Cultivo de virus

Deteccin de clulas infectadas por virus

Diagnostico viral en el laboratorio

Mtodos de cultivo viral (aislamiento)

Virus

CLULAS

Animales de
laboratorio

Huevos
embrionados

Lneas celulares

Cultivos primarios
Cultivos secundarios
Cultivos continuos o lneas celulares

Huevos embrionados

Embrin de pollo
Edad: 5-14 das despus de su fertilizacin.
Vas de inoculacin:

membrana corioalantoidea.
cavidad amnitica
saco vitelino
cavidad alantoidea

Crecimiento viral en embrin de pollo

virus

Vas de inoculacin

signos

Herpes simplex

Saco vitelino

muerte

Herpes simplex
poxvirus

Membrana
corioalantoidea

pstulas

Influenza
Newcastle
Aviadenovirus

Cavidad alantoidea

Hemaglutinacin
Muerte
Muerte

Influenza

Cavidad amnitica

Hemaglutinacin

Animales de laboratorio

Tcnica poco empleada; solo los que no puedan replicarse en

embriones de pollo o cultivos celulares

TIPOS DE ANIMALES: monos, cobayos, ratones lactantes y conejos.

ACTUALMENTE SE UTILIZAN EN:

* Estudios de mecanismos de patogenicidad , investigaciones
epidemiolgicas y respuesta inmune
* Produccin de Ac en grandes cantidades: vacunas
(especialmente conejos)
* Para probar agentes antivirales

Cultivos celulares
Son poblaciones celulares homogneas, que pueden ser incluso
mantenidas y multiplicadas in vitro.

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u rganos

tomados directamente del organismo.
Cultivos secundarios: se obtienen a partir de subcultivos, solo crecen
unos cuantos pases. Se les llaman clulas diploides (estas crecen hasta
50 pases)

Cultivos continuos o Lneas celulares

Son de origen tumoral o derivados de clulas diploides x Tx con
sustancias carcinognicas
Duran un tiempo prolongado o indefinido
Algunas lneas celulares:
Clulas HeLa

Clulas humanas, obtenida de Henrietta Lacks,

(falleci de cncer de tero) a partir del cual se
obtuvieron estas clulas: clulas HeLa

Lneas celulares
Lneas celulares de Primates (rin mono verde africano): lneas Vero
Lneas celulares de tumor de rata: GH3 y PC12
Lneas celulares de ratn: MC3T3
Lneas celulares de plantas: Nicotiana tabaccum BY-2
Lneas celulares de otras especies: clulas de pez cebra ZF4 y AB9

ST: clulas de testculos de cerdo

RK 13: clulas de rin de conejo
PK-15: clulas de rin de cerdo

El tipo de lnea celular depende del virus que se quiera aislar

Deteccin de clulas infectadas por virus en

LINEAS CELULARES

EFECTO CITOPTICO (ECP)

Son los cambios morfolgicos, bioqumicos
moleculares, y de viabilidad celular, visibles
a microscopia ptica, causados durante el
ciclo de replicacin viral.

Sin Infeccin

Monocapa de Clulas C6/36

Infectadas con Dengue 2
(RIO)

(Destruccin de monocapa)

Lneas celulares Vero

no inoculada

ECP caracterstico de adenovirus

Cambios observados en las monocapas

Monocapa normal

Monocapas infectadas
Lisis
Corpsculos de inclusin
Presencia de antgeno

El cultivo masivo de lneas celulares animales es

fundamental para:
q La manufactura de vacunas virales
q Productos biotecnolgicos
Ac monoclonales, interleucinas, linfocinas,
agentes anticancergenos.
(mediante tecnologa del ADN recombinante)

Cultivo de virus
Cultivo de virus que infectan humanos y/o animales:
Animales de experimentacin
Embriones de pollo
Lneas celulares
Cultivo de bacterifagos: cultivos puros" en medios lq. o semislidos
Cultivo de algas y hongos
Cultivo de virus vegetales: planta o protoplasto
Cultivo en insectos

Cultivo de bacterifagos

-Se mezcla, la clula husped, con el

bacterifago en agar nutritivo.
- Despus de varios ciclos de
multiplicacin ltica, los virus destruyen
las bacterias.
El rea de lisis es llaman calvas
-Se reportan unidades formadoras de
placas (UFP)

Cultivo de bacterifagos
q Ensayo

en placa.

Placa mostrando las calvas

producidas por un
bacteriofago (1-2mm).

Mtodos

directos

detectan

1.
2.
3.
4.

Al virus como agente infeccioso: cultivo celular

La presencia de antgenos virales (pruebas
inmunolgicas)
La presencia de cidos nucleicos virales (PCR)
El virus como partcula viral (microscopio electrnico)

Tcnica que utiliza Ac unidos a una sustancia fluorescente para

demostrar la presencia de una determinada molcula (partcula viral).
Compuesto fluorescente:
Isotiocianato de fluorescena
Se expone la muestra as tratada a una fuente de
luz de onda corta ( UV o azul). Esta luz genera un
fenmeno de fluorescencia en la molcula
marcadora que a su vez emite luz a una longitud
de onda mas larga (verde, amarillo o naranja).
Esta luz emitida puede ser cuantificada
En preparados histolgicos, se puede observar con
microscopio de fluorescencia.

Es una tcnica de inmunoensayo, en la cual un antgeno inmovilizado se

detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar
un producto detectable como cambio de color.

O inmunoblot, se usa para detectar protenas especficas en una muestra

determinada (una mezcla compleja )
Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio
que se desee: peso molecular, estructura, punto isoelctrico, carga elctrica, etc.
Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa
o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos
contra ella.
Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica,
fluorescencia entre otros mtodos.
De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y
analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas.

 Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de

nitrocelulosa.
Posteriormente se aaden anticuerpos anti-inmunoglobulina
humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y,
por ltimo, se agrega el substrato enzimtico para la
visualizacin de las bandas reactivas con un producto final
coloreado.
La tcnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero ms
especfica que esta.

TEST DE AGLUTINACIN
Mtodo simple, para la deteccin de antgenos virales en muestras clnicas.
Tcnica rpida y barata
Se usa partculas de ltex
Antgeno de Rotavirus en heces (el ms importante) mostrando una buena
sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Tambin
Adenovirus.

Test inmunocromatogrfico
para rotavirus y adenovirus

PCR, PCR tiempo real, sondas de cidos nucleicos

Virus H5N1

rotavirus

Mtodos

indirectos

La envoltura viral contiene dos glicoprotenas: ej: virus de la gripe

1) la hemaglutinina (HA) y
2) la neuraminidasa (NA).
La protena HA es la protena de unin al receptor celular, favorece la fusin
de la envoltura del virus con la membrana celular, importante para la
penetracin del virus a la clula blanco.
hematoaglutinina : debido a la capacidad de estas protenas de provocar
aglutinacin de los hemates.

Hemoaglutinacin
Es uno de los mtodos indirectos ms comunes para cuantificar
partculas virales y/o antgenos virales hemoaglutinantes en
suspensin.

Eritrocitos de pollo

Vacuna del Virus de Newcastle

Observe hemaglutinacin cuando los eritrocitos en los pozos control han

formado botones compactos.
Una unidad de hemaglutinacin (UHA) es la ms alta dilucin de la
suspensin viral que an de una aglutinacin completa.

Virus hemaglutinates
Familia

Gnero o especie

Eritrocitos

Adenoviridae
Poxviridae
Parvoviridae

La mayora de las especies

Ortopoxvirus
La mayora de las especies

Togaviridae
Flaviviridae
Orthomyxoviridae
Paramyxoviridae

Alfavirus
Flavivirus
Influenza A
Parainfluenza
Enfermedad de Newcastle
Varias especies
Varias especies
Rabia
Reovirus
Rotavirus

Mono y/o rata, 37C

Pollo, 37C
Cobayo, hmster, cerdo, humano,
mono, 4C.
Ganso, paloma, pollito; pH y
temperaturas crticos.
Pollito, humano, cobayo, 4C.
Pollito, humano, cobayo, 4C.

Coronaviridae
Bunyaviridae
Rhabdoviridae
Reoviridae

Rata, ratn, pollito.

Ganso; pH crtico.
Ganso, 4C.
Humano

CUADRO CLNICO

Cuadro clnico
Cultivos celulares
Tcnicas inmunolgicas
Aglutinacin en latex
Inmunoflurescencia
ELISA, RIA
Western Blot
Mtodos moleculares
PCR, PCR tiempo real

Microscopio electrnico