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HEBRAS
ANTIPARALELAS
18-10-2012
INTERACCIONES NONO-COVALENTES
Hidroflicas
fosfato y azcar
afuera
Hidrofbicas
las bases nitrogenadas
aromticas
adentro
Fuerzas de apilamiento
entre anillos aromticos
de las bases
2,0 nm
Puentes de hidrgeno
entre las bases
G C (tres)
A=T (dos)
Entre OHs del azcar
y el agua
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- la secuencia
- temperatura
ds (doble hebra)
- concentracin de
sal en el medio
ss (hebra simple)
Las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos absorben a 260 nm, siendo
adenina la que ms absorbe a esa longitud de onda y citosina la que absorbe
menos.
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DNA desnaturado
DNA nativo
Corrimiento hipercrmico
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Efecto de la secuencia
Dado que el par GC tiene 3 enlaces puente hidrogeno y el par AT solo tiene 2, es
ms fcil o requiere menos energa desnaturar un DNA o hbrido rico en AT que
uno rico en GCs.
1. (A+T) x 2
Ej:
+ (G+C) x 4
Tm (C)
5'-CTCTGCTTCGTCCAGCCACTT-3'
(9 x 2) + (12 x 4) = 18 + 48 = 66
Tm = 66C
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Partidor Heterlogo
No 100%
complementario
Partidor Homlogo
100% complementario
DNA templado
3
5
5
3
3
5
Oligonucletido o partidor
5
3
missmatch
o mal apareamiento
PCR
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Producto (amplicn)
DNA doble
hebra
Separar
hebras
T
+ DNA polimerasa
Hibridar
partidores
Sntesis de
DNA
elongacin
Mg2+
Etapa 1
Etapa 2
Etapa 3
Primer ciclo
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Etapas de un ciclo
Etapa 1: Desnaturacin de la doble hebra (separacin)
94 -95 C
30 a 60 s
30 - 60 s
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St
15
20
25
30
Ciclos de amplificacin
Porqu?
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convencional
Tiempo real
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Curvas de magnesio
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Determinacin de la temperatura de
apareamiento de los partidores
La Tm de los partidores y por lo tanto la temperatura de
apareamiento de stos depende de:
la longitud de los partidores
el % G-C
la secuencia de stos
la concentracin salina en el medio
La
Taq
ADN
concentraciones
polimerasa
de
iones
es
sensible
magnesio
a
y
las
iones
monovalentes.
La
concentracin
de
Mg+2
depender
de
la
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necesariamente
coincide
con
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