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CATALYSE ENZYMATIQUE

EFFETS DE pH
La plupart des enzymes sont actifs dans une gamme de pH restreinte,
typiquement entre pH 5 9. Le pH influence l'activit d'un enzyme plusieurs
niveaux :
1) par la liaison du substrat l'enzyme
2) de l'activit catalytique
3) de l'ionisation de substrat
4) de la stabilit structurale
La vitesse initiale de beaucoup d'enzymes dmontre en fonction de pH un
profil ressemblant une cloche.
- exemple : la cintique daldolase de muscle de lapin

Vmax (units/mg)

18
16
14
12
10
8
6
6

10

pH

Ces courbes refltent l'ionisation d'un certain nombre de groupements


dacides amins au site actif de l'enzyme et suggrent que certains tats d'ionisation
sont essentiels pour l'expression de l'activit catalytique. Le modle suivant est
capable d'expliquer une telle dpendance d'activit sur le pH.
E-

ES-

KE2

KES2
EH + S

k-1

KE1
EH2+

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k1

k2
ESH

E + P

KES1
ESH2+

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Dans ce modle simple, seulement EH et ESH possde de la comptence


catalytique. Implicite dans ce modle, il est assum que l'change des protons se fait
sur le rgime de l'quilibre rapide. Ceci est raisonnable vu que la constante de
deuxime ordre pour l'change d'un proton est rapide 109 M-1.s-1. L'change rapide
parmi les populations fait en sorte que les espces EH et ESH sont rduites par des
facteurs, f1 et f2, dpendant de leur constante d'ionisation ou pKa. Les facteurs f1 et f2
ont la forme suivante :
f 1=

[ H+ ]
K E1

;
+ 1 + K E2
[ H+ ]

f 2=

[ H+ ]
K ES1

+ 1 + K ES2
[ H+ ]

L'quation de Michaelis-Menten pour ce schma possde la mme forme


suivante :

vi =

V MAX , app [S ]
K M, app + [S ]

o VMAX,app et KM,app sont des constantes michaeliennes apparentes et


rfrent seulement aux formes actives de l'enzyme. Cette relation ressemble celle
obtenue de linhibition mixte vu que les constantes sont dfinis par
VMAX,app = VMAX / f2 et KM,app = KM (f1/f2).
L'analyse de la relation log VMAX,app vs pH fournie les valeurs de KES1 et KES2
correspondantes ltat li - tandis que la relation de log (VMAX,app / KM,app) vs pH
informe sur les valeurs de KE1 et KE2, celles de lenzyme et substrat libre. Ceci
implique la dtermination des paramtres VMAX,app et KM,app des pH diffrents.
Les pKa (log KEi ou log KESi) dtermins laide des logiciels donnent des
indices importants sur l'identit des acides amins au site actif.
Par exemple, pKa 4 suggre un rsidu Asp ou Glu essentiel pour l'activit de
l'enzyme. Des valeurs pKa 6 ou 10 suggre des rsidus His ou Lys,
respectivement. Cependant un groupement carboxylate d'un rsidu Asp en pont
salin (interaction lectrostatique) avec un groupement Lys est stabilis par la charge
positive de Lys et possde un pK plus bas (plus difficile protoner).
H

N
H
Lys

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C
H

pKa

O
Asp

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Inversement un groupement amin dans une rgion peu polaire est moins
basique que dans une rgion polaire. Dans ce cas, il sagit du fait quun rsidu charg
est toujours plus difficile stabiliser dans une rgion hydrophobe que sa forme
neutre correspondante.

NH3

NH2

Micro-environnement
hydrophobique
pKa

Donc il faut tre prudent dans l'identification des groupements essentiels pour
l'activit catalytique.
RACTIONS BISUBSTRATS
Les ractions enzymatiques impliquant deux substrats et deux produits
reprsentent 60% des ractions biochimiques connues.
E
P-X + B P + B-X
Presque toutes les ractions bisubstrats sont soient des ractions transfrases
o l'enzyme catalyse le transfert d'un groupement fonctionnel spcifique, X, d'un
substrat l'autre, soient des ractions oxydation - rduction o des quivalents
rducteurs sont transfrs entre deux substrats. Parmi toutes les ractions bisubstrats
(bi bi) possibles seulement quelques sont observs.
Il y a deux classifications mcanistiques majeures.
a) Ractions squentielles ou tous les substrats doivent combiner avec
l'enzyme avant qu'il y ait transformation de substrat en produit. Le transfert du
groupe X de A (= P - X) B donne P et Q (= B - X) est connu sous le nom de
ractions dplacement simple. Il y a deux sortes de ractions dans laddition des
substrats.

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i) Mcanisme squentiel au hasard


A

EA

Q
E

EAB EPQ

EB
B

EP
A

ii) Mcanisme ordonn ou obligatoire


A

EA

EAB EPQ

EQ

b) Ractions ping pong o un ou plusieurs produits sont librs avant que


tous les substrats aient particip dans la raction. Dans la raction ping pong bi bi, le
produit P est libr aprs l'attachement de substrat A et l'enzyme devient accepteur
du groupement X. La liaison de B l'enzyme permet le transfert d'X au produit Q.
Mcanisme enzyme substitu (ping pong)
- ces ractions connues sous le nom dplacement double impliquent une
modification de l'enzyme et les deux substrats, A et B, ne se rencontrent pas sur la
surface de l'enzyme.

EA EP

EB EQ

Les quations cintiques pour le cas bisubstrats sont plus complexes et il est
possible de distinguer entre les mcanismes diffrents.
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MCANISMES CATALYTIQUES
La catalyse est un processus qui augmente le taux par lequel une raction
atteint lquilibre.
La raison que les enzymes sont des catalyseurs puissants est due leur
spcificit de liaison au substrat et leurs arrangements optimaux des groupements
catalytiques.
Les mcanismes que les enzymes utilisent sont classifis de manire
suivante :
L'enzyme fournit les groupes accepteur/donneur de protons, dans un
mcanisme de catalyse acide/base.
Lenzyme peut se combiner de faon covalente avec le substrat pour former
un intermdiaire qui permet une raction plus rapide.
L'enzyme utilise des ions comme co-facteurs, pour stabiliser diffrentes
charges (intermdiaires), pour ioniser les molcules d'eau et les rendre plus
nuclophiles, et/ou pour cacher des charges.
L'enzyme utilise les forces lectrostatiques, pour aligner le substrat et
stabiliser l'tat de transition.
L'enzyme fixe le substrat de telle sorte que les liens ractionnels sont situs
prs du site catalytique et sont orients de telle sorte que l'tat de transition est
atteint trs rapidement.
L'enzyme peut induire la distorsion et/ou la tension au niveau du lien couper,
ce qui le dstabilise et le rend plus facile couper. L'enzyme fixe donc
prfrentiellement le substrat sous forme d'tat de transition.
CATALYSE ACIDE/BASE
Une catalyse acide gnrale est un procd dans lequel le transfert partiel d'un
proton partir d'un groupe acide (acide Bronsted - une molcule qui peut fournir un
proton) abaisse l'nergie libre de l'tat de transition.
Une raction peut aussi tre stimule par la catalyse basique gnrale, si le
taux de raction est augment par l'abstraction partielle d'un proton par une base
(base Bronsted - une molcule qui peut attirer un proton).
Certaines ractions utilisent les deux types de catalyse et si les deux ractions
sont simultanes, la raction devient acide - base gnrale concerte.

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Exemple : La tautomrie ctone - nol; ltat de transition [ ] ressemble un nolate

O
-

CH2

CH2

CH2

Catalyse acide gnrale - lacide, AH, est donneur de son proton H


R

O + H

H A

CH2

H + AH2O

CH2

CH2
H

A + OH-

Catalyse base gnrale la base, :B, joue le rle daccepteur de proton ctone H
R

O + :B

O
-

CH2

CH2

C
H+

H + B+

CH2
+
:B + H

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Raction catalyse par Ribonuclease A illustre la catalyse acide - base gnrale


La RNase A est un enzyme digestif qui hydrolyse lARN. Le profil pH de la
raction dmontre un maximum vers pH de 6 et correspond en effet l'ionisation de
deux groupements, His 12 et His 119.

Deux acides amins histidines (His 12 et His 119) agissent de faon concerte
dans un mcanisme acide/base.
1) His 12 agit comme la base, retirant un proton du groupe 2'-OH de lARN,
ce qui permet une attaque nuclophile sur l'atome de phosphore adjacent. De mme,
His 119 agit comme un acide et provoque le bris du lien en protonant le groupe
R'-O-.
2) L'intermdiaire 2'-3'-cyclique est hydrolys par le processus inverse de
lacide/base. His 12 est maintenant l'acide et His 119 la base.

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CATALYSE COVALENTE
La catalyse covalente implique l'acclration de la vitesse par la formation
transitoire d'une liaison catalyseur - substrat.
La formation de base de Schiff par l'enzyme reprsente un des mcanismes le
plus souvent rencontr. Dans lexemple, l'azote proton dans lintermdiaire agit
comme puit d'lectron afin de rduire la barrire de transition de lnolate.
Imine proton

Enolate

H3C

H
N

CH2

H3C

CH2

La formation et la dcomposition de la base de Schiff est trs rapide et ne


reprsente pas l'tape limitante de la raction.
La catalyse covalente se divise en deux tapes :
1) la raction nuclophile entre le catalyseur et le substrat afin de former une
liaison covalente
2) le retrait d'lectron du centre ractionnel par le catalyseur qui est devenu
lectrophile
H

1
+

2
N

OH

H
N

+ OH -

H
B

Imine protone

Les rsidus utiliss sont les groupements : -amine de Lys, la portion


imidazole d'His, le groupement thiol de Cys, la fonction carboxyle d'Asp et le
groupement hydroxyle de Ser.

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CATALYSE MTALLO-DPENDANTE
Presque un tiers des enzymes connus sont dpendants des ions mtalliques
pour leur catalyse
Les mtalloenzymes se divisent en deux classes qui sont distingues par la
force des interactions protine - ion :
a) Mtalloenzymes possdant des ions mtalliques fortement lis comme Fe2+,
Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, ou Co2+.
b) Des enzymes activs par des ions mtalliques faiblement lie en solution
comme Na+, K+, Mg2+, ou Ca2+.
Les ions de mtal participent la catalyse en trois faons majeures :
1) dans la liaison des substrats afin de l'orienter
2) facilitation des ractions oxydation-rduction par leurs changements
rversibles de leur tat d'oxydation
3) stabilisation lectrostatique des charges ngatives
Les mtaux sont trs souvent des meilleurs catalyseurs que des protons parce
que les ions mtalliques peuvent tre prsents en hautes concentrations et possdent
des charges stable > +1 super acides
La coordination par le mtal rend les molcules d'eaux attaches plus acides et
donc une source OH- des pH neutres.
- par exemple la molcule d'eau dans le complexe (NH3)5 Co3+ (H2O) ionise
(NH3)5 Co3+ (H2O) (NH3)5 Co3+ (OH-) + H+
avec un pKa de 6.6 et qui est quelques 9 units de pH plus bas que celui de leau. La
consquence est la cration d'un groupement hydroxyle mtallo-dpendant qui est
un nuclophile puissant.

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L'enzyme danhydrase carbonique est un bon exemple. L'enzyme utilise le


zinc pour catalyser la raction :
CO2 + H2O HCO3- + H+ en trois tapes.
1) coordination dune molcule de zinc par trois histidines et une molcule
d'eau. Il est postul que l'ionisation de la molcule d'eau est facilite par catalyse
base gnrale impliquent le rsidu histidine-64 voisin voir figure.
Site de
liaison de
CO2

5ime site de coordinance


Glu-106
His-64
His-96
-

HCO3
His-119
His-94

Site actif de lanhydrase carbonique


montrant la surface lectrostatique. Le
CO2, une fois li, est immdiatement
transform en HCO3- au fond du site actif.

Site actif montrant lintermdiaire enzyme HCO3- stabilis par le zinc. His-64 active par un
relais de 2 molcules deau (non montres) la
molcule deau qui sert attaquer le CO2.

2) attaque nuclophile par le OH- du CO2 et la conversion en HCO33) rgnration du site catalytique par la liaison d'une autre molcule de H2O
possiblement avant le dpart de HCO3- travers un intermdiaire du complexe de
zinc penta coordonn.
O
Zn2+ O
H

2
Zn2+ O

C
OH 2O

3
His
O

3'

+
Zn2+ O + H + HO C

H
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OCatalyse Enzymatique

His
Zn2+ O
His
H2O
H

O
C
O-

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CATALYSE LECTROSTATIQUE
Les distributions de charges dans un site actif sont arranges afin de stabiliser
les tats de transition. Les simulations sur ordinateur indiquent que la rduction de la
barrire de ltat de transition par des effets lectrostatiques est un composant
important de catalyse. On pense que l'enzyme plie fournit un environnement
polaire pr-organis qui dj est partiellement orient pour stabiliser l'tat de
transition.
CATALYSE PAR LES EFFETS DE PROXIMIT ET FACTEUR DORIENTATION
L'alignement spatial des ractifs sur une surface enzymatique permet leur
raction de faon optimale dans le site actif. Les ractions catalyses sont acclres
par la rduction relative en translation et rotation des ractifs. Le tableau montre des
exemples des vitesses relatives de la formation danhydrides partir desters ayant
des degrs de liberts diffrents.

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La bonne orientation des ractifs augmente encore le taux par un facteur 100.

Les enzymes lient les substrats de manire les immobiliser et les aligner afin
d'optimiser leur ractivit. L'nergie pour raliser ceci provient de l'nergie libre de
liaison du substrat avec l'enzyme.
CATALYSE PAR LIAISON L'TAT DE TRANSITION
Le mcanisme de catalyse parmi les plus importants qui est bas sur la notion
que la conformation contrainte du ractif ressemble plus celle de l'tat de transition
dune raction que la conformation non contrainte correspondante
Ceci d'abord suggr par Linus Pauling en 1946 et labor par Wolfenden et
Lienhard. Leur principe est le suivant :

Les interactions qui favorisent la liaison prfrentielle l'tat de transition


augmentent sa concentration et par consquent augmentent de faon
proportionnelle la vitesse de la raction catalyse
Ce principe peut se comprendre de faon suivante :
La formation du produit P partir du substrat S peut se faire de faon
spontane ou par catalyse enzymatique soit :
kN
S

kE

et

ES

EP

o kN et kE reprsentent les constantes de vitesse de premier ordre dcrivant


les ractions respectives

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La relation entre les deux ractions est dcrite par le schma suivant :
KN
E+S
KR

S +E

o KN =[E][S ]/[E][S]

P+E

KT

KR = [ES]/[E][S], KT = [ES ]/[E][S ]

KE
ES

ES

et KE =[ES ]/[ES] sont tous des constantes


d'association

EP

Par consquent KT / KR = [S][ES] / [S][ES] = KE / KN .

(1)

Les vitesses de la raction non catalyse ou catalyse sont les suivantes :


v = k N [ S ] = (k B T )[ S ] = (k B T ) K N [ S ] pour la raction non catalyse

(2)

v = k E [ ES ] = (k B T )[ ES ] = (k B T ) K E [ ES ] pour la raction catalyse

(3)

En manipulant les quations 1-3, on obtient k E k N = K E K N = K T K R

(4)

Cette quation indique que plus lenzyme favorise la liaison ltat


transitionnel (KT) par rapport la liaison au substrat (KR), plus laugmentation de
vitesse de la raction catalyse est grande (kE) par rapport celle de la raction non
catalyse (kN) ; en dautres mots
La catalyse enzymatique est due la liaison et la stabilisation prfrentielle de
ltat transitionnel (S) par rapport celle du substrat (S)
Le rapport en nergie libre entre les deux vitesses sexprime par :

k E K E e GE / RT
=
=

k N K N e GN / RT

[(

alors k E k N = exp G N G E

) RT ] = e

G / RT

Pour gagner un facteur dacclration de 106 25C, lenzyme doit lier ltat
transitionnel davantage par 34.2kJ.mol-1.
Ceci correspond approximativement lnergie libre provenant de la
formation de deux ponts hydrogne.

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Donc la liaison prfrentielle ltat transitionnel due la formation de


seulement deux ponts hydrogne qui ne sont pas prsents dans le complexe ES
augmenterait la vitesse par un facteur ~106

non catalyse
Stabilisation
implique la
rduction de la
barrire de ltat
de transition

Minimum dnergie
puisque lenzyme favorise
la liaison de ces ligands

Dans lapproximation de lquilibre rapide, KR = 1/KM, ke = kcat et dfinissant


la constant dissociation de ltat de transition par Kdiss = 1/KT ; lquation 4 devient

K diss = k N (K M k cat )

Mettons kN ~ 10-6 s-1 et kcat/KM ~ 106 M-1 s-1 o KM KS ~ 10-4 M et kcat = 102s-1
Kdiss = 10-12 M pour ltat de transition dune enzyme typique
Dans cet optique un bon substrat ne se lie pas ncessairement son enzyme
avec une affinit leve mais pourra le faire lors de lactivation son tat
transitionnel
Si un enzyme lie prfrentiellement le substrat ltat transitionnel, il est
donc possible denvisager des molcules stables qui ressemblent plutt S ou une
de ses composantes. Ces types de molcules sont considrs des analogues de ltat
transitionnel et ils sont des inhibiteurs comptitifs parmi le plus puissant.
Le fait que les enzymes lient davantage les tats transitionnels plutt que le substrat
reprsente le principe fondamental dans le design des mdicaments et dpend de la
connaissance au niveau molculaire du mcanisme ractionnel de lenzyme.
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