de una enzima
provocando su transicin a un estado inactivo13,14.
Se utilizaron metodologas estndar para la formacin de liposomas y se adicion la
misma cantidad de enzima que en el inciso anterior; ya que se trata de una fase netamente
acuosa, se decidi tambin probar las dems fosfodiesterasas. Los rendimientos de las
reacciones junto con los tiempos de mxima conversin obtenidos se detallan en la Tabla
7.2.
Tabla 7.2. Rendimientos obtenidos a partir de las reacciones hidrolticas de

fosfatidilnuclesidos en ausencia de solventes orgnicos
Rendimiento (%)
Producto
PLCBC
(t, h)
PLCCP
(t, h)
PECAd
(t, h)
PECAt
(t, h)
Nucleasa S1
(t, h)
29
75 (140)
30
82 (120)
31
72 (144)
10 (52)
32
61 (140)
33
78 (160)
35
73 (144)
Benzonasa PEcicl
(t, h)
(t, h)
Determinado por HPLC. PLCBC: fosfolipasa C de Bacillus cereus. PECAd: fosfodiesterasa de

veneno de Crotalus adamentus. PECAt: fosfodiesterasa de veneno de Crotalus atrox. PEcicl:
fosfodiesterasa 3`,5`-nucletido cclico especfica de cerebro bovino.
Nuevamente, la nica enzima capaz de producir los productos deseados fue la

fosfolipasa C de Bacillus cereus, con rendimientos que van de moderados a altos; tambin
se puede observar que se produjo citidina 5-monofosfato cuando se utiliz la
fosfodiesterasa de C. adamentus, a diferencia de la reaccin heterognea con solvente
orgnico. La presencia del fosfatidilnuclesido con una distribucin tridimensional distinta
192

________________________________________________________________________________
permiti que la hidrlisis del enlace fosfodister fuera selectiva, a pesar de esto los
rendimientos obtenidos son bajos y no se observ un avance de la reaccin inclusive a
tiempos largos de reaccin (7 das).
El tiempo de reaccin fue mayor con respecto a las reacciones con solvente
orgnico, obtenindose los rendimientos mximos aproximadamente a los 4 das de
reaccin (Figura 7.3), y en el caso de la 5-(3-sn-fosfatidil)-citidina a los 6 das se observa su
mximo de conversin a citidina 5-monofosfato. En ninguno de los casos ensayados la
reaccin fue completa, esto puede deberse a que en los agregados presentes en el medio de
reaccin se acumula 1,2-diacilglicerol ya que es el subproducto de la reaccin de hidrlisis.
Este compuesto es un potente inhibidor de la PLC como se pudo constatar en un estudio
realizado por Bangham15, donde se observ que la hidrlisis de micelas de lecitina
catalizada por la fosfolipasa C cesa antes de llegar a conversin total del sustrato.
Figura 7.3. Perfil de reaccin de las hidrlisis de fosfatidilnuclesidos

catalizadas por PLC en ausencia de solventes orgnicos
90
80
% Rendimiento
70
60
29
50
30
40
31
30
32
20
33
35
10
0
0
4
Das
La velocidad inicial de hidrlisis de los derivados de uridina y citidina fue distinta a

los dems ya que se observa una rpida formacin de los nucletidos respectivos a tiempos
cortos, pero luego la misma disminuye y se comporta en forma similar a los dems,
alcanzando el mximo de produccin a tiempos parecidos a los otros nuclesidos.
193

________________________________________________________________________________
El aumento de la temperatura podra favorecer la hidrlisis por parte de la

fosfolipasa C de manera de obtener el producto a tiempos menores, pero un estudio sobre la
dependencia de la actividad de esta enzima con la temperatura usando su sustrato natural,
fosfatidilcolina, demostr que existe una meseta en la actividad de la enzima entre 35 y 60
C sufriendo luego una cada abrupta16; adems, teniendo en cuenta la inestabilidad
termodinmica inherente a estas estructuras17,18, un aumento de la temperatura no fue
considerado como un parmetro a ser modificado con el fin de mejorar los rendimientos de
la reaccin.
Berti y colaboradores19 analizaron diversos aspectos estructurales de los arreglos
supramoleculares formados en solucin acuosa a partir de estos derivados de nuclesidos,
observaron que para los fosfolpidos que posean en su cabeza polar uridina, citidina y
adenosina, el radio hidrodinmico calculado por QELS (quasi elastic light scattering) se
mantuvo constante entre 2-3 semanas, es decir, formaban dispersiones vesiculares muy
estables. A pesar de esto luego de 48 horas de iniciada la reaccin pudo observarse la
presencia de un precipitado blanco, diacilglicerol, constatado por c.c.d.
7.2.4. Cribado de nuevos biocatalizadores
Para obtener nuevas fuentes enzimticas y para independizarse de la enzima

comercial, se efectu un cribado de los 100 microorganismos que componen nuestro
cepario. Ya que estas fosfolipasas, al igual que la PLD, son secretadas al medio, se analiz
la actividad enzimtica extracelular de cada cepa. Se efectu un cribado cualitativo por
c.c.d., en donde se busc la aparicin de 1,2-diacilglicerol a partir de fosfatidilcolina;
aquellas cepas que demostraron capacidad hidroltica frente a este sustrato, fueron
seleccionadas y se determin la actividad de las mismas por un mtodo colorimtrico
indirecto a travs de la medicin de fosfato inorgnico liberado luego de la adicin de una
fosfatasa cida. Los resultados se encuentran resumidos en la Tabla 7.3.
194

________________________________________________________________________________
Tabla 7.3. Datos de actividad de las cepas seleccionadas en el

cribado de actividad de PLC
Cepa
Concentracin
Actividad
de protenas
especfica
(mg ml-1)a
(U.10-2 mg-1)b
Actividad
relativa
Pseudomona stutzeri
0,07
16
25
Aeromonas hidrophila
0,29
11
Aeromonas hidrophila
0,96
Bacillus cereus (C57)
0,47
10
15
Bacillus cereus (C72)
0,05
65
100
Determinado por Bradford. bDeterminado a travs de un ensayo colorimtrico (Seccin

2.2.9.3.2)
Adems se determin la actividad especfica de las protenas provenientes del medio

extracelular de las bacterias ensayadas, demostrando que Bacillus cereus (C72) es la que
mejor desempeo tuvo, frente a las dems cepas cribadas. Sin embargo, este crudo
enzimtico tuvo una actividad especfica de 0,65 U mg-1, es decir, que la productividad del
medio de cultivo es de 36 U l-1; teniendo en cuenta esto y que la PLCBC comercial utilizada
hasta el momento se encuentra purificada y posee una actividad de 200 U mg-1, es necesario
un paso de purificacin o concentracin de la enzima para tener una fuente efectiva de
biocatalizador.
Otra cepa de Bacillus cereus (C57) mostr una actividad menor a pesar de
determinarse una concentracin 10 veces mayor de protenas en el medio extracelular,
denotando diferencias fenotpicas entre estos dos microorganismos de la misma especie.
7.3. Conclusiones
Se concibi una metodologa enzimtica novedosa, que permite obtener compuestos

de alto valor agregado con rendimientos altos. La sntesis de nuclesidos 5-monofosfato de
naturaleza diversa y sin la necesidad de proteccin qumica de ningn tipo, fue posible a
travs de la hidrlisis de sus respectivos fosfatidilnuclesidos sintetizados previamente
(Captulo 5). De las diversas fosfodiesterasas ensayadas slo la fosfolipasa C de Bacillus
cereus fue capaz de catalizar la hidrlisis eficiente de estos derivados; las fosfodiesterasas
provenientes de veneno de diversas serpientes fueron tambin capaces de escindir el enlace
195

________________________________________________________________________________
fosfodister, pero lo realizaban en forma no conveniente para nuestros propsitos y con

bajos rendimientos.
La optimizacin de la reaccin fue realizada evaluando el uso de pulsos
enzimticos, ya que la reaccin llegaba a una meseta. Al no observarse resultados positivos,
se decidi ensayar la reaccin en ausencia del solvente orgnico que actuaba de reservorio
del sustrato, y aprovechar la capacidad de estos compuestos de asociarse en medio acuoso
para formar estructuras complejas supramoleculares, este medio de reaccin demostr ser el
ms satisfactorio, obtenindose rendimientos superiores al 70%.
En la Tabla 7.4 se resumen los resultados finales obtenidos teniendo tambin en
cuenta el primer paso de transfosfatidilacin con la fosfolipasa D. Se puede observar que
los resultados son moderados, pero cabe destacar que no es necesaria ninguna proteccin
del nuclesido, debido a la regioselectividad mostrada por la fosfolipasa D, y slo es
necesario un paso cromatogrfico en la primera etapa de la reaccin global. Otra ventaja es
la de obtener el producto fosforilado disuelto en una fase acuosa de la cual puede ser
precipitado selectivamente, facilitando la purificacin del nucletido.
Tabla 7.4. Rendimientos totales en la preparacin de

nuclesidos 5`-monofosfato (Figura 7.1) incluyendo
ambos pasos enzimticos
Nuclesido
Rend. Reaccin Rend. Reaccin

Nuclesido
PLD (%)a
PLC (%)a
5-monofosfato
Rend. Final
5'-NMP (%)
Adenosina
84
75
29
63
Uridina
66
82
30
54
Citidina
68
72
31
49
Guanosina
52
61
32
32
Uracilarabinsido
97
78
33
76
Inosina
71
73
35
52
Determinado por HPLC
Tambin se efectu un cribado para la obtencin de una fuente enzimtica accesible,

a partir de la evaluacin de la capacidad hidroltica del medio extracelular de 100
microorganismos, permitiendo obtener 5 fuentes enzimticas capaces de catalizar la
hidrlisis de fosfatidilcolina; de las cepas encontradas, la proveniente de Bacillus cereus
demostr una mayor capacidad hidroltica que las dems. A pesar de ello, sera necesaria la
utilizacin de un mtodo de concentracin o purificacin de la enzima ya que la actividad
196

________________________________________________________________________________
del medio de cultivo es baja comparada con la comercial, tambin es factible la

sobreexpresin de la enzima por biologa molecular.
Esta metodologa, adems de novedosa, permite solucionar problemas que se
presentaban con otras estrategias enzimticas: bajos rendimientos debido a la presencia de
un equilibrio sinttico-hidroltico; particularmente las fosforilaciones realizadas con
fosfatasas no especficas poseen este problema debido a la tendencia que tienen estas
enzimas a hidrolizar el enlace fosfoster ms que formarlo. En nuestro caso, al hidrolizar el
derivado fosfoliponuclesido se aprovecha la reaccin natural que presenta la PLC y que
demostr que es aceptora de una amplia variedad de sustratos con alta eficacia.
7.4. Bibliografa
(1)
D'Arrigo, P.; Piergianni, V.; Pedrocchi-Fantoni, G.; Servi, S. Journal of the

Chemical Society, Chemical Communications. 1995, 2505.
(2)
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268, 14109-15.
(3)
Razzell, W. E.; Khorana, H. G. Journal of Biological Chemistry. 1959, 234, 210513.
(4)
Jepson, M.; Titball, R. Microbes and Infection. 2000, 2, 1277-84.
(5)
Hansen, S.; Hansen, L. K.; Hough, E. Journal of Molecular Biology. 1992, 225, 5439.
(6)
Ball, A.; Jones, R. L. Langmuir. 1995, 11, 3542-3548.
(7)
Berti, D.; Luisi, P. L.; Baglioni, P. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and
Engineering Aspects. 2000, 167, 95103.
(8)
Banchelli, M.; Berti, D.; Baglioni, P. Angewandte Chemie (International Ed. in

English). 2007, 46, 3070-3.
(9)
Baglioni, P.; Berti, D. Chemistry of Materials. 2003, 8, 55-61.
(10)
Baldelli Bombelli, F.; Berti, D.; Keiderling, U.; Baglioni, P. Journal of Physical
Chemistry B. 2002, 106, 11613-11621.
(11)
Milani, S.; Baldelli Bombelli, F.; Berti, D.; Dante, S.; Hau, T.; Baglioni, P. Journal
of Physics: Condensed Matter. 2008, 20, 104212.
197

________________________________________________________________________________
(12)
Milani, S.; Bombelli, F. B.; Berti, D.; Hauss, T.; Dante, S.; Baglioni, P. Biophysical
Journal. 2006, 90, 1260-9.
(13)
Ravi, P.; Bg, V.; Berti, D.; Pini, F.; Baglioni, P. Physica B. 2000, 278, 334-336.
(14)
Fan, K.; Ouyang, P.; Wu, X.; Lu, Z. Enzyme and Microbial Technology. 2001, 28, 37.
(15)
Bangham, A.; Dawson, R. Biochimica et Biophysica Acta. 1962, 59, 103-115.
(16)
Otnaess, A. B.; Little, C.; Sletten, K.; Wallin, R.; Johnsen, S.; Flengsrud, R.; Prydz,
H. European Journal of Biochemistry / FEBS. 1977, 79, 459-68.
(17)
Lasic, D. D. Journal of Liposome Research. 1995, 5, 431-441.
(18)
Lasic, D. Journal of Colloid and Interface Science. 1990, 140, 302-304.
(19)
Berti, D.; Baglioni, P.; Bonaccio, S.; Barsacchi-Bo, G.; Luisi, P. L. Journal of
Physical Chemistry B. 1998, 102, 303-308.
198
Captulo 8 Resumen de resultados, conclusiones generales y perpectivas
CAPTULO
8
RESUMEN DE RESULTADOS,
CONCLUSIONES GENERALES Y
PERPECTIVAS
Captulo 8: Resumen de resultados, conclusiones generales y perpectivas

________________________________________________________________________________
200

________________________________________________________________________________
8.1. Resumen de resultados
1- Se logr encontrar una metodologa enzimtica para la obtencin de furanosas

regioselectivamente acetiladas con el hidroxilo 5 libre con rendimientos altos;
entre ellas, metil 2,3-di-O-acetil-,-D-ribofuransido (82%) con una hidrlisis
catalizada por CRL en buffer fosfato pH=7,0 (con acetona como cosolvente,
10% v/v), metil 2,3-di-O-acetil-,-D-arabinofuransido (77%) en una reaccin
hidrlitica catalizada por la misma enzima en un sistema bifsico compuesto de
buffer fosfato pH=7,0 : [BMIM][PF6] (50:50), y metil 2,3-di-O-acetil-,-Dxilofuransido (72%), en una etanlisis catalizada por CAL B (A/S=3; 99,3%
v/v de terbutilmetilter).
2- Se sintetizaron dos compuestos nuevos, con rendimientos moderados, el etil 2,3di-O-acetil-,-D-ribofuransido
isopropil
2,3-di-O-acetil--D-ribo-
furansido, a travs de la alcohlisis de sus derivados peracetilados catalizadas

por CAL B.
3- Se encontraron adems condiciones experimentales que permitieron obtener a
partir de mezclas anomricas de furanosas peracetiladas derivados desprotegidos
regioselectivamente en 5, con una diastereoselectividad del 100%; estos
derivados fueron metil 3-O-acetil-2-desoxi--D-ribofuransido, 1,3-di-O-acetil2-desoxi--D-ribofuranosa y 1,2,3-tri-O-acetil--D-arabinofuranosa. En todos
estos casos, estos productos se obtuvieron mediante alcohlisis catalizadas por
CAL B.
4- Fue posible obtener una fuente enzimtica sustentable de fosfolipasa D, con alta
actividad a partir de un cribado en nuestro cepario; la evaluacin de distintas de
condiciones experimentales permiti obtener derivados lipdicos de nuclesidos
no
informados
fosfatidilfludarabina,
en
bibliografa,
como
la
fosfatidil-2,3-didesoxiuridina
arabinsido, algunos de ellos con buenos rendimientos.

201
fosfatidilguanosina,
y
fosfatidiluracil-

________________________________________________________________________________
5- Se desarroll una nueva metodologa que incluy la utilizacin de dos enzimas

en forma consecutiva, fosfolipasas D y C, que permitieron obtener con buenos
rendimientos compuestos de alto valor agregado como son los nuclesidos 5monofosfato; la sntesis no necesit de pasos de proteccin y desproteccin, y
no se generaron mezclas de productos ya que la primera enzima actu con gran
selectividad por el hidroxilo primario del nuclesido y la segunda posibilit la
escisin selectiva del enlace fosfodister, lo que permiti obtener el nucletido
correspondiente. Adems, ambas enzimas demostraron tener una buena
capacidad para aceptar una amplia variedad de estructuras de nuclesidos.
6- A travs de un cribado en nuestro cepario fue posible encontrar nuevas fuentes

enzimticas de fosfolipasa C, que posibilitaran independizarse de la fuente
comercial.
8.2. Conclusiones generales y perpectivas
Las lipasas demostraron ser verstiles y capaces de efectuar la desproteccin

regioselectiva del hidrxilo primario de pentofuranosas peracetiladas, en general la lipasa B
de Candida antarctica demostr un mejor desempeo en las alcohlisis ensayadas y la
lipasa de Candida rugosa lo hizo en las reacciones de hidrlisis. La utilizacin de
cosolventes orgnicos como aditivos auxiliares fue necesario en algunos casos para
optimizar los rendimientos de las reacciones, tambin demostr ser til el uso de lquidos
inicos, en particular el uso de [BMIM][PF6] en reacciones de hidrlisis; sin embargo esta
metodologa demostr ser dependiente de la furanosa de partida por lo que no puede ser
generalizado su uso a otros compuestos de esta familia.
La evaluacin de las alcohlisis de furansidos peracetilados con distintos
sustituyentes en el hidroxilo anomrico permiti determinar que la aglicona posee una
influencia en la regioselectividad de la reaccin ya que cuando el sustituyente era un
residuo alqulico lineal propilo o butilo, la reaccin careca de regioselectividad. La
configuracin de la furanosa tambin tuvo influencia en este aspecto, ya que las etanlisis
202

________________________________________________________________________________
de los derivados ribofuransicos eran suficientes para obtener el producto regioselectivo

con el hidroxilo 5 libre mientras que con los arabinofuransicos y xilofuransicos fue
necesario explorar condiciones de reaccin que incluan la utilizacin de cosolventes y
lquidos inicos.
Adems, la lipasa B de Candida antarctica demostr una reactividad distintiva por
los anmeros de las furanosas ensayadas, obtenindose en general una estereoselectividad
marcada para el anmero , produciendo nicamente el producto diacetilado deseado y una
desacetilacin subsiguiente para el anmero , con gran cantidad de subproductos. Esta
particularidad permiti obtener perfiles de reaccin diastereoselectivos para el anmero ,
establecindose esta metodologa enzimtica como un mtodo altamente estereoselectivo
para la sntesis de furanosas regioselectivamente acetiladas con el hidroxilo 5 libre y como
una opcin para la separacin de mezclas de anmeros de este tipo.
Estos compuestos regioselectivamente desprotegidos son utilizados como
precursores para la sntesis de nuclesidos, ya sea a travs de la qumica orgnica
tradicional o a travs de tcnicas quimioenzimticas; adems son sntones de otros
compuestos orgnicos que no se relacionan con los utilizados en nuestro laboratorio, como
pueden ser disacridos, surfactantes biodegradables y glicopptidos.
Adems de las lipasas, las fosfolipasas fueron utilizadas para la modificacin
estructural de nuclesidos, como as tambin la utilizacin de dos de ellas (fosfolipasa D y
C) para una reaccin en tndem para la produccin de nucletidos. Estas enzimas tienen un
alto costo comercial, por lo que la posibilidad de contar con fuentes enzimticas
sustentables y econmicas de ambas fue necesaria, y fue posible encontrarlas a travs de un
cribado en nuestro cepario.
La fosfolipasa D cataliz la transferencia de una variedad de nuclesidos a la cabeza
polar de la fosfatidilcolina, produciendo compuestos que pueden ser utilizados como
prodrogas, que dado su carcter anfiflico pueden mejorar su entrada a las clulas diana y
liberar la droga en el citoplasma. Tambin la capacidad de generar agregados complejos,
como liposomas, debido a la estructura particular que tienen estos compuestos, permitira
utilizarlos directamente mediante este tipo de formulaciones.
La fosfolipasa C demostr ser capaz de hidrolizar los derivados lipdicos
sintetizados anteriormente, llevando a la produccin de nucletidos con buenos
203

________________________________________________________________________________
rendimientos en forma selectiva y con una amplia tolerancia estructural hacia el sustrato.
Esta tcnica enzimtica se diferencia de otras que posean limitaciones como pueden ser
bajos rendimientos o alta selectividad por nuclesidos particulares.
Adems, se puede aprovechar la reaccin sinttica de la fosfolipasa C para efectuar
la transferencia de diversos grupos, como pueden ser los pentofuransidos desacetilados
regioselectivamente, a la porcin nucleotdica de los fosfatidilnuclesidos, dando como
resultado productos del tipo alquil-P-nuclesidos, que son utilizados como prodrogas de
nucletidos. En este aspecto nuestro laboratorio sigue trabajando y se encontraron
resultados preliminares alentadores.
204
Apndices
APNDICES
206
Apndice I
Descripcin del cepario de bacterias propiedad del Laboratorio de Biotransformaciones.
CECT: Coleccin Espaola de Cultivos Tipo.
Nmero
catlogo
CECT
Nombre (gnero y especie)
Medio de
cultivo
944
333
839
4221
4225
4226
4223
894
895
896
4235
4238
4356
4117
4067
4328
386
387
4368
131
193
43
47
49
4038
73
69
76
3050
863
401
Acetobacter sp.
Achromobacter cycloclastes
Aeromonas hydrophila
Aeromonas Punctata
Aeromonas Salmonicida
Agrobacterium ferrugineum
Agrobacterium radiobacter
Agrobacterium tumefaciens
Alicyclobacillus acidocaldarius
Arthrobacter oxydans
Bacillus Cereus
Bacillus Cereus
Bacillus Stearothermophilus
Bacillus Thermoglucosidasius
Brevibacterium helvolum
Brevibacterium linens
Brevibacterium linens
Cellulomonas celulans
Citrobacter amalonaticus
Citrobacter Freundii
44
1
2
1
1
1
20
1
1
1
1
1
30
LB
2
129
2
2
1
1
1
1
1
1
96
3
3
3
LB
1
1
207
Medio
alternativo
20
20
169
Temperatura
de
crecimiento
(C)
30
30
30
30
30
30
30
20-24
20
20-26
20
20
26
27
26
55-60
26-30
26-30
26
30
30
55
55
55
55
30
30
30
30
37
37
856
494
45
100
105
433
731
877
0
684
194
960
4214
4502
857
222
225
314
509
578
4312
5015
843
367
4019
362
570
4060
Citrobacter Koseri
Corynebacterium
ammoniagenes
Chromobacterium violaceum
E. Coli
E. Coli
E. Coli
E. Coli
E. Coli
E. Coli
E. Coli BL 21
Enterobacter Aerogenes
Enterobacter Cloacae
Enterobacter gergoviae
Erwinia Amylovora
Erwinia Carotovora
Erwinia Carotovora
Erwinia Chrysanthemi
Flavobacterium Aquatile
Flavobacterium Aquatile
Flavobacterium johnsoniae
Klebsiella planticola
Klebsiella sp
Lactobacillus acetotolerans
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus alimentaris
Lactobacillus animalis
51
Micrococcus luteus
241
4057
Micrococcus luteus
Micrococcus luteus
420
Norcardia
3051
4101
171
Norcardia
Proteus Mirabilis
Proteus Rettgeri
72
208
37
30
LB
1
1
1
1
1
1
LB
1
1
1
1
1
1
2
33
33
33
30
102
2
1
1
8 (pH=5,5)
8
8
8
LB (0,2% p/v,
extracto de
levadura)
LB
LB
1(1% p/v,
maltosa)
56
1
1
37
37
37
37
37
37
37
37
30
30
30
30
30
37
30
26
26
26
18
20-25
25
37
37
30
37
30
37
125
30
30
30
37
30
37
37
865
4557
165
174
4077
324
930
126
159
846
977
868
567
4052
233
3275
3249
3256
3257
3278
3276
3231
3129
3273
3116
3328
3263
3248
3308
3145
3322
3219
3220
3318
3324
3319
3323
95
Proteus Rettgeri
Proteus Rettgeri
Proteus Vulgaris
Proteus vulgaris
Proteus Vulgaris
Pseudomonas Putida
Pseudomonas Stuzeri
Pseudomonas Syringae
Serratia macescens
Serratia macescens
Serratia macescens
Serratia rubidaea
Sthaphilococcus aureus
spaurens
Sthaphilococcus auricularis
Sthaphylococcus capitis
Streptomyces badius
Streptomyces baldaccii
Streptomyces baldaccii
Streptomyces blastmyceticus
Streptomyces cattleya
Streptomyces cetonii
Streptomyces fladiae
Streptomyces flavogriseus
Streptomyces griseostramineus
Streptomyces griseus
Streptomyces halstedii
Streptomyces mobaraensis
Streptomyces netropsis
Streptomyces
phaeochromogenes
Streptomyces sp.
Streptomyces sp.
Thermoactinimyces candidus
Thermoactinimyces putidus
Thermoactinimyces thalpoph
Thermomonospora alba
Thermomonospora curvata
Thermomonospora sp
Xanthomona campestris
209
1
1
1
1
1
2
2
1
1
2
2
1
37
37
37
37
37
26
26
26
26
26
26
26
LB
37
LB
LB
54
54
54
54
54
54
54
54
54
54
54
54
54
118
118
118
118
118
118
118
118
118
118
118
118
118
37
37
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
28
54
118
28
54
54
20
20
56
56
61
56
1
118
118
173
173
59
28
28
50
50
45
37-55
50 (pH=8-10)
50
26
165
4480
549
4643
Xanthomona campestris
Xanthomona fragariae
Xanthomona traslucens
1
33
1
210
26
26
26
Apndice II
Descripcin de los medios de cultivo empleados para el crecimiento de las bacterias de
nuestro cepario
Medio 54: Potato dextrose agar: Papas

cortadas: 300 g; Glucosa: 20 g; Agar:
15 g; Agua destilada: 1litro.
Medio N 1: Agar nutritivo I; LB:

Extracto de carne: 5 g; Peptona: 10 g;
NaCl: 5 g; Agar: 15 g; Agua destilada:
1litro
Medio 56: YEME (Bennets agar) (ISP

mdium 2): Glucosa: 4 g; Extracto de
levadura: 4 g; Extracto de malta: 10 g;
Agar: 15 g; Agua destilada: 1litro.
Medio N 2: Agar Nutritivo II: Extracto

de carne: 1 g; extracto de levadura: 2 g;
Peptona: 5 g; NaCl: 5 g; Agar: 15 g;
Agua destilada: 1litro
Medio 59: Czapek Peptona: Sacarosa: 30

g; KNO3: 2 g; K2HPO4: 1 g;
MgSO4.7H2O: 0,5 g; KCl: 0,5 g;
FeSO4.7H2O: 0,01 g; Extracto de
levadura: 2 g; peptona: 5 g; Agar: 15 g;
Agua destilada: 1litro. pH=7,3
Medio N 3: Agar Corynebacterium:

Peptona de caseina (digestin triptica):
10 g; extracto de levadura: 5 g; glucosa:
5 g; NaCl: 5 g; Agar: 15 g; Agua
destilada: 1 litro. (pH=7,2)
Medio
359)
N8: Mrs.
Broth (Oxoid CM
Medio 61: Oat meal agar (ISP mdium 3)

(Difco 0771).
Medio N 20: Agar triptona Soya

(oxoid CM 131): Triptona: 15 g; peptona
soya: 5 g; NaCl: 5 g; Agar: 15 g; Agua
destilada: 1litro. (pH=7,3)
Medio
30:
(Difco0979)
Marine
agar
Medio 96: Bacillus thermoglucosidasius

medium.
Medio 102: Flavobacterium aquatile
mdium: Caseinato de Sodio: 2 g;
Extracto de levadura: 0,5 g; Proteose
peptone: 1 g; K2HPO4: 0,5 g; agar: 15
g; agua destilada: 1litro. pH=7,4
2216
Medio 33: YDC: Extracto de levadura:

10 g; glucosa: 20 g, CaCO3: 20 g,
Agar: 15 g; Agua destilada: 1litro.
Medio
118: Streptomyces mdium:
Glucosa: 4 g; Extracto de levadura: 4
g; extracto de malta: 10 g; CaCO3: 2 g;
agar: 15 g; agua destilada: 1litro.
Medio 44: Yeast glucosa agar for

Acetobacter: Extracto de levadura: 10g;
glucosa: 100 g, CaCO3: 20 g, Agar: 15
g; Agua destilada: 1litro.
Medio 125: SP medium: Rafinosa: 1 g;

Sacarosa: 1 g; galactosa: 1 g; almidon
211
soluble: 5 g; Casitona: 2,5 g;

MgSO4.7H2O: 0,5 g; KH2PO4: 0,25 g;
agar: 15 g; agua destilada: 1litro.
(modified): Ca(NO3)2.4H2O: 0,5 g;

Na2HPO4.12H2O: 2 g; peptona: 5 g;
sacarosa: 15 g; FeSO4.7H2O: agar: 15 g;
agua destilada: 1litro.
Medio
129:
Alicyclobacillus
acidocaldarius medium: SOLUCION 1:
extracto de levadura: 1 g; (NH4)2SO4:
0,2 g; MgSO4.7H2O: 0,5 g; CaCl2.2H2O:
0,25 g; KH2PO4: 0,6 g; agua destilada:
500 ml. SOLUCION 2: glucosa: 1 g;
agar: 15 g; agua destilada: 500 ml.
(Esterilizar la solucion 1 y 2 por
separado en autoclave a 121 C por 15
minutos, enfriar a 50 C y combinar
ambas soluciones).
Medio
133:
Wakimoto
Medio 165: CYC medium: Czapek Dox

(Oxoid CM 97): 22,4 g; extracto de
levadura: 2 g; cidos casamino (libres de
vitaminas): 6 g; agar: 16 g; agua
destilada: 1 litro.
Medio 173: CYC medium (modifies by
Cross & Attwell, 1973): Czapek Dox
(Oxoid CM 97): 48 g; extracto de
levadura: 2 g; acidos casamino (libres de
vitaminas): 6,1 g; triptofano: 0,02 g;
agua destilada: 1 litro. pH=7,2.
medium
212
Apndice III
Abreviaturas
[BMIM][BF4]
Tetrafluoroborato de 1-butil-3-metilimidazolio
[BMIM][MeSO]
Metanosulfonato de 1-butil-3-metilimidazolio
[BMIM][PF6]
Hexafluorofosfato de 1-butil-3-metilimidazolio
ADN
cido desoxirribonucleico
AG
cidos grasos
AMP
Adenosina 5'-monofosfato
AraC
Citarabina
ARN
cido ribonucleico
ARNm
cido ribonucleico mensajero
CAL A
Lipasa A de Candida antarctica
CAL B
Lipasa B de Candida antarctica
ChOx
Colina oxidasa
CMP
Citidina 5'-monofosfato
CRL
Lipasa de Candida rugosa
DAG
1,2-Diacilglicerol
DC
Dicrosmo circular
DMAP
4-Dimetilaminopiridina
DMSO
Dimetilsulfxido
dNTP
Desoxinuclesidos 5'-trifosfato
ESI
Fuente de ionizacin por electrospray
GMP
Guanosina 5'-monofosfato
GMS
Glutamato monosdico
GTP
Guanosina 5'-trifosfato
HEPES
cido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperacinil] etanosulfnico
HPLC
Cromatografa lquida de alta resolucin
HRMS
Espectro de masa de alta resolucin
IMP
Inosina 5'-monofosfato
IT
Analizador de trampa de iones
LIs
Lquidos inicos
213
LLC
Leucemia linfoltica crnica
NMPs
Nuclesidos 5'-monofosfato
NP
Nuclesido fosforilasa
NSAPs
Fosfatasas cidas no especficas
NTPs
Nuclesidos trifosfatos
PA
cido fosfatdico
PC
Fosfatidilcolina
PECAd
Fosfodiesterasa de Crotalus adamentus
PECAt
Fosfodiesterasa de Crotalus atrox
PLA1
Fosfolipasa A1
PLA2
Fosfolipasa A2
PLC
Fosfolipasa C
PLCBC
Fosfolipasa C de Bacillus cereus
PLCCP
Fosfolipasa C de Clostridium perfringens
PLD
Fosfolipasa D
PLE
Esterasa de hgado porcina
PNP
Purn nuclesido fosforilasa
PPL
Lipasa de pncreas porcino
PPM
Fosfopentomutasa
PyNP
Pirimidn nuclesido fosforilasa
QTOF
Analizador quadrupolo tiempo de vuelo
RMN
Resonancia magntica nuclear
SDS
Dodecilsulfato sdico
TBME
terbutilmetilter
TEOS
Tetretilortosilicato
THEOS
Tetraquis-(2-hidroxietil)-ortosilicato
Tris
Tris-(hidroxietil)-aminometano
UMP
Uridina 5'-monofosfato
VHB
Virus de la hepatitis B
VIH
Virus de inmunodeficiencia humana
VVZ
Virus de la varicela Zoster
214

Lipasas y Fosfolipasas en La Preparación de Nucleósidos Modificados y Sus Precursores

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Universidad Nacional de Quilmes

Lic. Esteban Daro Gudio

El presente trabajo de Tesis Doctoral, para optar por el

Nuclesidos naturales y modificados ...................................................................................... 3

Sntesis de nuclesidos .......................................................................................................... 10

Sntesis de nuclesidos a travs de la formacin del enlace glicosdico ....................... 11

Biocatlisis, biotransformaciones y biocatalizadores ............................................ 12

Ventajas de las biotransformaciones ..................................................................... 12

Desventajas de las biotransformaciones ................................................................ 14

Enzimas aisladas vs clulas enteras....................................................................... 15

Clasificacin de las enzimas.................................................................................. 16

Lipasa B de Candida antarctica (CAL B) ............................................................ 18

Lipasa de Candida rugosa (CRL) ......................................................................... 20

Sntesis biocataltica de nuclesidos ............................................................................. 21

Modificacin de nuclesidos naturales - prodrogas .............................................................. 26

Derivados lipdicos de nuclesidos ............................................................................... 28

Fosfoslipasa D reaccin de transfosfatidilacin ................................................. 29

Derivados fosforilados de nuclesidos .......................................................................... 34

Sntesis de nuclesidos 5-monofosfato ................................................................ 36

Hidrlisis de cidos nucleicos ............................................................................... 36

Fermentacin directa ............................................................................................. 37

Fosforilacin catalizada por nuclesido fosfotransferasa...................................... 38

Fosforilacin catalizada por quinasas.................................................................... 38

Fosfatasas cidas no especficas bacterianas ......................................................... 38

Fosforilacin indirecta utilizando fosfolipasas...................................................... 39

Inmovilizacin de enzimas .................................................................................................... 40

Mtodos de inmovilizacin ........................................................................................... 42

Mtodos por retencin qumica ............................................................................. 42

Mtodos por unin fsica ....................................................................................... 45

Inclusin en membranas ........................................................................................ 46

Efectos de la inmovilizacin ......................................................................................... 46

Efectos en la estabilidad ........................................................................................ 47

Efectos en la actividad enzimtica ........................................................................ 48

Objetivos del presente trabajo ............................................................................................... 50

Captulo 2 Parte experimental ....................................................................................................... 59

Consideraciones generales ............................................................................................ 61

Sntesis de pentofuransidos peracetilados ................................................................... 62

Sntesis de metil D-pentofuransidos peracetilados .............................................. 62

Sntesis de alquil-2,3,5-tri-O-acetil-,-D-ribofuransidos .................................. 66

Sntesis de pentofuranosas peracetiladas ....................................................................... 69

Alcohlisis catalizadas por lipasas ................................................................................ 72

Procedimiento analtico ......................................................................................... 72

Procedimiento preparativo .................................................................................... 72

Hidrlisis catalizada por lipasas .................................................................................... 75

Procedimiento analtico ......................................................................................... 75

Procedimiento preparativo .................................................................................... 75

Procedimiento analtico ......................................................................................... 76

Hidrlisis catalizadas por lipasas con lquido inico como cosolvente......................... 76

Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][BF4] y [BMIM][MeSO] ................. 77

Reacciones de hidrlisis utilizando [BMIM][PF6] ................................................ 77

Reacciones de transfosfatidilacin en medio bifsico catalizadas por la fosfolipasa D 78

Obtencin del crudo enzimtico de fosfolipasa D proveniente de Streptomyces

Reacciones de transfosfatidilacin ........................................................................ 79

Inmovilizacin de la fosfolipasa D................................................................................ 86

Inmovilizacin por adsorcin en Duolite ........................................................... 86

Inmovilizacin en alginato .................................................................................... 87

Inmovilizacin en glioxil-agarosa ......................................................................... 87

Inmovilizacin en poliuretano ............................................................................... 88

Inmovilizacin por tecnologa sol-gel ................................................................... 88

Sntesis del precursor tetraquis-(2-hidroxietil)-ortosilicato (THEOS) .................. 88

2.2.8.5.2. Protocolo de inmovilizacin de PLD y PLD/colina oxidasa en sol-geles dopados

Inmovilizacin en agarosa ..................................................................................... 89

Hidrlisis de fosfatidilnuclesidos ................................................................................ 89