Exerccios de Imunologia - P4

1. Em que se baseiam os ensaios de aglutinao direta e indireta? E os de

precipitao?
A reao de aglutinao caracteriza-se pela formao de agregados visveis como
resultado da interao de anticorpos especficos e partculas insolveis que contm
determinantes antignicos em sua superfcie. A aglutinao pode ocorrer tanto com
partculas que apresentam determinantes antignicos naturais em sua superfcie
(hemcia, bactrias, protozorios...) como com partculas inertes (partculas de ltex,
poliestireno, bentonita...), ou mesmo com clulas antigenicamente nao relacionadas
(hemcia, bactrias) s quais se absorvem ou se fixam antgenos solveis: no primeiro
caso, a reao dita aglutinao direta E no segundo, aglutinao indireta ou passiva.
Na precipitao quantidades de Ag solveis so adicionados a uma quantidade fixa de
soro contendo o Ac. Ocorre uma interao entre Ag - Ac que se ligam equimolarmente,
formando uma rede estvel que pode desenvolver um precipitado visvel. Na curva de
precipitao, com o excesso de Ac ocorre reduo de imunocomplexo, pois todo o Ag est
precipitado e fica Ac livre no sobrenadante. No excesso de Ag, os complexos podem ser
dissolvidos, pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados, diminuindo a
formao de complexos insolveis.
2. Descreva as etapas do ensaio de imunofluorescncia direta e imunofluorescncia
indireta.
O teste de imunofluorescncia direta empregado na pesquisa e localizao de
antgenos em clulas ou tecidos por intermdio de um anticorpo especfico marcado com
fluorocromo conjugado. O conjugado se fixa ao antgeno, formando um imunocomplexo
estvel. O anticorpo no ligado removido por lavagens e o preparado observado em
um microscpio de fluorescncia. Esse teste apresenta elevada sensibilidade e
especificidade.
O teste de imunofluorescncia indireto tem sido empregado para amplificar o sinal e
aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antgenos e anticorpo. A
pesquisa de antgeno consiste em incubao da clula ou tecido em que se quer
pesquisar o tecido com antgenos especfico obtido em animal especfico ou monoclonal,
levando a formao de imunocomplexo, aps a lavagem, a preparao incubada com
conjugado de antiimunoglobulina produzida em outras espcie de animal.
J a pesquisa de anticorpos, o soro do paciente diludo, colocado sobre o antgeno e
incubada para permitir a formao do complexo antgeno anticorpo. Aps lavagens, a
preparao incubada com conjugado fluorescente, e se houver anticorpo no soro, o
conjugado reage com o anticorpo especfico para o antgeno. Utilizando-se diluies

seriadas do soro possvel determinar o ttulo de anticorpos , que ser a mxima diluio
em que se observa fluorescncia.
3. Qual o fundamento do sistema avidina-biotina? Com que funo utilizado?
O sistema avidina-biotina uma tcnica de amplificao. A avidina pode ser saturada com
molculas de fluorescncia sem perder a sua capacidade de ligao a biotina, fornecendo
um conjugado cuja a fluorescncia especfica bem intensa. A biotina pode ser ligada
covalentemente a um anticorpo e, em uma segunda etapa, reagir com a avidina
conjugada a um fluorocromo. Aps a reao do antgeno com o anticorpo no marcado, a
biotina, marcada com um segundo anticorpo, adicionada com muitas molculas de
biotina que podem se ligar a um anticorpo, a adio da avidina marcada resulta em uma
amplificao da fluorescncia.
4. Descreva as etapas dos mtodos: ELISA indireto para pesquisa de IgG, ELISA
indireto para pesquisa de IgM, ELISA de captura de IgM, avidez de IgG e ELISA de
competio.
Mtodo indireto: nesse mtodo a placa sensibilizada com antgeno, que aps bloqueio,
reage com os anticorpos da amostra. O conjugado antiimunoglobulina humana reage com
o anticorpo capturado pelo antgeno e a reao revelada com a soluo cromgena. A
reao interrompida, e a intensidade da cor estimada.
Para a pesquisa de IgG, o antgeno anti IgG fixado na placa e o anticorpo IgG procurado
na amostra do paciente. J para a pesquisa de IgM, o antgeno anti IgM fixado na placa
e o anticorpo procurado no soro.
Teste de captura para IgM: em cavidades de placas recobertas por anticorpo anti IgM,
incubam-se os soros. Uma amostra de IgM capturada na cavidade. Segue-se nova
incubao com antgeno marcado com enzima, que ir se fixar na eventualidade de existir,
em meio s IgM, aquelas especfico para o antgeno. Nos testes positivos obtm-se
desenvolvimento de cor.
Teste de avidez para IgG: mede-se por um teste de ELISA modificado, pela dissociao
dos complexos antgeno-anticorpo IgG de baixa avidez, por meio de uma soluo
caotrpica (ex: uria 6M). Aps a incubao do soro na placa, est lavada com a
soluo de uria e, em seguida, prossegue-se a reao pela incubao com o conjugado
enzimtico. O resultado expresso pela porcentagem de IgG remanescente.
Competio: nessa tcnica, o antgeno ligado a placa e a ligao do anticorpo marcado
, competitivamente, inibida pela adio de antgeno-padro ou da amostra. Ou vice-versa
no caso de ELISA direto.
5. Explique as possveis interferncias que podem ocorrer nos resultados dos
mtodos indiretos para pesquisa de IgM. Como evit-las?
Os possveis interferentes so:

A alta concentrao de IgG; uma vez que o IgG por conta da alta concentrao vai se ligar
com maior facilidade a placa no lugar do IgM, logo, com a lavagem, o IgM presente vai ser
retirado e com isso o marcador anti-IgM no vai se ligar a esse IgG, indicando que no h
presena de IgM, culminando em falso negativo.
A presena de fator reumatoide com excesso de IgG vai indicar falso positivo uma vez que
o FR um anticorpo IgM contra IgG, assim, quando no teste anticorpo IgG, presentes no
soro fixam-se aos antgenos da placa, o FR por sua vez fixa aos IgG e ir reagir com o
conjugado anti-IgM, gerando um falso positivo.
Para evit-las, a melhor soluo remover previamente a IgG do soro, por precipitao
com um soro anti-IgG, alm do mtodo de capturar por meio de anti-IgM.
6. Descreva os conceitos dos parmetros intrnsecos: especificidade, sensibilidade,
VPP, VPN. D exemplo de utilizao prioritria de testes com maior especificidade
exemplo de utilizao prioritria de testes com maior sensibilidade.
Especificidade: definida pela porcentagem de resultados negativos pelo teste nos
indivduos no doentes, ou seja, a proporo dos resultados verdadeiros negativos. A
especificidade do teste pode ser influncias por inmeros fatores que levam a falsos
resultados positivos, como:
- anticorpos(IgM): resultados positivos. Os testes de hemoaglutinaao
- poliinfecco por parasitas: reao cruzada de anticorpos
- condutas laboratoriais
Sensibilidade: refere-se porcentagem de resultados positivos pelo teste na populao de
doentes, ou seja, a proporo de resultados verdadeiros positivos.
VPP: valor preditivo de um resultado positivo -> pode ser calculado pela proporo de
resultados positivos obtidos no teste em estudo. Probabilidade de doena quando o
resultado do teste positivo.
VPN: valor preditivo em um resultado negativo: pode ser calculado pela proporo de
indivduos no doentes entre os resultados negativos -> probabilidade de no ocorrncia
de doena quando o resultado do teste negativo.

7. Realizar clculos dados em sala de aula relacionados aos parametros de

validao dos testes sorolgicos

8. Descreva as principais diferenas entre as hepatites virais quanto a transmisso

tempo de durao da infeco.
Hepatite A: a transmisso ocorre pela via fecal-oral; o contagio pode ocorrer no s por
contato entre pessoas, mas tambm por meio de gua ou alimentos contaminados.
O perodo de incubao ao redor de quatro semanas e a infeco no evolui para a
cronicidade nem para o estado de portador assintomtico, sendo que a fase aguda dur 4
semanas.
Hepatite B: a transmisso ocorre principalmente por via sangunea, por meio de relaes
sexuais e da me para o filho (transmisso vertical), uso de agulhas e seringas
contaminadas, acidentes em laboratrio. A doena em geral aguda, mas cerca de 5-7%
dos pacientes evolui para forma crnica e 1% desenvolve hepatite fulminante.
Hepatite C: transmisso via parenteral, por meio de transfuso de sangue e
hemocomponentes; a transmisso por via sexual ocorre mais pouco frequente. Evolui

em mais de 50% dos casos, para formas

crnicas sem que se estabelecerem os
agentes etimolgicos envolvidos.
Hepatite D: transmisso via parenteral,
contato sexual, transmisso vertical rara. A
evoluo da doena semelhante aos
quadros observados em VHB e a

cronicidade chega a 95,5% dos casos.

Hepatite E: transmisso por via fecaloral, formas crnicas no identificadas
(somente fase aguda).
9. Descreva o significado clnico dos
marcadores de diagnstico da
hepatite B C e D.

10. O que co-infeco e o que superinfeco por HBV e HDV? Como detect-las?
Co-infeco significa a infeco simultnea pelos sorotipos B e D, uma vez que o HDV
necessita do envelope viral do VHB para sua estabilidade e expresso, s patolgico
por uma co-infeco com HBV. Superinfeco infeco com HDV quando o indivduo
est numa infeco crnica de hepatite B.m
Co-infeco:
+/- 1 ms aparece AgHBs e a partir de 5 surge anti-HBs
+/- 2 meses surge IgM anti-VHD e cai em 5 meses
A partir de 3 meses: IgG anti VHD
Superinfeco:
J possui AgHBs = crnico
Surge IgM anti VHD e IgG anti VHD

Por meio de ELISA, procura-se IgG e IgM anti-VHD;

HBsAg e anti-IgM (crnico)

11. Quais so os marcadores de HIV?

Antgeno p24, p31; antgeno gp41, gp120/ gp 160
O CDC recomenda que pelo menos uma das duas, p24 ou gp 120/160 seja identificada.
Ensaio de 1 gerao: pesquisa simultnea de antgeno e anticorpo
1 situao

2 situao

3 situao

Presena do Ag p24

Presena do Ac anti HIV

Ausncia de Ag p24 e Ac anti HIV

Positivo

Positivo

Negativo

12. Quais so os mecanismos de depleo dos linfcitos TCD4 na infeco pelo

HIV?
O HIV causa a AIDS, que destroem as clulas TCD4+. Isso enfraquece o SI. As clulas T
so essenciais a RI e sem elas, o corpo no pode combater as infeces. Os mecanismos
de depleo das clulas TCD4+ pelo HIV so:
- Apoptose induzida por protenas virais
- Lise direta ou fuso da membrana plasmtica da clula TCD4
- Eliminao por TCD8, por citotoxidade
Temos ento a lixe celular induzida por HIV e morte da clula infectada por conta das
clulas T citotxicas CD8+, e a apoptose tambm pode ser um fator de depleo. E com
as consequncias da ativao imune generalizada, junto com a perda gradual da
capacidade do SI gerar novas clulas T, resultam no declnio do nmero de clulas TCD4.
13. Apresente resumidamente como realizado o diagnstico laboratorial do HIV.
As tcnicas so a determinao sorolgico de anticorpos circulantes e deteco e
quantificao de antgenos virais (Ag P24); isolamento do vrus, deteco e quantificao
de genomas, cDNA ou RNA.
Os testes sorolgicos mais comuns so os imunoenzimaticos como ELISA e ELFA, Estes
testes, que pesquisam anticorpos circulantes (anti-HIV), ultilizam antigenos, Adsorvidos
em fase slida que podem ser de origem sinttica, peptdeos sintticos (geralmente gp41.
e p24 para o HIV1 e gp36 para o HIV2) ou o prprio vrus inativado.
O mtodo de ELFA apresenta uma verso para deteco simultnea de anti-HIV e Agp24.
A opo mais utilizada, atualmente, so os testes Imunoenzimaticos que detectam
simultaneamente anticorpos com HIV1 e HIV2. Os mtodos de western blot so

amplamente utilizados como teste confirmatrio dos resultados obtidos em teste

imunoenzimaticos. Para acompanhamento da infeco faz-se PCR, tem sido amplamente
utilizados para a deteco e quantificao do cDNA HIV1 e RNA HIV1, respectivamente, a
partir de sangue total, soro ou plasma.
14. Descreva as vantagens dos ensaios de 4 gerao.
Teste de 4 gerao ocorre a diminuio da janela imunolgica. Neste caso possvel
identificar ambas possveis fases em que o paciente encontra-se. Coloca-se na placa,
antgeno e anticorpo. Assim caso a paciente possui apenas antgeno, estando na fase
inicial da doena ou se ele j soroconverteu e possui anticorpos, ambos torna-se possvel
a identificao pelos testes de 4 gerao. Torna-se ento um teste mais utilizado.