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DE FISIOLOGA VEGETAL
Curso 2006-2007
M
D
DU
UL
LO
OD
DE
EC
CU
UL
LT
TIIV
VO
O IIN
NV
VIIT
TR
RO
O
Kinetina
Zeatina
BAP: bencilaminopurina
NOTA IMPORTANTE:
Hay que evitar en lo posible la contaminacin de los medios de cultivo por bacterias u
hongos. Es preciso trabajar en las mayores condiciones de esterilidad posibles.
Se trabajar muy cerca de la llama del mechero Bunsen, con la mesa de trabajo MUY
LIMPIA, evitando remover el aire alrededor de las placas en exceso. Hay que limpiarse
bien las manos con jabn y posteriormente se deben enjuagar con etanol 70 %.
SI NO CUIDAIS ESTE ASPECTO OS PODEIS ENCONTRAR CON VUESTRO
EXPERIMENTO
TOTALMENTE
INFECTADO
POR
ORGANISMOS
INDESEABLES!!!!
Asimismo, es necesario ser muy pulcros al esterilizar el material vegetal que se va a
cultivar in vitro. Por favor, seguid muy atentamente las indicaciones del guin de
prcticas y las recomendaciones que hagan los profesores.
1 PARTE:
FeSO47H2O
27.8
Dicho medio bsico hay que suplementarlo con diversos componentes. Las vitaminas
estn preparadas en disoluciones concentradas stock, que, al ser termolbiles, se
esterilizan por filtracin:
Tabla 2. Medios de cultivo a preparar por los distintos grupos de trabajo, en los que se variar la
proporcin de fitohormonas y la presencia o ausencia de kanamicina. Los volmenes de los stock de
fitohormonas se han calculado para preparar 500 mL de medio de cultivo.
Medio
Kan
BAP
Kan Grupo
(L)
(mg L-1)
Alta auxina (AA)
NO
3.0 : 0.0
500
NO
1.5 : 0.5
250
250
NO
0.5 : 3.0
85
1500
AA + kanamicina
50
3.0 : 0.0
500
500
MA + kanamicina
50
1.5 : 0.5
250
250
500
BA + kanamicina
50
0.5 : 3.0
85
1500
500
Balanza
Pulgas magnticas
Agitador magntico
Tubos Falcon
Frascos ISO de 1 L
DIA 2
Se proceder a recolectar los tejidos a cultivar in vitro de plantas de tabaco silvestre y
transgnico. Se cortarn secciones de tallo y hojas con bistur, que seguidamente se
transferirn a tubos Falcon de 50 mL para su esterilizacin.
Esterilizacin
Se aade 15-20 mL de etanol 70%, agitando suavemente durante 3 min. Se enjuaga el
tejido con agua estril y se lava el tejido con otros 15-20 mL de la disolucin
esterilizadora durante 5 min. Para eliminar la leja, se lava el tejido con tres volmenes
de H2O desionizada estril, TRABAJANDO SIEMPRE CERCA DEL MECHERO.
2 PARTE:
Cebador positivo
Cebador negativo
T ani.
Rubisco
(349 pb)
tccctgtttcaaggaagc
Rbcs01F
gtcgcataaaattgaaggag
Rbcs02R
59
nptII
(317 pb)
gaagagcatcaggggctc
nptII01F
gaagaactcgtcaagaaggc
nptII02R
59
35S
(234 pb)
tgccatcattgcgataaagg
35S01F
cctctccaaatgaaatgaac
35S02R
59
Nos term
(127 pb)
gaatcctgttgccggtcttgcg
nos01F
gcgggactctaatcataaaaac
nos02R
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Reaccin de PCR
Los profesores elaborarn una mezcla maestra (tubo MM) que contendr todos los
componentes de la mezcla de reaccin de la PCR excepto el molde de DNA (obtenido
por cada grupo) y los cebadores especficos de cada fragmento a amplificar. Para cada
tubo de PCR (utilizar los tubos especiales de 200 L de pared fina estriles), se
deben poner los siguientes componentes en la MM para un volumen de reaccin final de
50 L: tampn de polimerasa 10X (ya contiene Mg2+), 5 L; 1 unidad de Taq
polimerasa (5 U/L), 0,2 L; dNTPs 10 mM (conc. final 200 M), 2 L; H2O, 27,8 L.
A los 35 L de MM hay que aadir 5 L de cada cebador (total 10 L para la pareja) y 5
L del molde de DNA. En la Tabla 4 se describen los componentes que hay que aadir
en cada uno de los 8 tubos de PCR que cada grupo ha de preparar.
Dado que cada grupo ha extrado DNA de una sola planta, se compartir por mesa
ambos moldes para que TODOS LOS GRUPOS ENSAYEN TODAS LAS
COMBINACIONES (Tabla 4).
Una vez mezclados los componentes de la reaccin de PCR se introducen los tubos en el
termociclador y se someten al siguiente programa:
Temperatura (C)
Tiempo
94
5 min
Desnaturalizacin
94
1 min
Anillamiento
59
45 s
Extensin
74
45 s
Extensin final
74
5 min
Final reaccin
10
Hasta el siguiente da
Desnaturalizacin
40 ciclos
Nos termin
35S
nptII
Rubisco
Componente
Rubisc
o
WT
MnSOD
Molde de DNA
Tubos N
Molde de DNA
Tubos N
Molde de DNA
Tubos N
Molde de DNA
Tubos N
Rbcs01F
Rbcs02R
nptII
nptII01F
nptII02R
35S
35S01F
35S02R
Nos termin
nos01F
nos02R
35
35
35
35
35
35
TOTAL (L)
50
50
50
50
50
50
DIA 2
Anlisis de la PCR: separacin de los fragmentos en gel de agarosa
Los nucletidos se separarn mediante electroforesis no desnaturalizante en gel de
agarosa 2% en tampn TAE (40 mM Tris-acetato, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0). Las
bandas correspondientes al cDNA amplificado se visualizarn en un transiluminador
con luz ultravioleta teidos con bromuro de etidio (BrEt).
10
Volumen de 1 L
Tris base
242 g
57.1 mL
100 mL
0.25%
Xilencianol
0.25%
Glicerol
30%
10 mg/mL
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Fig. 4. Amplificacin por PCR de diversos fragmentos de DNA, utilizando como molde DNA
genmico obtenido de plantas no transgnicas (WT) y plantas transgnicas (MS) de tabaco. Se
muestran los resultados empleando cebadores contra la subunidad pequea de Rubisco (control
positivo) y el de dos componentes de un transgen: gen de resistencia a kanamicina (nptII) y contra el
promotor CaMV35S (utilizado para conseguir un nivel constante de expresin de un gen). En el
carril L se muestra la escalera de DNA de100 pb, que permite determinar el tamao de los
fragmentos amplificados (L).
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