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Diagnstico de Citrus Greening (HLB)

utilizando espectroscopia de
fluorescncia induzida por laser (LIFS)
Dbora M. B. P. Milori1*, Paulino Villas Boas1*, Andr Leonardo Vemncio2,
Marcelo C. B. Cardinali3, Ednaldo J. Ferreira4*, Polyana Kelly Martins5*,
Juliana Freitas-Asta6*, Joana Bresolin4*
1
2

4
5
6

Pesquisador, Embrapa Instrumentao, Rua XV de novembro, 1452, So Carlos, Brasil

Ps-graduando, Faculdade de Filosofia, Cincias e Letras de Ribeiro Preto FCLRP,
Universidade de So Paulo USP, Av. Bandeirantes, 3900, CEP 14040-901, Ribeiro Preto, SP, Brasil
Ps-graduando, Instituto de Fsica de So Carlos IFSC, Universidade de So Paulo USP,
Av. do Trabalhador So Carlense, 400, So Carlos, Brasil
Analista, Embrapa Instrumentao, Rua XV de novembro, 1452, So Carlos, Brasil
Ps-doc, Centro Apta Citros Sylvio Moreira, Cordeirpolis, SP, Brazil
Pesquisador, Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, Rua Embrapa, s/n. Cruz das Almas, BA, Brazil

*e-mail: debora@cnpdia.embrapa.br; paulino@cnpdia.embrapa.br; mcardinalian@gmail.com;

ednaldo@cnpdia.embrapa.br, polyana@centrodecitricultura.br; jfastua@centrodecitricultura.br;
jbresolin@cnpdia.embrapa.br;

Resumo: O Greening ou Huanglongbing (HLB) uma das mais srias doenas que a citricultura
mundial enfrenta. Aps causar muitos estragos na sia e na frica, a doena surgiu no Brasil em
2004 e nos EUA em 2005. Plantas novas infectadas no chegam a produzir e plantas adultas
doentes apresentam queda de frutos e perda de produo. O principal sintoma que leva ao
diagnstico em campo o mosqueado amarelado das folhas, que aparece em mdia cerca de
um ano aps a contaminao, j em um estgio avanado da doena. A transmisso ocorre
atravs do psildeo Diaphorina citri, um pequeno inseto que se alimenta da seiva elaborada. O
controle realizado pelos produtores consiste em inspees visuais frequentes para erradicao de
plantas sintomticas e pulverizaes constantes para o controle do vetor. Entretanto, isso no est
sendo suficiente para a conteno da doena. Nesse contexto, foi avaliado o potencial de uma
metodologia para deteco precoce da doena que permita a confeco de mapas de infestao
no campo. Para tanto, durante oito meses foram cultivadas mudas de laranja inoculadas com
a bactria candidatus Liberibacter Asiaticus (LAs), agente causador da HLB, para avaliao da
precocidade do diagnstico da doena utilizando tcnicas espectroscpicas e de imagens. Como
referncia um conjunto de mudas foi mantido saudvel. Alteraes espectrais foram observadas
com ambas as tcnicas a partir do primeiro ms aps a inoculao, que permitiram a construo
de modelos para diagnstico da doena com uma taxa de acerto superior a 80%.
Palavras-chave: citros, diagnstico precoce, greening, HLB, LIBS.

Citrus Greening (HLB) diagnosis using laser-induced

fluorescence spectroscopy
Abstract: Greening or Huanglongbing (HLB) is one of the most serious citrus diseases that the world
faces. After a lot of damage in Asia and Africa, the disease appeared in Brazil in 2004. Contaminated
seedlings fail to produce and mature plants have fruit drop and yield loss. The main symptom
leading to diagnosis in the field is mottled yellow leaves, appearing on average about one year
after contamination, already in an advanced stage of the disease. Transmission occurs through the
Diaphorina citri psyllid, a tiny insect that feeds on plant sap. The control carried out by the producers
consists in frequent visual inspections for eradication of symptomatic plants and constant spraying

78

| AGRICULTURA DE PRECISO: UM NOVO OLHAR

to control the vector. However, this is not been effective in containing the disease. In this context, this
project aims to propose a new method to carry out early diagnosis of this disease. To this end, during
eight months seedlings were grown and inoculated with the bacterium Candidatus Liberibacter Asiaticus
(LAs) to assess the early diagnosis of the disease using spectroscopy techniques. As a reference set
of seedlings was kept healthy. Spectral changes were observed in leaves from the first month after
inoculation for all the techniques, which allowed the building of models for diagnosis with a success
rate exceeding 80%.
Keywords: citrus, early diagnostic, greening, HLB, LIBS.

1. Introduo
A doena de campo mais preocupante atualmente

Atualmente, o controle da doena no Brasil se

no ramo da citricultura a Citrus Greening

alicera em trs procedimentos: produo de mudas

ou Huanglongbing (HLB). Esta uma doena

saudveis em viveiros telados, inspeo visual e

bacteriana que vem causando perdas enormes

erradicao de plantas sintomticas e controle da

na produo do Brasil e do mundo.

populao do inseto vetor. A principal limitao

O agente causador da doena, a bactria

da inspeo visual a subjetividade na avaliao

denominada CandidatusLiberibacter, se estabelece

das plantas acarretando erros da ordem de 50% no

no floema da planta acarretando sua obstruo

diagnstico. O controle do vetor pode ser efetuado

e consequentemente, distribuio inadequada da

por meio de aplicaes de pesticidas para evitar a

seiva para razes, tronco e folhas (BOV, 2006).

incidncia do mesmo (BOV, 2006). Entretanto, j

Este processo, aps a infeco da planta lento e

foi comprovado que h espcies de insetos resistentes.

ocorre em duas fases distintas: inicialmente temos

Alm disso, este procedimento envolve um impacto

aquela denominada de assintomtica (geralmente

ambiental considervel, como exemplo, levando

entre 3 e 36 meses) e posteriormente a condio

dizimao de insetos polinizadores. A erradicao

sintomtica. A doena afeta as folhas, ramos e

das rvores sintomticas no garante que todas as

frutos da planta. Na fase sintomtica evidenciado

rvores doentes sejam eliminadas, pois estimado

o surgimento de um ramo ou galho que se destaca

que em torno de 75% das rvores doentes, aquelas

pela cor amarela. As folhas apresentam colorao

em fase assintomtica, sejam mantidas nos pomares.

amarela plida, com manchas irregulares ou

Diante do exposto, incontestvel a necessidade

cloroses assimtricas. Por fim as plantas doentes

produzem frutos menores e com capacidade menor
para produo de suco (BOV, 2006).
O vetor natural do patgeno um inseto alado
denominado Diaphorinacitri, comumente encontrado

do desenvolvimento de mtodos analticos para o

diagnstico da citrus greening, desde a incubao
do patgeno, denominada de fase assintomtica at
a fase sintomtica. O monitoramento fundamental
para o controle da doena e assim, evitar a

nos pomares brasileiros (LOPESetal., 2007).

proliferao da bactria nos campos citrcolas,

A planta com a bactria incubada (fase

at que a cura desta doena seja encontrada. Na

assintomtica) tambm se transforma em uma

literatura so demonstrados alguns mtodos

fonte propagadora complementar da doena, j que

utilizando-se ferramentas espectroscpicas

um inseto pode ser contaminado ao se alimentar

(PEREIRAetal., 2010a, 2010b, 2011a, 2011b).

da seiva (BOV, 2006).

Neste trabalho, avaliado o desempenho da

A principal tcnica reconhecida para diagnstico

espectroscopia de fluorescncia induzida por laser

da doena o PCR (INNISetal., 1990). Entretanto,

para o diagnstico de mudas em fase assintomtica.

h uma grande dificuldade na aplicao desta

tcnica em folhas de rvores de campo, pois a
bactria se distribui de forma bastante heterognea

2. Material e mtodos

na planta (LIetal., 2009). Alm disso, o custo da

Para o monitoramento da doena foi elaborado

anlise e a sensibilidade do mtodo inviabilizam

um experimento que teve a durao total de

sua aplicao em larga escala.

8 meses, durante o perodo de 13 de Julho de

FERRAMENTAS PARA AGRICULTURA DE PRECISO |

79

2009 a 01 de Maro de 2010. Foram utilizadas

inoculao da bactria nas plantas em estudo. Os

mudas com as seguintes caractersticas: copa de

ensaios identificaram resultados positivos para

laranja doce Valncia [Citrussinensis(L.)Osbeck]

CLas que aumentaram gradativamente a cada

em porta-enxerto de Citrumelo Swingle

ms aps a inoculao das plantas. Os valores em

[Citrus paradisi Macfad. cv. Duncan X

porcentagem de folhas doentes, nas quais a bactria

Poncirustrifoliata(L.) Raf.]. Deste conjunto de

foi detectada, foram de 4, 20, 22, 70, 66, 67 e 82%

plantas de mesma variedade e idade, 60 mudas foram

para os meses 1, 2, 3, 4, 5, 7 e 8, respectivamente.

submetidas a inoculaes com uma das espcies da

Na Figura1 so mostrados espetros tpicos das

bactria, a Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas),

plantas saudveis e inoculadas aps dois meses

principal causadora da citrus greening no Brasil.

da inoculao. Como as mudas estavam em

Outro conjunto com as mesmas caractersticas e de

fase de crescimento, a variao espectral devido

igual nmero de plantas, porm sem inoculaes

ao crescimento era maior do que a variao

da bactria, foi mantido como amostras controle.

pela doena. Desta forma, foram analisados

Decorrido um ms aps a inoculao, as medidas

os resultados por ms, comparando os grupos

experimentais com a tcnica fluorescncia induzida

saudveis e inoculados. Para cada ms foi

por laser (LIFS) foram efetuadas mensalmente.

construdo um modelo para classificao das

Cada planta foi representada por 3 folhas (amostras)

plantas utilizando redes neurais artificiais (ANN).

que foram coletadas seguindo o procedimento:

O resultado por muda est sintetizado na Tabela 1.

as amostras foram retiradas do terceiro conjunto

de folhas, considerando o sentido de cima para
baixo, tendo como referncia o pice da planta.
Aps a coleta, as amostras foram armazenadas
em sacos plsticos pretos, sob refrigerao na
temperatura de 4C. Cada folha foi limpa com o
auxlio de algodo umedecido em gua deionizada
e a secagem foi efetuada ao ar.
Foram realizadas medidas de LIFS utilizando
um sistema porttil desenvolvido pela Embrapa
Instrumentao. Neste sistema um laser em
561nm (20mW) excita a folha atravs de um cabo
ptico bifurcado que tambm coleta o sinal de
fluorescncia. O sinal enviado a um moncromador
e um conjunto de fotodiodos calibrados que gera
um espectro que pode ser armazenado no software
de controle do sistema.
As mesmas folhas que foram submetidas s medidas
analticas com LIFS tambm foram utilizadas
nos ensaios de RT-qPCR. As partes das folhas
utilizadas para extrao do DNA da bactria CLas

Tabela 1. Taxas de acerto obtidas pelas ANNs para os

dados de LIFS de cada um dos 28 lotes de amostras
do experimento de diagnstico precoce. A tabela
contm ainda o valor mdio e o desvio padro para
cada ms. Os laudos foram emitidos por planta.

foram a nervura central e o pednculo. Todo o

Ms

Mdia

Desvio padro

procedimento, desde a extrao do DNA da bactria

47%

13,%

ao diagnstico, foi efetuado no Centro Apta Citros

60%

10%

Sylvio Moreira situado em Cordeirpolis/SP.

63%

9%

63%

5%

65%

8%

3. Resultados e discusso

A importncia dos testes efetuados pelo RT-qPCR

72,6%

8%

80,1%

11%

foi verificar a eficincia do procedimento de

80

Figura 1. Espectro tpico de LIFS para folhas retiradas

de plantas sadias e plantas inoculadas dois meses
aps a inoculao.

| AGRICULTURA DE PRECISO: UM NOVO OLHAR

No sexto ms do experimento no foram realizadas

Referncias

medidas em funo de problemas com o transporte

BOV, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging,

das amostras.

century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology,

O desempenho do mtodo aqui utilizado para

v.88, n.1, p.7-37,2006.

diagnstico de plantas assintomticas possui

INNIS, M. A.; GELFAND, D. H.; SNINSKY, J. J.; WHITE, T. J.

eficincia comparvel das inspees visuais

(Eds.). PCR Protocols: A guide to methods and applications.

comumente adotadas nas fazendas para diagnstico

San Diego: Academic Press,1990.482 p.

de plantas j sintomticas. Alm disso, os resultados

LI, W.; LEVY, L.; HARTUNG, J. S. Quantitative distribution

obtidos na fase sintomtica da doena so

of Candidatus Liberibacter asiaticus in citrus plants with

superiores aos da inspeo visual. Desta forma,

citrus huanglongbing. Phytopathology, v. 99, n. 2, p. 139-

o experimento realizado aponta para um grande

potencial da tcnica para realizao de diagnstico
em fase assintomtica da doena.

144,

2009.

PMid:19159305.

http://dx.doi.org/10.1094/

PHYTO-99-2-0139
LOPES, S. A.; FRARE, G. F.; YAMAMOTO, P. T.; AYRES,
A. J.; BARBOSA, J. C., Ineffectiveness of pruning to control
citrus huanglongbing caused by Candidatus Liberibacter

4. Concluses
A distino global mdia esteve em torno de 60%
j no segundo ms. Esse resultado tem grande
importncia, j que se trata de plantas inteiramente

americanus. European Journal of Plant Pathology, v. 119,

n.4, p.463-468,2007. http://dx.doi.org/10.1007/s10658-0079173-1
PEREIRA, F. M. V.; MILORI, D. M. B. P. Investigation of the
stages of citrus greening disease using micro synchrotron

assintomticas e recm-contaminadas. Portanto,

radiation X-ray fluorescence in association with chemometric

as diferenas espectrais comearam a manifestar

tools. Journal Of Analytical Atomic Spectrometry, v. 25,

quatro meses antes do aparecimento dos sintomas

n.3, p.351-355,2010. http://dx.doi.org/10.1039/b920980h

da doena, visveis apenas a partir do sexto ms, e

PEREIRA, F. M. V.; MILORI, D. M. B. P.; VENNCIO, A.

mesmo assim apenas em um nmero reduzido de

L.; RUSSO, M. S. T.; MARTINS, P. K.; FREITAS-STUA, J.

plantas. Esse resultado indica que o diagnstico

pode ser feito desde o incio do desenvolvimento
da doena, e com preciso muito superior ao que
vem sendo obtido pelo mtodo de controle por
inspeo visual em fase sintomtica.

Evaluation of the effects of Candidatus Liberibacter asiaticus

on inoculated citrus plants using laser-induced breakdown
spectroscopy (LIBS) and chemometrics tools. Talanta, v.83,
p.351-356,2010. PMid:21111145. http://dx.doi.org/10.1016/j.
talanta.2010.09.021
PEREIRA, F. M. V.; MILORI, D. M. B. P.; PEREIRA-FILHO,
E. R.; VENNCIO, A. L.; RUSSO, M. S. T.; MARTINS, P.
K.; FREITAS-ASTA, J. Fluorescence images combined to

Agradecimentos
Agradecemos Fundao de Amparo Pesquisa
do Estado de So Paulo (FAPESP) e ao Conselho
Nacional de Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico (CNPq) pelo apoio financeiro; e o
Grupo Fischer - Diviso Citrosuco e ao Centro
AptaCitros Sylvio Moreira pelo apoio na execuo
do projeto.

statistic test for fingerprinting of citrus plants after bacterial

infection. Analytical Methods, v. 3, n. 3, p. 552-556, 2011a.
http://dx.doi.org/10.1039/C0AY00538J
PEREIRA, F. M. V.; MILORI, D. M. B. P.; PEREIRA-FILHO,
E. R.; VENNCIO, A. L.; RUSSO, M. S. T.; CARDINALI,
M. B.; MARTINS, P. K.; FREITAS-ASTA, J. Laser-induced
fluorescence imaging method to monitor citrus greening
disease. Computers and Electronics in Agriculture, v. 79,
n.1, p.90-93, 2011b.

FERRAMENTAS PARA AGRICULTURA DE PRECISO |

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